（微生物学专业论文）杜氏盐藻甘油合成代谢调控的研究.pdf

摘要 本文系统进行了氮源、碳源、磷源、盐浓度对杜氏盐藻甘油代谢调控的影响；葡 萄糖、n a c i 对盐藻中3 一磷酸甘油脱氢酶活性的影响；3 一磷酸甘油脱氢酶提取和纯化 以及动植物抽提液对盐藻固体平板生长影响的研究。 利用本实验室分离纯化得到的无菌藻株a 1 研究影响杜氏盐藻合成甘油的各种因 子，如氮源、碳源、磷源、盐浓度等。氮源中尿素对盐藻单个细胞甘油积累量的影响 最大，当盐藻培养至6 d 时，添加尿素培养液中甘油积累量为2 5 8 1p g c e l l ，较添加 k n 0 3 培养液中甘油积累量高出5 2 4 5 。盐藻单个细胞甘油含量随着磷酸二氢钾浓 度的增加而上升，0 6 5 9 l 的磷酸盐对提高盐藻单个细胞甘油含量的作用最明显，达 到1 7 9 9p g c e l l ，比浓度为0 0 1g l 时的甘油累积量高出3 9 2 4 。碳源中葡萄糖对盐 藻细胞内甘油含量积累的促进作用最明显，1 5 9 l 的葡萄糖效果最佳；当葡萄糖和 n a c l 以不同的浓度组合添加时，0 5m o l l n a c l ，和1 5 9 l 葡萄糖的组合对盐藻的甘 油积累的促进作用最为明显，盐藻培养至第6 d 时，单个细胞甘油含量达到最大值 2 5 2 8p g c e l l ，较对照提高了1 2 4 3 2o a 。 葡萄糖对盐藻细胞内甘油积累有显著促进作用，在0 1 5 9 l 范围内葡萄糖的浓度 与胞内甘油积累显著相关( y = 1 2 3 4 9 x + 2 1 4 2 9 ，r 2 = o 9 9 6 5 ) ，葡萄糖浓度达至f j l 5 9 l 时，胞内甘油积累量达到最高值4 0 1 3 1 s g m l ，是对照的2 0 6 倍。葡萄糖对盐藻细胞内 总蛋白、3 磷酸甘油脱氢酶( g p d h ) 酶活和比活都有显著影响，这些值在1 0 1 5 9 l 之间产生较大的变化，但变化幅度与葡萄糖的浓度变化不成比例，在1 5 9 l 葡萄糖时 这3 个值达到最大值，分别是对照的4 3 8 4 、1 3 5 4 、3 2 2 9 倍。数据显示葡萄糖浓度在 1 5 9 l 时细胞内蛋白质含量增加不多，但g p d h 酶活和比活却大幅度增加。 当n a c l 浓度在0 1 2 0 m o l l 时，单个细胞内的甘油积累量、g p d h 酶活及比活均 随n a c l 浓度的增加而增加，但继续提高n a c l 浓度，各值却反而降低，当n a c l 浓度为 2 0 m o l l 时以上各值均达到最大，甘油积累量、g p d h 酶活及比活分别为3 3 0 p g c e l l ， o 2 4 ；_ t u c e l l 及9 0 2 ，分别是对照的1 3 8 、3 0 0 及4 9 3 倍。与此同时，平均每个细胞蛋白 质含量却随着n a c l 的增加而降低，当n a c l 浓度为2 5 m o l l 时，蛋白质含量为2 1 5 9 p g e e l l ，仅为对照的5 1 。 离心收集培养1 2 d 的藻细胞，冰浴超声破碎，获得粗提液；经2 次p e g 分级， 采用d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 柱纯化蛋白；经o o 5 m o l ln a c i 梯度洗脱后，在2 个不同n a c l 浓度的藻液样品中分别洗脱出2 个峰具有g p d h 活性，2 0 m o l ln a c l 浓度样品的g p d h 经d e a e 纯化后，2 个峰所对应的各项值较o 5 m o l ln a c l 浓度样 品的值均有大幅度提高，2 0 m o l ln a c l 浓度样品的第1 峰的总蛋白、总酶活及比酶 活分别是0 5 m o l l n a c l 浓度样品的4 2 3 、4 5 0 和1 0 6 倍，而第2 峰对应的总蛋白、 总酶活及比酶活分别是o 5 m o l l n a c l 浓度样品的1 3 8 0 、6 9 9 0 和5 0 7 倍，与第1 峰 相比各项值大幅度增加。数据显示第2 峰中可能存在显著受到高浓度n a c l 诱导的“渗 透调节”型g p d h 同功酶。 培养至3 0 d 时，在添加鱼汤提取物的平板上，形成了较好的单藻落，藻落较大， 颜色呈深绿色，而对照平板上的藻落小，呈浅绿色。通过计算植板率，发现随着鱼汤 提取物浓度的增加，植板率越高，8 鱼汤提取物浓度的平板植板率是对照平板的6 4 倍。 关键词：杜氏盐藻，甘油，3 磷酸甘油脱氢酶，葡萄糖，n a c i 1 1 1 a b s t r a c t t h i sp a p e rs y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dt h ei n f l u e n c eo fn i t r o g e ns o u r c e ，c a r b o ns o u r c e ， p h o s p h a t es o u r c e ，a n dt h en a c lc o n c e n t r a t i o nt ot h er e g u l a t i o no fg l y c e r o lm e t a b o l i co f d u n a l i e l l as a l i n a ，t h ei n f l u e n c eo fg l u c o s e 。