（有机化学专业论文）几种α葡萄糖苷酶抑制剂的协同作用研究.pdf

中山人学硕士学位论文 论文题目：几种弘葡萄糖苷酶抑制剂的协同作用研究 专业：有机化学 硕士生：张雷 指导教师：马林教授 摘要 糖苷酶在自然界中广泛分布且种类繁多，几乎存在于所有的生物体内，在人 类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。 弘葡萄糖苷酶在机体的许多代谢过程中起着关键性的作用。近年来的研究表 明，它与许多因代谢紊乱失调而引发的疾病如糖尿病、肥胖病等有密切的关系， 同时由于弘葡萄糖苷酶参与与糖蛋白中n 糖链的加工，因而在病毒感染以及肿 瘤的亲润和转化过程中占有重要的地位。因此，寻找合适的抑制剂用于调节和控 铝l j a - 葡萄糖苷酶的活性，对有关疾病进行防治，具有重要的临床意义。 目前，由于天然产物的资源丰富性及其高效低毒性，对开发毋葡萄糖苷酶抑 制剂类药物的研究热点逐渐由人工合成的化合物转向天然产物。我国中医药资源 丰富，中医治疗糖尿病的历史悠久。 多种常用中药的提取物也能显著抑n a - 葡萄糖苷酶的活性。但是当把这些成 分一一分离出来之后，其抑制效果均低于粗体物，说明中药的某些成分可能与有 效成分作用于一个靶点的不同部位，从而产生协同抑制作用。在我们所服用的中 药制剂大多数属于水煮煎制而成，汤药中含有较高浓度的糖以及微量元素，为了 证实，糖、微量元素与有效成分对酶的协同抑制作用，本文测试了一些金属、糖 类、黄酮类化合物对骆葡萄糖苷酶的抑制作用，并从中选取了c u 2 + 、z n 2 + 、葡萄 糖、木糖与槲皮素对酶的协同抑制作用，通过用两种方法来确定它们之间是否存 在协同作用。 i l l 中山人学硕上学位论文 关键词：弘葡萄糖苷酶协同抑制作用 i v 中山人学硕j ：学位论文 t i t l e ：s y n e r g e t i ci n h i b i t i o no fs o m e i n h i b i t o r so n d ，- g l u c o s i d a s e m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：l e iz h a n g s u p e r v i s o r ：p r o l i nm a a b s t r a c t g l y c o s i d a s e sa r eu b i q u i t o u si nt h el i v i n gw o r l da n da r ei n v o l v e di nc a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m t h e r eh a sb e e nw i d e s p r e a di n t e r e s ti ng l y c o s i d a s e si nr e c e n ty e a r s ， l a r g e l yd u et ot h e i rr o l en o to n l yi nam u l t i t u d eo fb i o l o g i c a ls y s t e m ss u c ha s c a r b o h y d r a t ed i g e s t i o n ，t h ep r o c e s s i n go fg l y c o lp r o t e i n sa n dg l y c o ll i p i d s ，b u ta l s oi n av a r i e t yo fm e t a b o l i cd i s o r d e r sa n do t h e rd i s e a s e ，f o re x a m p l e ，d i a b e t e s ，v i r a l a t t a c h m e n t ，a sw e l la sc a n c e rf o r m a t i o n a - g l u c o s i d a s e ( e c3 2 1 2 0 1h a sb e e nf o u n dt oc o n t r i b u t et ot h eg l y c o s y l a t i o no f h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u st y p ei ( h i - v - i ) 12 0a n di n h i b i t o r so ft z - g l u c o s i d a s e c a nb l o c kt h ev i r a li n f e c t i o n b e c a u s eo fi t si m p o r t a n c e ，i n h i b i t o r so fa - g l u c o s i d a s e h a v eb e e nc o n s i d e r e da sc o m p o u n d so fi n t e r e s tf o ral o n gt i m e ，s