（农业昆虫与害虫防治专业论文）甜菜夜蛾pban受体pbanr基因克隆及pban与pbanr的相对表达研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是如需保密，解密时间 2 0 10 年0 6 月3 0 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 娩夺易率帆厶。户阳 学位论文使用授权书 本人完金了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交 保密的论文) 在解密后适用于本授权书 黼她节i 乍锄张一 签名日期：z s 产6 月( ，日 签名日期：o 舾c 7 年月占日 【 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 甜菜夜蛾p b a n 受体( p b a n r ) 及p b a n 与p b a n r 的相对表达研究 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 立题依据1 1 1 前言1 1 2p b a n 、p b a n r 及性信息素合成的调控2 1 2 1p b a n 的研究进展。2 1 2 2p b a n r 的研究3 1 2 3 性信息素合成的调控6 1 2 4 研究目的和意义8 2 材料与方法1 0 2 1 方案设计1 0 2 1 1p b a n rc d n a 全长序列的克隆1 1 2 1 2 荧光实时定量r t - p c r 技术1 2 2 2p b a n re d n a 序列全长的克隆13 2 2 1 虫源及饲养方法13 2 2 2 试剂15 2 2 3p b a n r 基因特异片段的克隆1 5 2 2 4p b a n r 基因的3 r a c e 21 2 2 5p b 舢岍之基因5 r a c e 2 3 2 2 6 开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 的校正2 9 2 3p b a n 和p b a n r 的相对表达量的确定3 0 2 3 1 实验材料3 0 2 3 2 主要试剂3 0 2 3 3 引物设计及筛选31 2 3 4 总r n a 提取3 2 2 3 5d n a s ei 处理去除基因组d n a 污染3 2 2 3 6 反转录3 3 2 3 7 定量片段的确认3 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 2 3 8 标准曲线的获得3 4 2 3 9 批内和批间变异一3 5 2 3 1 0 不同组织中p b a n 与p b a n r 的相对表达量3 6 2 3 1 1 昼夜不同时间p b a n 与p b a n r 的相对表达量3 9 2 3 1 2 不同日龄雌成虫p b a n 与p b a n r 的相对表达量4 1 2 3 1 3 数据分析和统计4 3 3 结果4 5 3 1 甜菜夜蛾p b a n r 的克隆4 5 3 1 1 甜菜夜蛾p b a n r 基因e d n a 片段的克隆4 5 3 1 2 甜菜夜蛾p b a n r 基因3 7 r a c e 的克隆4 6 3 1 3 甜菜夜蛾p b a n r 基因5 7 r a c e 的克隆4 7 3 1 4 甜菜夜蛾p b a n r 基因的开放阅读框的校正4 8 3 1 5p b a n r 基因e d n a 全序列及结构分析5 0 3 2p b a n 和p b a n r 的实时荧光定量p c r 。5 6 3 2 1 特异引物筛选。5 6 3 2 2 基因组d n a 的去除5 8 3 2 3 定量基因参照片段的确认6 1 3 2 4 标准曲线6 2 3 2 5 批内和批间变异6 9 3 2 6 雌成虫不同组织中p b a n 和p b a n r 的相对表达量7 3 3 2 7 昼夜不同时间点雌成虫p b a n 和p b a n r 的相对表达量一7 5 3 2 8 不同日龄雌成虫p b a n 和p b a n r 的相对表达量7 7 4 讨论与结论8 0 4 1 甜菜夜蛾p b a n r 基因m r n a 全长序列的克隆8 0 4 2 雌成虫p b a n 和p b a n r 的相对表达量8 l 4 3 结论与问题8 5 参考文献8 7 致谢9 9 甜菜夜蛾p b a n 受体( p b a n r ) 及p b a n 与p b a n r 的相对表达研究 摘要 为了揭示甜菜夜蛾s p o d o p t e r ae x i g u a ( h