（微生物学专业论文）五氯苯酚降解菌的筛选及其降解条件研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 五氯苯酚降解菌的筛选及其 降解条件研究麦篑i 硕士 学生 姓名 学位论文 是否保密 孙强 j 茎鍪j 微生物学 薹鎏i 吴坤 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以 标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获 得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审 定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表 示了谢意。 特此声明。 导师签名： e i i i ：刃 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校 要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或 部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开河南农 业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业大学， 试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则，承担相应的 法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名： h 3 乡 日期：0 年1 月fo 曰 导师签名： 日期：济乡月角 学院领导签名： 羼羽 幽 日期：0j 年哆月f 口日 哆厶t ， q， 1司月 厂6 移惮 绺叮 生 ： 究 期 研 日 致谢 在本论文完成之际，首先向导师吴坤教授表达我诚挚的敬意和深深的感谢。 本文是在导师的精心指导下完成的。尽管导师工作繁忙，但是从课题的选定到具 体的实验安排，导师都予以耐心而细致的指导和帮助，使我能够顺利地完成此论 文的研究与实验工作。在整个论文的进行过程中，导师严格要求，一丝不苟、精 益求精的工作作风和学习态度对我产生深远的影响。在此，向尊敬的导师表示衷 心的感谢! 在实验过程中，贾新成教授、邱立友教授、陈红歌副教授、宋安东副教授就 实验中出现的问题提出过不少建议。徐淑霞老师、王明道老师、张世敏老师、赵 柏叶老师、赵玉萍老师、胡渝老师为实验的顺利进行提供了诸多便利。 从实验的开始到结束，和同学们的互相合作，使试验工作顺利进行，同时也 和他们建立了深厚的友谊。在和陈克、郑茜、高文静、王艳君等同学三年的共同 学习和生活中，得到他们很多的帮助。师弟田建军、师妹王斐、王慧琴、史小莉、 王艳颖等在实验上也给予了帮助。在此谨向关心和帮助我的老师和同学表示衷心 的感谢。 最后，谨将我的论文献给我的父母、兄妹和其他亲人以及我的妻子夏越俊。 在我三年求学生涯中，是他们无私的鼓励和不懈的支持使我顺利完成了学业，是 他们的爱使我有了应对困难一步一步走下去的勇气。最后，对关心、支持和帮助 过我的所有的老师、同学、朋友和亲人表示最诚挚的谢意! 孙强 2 0 0 7 年6 月于郑州 微生物学硕士论文 五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 摘要 五氯苯酚( p c p ) 作为重要的化工原料，被广泛的应用于农药、医药和合成材料等行业。 p c p 毒性高，化学性质稳定、残留时间长，给环境造成了严重的危害，为了保护环境需要降 解掉环境中大量存在的p c p 。而利用微生物来降解环境中的p c p 同物理、化学法相比是一种经 济有效且无二次污染的方法。但在生物处理过程中，由于p c p 的高氯代性使其难降解，需引 入具有较强降解p c p 的能力的菌种，因此对p c p 降解菌的筛选及降解条件的研究就有着重要意 义。本文研究的是环境中p c p 的生物处理方法，即以筛选高效降解菌株为主要研究内容，通 过摇瓶发酵对该菌的降解效率和影响降解的因素作了初步研究： 采用富集和协迫式培养方法筛选到一株p c p 降解细菌h p d _ 2 菌株，它能够在以p c p 为唯 一碳源和能源的培养基上生长。该菌株最适生长温度为3 0 c ，最适p h 为7 4 ，初步鉴定为 芽孢杆菌属( b a c i l l u ss p ) 。 培养基主要成分如碳源、无机盐等营养成分是影响h p d 一2 菌株生长和降解p c p 的重要影 响因子。对2 0 0 i l g m 1 1 的p c p 在3 6 h 内的降解效率可以达到1 0 0 ，在5 0 0 “g m l 。1 的情况下 3 6 h 降解效率也可达到9 3 3 以上；在温度为3 0 c ，p h 值呈弱碱性7 4 的条件下，接种3 的菌种，添加微量浓度的葡萄糖( 1 5 0 j 山g m l q ) 及0 2 的吐温一8 0 ，是职d 一2 菌株降解p c p 的最佳条件。影响h p d 一2 菌株降解p c p 的因素主次顺序为：葡萄糖浓度、温度、p h 值； 在不同温度的条件下研究了h p d _ 2 降解p c p 的降解动力学，得出了该条件下船d 一2 降解 p c p 的降解动力学方程，符合一级动力学特征。 