i n c et h e yc a nb ev i t a l t o o l sf o rs t u d y i n gg l y c o s i d a s em e c h a n i s m so fa c t i o na n da c ta st h e r a p e u t i ca g e n t sf o r s o m ed e g e n e r a t i v ed i s e a s e r e c e n t l ym o r ea n dm o r er e s e a r c h e r sh a v ef o c u s e dt h e i ri n t e r e s t so ns c r e e n i n g m o r ee f f e c t i v ea n d1 0 w e rs i d e e f f e c t si n h i b i t o r s t r a d i t i o n a lc h i n e s eh e r b sa r e p r e c i o u sr e s o u r c e so fm e d i c i n e n u m e r o u sc r - g l u c o s i d a s ei n h i b i t o r sc o u l db ef o u n d a n ds t u d i e di nt r a d i t i o n a lc ：h i n e s eh e r b s c o m m o n l yav a r i e t yo fr o u g he x t r a c t sf r o mt r a d i t i o n a lc h i n e s eh e r b s c a n s i g n i f i c a n t l yi n h i b i tt h ea c t i v i t yo fa - g l u c o s i d a s e b u tt h er e s u l t sa r el o w e rt h a nt h e c r u d ee x t r a c t s ，w h e nt h ei n g r e d i e n t ss e p a r a t e df r o mt h e m i ts h o w st h a ts o m e c o m p o n e n t sa r ed i f f e r e n tf r o me f f e c t i v ee x t r a c t s ，b e c a u s et h e yl o c a t ei nd i f f e r e n t v 中山大学硕士学位论文 t a r g e t t r a d i t i o n a lc h i n e s eh e r b sc o n t a i nh i g h e rc o n c e n t r a t i o no fs u g a ra n dt r a c e e l e m e n t s ，i no r d e rt oc o n f i r mt h es y n e r g e t i ci n h i b i t i o no fs u g a r , t r a c ee l e m e n t sa n dt h e a c t i v e i n g r e d i e n t s i nt h ep a p e rw et e s tan u m b e ro fm e t a l s ，c a r b o h y d r a t ea n d f l a v o n o i d st oi n h i b i tt h ea - g l u c o s i d a s e ，a n ds e l e c tc u 2 + ，z n 2 + ，g l u c o s e ，x y l o s ea n d q u e r c e t i na st h ei n h i b i t i o nt ot e s tt h es y n e r g e t i ci n h i b i t i o n a n dis e l e c tt w om e t h o d s t ot e s ti ft h e ya r ei nt h es y n e r g e t i ci n h i b i t i o n k e y w o r d s ：a - g l u c o s i d a s es y n e r g e t i ci n h i b i t i o n v i 论文原创性声明内容 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 中山入学硕上学位论文 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 导师签名：马林 日期2 0 0 8 年5 月1 3 日 中山大学硕士学位论文 第1 章前言 酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂。 