n a c lt ot h ea c t i v i t yo f g l y c e r o l 一3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( g p d 聊i nd s a l i n a ，e x t r a c t e da n di s o l a t e dg p d h ，a n dt e s t e dt h e i n f l u e n c eo f f i s he x t r a c tf l u i dt o 也eg r o w t ho l d s a l i n ao np l a t e s t h ei n f l u e n c e so fd i f f e r e n tf a c t o r s ，l i k en i t r o g e ns o u r c e , c a r b o ns o u r c e ，p h o s p h a t e s o u r c ea n dn a c lc o n c e n t r a t i o nt ot h eg l y c e r o la n a b o l i s mo fd s a l i n aw e ：r er e s e a r c h e d u s i n gt h ea s e p t i ca 1s t r a i ni s o l a t e db yo u rl a b a m o n gn i t r o g e ns o u r c e ，u r e aa f f e c t e d m o s t l y t h ea c c u m u l a t i o no f g l y c e r o l i ns i n g l ec e l lo f d s a l i n a a f t e r6d a y so f c u l t u r e ，t h e a c c u m u l a t i o nv a l u eo fg l y c e r o la d d e dw i t hu r e aw a s2 5 8 1p g c e l l ，w h i c hw a sh i g h e rt h a n t h a ta d d e dw i mk n 0 3b y5 2 4 5 t h eg l y c e r o lc o n t e n to fs i n g l ec e l lo fds a l i n a i n c r e a s e dw h e nc o n c e n t r a t i o no fl ( h 2 p 0 4i n c r e a s e d t h eb e s tc o n c e n t r a t i o no fp h o s p h a t e t oi n c r e a s eg l y c e r o lc o n t e n to fs i n g l ec e l lo f d s a l i n aw a s 0 6 5 9 l u n d e rt h i sc o n d i t i o n 。 t h e a c c u m u l a t i o n v a l u eo f g l y c e r o lc o u l dr e a c h t o1 7 9 9 p g c e l l ，w h i c h w a sh i g h e r t h a n t h a t w i t ho 0 1g lp h o s p h a t eb y3 9 2 4 a m o n gc a r b o ns o u r c e ，g l u c o s ew o r k e db e s tt o i n c r e a s et h eg l y c e r o lc o n t e n t t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ew a s1 5 9 m w h e n d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s ew i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn a c lw e r ea d d e dt o s c r e e nt h eo p t i m a lc o m b i n a t i o ni n c r e a s i n gt h eg l y c e r o lc o n t e n tb e s t ，t h eo p t i m u mo n ew a s 0 5m o l ln a c ia n d1 5 9 lg l u c o s e a f t e r6d a y so fc u l t u r e t h ea c c u m