关键词：p c p 生物降解筛选h p d - 2 菌株动力学正交试验 微生物学硕士论文 五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 1 文献综述 众所周知，土壤及水资源是人类赖以生存的主要自然资源，又是人类生态环境的重要 组成部分，没有清洁的土壤，就不可能有清洁的空气和水资源及食品安全n 1 。近些年来，随 着工农业生产的迅猛发展，我国经济取得快速发展，但同时也产生了大量的有毒有害难降 解污染物，尽管在发展的同时加紧了对这些污染物的治理，但由于种种原因，环境污染还 在加剧。随着国家可持续发展战略的实施及人们保护生态环境意识的提高，要求改善生存 环境质量的呼声日益高涨，因此，保护土壤和水资源环境，充分发挥对人类的有利影响， 已成为社会各级领导和科学家特别关注的首要任务脚。然而我们的财力又有限，如果能采用 既高效又节能或可资源化的技术，无疑对环境保护和经济的持续发展具有重要意义口1 。 微生物是地球生态系统中最重要的分解者，在自然界物质与能量的转化循环中占有特殊 的地位，发挥着重要的作用。以微生物为主的生物修复由于能够治理大面积污染而成为一种 新的可靠的环保技术，已得到世界环保部门的认可，并引起了工业界的关注，预计生物修复 服务和产品平均每年以1 5 的速度增长。生物修复在治理环境污染方面的作用已越来越突出 【4 】 氯代酚类化合物是一类有机污染物，它在农药、医药和合成材料等行业的广泛应用， 给环境造成了严重的危害，是重要的环境污染物之一，五氯苯酚是这类化合物的代表，作 为除草剂、木材防腐剂而被广泛应用。研究其环境化学行为、生物降解具有非常重要的意 义。 1 1 五氯苯酚的性质及其毒害作用 五氯苯酚( p c p ) 是一种氯代芳香族化合物，它的分子式为c 6 c 1 。o h ，结构式如图1 1 所 示。纯的p c p 为无色结晶，熔点为1 9 0 c ，沸点为3 1 0 c ，分子量为2 6 6 4 ，密度为1 9 8 7 1 0 3 k g m _ 3 。一般农药用的p c p 通常含有2 、4 一二氯酚，2 、3 、4 一三氯酚，2 、3 、5 、6 一四 图1 1p c p 的分子结构式 f i g 1 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo f 1 微生物学硕士论文五氯苯酚降解茵的筛选及降解条件的研究 氯酚等杂质，颜色呈灰暗色到棕色，常以粉粒或薄片的形式存在。常用的溶剂有二氯甲烷、 正己烷、甲醇、乙醚、稀碱、热的苯液等。因为p c p 是一种在水溶液中可解离的弱酸性有机 化合物，在水中可解离为离子态p e p ，因此在水溶液中的溶解度受p h 变化的影响很大，随 p h 升高，离子态p c p 浓度增大，使p e p 在水中总溶解度增大哺1 。 毒理学研究表明，p c p f l 皂直接作用于机体的能量代谢，使细胞膜对质子的通透性增加， 使氧化磷酸化耦联中断，即刺激细胞氧化而抑制其磷酰化作用，从而导致跨膜p h 梯度和电势 的丧失1 ，氧化产生的能量不能通过磷酰化转为三磷酸腺苷( a t p ) 或磷酸肌酸的形式储存， 而以热能的形式散发，机体因缺乏生理活动所需的能量而致肌肉收缩无力，对刺激反应迟钝， 直至完全抑制呈僵直麻痹状态。患者出现体温调节中枢失调，新陈代谢亢进伴高热，并由此 造成中枢神经系统和心、肝、肾等脏器的损害。更为重要的是，五氯苯酚化合物能够通过食 物链在生物圈中累积富集，从而大大加剧了它的污染性h 1 。有研究表明五氯酚对各种哺乳动 物最低致死剂量：l d s o ：5 0m g k g ( 大鼠经1 1 ) ：1 0 5m g k g ( 大鼠经皮) ；7 8m g k g ( 1 橄榄油 液) ( 大鼠经口) ；7 0m g k g ( 5 橄榄油液) ( 兔经口) ；人经11 2 9m g k g ，。五氯酚钠对人的刺激 阈为0 6 0m g m 3 。对人各种途径的急性致死量约为2g 。致死量及中毒程度受气温的影响 尤为明显。 在实验中还发现，p c p 不但对生物有直接的毒害作用，它还可以间接地影响有机土层中 的含水量和土壤、水体的p h 值，从而改变生态环境，影响生物的正常生活规律埔1 。p c p 对微 生物生长速度的影响分两个方面，当p e p 的浓度在抑制范围之下时，微生物的生长速度会 与p c p 浓度成正比；当p c p 浓度超过基质抑制浓度时，微生物的生长速度就会受到抑制而逐 渐减慢旧1 。基质的毒性对微生物的伤害程度可用半致死量l d s o 来表示。不过，l d 朝是一个条件 值，不同的微生物种群由于驯化的程度不同其l d 值不同n 引。p a l v lm m 等人分别研究了多 种不同氯酚类化合物对微生物的毒性影响后发现，氯化程度越高的氯酚其e c 越低对微生物 所产生的毒性越强n ，故本试验所研究的p c p 是酚类化合物中毒性最强的。 1 2 环境中五氯苯酚的来源及现状 五氯苯酚作为重要的化工原料，自2 0 世纪3 0 年代以来在全世界范围内被广泛使用。我国 从2 0 世纪5 0 年代开始，p c p 就被作为灭钉螺常用药物在血吸虫病疫区大量地使用。