绝大多数的酶都是蛋白质。在酶的作用下，许多生物化学反应过程可以在温和的 条件下以很高的速度和效率进行。所以，酶是维持生命体内正常的生理活动和新 陈代谢基本条件。随着生命科学以及医学的发展，人们发现许多疾病与生物体内 酶系的活动有着非常紧密的联系，酶活性的亢进或衰竭都会导致多种疾病发生。 因此，从酶作用的分子水平上研究生命活动的本质及其规律是十分重要的( 1 。2 l 。 糖类是自然界分布最广的一类重要的能量和结构分子，也是一类生物信息大 分子。糖苷酶和糖基转移酶催化糖苷、低聚糖、多糖以及糖脂、糖蛋白中的糖苷 键的断裂，是糖蛋白中寡糖链的修剪酶，对糖蛋白中糖链的合成极为重要。在生 物界广泛存在并参与糖代谢，糖链的结构和组成是蛋白质特异功能的识别部位， 糖苷酶的活性对糖蛋白的生物合成有关键作用。它不仅是生命体正常运转的关键 性酶，又是许多疾病的相关酶。因此研究糖苷酶对相关的生物过程影响具有重要 意义。 其中z - 葡萄糖苷酶广泛分布于生物体中，在机体的代谢过程中起着非常重要 的作用，参与食物消化、糖蛋白的生物合成，多糖及糖复合物的合成与分解代谢 等许多生物过程。如果这些弘糖苷酶的酶活力受到了影响，体内的正常代谢就会 破坏。糖尿病、肥胖症、高血脂、炎症、癌变、免疫反应和病毒感染等都和细胞 表面的复合糖质有密切关系，而复合糖质的形成又和弘葡萄糖苷酶的存在有一定 的联系【孓4 】。因此，开发出适当的劳葡萄糖苷酶抑制剂类药物，调节弘葡萄糖苷酶 的活性，可以治疗很多疾病，具有广阔的应用前景。 1 1仿葡萄糖苷酶的研究进展 1 1 1 萨葡萄糖苷酶的化学构成与结构 中山大学硕士学位论文 酶学的核心问题之一就是研究酶结构与功能的关系。由于蛋白质分子结构是 由其一级结构中的氨基酸连接顺序直接决定的，为了更好地反映酶分子结构方面 差异，1 9 9 1 年，h e n r i s s a tb 首次提出按氨基酸序列来划分糖苷酶，按照该分类法， 迄今2 0 0 0 多个已知氨基酸一级序列的糖苷酶可分为8 0 族。这种基于结构的系统 分类法揭示了同类酶问的进化关系，有利于推测酶活性部位的氨基酸残基组成、 结构特点和酶的催化机理。 1 1 1 1仿葡萄糖苷酶的化学构成 萨葡萄糖苷酶( d g l u c o s i d a s e ，e c3 2 1 2 0 ) 是一类能够从含有弘葡萄糖苷键底 物的非还原端催化水解葡萄糖基的酶的总称、包括麦芽糖酶( c r - d g l u c o s i d a s e g l u c o h y d r o l a s ee c3 2 1 2 0 ) 、异麦芽糖酶( d e x t r i n6 - a d g l u c a n c h y d o l a s e ，e c3 2 1 1 0 ) 、蔗糖酶( s u c r a s e ，c r - d g l u c o h y d r o l a s e ，e c3 2 1 4 8 ) 和海藻糖酶( t r e h a l a s e ， a 5 - t r e h a l a s eg l u c o h y d r o l a s e ，e c3 2 1 2 8 ) 等，这些酶首先从猪肠粘膜中分离得到， 随后从人体组织中也制备得到，又叫仿d 葡萄糖苷水解酶。多数俨葡萄糖苷酶在 化学本质上是一种蛋白，因来源不同其分子中碳水化合物部分所占比例不同。 关于弘葡萄糖苷酶分子中碳水化合物构成的研究较少，多数弘葡萄糖苷酶的化 合物的构成与结构尚不清楚。t a k a y a n a g i 和k i m u n a 等【5 叫的研究表明，日本天野制 药株式会社生产的黑曲霉弘葡萄糖苷酶分子中含有2 5 5 的碳水化合物，主要由甘 露糖、葡萄糖、半乳糖和n 乙酰葡萄糖胺构成，并分离出7 种低聚糖。虽然没有 劳葡萄糖苷酶的晶体结构，但根据基于结构的糖苷酶分类方法，此酶属于糖苷酶 的1 3 族，因此它的氨基酸序列应该和同族的仿淀粉酶等糖苷酶结构相似。( 如图 1 一1 1 萨葡萄糖苷酶的相对分子质量一般在4 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 之间 5 , 7 - 1 4 】。来源不同的弘 葡萄糖苷酶的相对分子质量差异很大，例如，日本天野制药株式会社生产的黑曲 霉葡萄糖苷酶( t r a n s g l u c o s i d a s ela m a n o ，以下简称t g l a ) 的相对分子质量为 1 2 5 0 0 0 t 5 1 ；而藤井聪等【9 】，从中国华南地区的粉葛根中分离出一株丝状真菌的葡 萄糖苷酶，其相对分子质量经凝胶色谱法测定为5 7 0 0 0 ，十二烷基磺酸钠聚丙烯 中山大学坝l = 学位论义 酰胺凝胶法( s d s p a g e ) 钡, u 定为6 0 0 0 0 。即使是同一菌属的不同菌株或同一植物组 织中的不同弘葡萄糖苷酶的相对分子质量也存在显著差异。 图1 1 淀粉酶的结构模1 1 1 1 2 1 弘葡萄糖苷酶的结构 木村淳夫等5 】的研究表明，t g l a 由2 个亚基组成( p 1 和p 2 ) ，p 1 具有2 2 7 个氨基酸残基，而p 2 具有7 1 9 个氨基酸残基。