u l a t i o nv a l u eo f g l y c e r o li ns i n g l ec e l lr e a c h e dt ot h em a x i m u mv a l u eo f2 5 2 8p g c e l l ，w h i c hw a sh i 曲e l t h a nc o n t r o l b y1 2 4 3 2 g l u c o s eh a da p p a r e n te f f e c ti ni n c r e a s i n gt h eg l y c e r o lc o n t e n ti nds a l i n a i nt h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 0 - 1 5 9 l ，g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n m a r k e d l y c o r r e l a t e dw i t h i n t r a c e l l u a rg l y c e r o l a c c u m u l a t i o n ( y = 1 2 3 4 9 x + 2 1 4 2 9 ，彰= o 9 9 6 5 ) w h e n g l u c o s e r e a c h e dt o1 5 班，i n t r a c e l l u a r g l y c e r o la c c u m u l a t i o nr e a c h e dm a x i m u mv a l u eo f 4 0 1 3 i _ t g m l ，w h i c hw a sa s2 0 6t i m e sa st h a to f t h ec o n t r 0 1 g l u c o s eh a dn o t a b l ei n f l u e n c e t ot o t a lp r o t e i no fns a l i n ac e l l s t o t a le n z y m ea c t i v i t ya n ds p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t yo f g p d h t h ev a l u e so ft o t a lp r o t e i n , t o t a le n z y m ea c t i v i t y , a n ds p e c i f i ce n z y n l ea c t i v i t y v a r i e di nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f1 0 15 9 ，l h o w e v e r , t h ec h a n g ee x t e n tw a sn o t p r o p o r t i o n a lt ot h ec h a n g eo fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n a tt h ec o n c e n t r a t i o no f15 9 l ，t h e t h r e ev a l u e s ，w h i c hw e r em a x i m u m ，w e r ea s4 3 8 4 ，1 3 5 4 ，3 ，2 2 9t i m e sa st h o s eo f c o n t r o l s ， r e s p e c t i v e l y a c c o r d i n gt od a t a , t o t a lp r o t e i ni n c r e a s e dal i t t l eu n d e rt h i sc o n c e n t r a t i o n , w h i l et o t a le n z y m ea c t i v i t ya n d s p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t yo f g p d h i n c r e a s e dr e m a r k b l y i v i nt h er a n g eo 1 - 2 0 m o l ln a c l ，g l y c e r o la c c u m u l a t i o nq u a n t i t yi ns i n g l ec e l l ，t h e t o t a le n z y m ea c t i v i t ya n ds p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t yo fg p d hi n c r e a s e da st h en a c l c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d b u tf u r t h e ri n c r e a s