当p c p 作为 灭钉螺剂被广泛地洒入河流、湖泊和田间，一方面达到了灭螺防病的目的，另一方面却由于 其在环境中具有一定的持久性和生物累积性，导致大量的p e p 残留在环境中。1 9 8 5 年，据 c r o s b y 报道，全世界p c p 的产量达n 5 0 1 0 4 吨，当时我国p c p 及其钠盐的年产量接近1 0 x 1 0 4 吨，相当于全世界总产量的2 0 n 羽。由于p e p 具有很强的“三致”( 致癌、致畸、致突变) 效应，已被美国国家环保局( u s e p a ) 列为优先污染物，并被北美和加拿大列入地区控制的 持久性有机污染物黑名单中u 引，于是近年来发达国家p c p 的生产量和使用量都大幅削减。目 前我国血吸虫疫区虽己停止施用p e p ，但以往施用的p e p 对环境的影响还会持续很长的时间， 2 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 仍存在较严重的p c p 土壤和沉积物污染，在地表水和地下水环境中亦检i 贝! | 至u p c p 的存在，值得 关注的是，其生物毒性通过食物链进入人体，有进一步富集放大的危险n 劓。虽然在农业上p c p 已基本停止使用，但在化工行业仍少量使用，同时作为五氯苯酚污染源之一的五氯苯酚钠， 现仍被大量用于木材防腐工业，造成木材防腐工厂周围土壤及水资源的严重污染，将在相当 长的一段时间内对生态系统和人体健康构成威胁n5 1 。王宏等对海河流域几种典型优先控制 有机污染物的环境安全性分析时发现，p c p 的环境实测浓度值已经是无影响浓度值的8 0 4 倍u 引；尽管洞庭湖地区已停止使用p c p ，但张兵等人在对洞庭湖水体和沉积物中的p c p 进行 测定时，发现湖水中p e p 的含量在0 0 0 5 垤l 7 1 3 1 ，沉积物中p c p 的含量在 0 1 8 p g g - l - 一4 8 3 l a g g ，其含量值显著高于四川、江苏、福建以及全国用药区的平均值n 7 1 。 世界上其它地方p c p 的污染现状也不容乐观，a j c e s s n a 等人调查了加拿大的三个地区空气 中p c p 的含量后发现：其中有两个地区空气中p c p 的平均含量为0 3 n g m - 3 ，在另外一个地区 p c p 的平均含量为1 5 3 n g m q n 引；1 9 9 4 年t h o m p s o n 等报道了加拿大的s a s k a t c h e w a n 地区， 在非职业暴露人群中，尿中所含有的p c p 的浓度平均达到1 6 p g l ，最低含量也超过 0 2 p g l - 1 。 1 3 环境中五氯苯酚的处理方法 1 3 1p c p 的物理降解 在众多的p c p 的物理降解方法中，由于光电、超声波等处理过程具有时间短、处理量大 的特点，适用于p c p 污染严重的地区，获得较多的关注。 土壤中p c p 的光降解一般指发生在土壤表面与光线接触的部位，所以作用并不大。多数 关于p c p 光降解的研究都是在水相中进行的。p i c c i n i n ip 等认为p c p 的光解主要是利用光 催化剂加速紫外光的光解作用。水中p c p 的光解历程主要是伽取代c 1 ，导致后续氧化反 应生成醌衍生物，主要产物类型是p e p 上去除一个氯原子的物质 2 0 。同时也有研究者发现， 由于化合物的酸性越强，其解离常数越大，越容易生成阴离子，而酚阴离子对3 1 0 n t o 以上的 光( 太阳光谱) 吸收强导致酚转变成为阴离子时使其容易发生光降解作用，所以在p h 3 0 或 5 0 的含有f e 3 + 或含f e 3 + + 腐殖酸的溶液中，p c p 与铁形成复合物，能促进p c p 的光降解。 张春桂等研究发现，p c p 在紫外光照射下迅速降解，同时伴有c 卜产生并导致溶液p h 下降， l o o g g g - 1 的p c p 溶液，光解的半衰期为8 5 h 2 1 j 。k o s h i o k a 等用氛灯照射3 3m i n ，溶于 正己烷中的1 0 0p p m 的p c p 在2 9 2 i n m 降解速率最大，i 0p p m 的p c p 在2 5 2 6 - 3 1 8 6n m 时 降解速率最大。在降解过程中，p c p 可发生脱氯反应，部分氯原子还与溶剂发生基团取代反 应 2 2 。 w e a v e r s 和p e t r i e r 等人分别研究发现，当用两种不同频率的超声波考察五氯酚的声降 解作用时，高频率的降解效果明显好于低频率的；同时也发现，0 h 的存在可以促进五氯酚 降解速度的加快。反应历程因频率和五氯酚浓度的变化而变化乜3 矧。宋勇、戴友芝等2 0 0 5 3 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 年研究表明，对五氯苯酚的降解超声波与零价铁具有明显的协同作用。协同体系中五氯苯酚 的降解速率比单独用超声波处理提高5 6 7 倍瞳5 1 。 在受污染土壤的修复中，由于有机氯代化合物如p c p 酚羟基上的负电荷与土壤颗粒表面 电荷之间的相互吸引产生的对土壤基质强烈的亲和力降低了传统的水注入修复法的修复效 率。蒸汽注入法( s t e a mi n j e c t i o n ) 是通过注入水蒸气，使地下水的温度升高从而增加了p c p 在水中的溶解度。