酶分子中共有7 个半胱氨酸残基， 仪有1 个半胱氨酸残基具有自由巯基，另外6 个半胱氨酸残基以二硫键结合为胱 氨酸残基，1 个胱氨酸残基位于p 1 亚基，而另外2 个胱氨酸残基和1 个半胱氨酸 残基位于p 2 亚基。因此，p 1 和p 2 不是由二硫键连接，而是通过非共价键结合形 成三维空f 刚结构。有趣的是，该黑曲霉骆葡萄糖苷酶与4 种哺乳动物萨葡萄糖苷酶 具有同源性，而与其它微生物型弘葡萄糖二 j 二酶很少或不具有同源性。p 2 的a s p ( 2 2 4 ) 被认为是该劳葡萄糖苷酶催化反应必不可少的氨基酸残基。甜菜葡萄糖苷酶的 a s p 残基也被认为是其催化基阴之 。 a l a m 等f 16 】从t e t r a h y m e n ap y n f o r m s 分离的酸性弘葡萄糖苷酶具有9 2 3 个氨 中山大学硕十学位论文 基酸残基，其氨基酸序列有3 4 与人类溶酶体酸性弘葡萄糖苷酶相同，4 5 相似。 在其推测的活性中心的1 6 个氨基酸残基中有7 5 与人类溶酶体酸性弘葡萄糖苷酶 相同。而溶酶体酸性萨葡萄糖苷酶与小肠膜蔗糖酶2 异麦芽糖酶复合体的结构特 别类似【1 7 】，它们可能起源于同一基因。在蔗糖酶异麦芽糖的推测活性中心的1 3 个氨基酸中有l o 个与溶酶体酸性仿葡萄糖苷酶相同，而a s p 残基也是其活性中 心结构之一。 蜜蜂弘葡萄糖苷酶i 的催化基团被认为是组氨酰残基，并且仅有1 个活性中心 【1 8 1 。对m u c o r j a v a n i c u si f o4 5 7 0 葡萄糖苷酶反应动力学的研究也表明它仅有一 个活性中心【1 9 】。 木村淳夫【”】根据2 0 多种铲葡萄糖苷酶的整个氨基酸序列的同源性和底物专 一性的不同，将骆葡萄糖苷酶分为骆葡萄糖苷酶l 干 1 t x - 葡萄糖苷酶i i 两大类。所有 i 类弘葡萄糖苷酶都含有骆淀粉酶催化部位的4 个氨基酸保留序列，而i i 类弘葡萄 糖苷酶仅含有序列2 ，即含有a s p ( 2 2 4 ) 的序列基元。多数酵母、细菌、昆虫及部 分植物的弘葡萄糖苷酶属于弘葡萄糖苷酶i ，多数霉菌、哺乳动物和部分植物的弘 葡萄糖苷酶属于葡萄糖苷酶i i 。 1 1 2 弘葡萄糖苷酶的催化机制 1 1 2 1 萨葡萄糖苷酶的亚基组成 不同来源的弘葡萄糖苷酶在晶体中均以紧密的四聚体形式存在。单体分子质 量为4 0 5 0 k u 。单体间符合2 2 2 点群对称分布。每个单体分两个结构域【1 5 】。n 端主 结构域由8 股别脚( b a r r e l ) 构成，它包含两个同轴圆柱，内圆柱由8 条平行的 折叠片构成，外圆柱由8 股与所叠片交替相邻的弘螺旋构成，毋螺旋的肽链走向 与所叠片成反平行。c 端的小结构域由几段骆螺旋无规卷曲成一个远离n 端的环 状结构，参与单体间的相互作用及活性部位的构成。 1 1 2 2 活性中心结构及活性形式 4 中山大学顾士学位论文 每个单体有一个深陷的口袋状的萨葡萄糖苷酶活性中心，位于平行廊的近c 端口部。每个活性中心包含m 1 和m 2 两个二价金属离子结合位点【2 0 1 。结构离子 m 2 与g l u 8 0 、g l u 2 1 6 、a s p 2 4 4 及a s p 2 8 6 的羧基氧原子成四配位；催化离子m 2 的活性部位的g l u 2 1 6 、a s p 2 5 4 、及a s p 2 5 6 的羧基氧原子、h i s l 9 咪唑基团及一个 溶剂分子的氧原子配位成键，m 2 在异构化过程中位置偏离原处o 1 n m 左右。g l u 2 1 6 是与m 1 、m 2 配位的桥梁。在上述氨基酸构成的极性区域外的o 5 0 8 n m 范围内， 有保守的疏水残基p h e 9 3 、t r y l 5 、t r y l 3 6 和p h e 2 5 形成“高度疏水背景( h i 曲 h y d r o p h o b i cc o n t r a s t ) 。由于p h e 2 5 来自不对称的一个单体，因此认为溶液中弘葡萄 糖苷酶首先聚成二聚体，但活性微弱或没有活性，只有形成四聚体时，它才有全 部的酶活。 1 1 2 3 萨葡萄糖苷酶的底物专一性 劳葡萄糖苷酶属于键专一性酶，它可专一性地切开糖类底物分子中的o r - 1 ，4 糖 苷键，个别种类的萨葡萄糖苷酶也可以作用于蔗糖的a c - 1 ，2 糖苷键。因此，一般来 说，萨葡萄糖苷酶对底物要求不甚严格，具有广泛的底物专一性。例如，t g l a 可 作用于麦芽二一八糖、苯基葡萄糖苷：苯基弘麦芽糖苷、弘葡萄糖苷、海藻糖、 黑曲糖、环状糊精、可溶性淀粉及直链淀粉等，其最适作用底物为麦芽三糖、麦 芽四糖和苯基弘麦芽糖苷；蜜蜂劳葡萄糖苷酶i i 可作用于麦芽二一七糖、海藻糖、 黑曲糖、异麦芽糖、蔗糖、松二糖、苯基弘葡萄糖苷、对硝基苯基铲葡萄糖苷、苯 基伽麦芽糖苷、环状糊精和可溶性淀粉等，其最适作用底物为苯基萨葡萄糖苷和对 硝基苯基仿葡萄糖苷。 萨葡萄糖苷酶底物专一性的差异取决于其活性中心结合部位的氨基酸构成。 中山亨等对b a c i l lu ss p s a m l 6 0 6 仿葡萄糖苷酶的底物专一性进行了研究。