i i b n e r ) ( 鳞翅目：夜蛾科) 体内性信息 素的合成途径及相应的调控基础，为了解其交配行为及改善、提高其性信息素监控 技术提供更多的科学依据，本文在认真总结、分析了性信息素合成激活肽受体 ( p b a n r ) 及性信息素合成激活肽( p b a n ) 研究进展及存在问题的同时，利用r t - p c r 和r a c e 技术对甜菜夜蛾p b a n r 基因e d n a 全长序列进行了克隆和阐述，对p b a n 及p b a n r 相对表达量进行了检测，得到了一些重要的原创性结果： 1 、利用r t - p c r 结合r a c e 方法首次从甜菜夜蛾雌成虫性腺组织中克隆到了 p b a n r 基因e d n a 全长序列( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：e u 3 6 5 8 7 8 ) 。该序列包 括了1 0 5 3 b p 并编码3 5 0 个氨基酸残基的甜菜夜蛾p b a n r 基因开放阅读框。 2 、应用软件分析氨基酸序列表明甜菜夜蛾的p b a n r 为g 蛋白偶联受体家族成 员之一，由7 个跨膜结构域，1 个胞外n 端结构域，1 个胞内c 端结构域，3 个胞外 和3 个胞内环状结构域组成。与其近缘种海灰翅夜蛾s p o d o p t e r al i t t o r a l i s ( b o i s d u v a l ) 的p b a n r 氨基酸序列同一性高达9 8 。 3 、利用荧光实时定量r t - p c r 方法分别检测了p b a n 和p b a n r 在甜菜夜蛾雌 成虫脑咽下神经节复合体、腹神经索、卵巢和性腺的相对表达量，并成功地从量的 角度证实了p b a n 和p b a n r 的配体受体关系。所得的结果为：p b a n 和p b a n r 在这4 种组织中均可表达，但其表达量会随组织的不同而异；p b a n 相对表达量以 脑咽下神经节的最高( 1 4 7 1 ) ，腹神经索的次之( 4 1 2 ) 、卵巢( 1 0 2 ) 和性腺的最 低( 1 0 0 ) ，前者的表达量与后三者的差异显著( 尸 0 0 5 ) ；p b a n r 的相对表达量以性腺的最高( 5 3 6 ) ，腹神经索的次之( 2 3 7 ) ， 脑咽下神经节( 1 0 0 ) 和卵巢( 0 7 4 ) 的最低。前者的相对表达量显著高于后三者 的( 尸 0 0 5 ) 。 4 、利用荧光定量实时r t - p c r 方法测定了3 日龄雌成虫p b a n 和p b a n r 在昼 夜2 4 h 中6 个时间点的相对表达量，p b a n 在光期( 0 7 ：0 0 2 1 ：o o ) 的表达量均较低， 进入暗期后p b a n 的表达量明显增加，到2 3 ：3 0 ( 进入暗期2 5 h ) 达到最大值之后 明显下降( 进入暗期6 5 h ) 。p b a n r 的相对表达量与p b a n 的同步性较为一致。即 进入光期的4 5 h 到进入暗期的6 5 h 之间，p b a n 和p b a n r 相对表达量的变化趋势 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 几乎相同。虽然p b a n 和p b a n r 不同时间点的表达量没有显著差异俨 0 0 5 ) ，但 这些结果与甜菜夜蛾性信息素释放及交配的昼夜节律相一致。 5 、利用荧光实时定量r t - p c r 方法测定1 - 5 日龄雌成虫脑咽下神经节复合体 p b a n 和性腺p b a n r 的相对表达量所获的结果为：p b a n 的相对表达量随雌成虫 日龄的增加而升高，到5 日龄时达到最大。其中5 日龄p b a n 的相对表达量显著高 于1 、2 日龄的( 尸 0 0 5 ) 。另外，1 - 4 日 龄成虫的p b a n 表达量差异也不显著( 尸 o 0 5 ) 。p b a n r 的相对表达量也随日龄 的增加而升高。其中第4 d 的表达量与第5 d 、2 d 的差异不显著( p 0 0 5 ) ，但与第 1 d 、3 d 的差异显著( 尸 0 0 5 ) 。