eo ft h en a c lc o n c e n t r a t i o nl e dt ot h e d e c r e a s e dv a l u e s l e nt h en a c lc o n c e n t r a t i o nw a s2 0 m o l l t h ev a l u e sa b o v ea c h i e v e d m a x i m u m t h eg l y c e r o la c c u m u l a t i o nq u a n t i t y , t h et o t a le n z y m ea c t i v i t y , a n ds p e c i f i c e n z y m ea c t i v i t yo fg p d hw e r e3 3 0 p g c e l l ，o 2 4 p u c e l l ，a n d9 0 2 ，r e s p e c t i v e l y , w h i c h w e r e1 3 8 ，3 0 0a n d4 9 3t i m e st h o s eo fc o n t r o l s a tt h es a m et i m e 。p r o t e i nc o n t e n to f s i n g l e c e l lg r a d u a l l yr e d u c e da sn a c lc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d w h e nt h e n a c l c o n c e n t r a t i o nw a s2 5 m o l l ，t h ep r o t e i nc o n t e n tw a s2 1 5 9p g c e l l ，51 o ft h a to ft h e c o n t r 0 1 c r u d ee n z y m ee x t r a c tw a sp e r f o r m e dd u r i n gw h i c ha l g a ec e l l sw e r ec o l l e c t e db y c e n t r i f u g i n ga n db r o k e nb yu l t r a s o n i cd i s i n t e g r a t i o ni na ni c eb a t h a n dt h e nm e t h o d sl i k e p e gf r a c t i o n a t i o na n dd e a ei o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw e r eu s e dt of u r t h e rp u r l f y t h ec r u d ee n z y m e a f t e ro 田5 m o l lg r a d i e n te l u t i o n t w op e a k so fg p d hw e r es e p a r a t e l y e l a t e dr e s p e c t i v e l yf r o mt w ons a l i n ac u l t u r e sw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn a c l a l l t h ev a l u e so ft h et w op e a k so fg p d hf r o mt h es a m p l ew i t h2 0 m o l ln a c lw e r eh i g h e r t h a nt h a tf r o mo 5 m o l lr e s p e c t i v e l ya f t e rt h ed e a ep u r i f i c a t i o n ，t h et o t a lp r o t e i n , t o t a l e n z y m ea c t i v i t y , a n dt h es p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t yo ft h e f i r s t p e a kf r o ms a m p l ew i t h 2 o m o l l n a c l w e r e4 2 3 ，4 5 0 ，a n d1 0 6 t i m e s a s t h a t o f s a m p l e w i n lo 5 m o l l n a c l ， w h i l ev a l u e sc o r r e s p o n d i n gt ot h es e c o n dp e a ko ft h es a m p l ew i t l l2 0 m o l ln a c lw e r e 1 3 8 0 ，6 9 9 0 ，a n d5 0 7t i m e sa st h a to fs a m p l ew i t