2 5 i c 时p e p 的溶解度为2 1 4 士1m g l - l ，4 6 8 c 时p c p 的溶解度为 8 6 2 士1m g l q 啪1 。温度升高时，p c p 更倾向于水相而不是土壤，当水蒸气注入到含水土 层中时，p c p 更易去除。提高土壤温度的途径，如电极加热、注入热水、注入水蒸气等都有 益于提高水注入修复法修复手段的效率。利用水蒸气去除挥发性有机物的实验已有一些报 道，但是通过加热去除半挥发性有机物( 如p c p ) 的研究则几乎没有。在台湾的台南，目前正 在研究向蓄水层注入热水加热土壤基质这一看起来很有前景的修复手段的可行性。 1 3 2p c p 的化学降解 虽然关于p c p 的化学降解在温和的条件下，如中性p h ，室温常压，非真空，没有昂贵的 试剂和特殊反应装置等条件下，p e p 完全降解还鲜见报道。但是对p c p 的化学降解的研究包括 f e n t o n 试剂降解，电解，超临界水氧化以及脱氯降解等研究仍较多瞳引。在肯定这些研究取得 一定成绩的同时，也让我们看到没有一种方法是可以广泛加以推广的。 近年来，在研究p c p 的化学降解过程中氧化降解法被越来越多的用于修复五氯酚污染过 的土壤和水体。f u k u s h i m a 和t a t s u m i 在研究双氧水溶液中光一芬顿试剂降解p c p 的特性和历 程时发现，向溶液中加入f e 3 + 和腐殖酸可以通过光一芬顿反应( p h o t o f e n t o n ) 生成羟自由 基，对于有机物质来说，羟自由基是很强的氧化剂，对水体和土壤中有毒化学物质的降解有 重要的作用。同时通过暗一芬顿反应研究助溶剂对p c p 去除效率的影响时发现，在仅有腐殖 酸存在的条件下p c p 的去除并不是羟自由基的作用，而是受到氯代苯氧类物质生成的过氧自 由基的攻击；在仅有f e 3 + 存在的条件下，光照去除p c p 与羟自由基有关。f e 3 + 一羟基复合物降 解释放羟自由基是酸性溶液中发生的重要反应，因此在p h 为3 或5 时，仅有f e 3 + 存在时，p c p 的去除与羟自由基有关。p c p 的光降解与p c p - f e 3 + 和p c p f e 3 + 一腐殖酸的浓度有关，且复合物 的浓度随p h 的升高而升高。因为过氧化氢是腐殖酸一光激化产生的活性中间产物，而羟自由 基是过氧化氢与f e 3 + 反应生成的。也就是说，通过光一芬顿试剂反应去除p c p 需要有大量的f e 2 + 的存在。此外，f e 3 + 被腐殖酸光还原是在酸性条件下得到促进的，因此酸性条件下p c p 的有效 去除应归功于f e 争的光还原啪1 。b r i l l a s 等也发现p c p f e 3 + 复合物的暗一芬顿试剂降解的速 度要慢于光一芬顿试剂反应。这说明在仅有f e 3 + 存在的体系中，p c p 的氧化降解是f e 3 + 的光还 原造成的，而在f e 3 + 和腐殖酸共存条件下，p c p 的氧化降解是由于光导致的芬顿反应造成的【捌。 羟自由基以一种非选择性的方式与有机污染物进行反应，并最终将其矿化。高级氧化去 除p e p 的过程正是以这种羟自由基为基础的。有关p e p 的自由基降解己有一定的研究，如 f e n t o n 反应，直接光化学降解，过氧化氢的光降解，f e n t o n 试剂辅助的光化学降解，以t i ( h 4 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 作为催化剂的光催化降解及声化学降解等，但多数都是以水体系为研究对象。直接光化学降 解是一个非常慢的过程，辅助光化学降解( 如过氧化氢的光解和f e n t o n 试剂) 则需要向待处理 的污染体系添加一些化学物质( 如t i 晓) ，光催化降解是一种很有效的过程，但是在处理结束 后必须除去添加的t i 0 2 颗粒。因此，以电化学引起的高级氧化过程开始引起人们的重视，它 以f e n t o n 试剂生成羟自由基为基础，i 2 0 2 + f e 2 + 一f e 3 + + o h + 0 盯，但高级氧化过程中的自由基 是通过电化学反应在原位生成的，它与p h o t o - f e n t o n 过程类似，因此这个过程被称为电一芬 顿反应( e l e c t r o f e n t o n ) 2 8 oo t u r a ne ta l 发现，在反应过程中，当p c p 及其衍生物已完 全消失后，仍然不断有氯离子释放出来，说明芳环打开后生成的脂肪族化合物上的氯原子也 在不断的释放出来。p c p 通过矿化降解的速度明显的低于2 ，4 - d 和a 一硝基酚，这可能是因为 在p c p 的苯环上，所有的位置都已被取代，羟自由基难以找到适合的位置进行攻击，因为羟 自由基加成到已被其他取代基占据的位置要难于未被取代基占据的位置。e l e c t r o - f e n t o n 过程可以有效的、无选择性的矿化有机污染物，如2 6 p p mp c p 经过e l e c t r o - f e n t o n 过程处理， 可使其浓度降低到0 5 p p m 以下。