为研 究决定该酶具有广泛底物专一性的关键氨基酸残基，对s a m l 6 0 6 a 一葡萄糖苷酶的 5 个氨基酸残基进行了定向诱变，结果表明，所有诱变株对麦芽糖、异麦芽糖和蔗 糖的k r n 值无显著变化，而含有g l y 2 7 3 p r o 残基的诱变株对海藻糖的k m 值明显增 加，说明对海藻糖的亲和性主要由g l y 2 7 3 p r o 残基控制，而进一步的研究表明 t h r 3 4 2 a s n 残基可提高其控制效果。 中山大学硕士学位论文 1 1 2 4 弘葡萄糖苷酶的催化机制0 2 1 - 2 3 1 a c i d b a s ee n z o 弋 、r n u c l e o p h i l e g l y c o s y le n z y m e i n t e r m e d i a t e o - 冬- o rh h 。踌洲一i i 队y o 【- r 噼o 。0 善o h k o o a r c 孓 e n z h 口 h 1 l e n z | | o 弋 e n z o = k o r q 汁lo 丫o j h ： ( _ 嘣 o h j 、 o v o ， b 图1 2 弘葡萄糖苗酶催化糖舒酶键水解机制 在糖类底物的水解和转移反应中，糖苷键的裂解发生在糖基的异头碳和糖苷 6 中山大学硕十学位论文 氧原子之间。糖基残基在水解反应中被水分子的质子取代，而在转移反应中被来 自受体的质子取代；即无论在水解反应还是在转移反应中都发生了糖基和质子间 的交换反应。糖苷酶水解糖苷键时发生底物端基构型的保持或翻转，产物的构型 则由酶分子的构型决定而与底物无关。 正象5 - 淀粉酶水解淀粉得n a - 端基异构体，肛淀粉酶和葡萄糖淀粉酶水解淀粉 得到伊端基异构体一样，仿葡萄糖苷酶在催化反应中“保持”其构型而生成弘端基 异构体，属于构型“保持”酶。这与在水解酶中构型“翻转”酶不催化转苷反应 而仅构型“保持酶催化转苷反应的结论一致。 骆葡萄糖苷酶的催化反应属于氧碳正离子催化机制，由2 步( 如图1 2 ) 组成： 第一步为塑性阶段，在此阶段弘葡萄糖苷酶的活性中心可根据不同类型的底物而 相应发生一定程度的结构变化，从而使弘葡萄糖苷酶可以和多种糖类底物结合， 这一步决定了弘葡萄糖苷酶具有广泛的底物专一性；第二步是立体结构保持阶段， 这取决于酶分子的结构，酶分子的结构决定了水分子或其他受体接近或定向酶反 应中心的方向。在这一催化机制中，过渡态结构的离去基团彻底质子化，并且不 管底物的初始异头碳构型如何( 刎或刎) ，酶分子稳定化的氧碳正离子中间体的立 体构型不变，即反应的立体结果由酶分子的结构控制，而与底物构型无关。甜菜 种子和未发芽的稻谷种子仿葡萄糖苷酶以及结晶态黑曲霉舒葡萄糖苷酶可催化 f l - - d 吡喃葡萄糖基氟生成c r - d 葡萄糖的反应为这一机制提供了证据。i g a k i 等对黑 曲霉诉葡萄糖苷酶、甜菜弘葡萄糖苷酶和蜜蜂弘葡萄糖苷酶i i 的反应动力学研究 也证明了弘葡萄糖苷酶催化水解糖苷键的反应中氧碳正离子中间体的存在。 1 1 3 萨葡萄糖苷酶的功能 1 1 3 1t 2 - 葡萄糖苷酶与糖尿病 弘葡萄糖苷酶在自然界广泛分布，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生 物体内，在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生 理功能【2 4 - 3 1 】。 肠道是营养物质消化吸收的主要部位，肠粘膜是所有营养物质的最终消化场 中山火学硕上学位论文 所，因而肠道的粘膜消化是各种营养物质的最终消化阶段，具有关键地位。研究 结果证明，食物中的碳水化合物绝大部分是复合糖，包括淀粉、蔗糖等。碳水化 合物在胃肠道中的消化是几个连续的酶促反应的结果。淀粉首先被位于十二指肠 和空肠上部的胰腺弘淀粉酶部分水解为分子量较小的寡糖，再经麦芽糖酶、葡糖 淀粉酶和异麦芽糖酶等粘膜二糖酶水解为单糖( 葡萄糖) 才能被粘膜表面有效运输， 最终以血糖形式而进入代谢循环。相关糖苷酶的功能失调将引起糖代谢紊乱如糖 尿病等疾病，而调节这些酶的活性将成为药物开发的目标。 l 食物中的淀粉等多糖l 上胰d _ 淀粉酶 口葡萄糖苷酶抑制剂 几确萄糖苷酶 u 【 厅间葡萄糖矗吸收减慢 吸收进入血液、l ll 佩 避免高血糖 图1 - 3 食物中多糖类的吸收过程 因为葡萄糖苷酶与糖类代谢的密切关系，所以，近年来，把一葡萄糖苷酶作 为治疗糖尿病的靶点成为研究的热点，并有很多弘葡萄糖苷酶抑制剂合成出来， 应用到临床的如：伏格列波糖、阿卡波糖和米格列醇。它们对i i 型糖尿病有很好 的疗效。 弘葡萄糖苷酶参与生物体的糖代谢还可以引起另外一种疾病。因为酸性弘葡萄 糖苷酶可催化麦芽糖和糖原降解为葡萄糖，它在人类和哺乳动物组织中的糖原降 解方面起着重要作用。如果人类和哺乳动物组织中骆葡萄糖苷酶缺失，就会导致 严重的糖原代谢紊乱和组织中糖原的过渡积累，从而引起庞帕氏病( 一种常染色体 隐性遗传性糖原贮积病，又叫i i 型糖原生成疾病) 。而人体组织中萨葡萄糖苷酶活 性长期性偏低会引起肌肉纤维的破坏和肌肉萎缩。 1 1 3 2 弘葡萄糖苷酶与h i v 中山大学硕上学位论文 许多研究都证明：h i v 的感染是从病毒表面的糖蛋白g p l 2 0 分子与靶细胞表 面的c d 4 分子的互相结合开始的。