ho 5 m o l ln a c l t h ev a l u e so ft h e s e c o n dp e a kf r o ms a m p l ew i t h2 o m o l ln a c li n c r e a s e dm a r k e d l y p r o t e i ni nt h es e c o n d p e a km i g h tc o n c e r n 、i mt h eg p d hi s o e n z y m e si n d u c i b l eb yh i 曲c o n c e n t r a t i o n o f n a c l d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ff i s he x t r a c th a v e b e e na p p l i e dt ods a l i n at op r o m o t et h e g r o w t ho fds a l i n ao np l a t e t h ea l g a ec o l o n i e so np l a t e 丽t 1 1f i s he x t r a c ti n c r e a s e d a p p a r e n t l yc o m p a r e dw i t hc o n t r o l ，t h ec o l o ro ft h ec o l o n i e sb e c a m ed a r k e rg r e e n , a n d d i s p e r s e dm o n o c o l o n i e sc o u l db ee a s i l yo b t a i n e d w i t ht h ei n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o n a p p l i e dt o t h ep l a t e t h ep l a t i n ge f f i c i e n c yo fds a l i n aw a si m p r o v e do b v i o u s l y 1 h e p l a t i n ge f f i c i e n c yo fa l g a es a m p l es u p p l i e dw i t h8 o f f i s he x t r a c tr e a c h e dt oa sh i g ha s 4 2 a n dw a s6 8t i m e so f t h 砒o f t h ec o n t r 0 1 k e yw o r d s ：d u n a l i e l l as a l i n a ，g l y c e r o l ，g l y c e r o l 一3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ， g l u c o s e ，n a c l v 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽 农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 短幽 签字日期：细 年6 月) 。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件， 允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 。 学位论文作者签名：氩生直 签字日期： z - , t 年彳月? 2 ，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址： 指导教师签名两锄 签字日期：，7 年月日 电话： 邮编： 综述 1 国内外研究动态 1 1 盐藻简介 杜氏盐藻( d u n a l i e l l a s a l i n a ) 是一种单细胞真核藻类，1 8 3 7 年首次由法国人d u n a l 发现于地中海沿岸的盐池中。其分类学地位是绿藻门、绿藻纲、团藻目、杜氏藻科、 杜氏藻属j ，无细胞壁，原生质外有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜 2 1 。盐藻属于 光合自养生物，藻个体通常呈卵圆形，有2 条等长的鞭毛，藻体内有一杯状、大型的 叶绿体，体积约占细胞的一半，内含一淀粉核，前端有一红色眼点。营养繁殖为纵裂， 有性生殖为同配生殖【3 】，形成红色或绿色接合子。盐藻是迄今为止发现的最耐盐的真 核生物之一，可在高达5 5 m o l l n a c l1 4 1 f l 勺极端环境中生存，广泛分布于海洋、盐湖等 高盐地区。 1 2 研究价值 1 2 1 甘油的生理功能及应用前景 ( 1 ) 甘油的生理功能 在高渗透压的外界环境下，胞内的水活度( h y g r o c o p i cw a t e rc a r c e n t ) 降低，长期处 在这种状态下，微生物的细胞膜结构和功能受到破坏，生长受到抑制，甚至使细胞死 亡。