从生态和经济的角度讲，原位电化学催化生成f e n t o n 试剂的 方法要显著的优于p h o t o - f e n t o n 和c h e m i c a 卜f e n t o n 过程啪1 。 五氯酚的催化加氢脱氯是将五氯酚放在密闭的体系内在催化剂的作用下转化为可再利 用的物质。这一技术目前还在探索阶段，但是在液相和气相中以氯苯和氯酚作为典型反应物， 以钯、铂和镍为催化剂的研究已有报道口：m o r a l e s 等研究发现以p d 作为催化剂m g 可使体 系中的p c p 彻底清除，且反应产物只有环己醇和环己酮m 1 ；据范经华，范彬等报道，以多孔 钛板负载钯作为阴极，通过电催化加氢还原水中五氯酚。5 h 后，2 0 0 0 m l 浓度为h m o l l 的p e p 被降解达9 5 以上m 1 。 1 3 3p o p 的生物降解 目前，p c p 的生物修复措施倍受世界各国的重视，并正在进行广泛深入的研究。包括p c p 污染的植物修复技术研究、微生物修复技术的研究和动物修复技术的研究。 1 3 3 1p c p 的植物降解 植物修复可以通过根截获、叶表挥发和植物降解的方法去除p c p 。如利用植物过滤带作 用对粘土中p c p 的去除和降解具有促进作用，某些植物根可以增加p c p 在土壤表层的固定作 用，从而减少其对地下水的污染m 1 。高创新等采用水池栽培水葱，研究了该植物对土壤中 p c p 的生物富集能力结果表明，供试污染土壤中五氯酚的起始浓度为2 0 0 0 0 0l ig k g - 1 ， 经3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0d 后种植水葱培养池土壤中五氯酚的含量分别为起始浓度的2 8 3 4 、 1 0 3 、0 8 6 和0 0 8 8 1 而对照未种植水葱的培养池土壤中五氯酚的含量分别为起始浓度 的9 5 0 9 、8 1 1 7 、7 1 3 2 和6 3 7 5 n 删；另外，植物根际一土壤微生态系统中的一系列代 谢过程对p c p 去除有着不可忽视的作用，通过比较了p c p 在本体土壤中和根际上壤中的矿化 降解速度表明，植物的存在对土壤中的p c p 的降解具有促进作用引。我国野生植物资源丰富， 生长在天然的污染环境中的野生植物不计其数，可在污染的土壤上栽种对p c p 吸收力高、耐 5 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 受性强的植物，应用植物的生长吸收以及根区修复机理( 植物一微生物的联合作用) 从土壤中 去除p e p 或将p c p 予以固定。因此开发与利用这些野生植物资源对植物修复的意义十分重大。 1 3 3 2p c p 的微生物降解 众所周知，微生物降解既是自然环境中有机污染物转化的重要途径之一，也是有机污染 物污染控制与污染环境修复的有效技术方法。土壤和水体中存在着各种微生物，在污染物侵 入后，可出现一个天然的驯化选择过程。一些特异的微生物在污染物的诱导下可产生分解污 染物的酶系，直接或通过氧化、还原、转化、共代谢作用将污染物降解和转化为低毒或五毒 的代谢物；环境微生物修复技术主要f l j _ - 方面的内容组成潞剜：( 1 ) 利用土著微生物代谢 能力的技术；( 2 ) 活化土著微生物分解能力的方法；( 3 ) 添加具有高速分解难降解化合物 能力的特定微生物( 群) 的方法。 1 3 3 3p c p 的动物降解 有关p c p 动物降解的报道很少。动物降解可以通过在p e p 污染的土壤或水体中养殖蚯蚓等 小动物，依靠它们吸收、利用p c p 转化为代谢物而达到降解p c p 的目的。我国最近的研究报道 了蚯蚓对土壤中有机氯农药具有生物富集的功能n 叫。 1 4p c p 的微生物降解 1 4 1 生物强化技术 目前，在环境工程中主要是利用环境固有微生物降解污染环境中的污染物质，以修复受 污染的环境1 。然而这些微生物生长速度太慢，代谢活性不高，而且污染物负荷高还会造成 固有微生物的数量下降。同时，随着生产方法和科学技术的发展，有毒、难降解有机污染物 的种类和数量日益增多，对该有机物具有高效降解能力的微生物在自然环境的种类、数量都 较少，在种间竞争中处于劣势，导致传统的生物处理无法达到要求。及人类工业生产中合成 的一些异生化合物，它们的结构不易被自然界中固有微生物的降解酶系识别，需要用目标降 解物来驯化、诱导以产生相应的降解酶系，从而筛选得到高效菌种，这种方法在自然状态下 需要经历很长时间。为了提高污染物尤其是难降解污染物的处理量和去除率，需要开发出一 系列新的生物处理技术，微生物强化技术就是在这种情况下提出来的h 1 1 。 生物强化技术是为了提高系统对染物的处理能力，投加从自然界筛选出的优势种群或通 过基因组合技术产生的高效菌种，以提高污系统内生物处理效率，以去除某一种或某一类有 害物质的方法。它通过向自然菌群中投加具有特殊作用的微生物来增加生物量，以强化对某 一特定环境或特殊污染物的去除m 1 。微生物具有分布广泛、数量巨大、代谢类型多样和适应 突变能力强的特点，因而任何存在污染物的地方都会出现相应的降解微生物，并存在或强或 弱的生物降解作用啪1 ，通过驯化、筛选、诱变、基因重组技术等可获得高效菌种，再经培养、 繁殖可得大量的高效降解菌，用于目标污染物的治理。