回 归分析结果表明，1 5 d 内p b a n 和p b a n r 的相对表达量均随与成虫日龄的增加而 呈显著的直线上升趋势( 尸 0 0 5 ) r e l a t i v ee x p r e s s i o nl e v e lo fp b a n ra l s oi n c r e a s e s 鹊t h ef e m a l em o t ha g ei n c r e a s ef i o m m c1s t t o 5 伍d a yo ft h ea d u l tl i f e t h er e l a t i v ee x p r e s s i o nl e v do fp b a n ri nt h e i v 甜菜夜蛾p b a n 受体( p b a n r ) 及p b a n 与p b a n r 的相对表达研究 4 - d a y - o l dm o t hr a n k st h ef i r s t ，f o l l o w e db yt h a ti n5 - ，2 - ，3 - ，a n dl - d a y - o l dm o t hi na d e c r e a s i n go r d e r d i f f e r e n c e si nt h er e l a t i v ee x p r e s s i o nl e v e lo fp b a n r a r es i g n i f i c a n t o n l yi nt h e4 一，3 - a n d1 - d a y - o l dm o t h 妒 0 0 5 ) r e g r e s s i o na n a l y s i si n d i c a t e st h a tt h er e l a t i v ee x p r e s s i o nl e v e l so fb o t hp b a na n d p b a n ra r ep o s i t i v e l yc o r r e l a t e dt ot h ea g eo f & e x i g u af e m a l em o t h s 1 1 1 el i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o nf o rp b a na n dp b a n ri sy = 0 2 17 5 + 0 5 9 9 9 x , r = 0 7 7 9 0a n dy = o 8 4 7 9 + 0 2 6 5 5 x , r = 0 6 4 7 0 ，r e s p e c t i v e l y t h eg r e a t e re x p r e s s i o nl e v e l so f b o t hp b a n a n dp b a n rw i t ht h em o t h sa g i n ga r eh i g h l yc o i n c i d e n tt ot h ef a c tt h a tt h ec a l l i n ga n d m a t i n gc a p a c i t yo fs e x i g u am o t hi sv i g o r o u sf r o mt h ef i r s tt ot h ef i f t hd a yo fn l e i ra d u l t l i f e k e yw o r d s ：b e e ta r r n y w o r m ；s e xp h e r o m o n e ；p b a n ；p b a n r ；g - p r o t e i nc o u p l e d r e c e p t o r v 甜菜夜蛾p b a n 受体( p b a n r ) 及p b a n 与p b a n r 的相对表达研究 1 立题依据 1 1 前言 甜菜夜蛾s p o d o p t e r ae x i g u a ( h i i b n e r ) ，鳞翅目，夜蛾科，是一种生态适应性很 强的的昆虫，具有迁飞性( 苏建亚，1 9 9 8 ；江幸福等，1 9 9 9 a ；左仕庚，2 0 0 3 ；韩 兰芝等，2 0 0 4 ；牛成伟等，2 0 0 6 ) 、对杀虫剂的高度抗性( 赵建周等，1 9 9 5 ；朱树勋 等，1 9 9 6 ；刘永杰等，2 0 0 2 ；兰亦全等，2 0 0 4 ；曹翔翔，2 0 0 5 ；贾变桃等，2 0 0 6 ； 袁永达等，2 0 0 6 ；周利琳等，2 0 0 8 ；) 和广泛的寄主植物( 罗礼智等，2 0 0 0 ) ，从北 纬4 0 。5 7 。到南纬3 5 。4 0 。之间都有发生为害记录。因此，甜菜夜蛾常对农业生产和经 济造成严重威胁。在我国，2 0 世纪8 0 年代前甜菜夜蛾主要为害北京、河北、河南、 山东和陕西等地，东北、西北及长江流域虽有分布，但为害不重。8 0 年代中后期以 来，甜菜夜蛾为害地区逐渐扩大，为害的范围越来越大，造成的经济损失也越来越 严重( 余友森等，1 9 8 9 ；江幸福，1 9 9 8 ；宋国春，1 9 9 8 ；车晋滇等，2 0 0 1 ；张振林， 2 0 0 4 ；宋天俊等，2 0 0 4 ；曹春田等，2 0 0 5 ；谭秀芳等，2 0 0 5 ；阚跃峰等，2 0 0 7 ) 。