甘油作为一种小分子的多元醇，除了具有多元醇的共性以外，又具有它自身的特 性：在高浓度下表现出较低的粘度，可以保持细胞内环境合适的流动性：对细胞内酶类 有着明显的保护作用。 当盐藻生境中盐浓度升高后，其细胞内即开始进行甘油的合成，盐浓度降低则促 进甘油的转化，使细胞快速适应新的环境。陈志等亦研究表明盐藻是通过甘油的合成 与转化来调节渗透压，恢复其原来的形状和大小的【5 】o 甘油的转化是发生在甘油与淀 粉之间。 ( 2 ) 甘油的应用前景 在饱和的盐水中，盐藻细胞内甘油积累可达其干重的5 0 以上。甘油是优质的化 妆品原料，同时也是化工和医药工业中广泛应用的有机化合物。作为一种重要的基本 轻化工原料和国防工业物资，甘油由于具有吸湿性好，粘度高，冰点低等特点，被广 泛应用到医药、国防、油漆、化妆品、食品、造纸和纺织印染等行业的1 7 0 0 多种产品 中【6 】。 甘油的应用领域概括起来分为两类：直接接触皮肤( 包括入口) 和非接触皮肤类。前 者包括食品( 包括饮料) 、发胶、牙膏、化妆品、医药、烟草、纺织等；后者有造纸、 胶乳、国防工业、涂料、皮革、鞋油、墨汁、油墨、合成树脂、油漆、染料和印刷业 等。精制甘油应用领域很广，两大类应用领域均可使用，并且备受用户欢迎，但价格 高、货源少。复合甘油主要用于非皮肤接触和纯度要求不苛刻的领域。 从甘油的消耗结构上看，美国和日本主要用于合成醇酸树脂，医药和饮料等方面； 国内精制甘油( 多指皂化甘油和化学合成高质量甘油) 主要用于涂料和牙膏等，复合甘 油主要用于油漆和造纸。 1 2 2 盐藻在分子遗传学上的应用 盐藻是最耐盐的真核生物之一，可在o 0 5 m 5 m 的n a c i 浓度的环境中生长，并 且其结构较为简单，是研究耐盐相关基因和渗透调节机制理想的模式生物。 盐藻应用于分子遗传学有如下优点： ( 1 ) 盐藻无细胞壁，易于制备原生质体，为遗传转化和细胞融合奠定了良好的基础： ( 2 ) 藻营养细胞是单倍体，便于对其进行遗传改造和遗传分析； ( 3 ) 盐藻属真核生物且易于培养，作为新的生物反应器，用以高效表达生产蛋白和 药物的目标基因，在医药上将有巨大的经济价值。 2 丰土氏盐藻耐盐机制的相关研究 盐藻具有广泛的盐适应度，能耐受生存环境中o 0 0 5 ，5 m o l 1 的n a c l 盐浓度1 4 。 同其他生物相比，盐藻之所以具有极强的抗渗透能力，与盐藻的甘油代谢途径的关键 酶、细胞膜及些质膜蛋白具有特殊的形状有关。 2 1 盐藻中甘油的代谢途径 b e n a m o t z 及b e l m a n s 等分别对盐藻的渗透压调节机理研究后表明，其细胞内能 进行渗透调节的物质是甘油【7 一。盐藻细胞内甘油有可能是通过两种途径来合成的， 一是通过光合作用直接从c 0 2 固定而来，二是叶绿体内储藏产物淀粉的降解而来。 在渗透调节中，甘油的合成在光照和黑暗下都能正常进行，这一事实说明盐藻细胞内 甘油的合成，不需要光合作用过程的直接参与，也就是说，第二条途径最为可能。 a v r o n 等用“c 0 2 固定实验否定了甘油是通过光合作用由c 0 2 固定下来。陈志等亦研 究表明盐藻是通过甘油的合成与转化来调节渗透压，恢复其原来的形状和大小的【”。 甘油的转化是发生在甘油与淀粉之间。当外界低渗时，细胞内的甘油转化为淀粉，所 需能量由正常呼吸链和交替氧化酶提供；当外界高渗时，淀粉则降解为甘油，光照下 能量由光合电子提供，黑暗中则由正常呼吸链提供【9 j 。据g o y a l 报道，在培养液中加 入k c n ，能抑制藻细胞内低渗震动后甘油含量的下降和淀粉含量的上升：同样，抑 制经历高渗震荡后胞内甘油含量上升，a t p 和淀粉含量的下降，进一步证明盐藻是通 过第二条途径来调节甘油的变化。即由糖酵解途径和磷酸戊糖途径共同参与完成【l “ 儿1 。图1 显示了杜氏盐藻的甘油代谢循环途径。 2 d i h y d r o x y a 高t o n e p h o s p h a t e g - 3 - p d e h y d r o g e n a s e a m d p 心( 二d 羟h a 丙k 酮n 激a s 嘲e g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t e ( 埔酸甘油) d i h y d r o x y a c c s t o n e ( - - 羟丙酮 未；：hm 燃， 盐藻中甘油的产生主要是在叶绿体内，部分是在细胞质中完成的。其过程大致可 以可以分为两个阶段，1 ) 磷酸二羟丙酮( d h a p ) 的产生，2 ) d h a p 向甘油的转换。 盐藻中有四个酶催化d h a p 和甘油之间的相互转化，它们是甘油磷酸脱氢酶 通过a t p 使d h a 磷酸化；g p a s e 特异性地使3 一磷酸一甘油脱磷酸；g p d h 则催化 d h a p 转化3 一磷酸一甘油。从图1 可以看出g p d h 和d h a r d 催化地反应是可逆的， b c n - a m o t z 等根据在盐藻细胞内已发现的酶及其分布，提出在高渗震动下，甘油 低渗震动下，甘油是通过d h a r d 氧化成d h a ，再经d h a k 返回d h a p 1 0 l 。