（农药学专业论文）气相色谱质谱法快速测定蔬菜中农药多残留方法研究.pdf

摘要 随着人们对健康的天 i - 以及进出口贸易的发展变得r 益重要，食品安全 问题同益受到广泛关汴，为此斟家以及各地方出台了繁多的相关技术标准， 如何在尽可能短的分析时问内检测m 食品中所含有的多种类的残留农药是 目前迫切需要解决的问题。 本文根掘有机农药的质谱裂解规律，建市了蔬菜中2 8 种农药的气 h 色 谱一质谱法的快速检测方法，包括8 种有机磷杀虫剂、7 种有机氯杀虫剂、3 种氨基甲酸酯类杀虫剂、7 种拟除虫菊酯类杀虫剂、3 种杀菌剂。对样品的 提取、净化、浓缩等前处理过程进行了优化，对整个实验方法的准确度、精 密度、灵敏度等各方面进行r 全面的验证。 存测定方法上，确定的优化色谱条佴：确定色谱杠为毛细管柱h p5 m s p h e n y ls i l o x & r l e ，3 0 m x0 3 2 r a m 0 2 5u i n ：载气：氦气；进样方式：不分 流进样；进样体积2ul ：流速1 i m l m in ；进样口温度2 5 0 。c ；程序升温： 7 0 ，2 m i n ：2 0 m i l l ，1 4 0 ；10 m i n ，1 6 5 ，2 5 m in ：3 m i n ，1 9 0 ：5 m i l 3 ，2 2 0 。c ：1 0 。c m i l 3 ，2 7 0 ，7 1 7 m i l 9 ( 共3 7 o o m i n ) 。优化的 质谱条件：色潜一质谱接口温度：2 8 5 。c ：离子源温度：2 3 0 。c ；四极打温度： j5 0 ；离子化方式：e i ；电子能量：7 0 e v ；光它倍增管：1 9 1 8 m y ；采集方 式：选择离子监测方式( s i m ) 、仝扫描方式( s c a n ) m z5 04 5 0 ；溶剂延迟： 3 m in ；调谐方式：自动调谐。 对于前处理过程，本文通过系列对比实验确定如下方法：采用丙酮和 二氯甲烷( v v ，3 2 ) 的混合溶剂提驳样品中农药，再用助滤剂( c e l i t e 5 4 5 ) 和活性炭( m m ，7 3 ) 的层析村净化，最j ，内酮和_ 氯甲烷( v v ，1 1 ) 的混合 溶刺作为洗脱液洗脱。气相色谱一质谱法在选择离了模式下进行快速测定， 以保留时问利特征离子进行定性、定量。划黄瓜、甘蓝两种蔬菜样品进行添 摘堂 加回收率实验，分别添加0 2m g k g 、0 1 m g k g 、0 0 5 m g k g ，平均回收率在 7 2 1 0 8 之间，变异系数为24 5 1 9 1l 。大多数农药的回收率、变异系数 都很理想但个别农药如氯氰菊酯、氰戊菊酯的一个异构体的前处理效果不 理想，需要改进。 本文所建立的实验方法灵敏、准确、可靠，基本上满足蔬菜中多种农药 钱留快速检测的要求，具有广泛的应用前景。 关键词气相色谱一质谱法；蔬菜；农药；多残留；检测 沈阳农业人学帧 学位论文 第一部分前言 一、我国使用农药现状： 我国是世界上最早使用农药防治农作物有害生物的国家之一，也是农药 生产和使用的大因。农药在保汪农业丰收，促进高产，优质，高效现代化农 业的发展，以及满足人们对农副产品的需求等方面所发挥的确定性作用是众 所周知的，可以醴，农药已成为我囤农业生产中不可缺少的生产资制。 1 9 8 3 年以前，中田推广使用的农药品种约1 0 0 种，年均用药量在2 0 万 t 。按排毒系数他测，有机氯农药( o r g a n o c h l o f jf i ep e sl ic i d e s ，o c p s ) 占农 药排毒系数的6 5 ( 六六六占5 i 、滴滴涕占1 1 ) ，有机磷 ( o r g a n o p h o s p h o r o usp e s t i c i d e s ，o p p s ) 占3 0 ，其它占5 ) ( 姚建仁 等，2 0 0 3 ) 。