h i v 的靶细胞是在免疫系统中起中心作用的辅 助性t 细胞。病毒表面糖蛋白的糖链与h i v 感染有密切关系。h i v - 1 包膜糖蛋白 的合成需要讲葡萄糖苷酶对寡糖进行加工，劳葡萄糖苷酶抑制剂可使包膜糖蛋白前 体因在内质网内进行n 糖基化时发生错误折叠而停留在内质网，干扰病毒的组装， 因此弘葡萄糖昔酶抑制剂可以阻止病毒的感染，从而阻止h w - 1 在淋巴细胞和单 核细胞之间传播，减少感染细胞和未感染的淋巴细胞之间的合体细胞的形成。由 此从理论上讲，弘葡萄糖苷酶抑制剂可用于治疗爱滋病的药物。特别是在a z t 等 药物的抗药性问题同趋严重的情况下，萨葡萄糖苷酶抑制剂作为治疗爱滋病药物 开发引起了人们的重视。 丘p b 。一一。一一。一z c b 0 00 0 0 ；勰辫i 彬 0 0 ， 岛岛岛 g 例，觥。- 暮嚣篙嚣蠹篁；。州砉 a 一热一鹩 a o 凸凸凸凸 f 埔科。 西啦砧j 翻翱憾嘲k 脚m a g i , c 翻。l 】脾，h o ：眭m s 讲y 1 何o t 钿 图1 - 4 抗h i v 病毒作川的弘葡萄糖苛酶抑制剂的作片j 方式 第一个用于临床抗病毒作用的弘葡萄糖苷酶抑制剂是n 丁基1 脱氧尻霉素 ( b u d n j ，s c 4 8 3 3 4 ) ，它对萨葡萄糖苷酶i 的抑制常数硒为0 2 2 t m o l l ，具有明显 的抗h i v 作用。第二个用于临床的骆葡萄糖苷酶抑制剂是一种从澳大利亚的植物 中分离得到的生物碱( c a s t a n o s p e r m i n e ，c a s t ) 的衍生物，即6 o 丁酰c a s t ( b u c a s t ， m d l 2 8 5 7 4 ) ，该化合物对h i v 的抑制作用比原始的生物碱强3 0 倍，但抑制糖蛋白 加工所需的i c 5 0 却比c a s t 大1 0 倍。 9 中山人学硕l j 学位论文 ) h i ) j 1 ) 4 一 獭燃篓 遘 图1 - 5i - d n j 与弘葡萄糖一吁酶作朋的模型3 2 】 o h h c a s t a n o s p e r m i n e 幽1 - 6c a s t a n o s p e r m i n e 的结构 1 1 3 3 萨葡萄糖苷酶与癌症 当萨常细胞显示出典型的低聚糖结构时，癌细胞却显示出通常仪限于内质网 的复杂结构。这些复杂结构为肿瘤细胞增殖和转移传导信号。骆葡萄糖糖苷酶抑 制剂利用f f 常细胞和癌细胞之i r j 生长速率的差异来抑制复杂低聚糖结构的形成。 例如：吡咯并i1 ，2 一卅吡啶( 中氮茚) 士物碱s w a i n s o n i n e ，g o l g ia ：- m a n n o s i d a s ei i 萨 j 一 露糖苷酶j i 的抑制剂，据报道- 叮降低小鼠肿瘤的转移，增强细胞的免疫反j 哑以及 减缓肿瘤细胞的增殖。s w a i n s o n i n e 町使炳人的肿瘤质量显著减少并向良性发展， 闪而是患有恶性乳腺、肝脏、肺及其他器官肿瘤的有效治疗手段。因此天然的或 ir l 中山大学硕士学位论文 合成的糖苷酶抑制剂可作为癌症治疗用药剂。已有的抑制剂如s w a i n s o n i n e 和 c a s t a n o s p e r m i n e 在生理p h 下带正电荷。这种抑制剂的抑制行为至少可部分地认为 是由酶的活性区域的羧基和抑制剂之间稳定的静电作用产生的 综上所述，弘葡萄糖苷酶是体内重要的调节因子，具有多方面的功能。所以 对弘葡萄糖苷酶分子进行激活与抑制研究，是人们开发利用酶蛋白的基础工作， 也是研究催化作用机理的重要手段。有关酶和酶抑制剂的研究自二十世纪八十年 代以来取得了较大进展，其中寻找合适的抑制剂用于控制和调节弘葡萄糖苷酶的 活性，以期对有关疾病进行防治，具有重要的临床意义，所以引起了研究者们的 广泛关注。 1 2 天然产物作为萨葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展 自从人们发现葡萄糖苷酶的功能以来，弘葡萄糖苷酶抑制剂就引起了国内外 研究者的广泛关注，各种劳葡萄糖苷酶抑制剂被作为药物进行开发，并已经医用 到临床的有5 种，就是1 1 3 已经提到的伏格列波糖、阿卡波糖、米格列醇、n 丁 基1 一脱氧尻霉素( b u d n j ，s c 4 8 3 3 4 ) 和生物碱( c a s t a n o s p e r m i n e ，c a s t ) 的衍生物，即 6 0 丁酰c a s t ( b u c a s t ，m d l 2 8 5 7 4 ) 。前面三种是作为医治i i 型糖尿病所应用的，后 两种是现在应用的抗艾滋病类药物。 仿葡萄糖苷酶抑制剂，依其来源可划分为3 大类：微生物代谢物、天然动植 物、微生物提取物和人工合成物。依照结构可分为糖及其衍生物与非糖基化合物， 从中糖及其衍生物按照已有文献分类，又可分为单糖类、双糖类、亚氨基糖类， 碳糖与假糖氨类与硫糖类。 