黄益群 等认为在甘油代谢途径中，d h a r d 催化甘油与d h a 之间的转化，为甘油合成或转 化的一个关键酶 9 1 。g e e 等通过改变培养条件，从杜氏盐藻细胞中分离至f j t - - 种g p d h 的同功酶，其中一种起渗透调节作用，称为“调渗型”同功酶【1 2 1 。白含林等研究发现在 外界渗透压骤增时，该同功酶酶活有显著增加，并据此认为渗透压调节功能的启动， 等【1 4 】在盐藻叶绿体内鉴定到了磷酸果糖激酶( p f k ) 的活性并对之进行了分析。另外 g o y a l 等i l 副在d t e r t i o l e c t a 中检测到了磷酸戊糖途径中的一些酶的活性。在对盐藻渗 透调节缺陷突变体的研究中发现了两个分别在6 一磷酸一葡糖酸脱氢酶活性受损的 突变体，他们在高渗震荡后分别积累6 一磷酸一葡萄糖和6 一磷酸一葡糖酸【1 7 1 。这 些结果也为磷酸戊糖途径在盐藻甘油的生产中起作用提供了有力的证据。 2 3 盐藻渗透调节的启动 当盐藻受盐胁迫作用时，首先是细胞体积的增大，这一变化可达到5 0 。这是 由于大量的位于原生质膜下的液泡与原生质膜融合，从而使细胞体积的增长成为可 能。同时，叶绿体体积的增加是由于内质网上的某些部分叶绿体膜相融合。这种融合 作用普遍被认为是由膜不稳定性激起的。这一过程与细胞内一些小分子量的g t p 结 合蛋白有关。盐藻中至少存在5 中这样的蛋白：2 1 ，2 8 ，2 8 5 ，2 9 和3 0 k d ，其中2 8 k d 蛋白质参与细胞内液泡的位移过程。在细胞体积增长时，该蛋白从e r 富集的微粒体 部分转移到原生质膜、叶绿体上，可见该蛋白对渗透调节过程中，细胞体积的控制起 着一定的作用1 9 2 0 1 。 b e n t a l m ( 1 9 9 0 ) 提出盐藻渗透调节是由细胞质与叶绿体不同的体积变化引起的。 这种变化改变了细胞质中的浓度，从而激活了叶绿体中的某些酶，引起合成淀粉的积 累，而甘油合成的速率与胞内磷的含量有关【2 ”。同样，也有报道称c a 2 + 在盐胁迫调 节中起着一定“信号”作用。1 7 m n a c i 中培养的盐藻，当用高渗( 3 4 m n a c l ) 或低渗 ( 0 8 m n a c l ) 处理时，会发生保外钙离子流入或钙离子流出，流动量与渗透压成比 例，这间接地表明细胞内钙离子浓度发生了变化，且这一变化发生在甘油合成之前。 当用钙专王抑制剂t f p ，w 一7 处理时，作为渗压剂甘油，其浓度的增加也受到抑制。 抑制作用可达5 0 。这些说明在盐藻调渗系统中，钙离子作为盐胁迫转导信号的第 二信使的可能性是存在的1 2 2 2 3 1 。 2 4 盐藻甘油代谢途径中的相关蛋白 s a d a k a 等研究表明盐藻对高盐的适应与细胞内某些蛋白表达量有关，并于1 9 9 1 年鉴定了与盐适应相关的1 5 0 k d 蛋白，发现该蛋白位于细胞表面，与高盐下细胞分 裂生长有关阱】。m o r l y 等( 1 9 9 4 ) 发现并鉴定与盐适应相关的另一种6 0 k d 蛋白【2 5 】。 f i s h e r 等通过e d n a 序列分析表明1 5 0 k d 蛋白是一种转铁蛋白【2 6 1 ，6 0 k d 蛋白是一种 碳酸酐酶，位于细胞膜上，与离子的运输有关1 2 ”。徐坤等研究亦证明这些蛋白含量变 化可能和杜氏盐藻的盐适应有一定的联系【2 引。从整个渗透调节过程来看，渗透骤变后 离子效应和其它生理活动也是杜氏盐藻渗透调节的重要组成部分。陈思学等认为渗透 震扰信号可通过蛋白质磷酸化进一步放大，而2 4 k d 蛋白是杜氏盐藻细胞内蛋白激酶 最有潜力的底物眇j 。 4 3 杜氏盐藻生理特性的相关研究 3 1 光、温，p h 等生态因子的研究 杜氏盐藻营自养生活，必须依靠光合作用来合成有机物质。因此，光照对于杜氏 盐藻的生长发育至关重要。杜氏盐藻能耐强光照，对自然光的利用率可达3 1 1 ，高 于一般高等植物，这可能与大细胞藻类的细胞生理机制有关【3 0 l 。彭建新等( 2 0 0 0 ) 研 究杜氏盐藻光合特性时指出杜氏盐藻具有正常的光系统结构，并且藻细胞可诱导可逆 的光状态转换1 3 ”。s c h r e i b e r 等亦指出杜氏盐藻具有如高等植物叶绿体光系统i i 相近 的结构和功能【3 z j 。陈敏等认为光系统i i 中的捕光复合物i i ( l h c i i ) 由粕种2 7 3 1 k d 多肽构成 3 3 1 江月玲等研究蛋白修饰剂对杜氏盐藻光合速率及吸收光谱特性的影响后 指出具多酶体系和复杂蛋白结构的完整细胞的蛋白构象与光合功能存在一定的关联 3 4 1 。夏丽等研究低温条件下光抑制作用，结果发现低温提高杜氏盐藻对光抑制的敏感 是由于低温抑制了光合放氧，是光系统i i 反应中心多余的激发能增加以及光系统i i 修复循环受到阻碍的结果i 3 5 l 。彭长连等研究指出在1 0 - 3 5 的条件下，杜氏盐藻的 光饱和点2 2 0 9 m o l ( m 2 s ) 3 6 1 。夏丽等应用叶绿素荧光技术检测杜氏盐藻产生非荧光淬 灭的条件和鉴别非光化学荧光淬灭的组分后，结果表明通过增加能量耗散可以避免光 破坏光合器官的保护机带j l t 3 n 。