更 让人忧虑的是，随着全球气候的转暖以及种植业结构的调整，导致甜菜夜蛾的发育 历期缩短、发生世代增加及天敌的持续控制作用下降，甜菜夜蛾的发生为害程度趋 向严重( 江幸福等，1 9 9 9 a ；罗礼智等，2 0 0 0 ) 。 但是，传统的害虫控制方法对于甜菜夜蛾的防治显得越来越困难。目前常规杀 虫剂对甜菜夜蛾的防治效果平均不到5 0 ，甜菜夜蛾对各类杀虫剂( 慕卫等，2 0 0 1 ； 刘永杰等，2 0 0 3 a ，b ，2 0 0 5 ；兰亦全等，2 0 0 4 ，2 0 0 5 ；黄琳瑞等，2 0 0 5 ；贾变桃等， 2 0 0 6 ；刘向阳等，2 0 0 7 ：刘玮玮等，2 0 0 8 ) ，其中包括昆虫生长调节剂( 徐蓬军等， 2 0 0 6 ；周利琳等，2 0 0 8 ) 及转b t 基因作物( 殷向东等，1 9 9 9 ；赵小公，1 9 9 9 ；王万 群等，2 0 0 2 ；殷向东等，2 0 0 4 ；王振营等，2 0 0 5 ) 都有很强的抗性，且长期过量使 用杀虫剂不仅造成了甜菜夜蛾抗药性的增加，还给生态环境、农业经济和人类健康 造成了很大的负面影响。因此，开发新型杀虫剂和寻找新的控制甜菜夜蛾的方法提 上了日程。其中，利用甜菜夜蛾性信息素来来干扰成虫交配已用于甜菜夜蛾监测和 防治( 董双林等，2 0 0 2 ；许国庆等，2 0 0 6 ；柏立新等，2 0 0 7 ；许国庆等，2 0 0 8 ) 。不 过，性信息素防治甜菜夜蛾也有自身的局限性：只对雄性成虫有作用；诱芯受天气 和地理环境影响较大，不稳定。而性信息素在甜菜夜蛾体内的产生受到一系列的内 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 在机制的调控，其中性信息素合成激活肽( p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sa c t i v a t i n g n u r o p c t p t i d e ，p b a n ) 与其受体p b a n r ( p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sa c t i v a t i n gn u r o p e p t i d e r e c e p t o r , p b a n r ) 是重要的调控因子，研究甜菜夜蛾性信息素合成和释放的调控，对 于采用遗传防治的方法来控制甜菜夜蛾种群有重要的意义。 1 2p b a n 、p b a n r 及性信息素合成的调控 广泛的信息交流是一个物种在地球上赖以生存和繁殖的基础之一，通过信息的 传递生物体实现了物质、能量和信息的正常运转。在对众多的信息交流的关注中， 生殖过程中的信息交流普遍吸引着人们的眼球。对于昆虫个体来说，如何能在交配 的季节快速并准确地找到同种的异性个体，且获得交配的权利，直接关系到个体的 基因是否能够成功传递给后代；而对于整个昆虫种群来说是否具有一种行之有效的 通讯方式来实现生殖季节中成功地寻找配偶，决定了这个物种是不是能够适应环境 并且能够长期在地球上生存和繁衍。性信息素的合成和释放在雌性昆虫体内受到一 系列复杂的生命过程调控，这些调控决定了性信息素的合成的质和量，间接地影响 了雌性昆虫对雄性昆虫的吸引能力。研究性信息素的调控对于了解性信息素在昆虫 体内的合成途径，开发利用昆虫自身的基因资源来防治农业害虫种群具有重要的意 义。 1 2 1p b a n 的研究进展 在多种蛾类中，雌成虫性信息素的释放行为具有昼夜节律性。这种节律性在体 内主要受到周期性释放的神经肽的控制，这种神经肽目前已经知道是性信息素合成 激活肽，它首先在成虫的咽下神经节合成，然后暂时储存在心侧体，在受到相应的 刺激时释放出来，促进雌成虫性信息素的合成。p b a n 首次在玉米夜蛾h e l i c o v e r p a z e a 发现，为含3 3 个氨基酸残基且羧基端氨酰化的多肽( r a i n ae ta 1 ，1 9 8 9 ) 。人工合 成的玉米夜蛾p b a n2 - 4p m o l 浓度可以刺激玉米夜蛾和其他6 种鳞翅目雌成虫性 腺产生正常量的性信息素( r a i n ae ta 1 ，1 9 8 9 ) 。随后，在家蚕b o m b y xm o r io o t a m u r ae t a 1 ，19 8 9 ) ，舞毒蛾l y m a n t n ad 括p a r ( m a s l e re ta 1 ，19 9 4 ) 均发现了这种多肽。