天然产物资源丰富，微生物代谢物和天然植物，微生物提取物都是属于天然 产物，并且很多人工合成物也是根据已有的天然产物改造而得到的，所以以下， 我们按照结构分类来介绍天然产物的对弘葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展可以更加 清晰。并且根据我国中药研究的情况，加入了中药粗提液的分类。 1 2 1糖及其衍生物的弘葡萄糖苷酶抑制剂 中山大学硕七学位论文 ( 1 ) 天然产物中单糖类萨葡萄糖苷酶抑制剂 临床应用伏格列波糖都属于单糖类的衍生物，确切的说是属于假单糖。它是 由天然的细菌代谢的产物经过合成所值得的。伏格列波糖由日本武用药品公司研 制，1 9 9 4 年上市，商品名为倍欣。人工合成伏格列波糖有两条路线：一条是由有 效霉素产生菌发酵并分离其产物有效霉素a ，再经过生物转化得到关键中间体 v a l i e n a m i n e 再通过化学合成；另一条途径是同样利用有效霉素产生菌进行发酵时， 直接从其发酵代谢物产物中分离关键中问体v a l i e n a m i n e ，再通过化学合成。 伏格列波糖也属于假糖氨类。 ( 2 ) 天然产物中二糖类萨葡萄糖苷酶抑制剂 曲二糖和黑糖的提取，尤其为假二糖类的药物作为仅葡萄糖苷酶抑制剂治疗 h i v 开创了一条全新的思路。曲二糖l 是在1 9 5 3 年从清酒和及其来源的大米发酵 物中提取的，它具有a - ( 1 ，2 ) 糖苷键，而黑糖2 是从胶淀粉在酸性水解下得到的，并 且黑糖2 除了有抗h i v 病毒的作用，还有可以作为糖浆改善人体免疫力的效果， 黑糖具有0 c ( 1 ，3 ) 糖苷键【3 3 1 。( 如图1 - 7 ) h o h l o h 1 ，o h h o o h o 2 一0 h o h 图1 7 苦瓜( m o r m o d i c ac h a r a n t i a ) 的种子和厌树花( g r i f o l af u o n d o s a ) 的果实中提取的 d ( + ) 海藻糖3 对仿葡萄糖营酶有作用【3 4 1 ，它是两个葡萄糖通过衍( 1 ，1 ) 键连接起来 的，现在主要应用在食品和化妆品的制造中，但是它的抑制效果一半，在2 m m 时 对仅。葡萄糖苷酶有4 2 的抑制率。( 如图1 8 ) h o h oo h 3 1 2 h h h 中山大学硕上学位论文 图1 8 ( 3 ) 天然产物中亚氨基糖类仿葡萄糖苷酶抑制剂 从植物和有机微生物分离出来的亚氨基糖( 多羟基生物碱) ，根据其对被弘葡 萄糖苷酶的抑制作用，被认为是在治疗价值和生物识别过程中有很高的应用潜力。 大多数亚氨基糖是竞争性抑制剂，无论是构型还是静电影响都对活性中心键的连 接有着重要的作用。 1 9 6 6 年，野尻霉素4 ( n o j i r i m y c i n ) 从芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 、链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 和桑树叶中提取出来，它对不同来源葡萄糖苷酶有有效的抑制作用【3 4 】。但是， 在1 号碳上的羟基的不稳定性会对生物活性有很大的影响。通过催化氢化等方法， 得到比较稳定的1 脱氧野尻霉素5 ，在体外表现出不错的抑制作用，但是比较起来， 1 脱氧野尻霉素5 的抑制作用一般，却有很大的副作用。( 如图1 - 9 ) o h o h h 裕罨。h h 秘窀 图1 - 9 为了找到更好效果的的亚氨基类的弘葡萄糖苷酶抑制剂，我们继续改造了1 脱氧野尻霉素，通过n 烷基化得到的衍生物，例如米格列醇6 和n 丁基1 脱氧尻 霉素7 ( b u d n j ，s c 一4 8 3 3 4 ) ，不但可以治疗糖尿病和高雪氏病，还可以抗h i v 病毒， 甚至可以抵抗肝炎病毒等。1 脱氧野尻霉素5 对弘葡萄糖苷酶i i 的作用比对骆葡 萄糖苷酶i 好的多，但是当n 烷基化后，作用刚好相反。更有趣的是，如果把1 脱氧野尻霉素5 的c 5 结构翻转，使之变成，1 脱氧基一l 一野尻霉素8 ，这样，对 弘葡萄糖苷酶的抑制作用会消失，而1 ，5 二脱氧基1 ，5 亚氨基木糖醇9 则没有影 响，说明c 5 上的羟甲基在减弱酶的抑制作用上起到了关键的作用。( 如图1 1 0 ) h o h o 6 h o h o 7 中山人学硕士学位论文 h。：三：，oh ho、(，oh h o h o r h 、o h o h o h r = h ，m e ，n b u 1 0 c o h 2 o h o h h h 3 c r 1 o h 1 1 - 、o h ，o h - c r ， h 2 h 1 2 r 1 = h ：r 2 2 旷1 d 3 - g l u c o p y s y i 图1 - 1 1 多羟基双稠吡咯啶生物碱【3 8 】是一种特殊的亚氨基糖，这一类化合物的代表是 从栗豆树( c a t r a n o s p e r m u ma u s t r a l e ) d ? 分离出来的a u s t r a l i n e l 4 。从结构上看，n 原 子处于两个环的节点处。并且此化合物能够有效的抑带l j a - 葡萄糖苷酶的活性。