生物强化技术的核心是投加高效微生 物，这些投加的高效降解微生物一般满足3 个基本条件：所投加的菌体活性高、菌体能快速 6 微生物学硕士论文五氯苯酚降解茵的筛选及降解条件的研究 降解目标污染物、具有竞争能力且能维持相当的数量。投入的菌种与目标污染物之间的作用 主要有直接微生物降解和共代谢作用。 ( 1 ) 直接微生物降解。菌种投入处理系统以去除目标污染物。主要来自三个方面：直 接从被污染的环境或污泥中富集、筛选。例如，由于石油污染、海上油轮事故和来源于大气 沉降的多环芳烃，海底沉积了大量的石油组分，成为天然的富集驯化场所，因此可以从海底 沉积物只筛选到降解石油组分特别是多环芳烃的高效降解菌株h 引；狄军贞，王显军等报道， 从煤气厂废水处理设施的活性污泥中筛选出一种降酚能力较强的假单孢菌菌株，其最佳降酚 率为9 8 1 1 。随着外加碳源的质量浓度增加，其降酚率也增加，说明该菌有一定适应冲击负 荷变化的能力h 4 1 。通过较长时间的驯化，诱导出自然界中已经存在的微生物产生能对特定 化合物进行降解的代谢途径和代谢酶类，从而获得这些物质的降解菌种；宋吴，何泽超等采 用选择性富集培养技术，以逐步提高苯酚浓度的方式从受苯酚污染的环境中驯化出六株具有 较高降解能力的微生物菌株，它们以苯酚为唯一碳源生长，4 8 小时内降解苯酚可达 1 0 0 0j 1 9 m 1 1 h 引。通过基因改良技术改造微生物的降解特性，可使其降解性能得到显著提 高或者获得新的降解性能。主要包括a 质粒育种：即将两种或多种微生物通过细胞结合或融 合技术，使供体菌的质粒转移到受体菌体内，使受体菌保留自身功能质粒，同时获得 选择珂染环境 1 l 分离适应性菌 土 选择特殊降解性菌 ll + l 反复适应和驯化遗传修饰l 上j r 进步筛选 1 l 培养高效菌株 1 l 繁殖 上1 l1 l 直接固定生物 投加化微强化 高效生物制剂 菌 图1 3 高效降解菌的生产流程 f i g 1 3p r o d u c t i o no f b e s tb a c t e r i u m 7 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 时获得供体菌的功能质粒，即培育出具有两种功能质粒的新品种。这已在环境工程中获得初 步研究成果：如d a f r i e l l o 等报道，通过质粒转导技术将这些质粒转移到同一株细菌中构 建出能同时降解芳烃、萜烃、多环芳烃和脂肪烃等石油组分的菌株1 ：q 5 t 工程菌是将嗜温 的p s e u d o m o n a sp u t d ap a 订和嗜冷的q 5 菌株融合，使前者体内降解甲苯、二甲苯的t o l 质粒 转移入q 5 菌株体内构建而成，该菌在0 仍能正常利用浓度为1 0 0 0 “g m l 。1 的甲苯作碳源，这 对寒冷地区的废水生物处理很有意义h 。b 基因工程构建：现在，利用基因工程获得了分解 多种有毒物质的新型菌种。例如，将降解氯化芳香化合物的基因和降解甲基芳香化合物的基 因分别切割下来组合在一起构建成工程菌，使它同时具有降解上述两种物质的功能；f j m o n d e l l o 等报道，通过定点基因突变技术提高降解菌株的底物范围与活性1 。 ( 2 ) 共代谢作用。即微生物在有它可利用的惟一碳源存在时，对它原来不能利用的物质 也能分解代谢的现象m 1 。对于一些有毒有害物质，微生物不能以其为碳源和能源生长，但在 其他基质存在下能够改变这种有害物的化学结构使其降解。如利用共代谢微生物甲烷氧化菌 修复三氯乙烯( t c e ) ，添加甲烷可以增加微生物浓度从而使t c e 的降解速度提高，该方法已 应用于t c e 污染的现场修复中试试验中眦5 1 1 。 共代谢作用可以提高微生物的降解效率。g r a v e 等发现，漂白厂的废水对产甲烷菌有抑 制作用，但当用甲醇或乙醇作一级基质时可以提高对废水中难生化有机卤化物的去除率澉1 。 共代谢作用主要有3 种类型：a 生物在正常生长代谢过程中对二级基质的共同氧化。这种代 谢是指当一级基质存在时，一级基质的代谢能够提供足够的碳源和能源供微生物生长并诱导 产生相应的降解酶来降解二级基质。施汉昌等的研究表明，补充碳源，可以提高啤酒废水污 泥对氯酚的降解作用哺引。付莉燕等考察了厌氧条件下废水中活性染料( 活性翠蓝) 的生物降 解，发现以活性翠蓝为单一碳源时，厌氧菌不能降解活性翠蓝，但在进水中补充葡萄糖后， 厌氧菌对葡萄糖和活性翠蓝产生了共代谢作用，活性翠蓝被降解瞰1 。b 微生物间的协同作 用。这种代谢是指有些污染物的降解并不导致微生物的生长和能量的产生，它们只是在微生 物利用一级基质时由微生物所产氧化物进而被另一种微生物利用并彻底降解。例如，在用苯 甲酸单独培养普通的脱硫弧菌属和铜绿假单胞菌属时，二者均不能利用苯甲酸，但当在含有 苯甲酸和s 0 2 - 的基质中共同培养时，苯甲酸即可彻底被生物降解，同时s 0 2 - 被还原为h 。s ；生 物膜或颗粒污泥的形成能有效地发挥微生物间的协同作用，提高生物降解率嘞1 。c 一级基 质不存在时休眠细胞对二级基质的利用。