之后p b a n 的基因序列在多种蛾类昆虫中被克隆：玉米夜蛾( d a v i se ta 1 ，1 9 9 2 ；m ae ta 1 ，1 9 9 4 ) ， 家蚕0 0 w a n oe ta 1 ，19 9 2 ；s a t oda 1 ，19 9 3 ) ，甘蓝夜蛾m a m e s t r ab r a s s i c a e 2 甜菜夜蛾p b a n 受体( p b a n r ) 及p b a n 与p b a n r 的相对表达研究 ( j a c q u i n - j o l ye l ：a 1 ，1 9 9 8 ) ，烟青虫h e l i c o v e r p aa s s u l t a ( c h o ie ta 1 ，1 9 9 8 ) ，小地老虎 a g r o t i si p s i l o n ( d u p o r t e t se ta 1 ，19 9 8 ) ，海灰翅夜蛾s p o d o p t e r al i t t o r a l i s ( i g l e s i a se ta 1 ， 2 0 0 2 ) ，棉铃虫h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 a ) ，小菜蛾p l u t e l l ax y l o s t e l l a ( l e ee ta 1 ，2 0 0 5 ) ，甜菜夜蛾( g e n b a n ka c c e s s i o nn o a y 4 9 5 9 6 ) 。这些昆虫的p b a n 的转录前体编码滞育激素( d i a p a u s eh o r m o n e ，d h ) ，a 神经肽，p 神经肽，p b a n 和 r 神经肽( i g l e s i a se ta l ，2 0 0 2 ) ，甜菜夜蛾中p b a n 的转录前体也存在同样的情况( 许国 庆，2 0 0 7 ：x ue ta 1 ，2 0 0 7 ) 。这些研究结果表明，p b a n 在昆虫体内被转录后，与其 他三种神经肽一起被翻译成嵌合的肽前体，之后被切割成具有活性的肽。 p b a n 是p y r o k i n i n ( 热激肽) p b a n 家族的成员，它们有一个共同的特点，c 末 端有共同的f x p r l 氨基( r a f a e l i ，2 0 0 2 ) ，所以又称其为f x p r l 肽家族( f 为苯丙氨 酸，x 为任意氨基酸，p 为脯氨酸，r 为精氨酸，l 为亮氨酸，且亮氨酸氨基化) 。 研究表明，这段保守序列是热激肽p b a n 家族保持其相应的生物学活性的最短序列 ( z d a r e ke ta 1 ，1 9 9 7 ) ，即这段保守的五肽序列对保持这类肽的生物学活性必不可少。 但是在不同的生物体内，热激肽p b a n 家族成员的功能并不一样：引起多种鳞翅目 昆虫幼虫表皮的黑化( m a t s u m o t oe ta 1 ，1 9 9 0 ；a l t s t c i ne ta 1 ，1 9 9 6 ) ，诱导家蚕胚胎滞育 ( i m a ie ta 1 ，1 9 9 1 ) 而解除棉铃虫蛹的滞育( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 a , b ) ，在双翅目昆虫 的某些种类中又可加速蛹的形成( z d a r d ke ta 1 ，19 9 7 ) 。热激肽l a b a n 家族成员既然有 不同的功能，那么在体内也一定有相对应的受体与之相互作用，从而推动其正常功 能的发挥。 1 2 2p b a n r 的研究 p b a n r 的结构 目前，认为7 次穿膜结构域是各种蛾类p b a n r 共同的结构特征。如玉米夜蛾的 p b a n r 包括胞外结构域、脂双分子层结构域和胞内结构域，其中脂双分子层中的结 构域即7 次穿膜结构域。c h o i 等( 2 0 0 7 ) 发现玉米夜蛾的p b a n r 的二级结构与黑腹果 蝇d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rp k l 一r 氨基酸残基有较高的同一性，如图1 中玉米夜蛾 与黑腹果蝇的p b a n r 氨基酸序列，相同的氨基酸序列已用黑色标示出：从克隆 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 图1 玉米夜蛾p b a n r 的二级结构模式图( c h o ie ta 1 ，2 0 0 7 ) f i g 1s c h e m a t i