彭长连等通过研究强光下s 0 3 2 和h c 0 3 对杜氏盐藻叶 绿素荧光的影响指出低s 0 3 2 浓度下强光的光抑制在随后的低光条件下放置2 h 后能完 全恢复，高浓度引起的光抑制不能完全逆转，低光下h c 0 3 能促进光抑制的恢复【3 8 1 。 林植芳等研究单细胞盐藻在强光前后5 0 5 n m 的光一暗差示吸收变化后，结果表明 a a 5 0 5 可作为强光下植物光保护机制运行状况的检测指标 3 9 1 。此外，杨震等比较海 洋单细胞藻对紫外吸收差异后发现盐藻的吸收峰最大 4 0 1 。h e m a n a n n 等认为杜氏盐藻 的光化学效率在全模拟太阳光下比在滤除u v - b 的情况下显著下降“1 。 在适宜的温度条件下，盐藻分裂旺盛，生长快速。古玉环等实验研究表明杜氏盐 藻的温度范围在5 - 3 5 c ，最适生长温度为2 5 - 3 0 c ，低于5 c 藻生长缓慢，细胞几乎 不增殖，当温度超过3 5 后，藻细胞会逐渐死亡【4 2 j 。 盐藻能抵御碱性环境，其细胞内的酸性液泡是一个大容量的胺缓冲系统，可以防 止细胞质碱化和光合过程解偶联的“卫士”。研究表明杜氏盐藻的最适生长p n 为9 0 左右【4 3 j 。影响和制约杜氏盐藻生长发育的气体主要有c 0 2 ，培养液中如果缺乏c 0 2 则会限制藻细胞的生长。 3 2 营养条件的研究 杜氏盐藻生长发育所必需的矿质元素有：c 、h 、o 、n 、p 、k 、c a 、m g 、s 、 f e 等l o 余种，除此之外，还需要一些如b 、i 、z n 、w 等微量元素。 杜氏盐藻是一种光合自养生物，需要无机碳作为其碳源。无机碳的溶解量与培养 液中的盐度和温度有关。对于高盐环境下生长的杜氏盐藻而言，无机碳的供给可能是 其生长的最大限制因素。2 5 、2 5 盐浓度、p h 9 0 的条件下，9 9 9 的无机碳是以 c 0 3 2 - 的形式存在，其次是h c 0 3 ，几乎无c 0 2 的存在m 】。盐藻细胞表面存在碳酸酐 酶m4 6 1 ，并具耐盐性，可使杜氏盐藻在高盐条件下能很好地吸收c 0 2 【4 7 1 。杨雪梅等 认为盐藻若以n a h c 0 3 为碳源，其浓度为l g 1 ，若以c 0 2 为碳源，其培养液的p h 值 应在7 - - 9 1 4 翻。 在杜氏盐藻的培养中，硝酸盐是最常用的氮源。m i l k o 和g r a n t 等认为n a n 0 3 是 杜氏盐藻最好的氮源【4 9 5 0 o 但盐藻对硝酸盐和亚硝酸盐的吸收利用是需要光照的。 铵态氮一般不能被盐藻吸收利用【5 1 1 。有机碳源如尿素、谷氨酰胺一般不如无机氮有效 【5 2 5 3 1 。李建宏等实验发现使用低浓度脲比硝酸盐对杜氏盐藻的生长更有效【5 4 】。王富 平等认为在盐藻培养中投入0 2 m m 0 1 1 1 0 m m o l l 的尿素，可以得到适宜的细胞生长 速率和较高的类胡萝卜素含量f 5 ”。陈晗华等认为k n 0 3 、k h 2 p 0 4 作为盐藻氮源、磷 源的最适浓度分别为1 0m l t l 0 1 1 和0 3m m o l 1 博。姜建国等实验发现 n 【p 比值在 2 5 3 0 时盐藻细胞生长速率最耐5 7 1 。 在海水环境中有足够的离子可供盐藻生长所需。杜氏盐藻生长所需的最适浓度 c a 2 + 、m 9 2 + 分别是1m m o l 1 和0 1f n r n o l 1 【5 8 】，而最适f e 离子浓度为1 2 5 3 7 5 m g 1 ， c i s 0 4 2 有利于生长的最佳比值3 2 ，有利于胡萝h 素积累的比值则是8 6 i 5 9 】。 4 杜氏盐藻细胞生物学研究 4 1 盐藻细胞壁的电镜观察 c h a r d a r d 通过细胞切片和电镜观察发现d b i o c u l a t a 藻无完整的细胞壁，但细胞 膜外有一层薄而柔软的糖蛋白纤维外被。刘广发等通过电镜观察发现d p e i r c e i 细胞 外被由不同类型的糖蛋白纤维构成：一类长约5 0 2 0 0 n m 的柔软纤维，均匀地布满细 胞的外周；另一类为长约6 0 r i m 簇状分布的纤维，呈有规则的分散排列，且这两类纤 维通常不同时出现在同一细胞上 6 0 l 。 4 2 盐藻原生质膜组成的研究 杜氏盐藻对盐的适应是一个信号传导过程，而其原生质膜很可能是信号传导的第 一站，己分离提纯的1 5 0 k d 和6 0 k d 均位于细胞或细胞膜上。这两种蛋白均是盐诱 导蛋白，有关于它们的功能尚在进一步的研究之中。k a t z 等认为质膜上的 i + 一a t p a s e 、 n a + h + 泵也在一定程度上参与渗透调节 6 1 1 ，甚至有研究者认为旷- a t p a s e 是渗透调节 的触发器岫6 3 1 0 4 - 3 盐藻原生质膜通透性的研究 杜氏盐藻缺乏细胞壁，是一个进行膜研究的良好材料。甘油是一种易透过细胞膜 的物质【矧，细胞中最终的甘油浓度是由细胞合成甘油与排出甘油达到平衡时所决定 的，但在杜氏盐藻细胞内外甘油浓度之比可高达1 0 4 ：1 6 5 1 。杜氏盐藻细胞膜对水的 通透性与其它膜无差异，但对甘