翟福平研究了氯苯类有机物的生物降解，分别用氯 苯、邻二氯苯、间二氯苯、对二氯苯、1 ，2 ，4 一三氯苯溶液驯化污泥并使其中微生物处于 内源呼吸阶段，然后用这些污泥对这5 种有机物在不同浓度下的降解进行了研究，发现用氯 苯、邻二氯苯、间二氯苯溶液驯化的污泥，能够有效地相互降解，它们诱导的酶系统具有一 个共同特征，即要求被作用的二级基质苯环上至少具有一个“连续三空结构”；由于对二氯 苯、1 ，2 ，4 一三氯苯缺乏“连续三空结构”，故不能被由上述3 种有机物驯化的污泥降解， 而用这2 种有机物驯化的污泥诱导的酶系统，作用的二级基质范围更宽，只要求二级基质苯 8 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 环上至少具有一个“连续二空结构”即可，所以用这2 种有机物驯化的污泥能够降解所有受 试的5 种有机物侧。由此可见，共代谢作用在氯代苯的生物降解中能发挥重要作用，因此可 考虑利用此技术来驯化和富集高效降解菌株。 1 4 2 降解p c p 的主要微生物类群 目前发现的能够降解p c p 的微生物类主要有见表1 1 表1 1 降解p c p 的微生物 ! 璺垒! 皇：! ：! b 曼堕i 里! 旦垒皇璺型曼墨! 墨垡l 盟墨里 革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌真菌 1 4 3p c p 的代谢途径 在研究p c p 的降解代谢过程中还原脱氯作用被研究的最多也是最常见代谢方式，这是由 于厌氧菌除具有高效催化还原性脱氯反应的大量低氧化还原电位辅助因子和酶之外，一些厌 氧微生物经过进化具有了利用特定的有机卤化物作为最终电子受体的能力 5 7 o 厌氧混合菌对 五氯酚的降解过程为五氯酚脱去氯原子依次转化为四氯酚、三氯酚、二氯酚和氯酚后，生成 苯酚，并最终得到矿化。b r o y d ，m i k e s e l l 和w o o d s 等分别在用厌氧活性污泥对p c p 降解过 程中发现羟基邻位的氯原子较间、对位的容易被取代：n i s h i n o 等在经p c p 驯化的产甲烷 茵对c p s 还原脱氯时有相似的结论：在驯化1 0 天的产甲烷茵的作用下，p c p 的脱氯主要发 生在羟基邻位，当驯化时间为6 个月，p c p 的脱氯可在邻、间、对三位同时发生嘲1 ；b o u c h a r d 等从混合菌群中分离出一株纯化菌d e s u l f i t o b a c t e r i u m f r a p p i e r i ，该菌可通过邻位、问位 和对位脱氯的方式将五氯酚转化为3 一氯酚哺引。然而微生物种群不同，环境条件不同，相同 化合物会显示不同的代谢途径我国周岳溪等研究了升流式厌氧污泥床反应器在中温条件下 处理含p c p 废水时，检测结果表明，p c p 厌氧降解途径是首先经间位脱氯生成2 ，3 ，4 ，6 - t e c p ， 进一步间位脱氯生成2 ，4 ，6 - t c p ，然后经邻位脱氯生成2 ，4 - d c p ，再经对位脱氯生成邻氯 9 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 苯酚，最后矿化生成甲烷和二氧化碳啪1 ；m a g a r 等在富含产甲烷菌反应器中考察了五氯酚降 解历程：五氯酚在间位上脱氯变成2 、3 、4 、6 一四氯酚，约7 5 的2 、3 、4 、6 一四氯酚间位 脱氯而成2 、4 、6 一三氯酚，然后在反应中生成4 一氯酚，剩余的2 、3 、4 、6 一四氯酚进行邻 位脱氯而成为2 、4 、5 一三氯酚，进一步邻位脱氯成为3 、4 一二氯酚，并认为可以用空间位阻 效应解释这种现象1 。徐向阳等则发现五氯酚可依次还原脱氯形成2 、4 、6 - t c p 、2 、4 一二 氯酚、4 c p 或苯酚，降解过程遵循一级反应动力学嗽1 。而w i l s o n 等认为最终生物降解为3 一 氯酚旧1 。 也有研究表明，大多数情况下，五氯酚可进行厌氧降解，但同样也可以进行好氧降解旧1 。 不同种类的细菌由于其自身降解污染物的生化机制不同，使得五氯酚的降解途径多样化。细 菌r h o d o c o c c u s 降解的第一步为需氧和n a d p h 的酶催化，脱去对位的氯，生成四氯对苯二酚， 再经过一次羟基化和三次还原性脱氯以后形成1 ，2 ，4 - 羟基苯旧朋1 。而s p h i n g o m o n a s c h l o r o p h e n o l i c a 降解五氯酚的过程是先转化p c p 为四氯苯醌，而后再被还原为四氯对苯二 酚。生成的四氯对苯二酚，经过两次脱氯转化为2 ，6 一二氯氢醌，并最终通过间位裂解途径转 化为2 一氯马来酸乙酸盐的双加氧酶7 例；r e d d y f l 报道了白腐真菌p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m 脱去五氯酚中全部氯元素的过程。五氯酚首先氧化脱氯形成四氯苯醌，苯 醌经由两条平行且交互联系的路径继续代谢，一条是苯醌首先还原为四氯对苯二酚，再经过 四次还原脱氯生成对苯二酚；另一条是经羟基化作用，最终形成羟基苯，在开环之前，脱 去所有氯原子嘲，。 z e l l e s 等认为p c p 的还原主要是通过生物矿化成c o z 。p c p 的脱氯过程在硫酸盐还原和甲 烷生成的条件下受到促进，而在反硝化条件下受到抑制嘲1 。在上述三种相同的条件下，加入 乳酸盐、丙酮酸盐和醋酸盐等能促进p c p 的脱氯，加入锰氧化物能减缓脱氯的速度，而加入 f e c l 3 贝1 抑制脱氯。