( 如 图1 1 2 ) 1 4 中山大学硕士学位论文 hh o h 1 4 c h 2 0 h 图1 1 2 2 0 0 7 ，j o n e lp s a l u d e s 等【3 9 】从西澳大利亚的海绵体当中得到两种亚糖，1 ，4 二脱氧基一1 ，4 亚胺阿拉伯糖1 5 和1 ，4 二脱氧基1 ，4 亚胺木糖1 6 ，这两种物质以 前是在植物中提取得到过，在海洋无脊椎动物中还是第一次得到。化合物1 5 对0 c 葡萄糖苷酶有不错的抑制作用，化合物1 6 比化合物1 5 作用小很多。( 如图l 一1 3 ) h 幂。h h 砹。h 图1 1 3 ( 4 ) 碳糖和假糖氨类弘葡萄糖苷酶抑制剂 从天然产物中得到的假糖氨类弘葡萄糖苷酶抑制剂最具代表型的是有效霉素 a1 7 2 3 和阿卡波糖类似物2 4 2 5 。前者是从链球菌【4 0 l 中分离得到，后者是从 s h y g r o s c o p i c u sv a r l i m o n e u s 中分离得到的有效成分【4 。研究表明，他们都对萨葡 萄糖苷酶有良好的抑制作用，并且其中的化合物2 3 伏格列波糖是已经应用到临床 的治疗糖尿病的药物，它的商品名叫倍欣，由同本武田于1 9 9 4 年推向市场，它的 活性比阿卡波糖高2 0 3 0 倍，且副作用较小。( 如图1 1 4 ) h o h o 1 7 h o n h 2 h o o h h o h o 1 8 1 9 h h o n h 2h o 二虢呲 中山大学硕士学位论文 h o h o 2 1 h n h 2 蠢二。愍 h o h o 2 2 h h n h 2 h o h o h 厂o h n 2 的原理。但是在查阅文献的过程中，2 0 0 3 年，s s a v e l e v 等【6 5 】 人在测定乙酰胆碱酯酶的活性中提到，协同作用就是当单一成分的抑制作用明显 不如在粗提液中相同浓度的同一种抑制剂对酶的作用。2 0 0 5 年，杨培慧等【6 6 1 人 在测试金属离子的协同作用对血红蛋白分子荧光光谱的影响时，就与s s a v e l e v 中山大学硕十学位论文 所理解的协同抑制作用的定义一致。这就说明对于协同作用，不同的人的理解还 有差别，但是本论文是以前者为标准，即遵循协同作用要大于单一作用抑制之和。 方法( 2 ) ：还有一种方法即是遵循1 + 0 1 ，即选择的其中一种抑制剂所加的 量几乎不影响空白时酶的活力进行协同测试研究。y ew a n g 等6 7 1 人就采用了此 种方法测试对弘葡萄糖苷酶的协同抑制作用，但是我们发现在此篇文献中的测试 中所用的酶的活力的o d 4 0 0 过小，通常我们所用的酶的活力o d 4 0 0 大概在0 1 - 0 1 5 之间，而此篇文献中，测试中所采用的o d 4 0 0 大多在0 0 0 5 0 0 1 2 左右，由于本 身测试时酶有波动性，操作上比较困难。 方法( 3 ) ：通过yew a n g 的方法给我们启示，我们发现在测试酶活性的过 程中，酶相对活性不同的时候，我们测试同一种化合物的半抑制浓度是相同的， 这就说明，酶的活力不影响抑制剂的i c 5 0 。我们就可以先固定一种化合物a 的 浓度，以此时的抑制活力为新的空白参照点，以浓度从低到高变换另一种化合物 b 的浓度，来说明协同作用，如果没有协同作用，b 的半抑制浓度i c 5 0 将变化不 大( 有一定误差范围) ，如果有协同作用则i c 5 0 变小。而此时的i c 5 0 我们把它称 为表观i c 5 0 ，即i c 5 0 。 方法( 4 ) ：刘艳【6 8 】在其博士论文中对弘葡萄糖苷酶测试协同作用时，引入了 一个最佳比例的概念，即两种能产生协同抑制作用的抑制剂有一个最佳比例能使 协同作用达到最好。理论上讲，所有两种化合物的协同都应该会有一个最佳比例， 但是在操作过程中，应该只有有协同作用并且半抑制浓度i c 5 0 比较接近时才可以 使用此方法，否则很难表示出来。 2 4 1竞争性抑制剂与非竞争性抑制剂 由于竞争性抑制剂作用于酶的活性中心，而非竞争性抑制剂作用于活性中心 以外的部位，所以此二者的组合是最有可能产生协同作用。因此，本实验我们首 先采用两种不同类型的抑制剂同时与酶作用，通过动力学研究，获得有关酶活性 和催化机制的重要信息。 2 4 1 1 槲皮素与木糖，葡萄糖化合物的协同抑制作用 中山大学硕上学位论文 ( 1 ) 槲皮素与葡萄糖的协同抑制作用 依据方法( 3 ) ： 0 ，1 4 o 1 2 0 1 0 0 0 4 o 0 2 0 0 0 o 1 4 o 1 2 o1 0 0 0 4 o ，0 2 0 0 0 024681 0 t h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e ( r a m ) o24681 0 t h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e ( m m ) 3 7 o o o 0 中山大学硕上学位论文 24681 0 t h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e ( m m