土壤中加入乳酸盐可导致甲烷的大量生成，锰氧化物次之，而f e c l 。的促 进作用最小h 们，因此认为产甲烷条件下，p c p 的微生物降解受到促进。但d e l a u n e e 等的实验 表n 刃p c p 的降解速率随o r 势的降低而降低h 。i d e 等则认为p c p 在好气和厌气条件下都可发生 降解和转化，好气条件下，p c p 转化首先生成五氯苯甲醚，但是3 0 天后这两种物质的7 5 都已 消失h 羽。同时，i d e 等第一次证实，四氯酚( t e c p s ) 和三氯酚是厌氧微生物还原p c p 的产物； 脱氯的速度与电子供体( 全碳、全氮、有机氮的矿化速率) 的供给和微生物量密切相关，例如 酵母提取物能促进p c p 的降解，而( n h 4 ) z s 0 4 ，n h 4 n 0 3 ，尿素没有影响。向有机质和微生物量 含量低的土壤中加入蛋白质电子供体也可以促进p c p 的还原脱氯。在水稻土中，脱氯是p c p 降解的主要途径，且微生物所起到的作用大于土壤的其它化学因素。 在水环境中，p c p 主要结合于沉积物或水中飘浮的颗粒物上，生物降解主要发生在沉积物或 颗粒物的表面，p c p 的半衰期为几小时几天，p c p 微生物降解的代谢途径是首先水解生成 2 ，3 ，5 ，6 一四氯代氢醌( 2 ，3 ，5 ，6 一t e t r a c h l o r o h y d r o q u i n o n e ) ，继而是一系列的脱氯步 骤，然后生成3 一o x o a d i p i ca c i d ，最后分解为c 0 2 和c 1 1 m 1 。 l o 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 总结前述好氧微生物和厌氧微生物对五氯酚的降解途径( 如图l - 2 所示) 可以看出，五 氯苯酚通过脱氯和开环两种过程进行生物降解。五氯酚首先脱氯转化为低氯代产物，进一步 开环得到降解或矿化。因此脱氯就成为五氯酚降解的关键步骤。在五氯酚的生物脱氯中有两 种基本的脱氯机制，第一种是氧化脱氯机制，即芳香环被氧化并脱去氯取代基的过程。细菌 & c h l o r o p h e n o l i c a 和真菌p c h r y s o s p o r i u m 分别在单加氧酶和过氧化物酶作用下，使五氯 酚脱去第一个氯原子转化为四氯苯醌就是典型的氧化脱氯作用。第二种是还原脱氯机制，化 合物得到电子的同时氢原子取代氯原子并且释放出一个氯阴离子。尽管大多数还原脱氯都是 在厌氧环境下进行的，但在一定条件下，好氧微生物也可以发生还原脱氯。 & c h l o r o p h e n o l i c a 和p - c h r y s o s p o r i u m 均可通过还原脱氯方式将四氯对苯二酚转化为低氯 术壬术引术 瞳中正 佃 帼 硒一一旷壬节壬 硒一一钞壬o _ 秒 嫩一众一a a 一泠q 一肆a pba q b qa i a 鹏+ a 1 一0 一q 图1 2 五氯酚的降解途径 f i g 1 2t h ed e g r a d a t i o np a t h w a yo f p c p 代芳香化合物。四氯对苯二酚的氧化反应产物中没有脱氯产物生成，也说明了还原脱氯是 p c t w y s o s p o r i u m 对五氯酚进一步降解中的主要脱氯方式嘲1 。 1 4 4p c p 降解微生物的应用 基于厌氧微生物对五氯酚的还原脱氯降解机理，一些研究者尝试了应用厌氧污泥或培养 物修复土壤和水体中沉积物：m i k e s e l l 等( 1 9 9 8 年) 试验发现，厌氧污水污泥作为生物修复 的生物强化剂，当使用量为5 9 k g 时，在2 8 - 3 5 天内可将受污染环境中的p c p 从l o - 3 0 m g k g 降 至0 5 m g l 【g 。污泥使用量增加，能明显强化p c p 降解速度盯鄙；b e a u d e t 等用厌氧生物降解污染 水体和土壤中的p c p ，保持温度在2 9 c ，3 0 天可以降解9 0 以上的p c p h 引：李海英等认为降解 8 0 腿g - l p c p 时的最适温度为3 2 c ，较佳的p h 值范围为6 8 - 7 2 口钉；d a i 等研究发现，带隔板 的厌氧生物反应器可以抵御五氯酚钠的高浓度冲击，这种反应器可以承受的高浓度冲击负荷 为正常操作条件下的1 0 倍以上h 引；w i l s o n 等厌氧降解p c p 得到大约等摩尔浓度的氯酚，这是 p c p 转化为其它氯酚的效率较高而且操作较稳定3 1 ；k h o d a d o u s 等( 1 9 9 4 年) 采用溶剂冲洗 从f e b ( 厌氧附着膜膨胀床) 工艺修复p c p 污染土壤，试验发现在土柱中采用5 0 朴7 5 乙醇作 为冲洗剂，连续冲洗可最大限度地从受污染土壤( p c p l o o m g 1 【g ) 中去除p c p ，使流出液中p c p 浓度降至检出限以下。玛1 。在厌氧条件下，外加碳源和形成颗粒污泥对处理五氯酚也有重要的 影响：h e n d r i k s e n 等的研究结果表明，增加葡萄糖有利于微生物利用底物并刺激脱氯反应、 弧吖明 微生物学硕士论文五氯苯酚降解菌的筛选及降解条件的研究 稳定反应器的运行