无疑有机氯农药是丰要污染源。自1 9 8 3 年中国开始禁止生产有 机氯农药以后，中国农药的品种结构发生了重大变化，投入市场的品种已达 2 0 0 个左右，年均用量在2 7 力- t 左右，依排毒系数估测，依次为杀虫剂、杀 菌剂、除草剂和植物生长调节剂。在杀虫剂中用量较大的是有机磷农药、氨 基甲酸酯类农药( n - m e t h y lc a r b a m a t ep e s t ic i d e s ，m c p s ) 和拟除虫菊酯类 ( p y r e t h r o i dp e s t ic i d e s ) 。 然而绝大多数农药都是肯毒的，科学试验表明农药施十农作物上有 1 02 0 附着在作物本体上，其他8 0 一9 0 的农药散落在农作物的j 土j 边环城农 田土壤中飘落在大气中。生物本体及其生活环境中的农药量经过降解、代 谢等作用，其含量会降低到 定的水平，我们把残存在环境中和牛物体内的 微量农药，称作农药残留，它包括农药原体及其有毒代谢物和杂质。农药贱 留量与农药本身的理化性质、作物种类、施药冈素、环境条件和气候等有关。 农药残留不仅污染环境危及生物生长 的顶端人体之内，危及人类健康 同时最终也通过食物链聚积在食物链 造成慢性中毒。 二、有机氯、拟除虫菊酯类、有机磷、氨基甲酸酯类农药 及残留现状 ( 一) 有机氯农药及残留现状 有机氯农药包括有机氯杀虫剂、有机氯杀螨剂、有机氯杀菌剂和有机氯 熏蒸剂，其中杀虫剂是重要的组成部分。 随着公众环保意识的增强，现在人们普遍关注持久性有机污染物 ( p e t s is t e n to r g a n i cp o l l u t a n ls ，简称p o p s ) ，此类农药就是其中一部分。 它具有p o p s 的重要特征：能在坏境中持久的存在；能蓄积在食物链中对有 较高营养级的生物造成影响；能够经过长距离迁移到达偏远的极地地区；在 相应环境浓度下对接触该物质的生物造成有毒或有害的效应。这主要是出有 机氯杀虫剂的理化性质所决定的，冈为这一类农药化学性质稳定，在水中的 溶解度很低，在大多数有机溶剂中的溶解度很高，因而易被吸附在分散性的 颗粒物体上，不易分解，并能通过4 物富集与食物链促进其在动物体内积累。 并且降解的周期很长，一般有数年至二三十年之久。 有机氯杀虫剂是2 0 世纪4 0 年代发展起来的一类含氯有机杀虫剂。自 1 9 3 9 年发现滴滴涕的杀虫作用以柬，这一类杀虫剂在消灭农业、林业及卫生 害虫等方面发挥了很大的作用。o c p s 是中国最早大规模使用的农药，八十年 代初达到项峰。o c p s 为我国的农业发展写下了光辉的一页，同时也给我们赖 以生存的环境带来了难以弥补、修复的危害。2 0 0 1 年由1 2 7 个困家共同签署 的关于持久性有机污染物的斯得哥尔摩公约中首批控制的12 种p o p s 中 就有9 种o c p s 。针对目前o c p s 贱留现状，多数国家制定了高毒或残留严重 的中毒有机氯杀虫剂最大残留限量( m r l ) 以及一些常用有机氯杀菌剂、杀螨 剂m r l 。 目前，蔬菜中有机氧农药m r l s 限制如下： 表1 ，1 蔬菜中有机氯农曲最人残留限革 t a b l el 一1m r l so fo r g a n o c h l o r i n ep e s t i c i d e si nv e g e t a b l e s ( 二) 拟除虫菊酯类农药及残留现状 拟除虫菊酯类农药辛要包括杀虫剂、卫生杀虫刺：多数是低毒，但也有 中毒农药，例如氯氰菊酯、顺式氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、顺式氰戊 菊酯、联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氰戊菊酯等；并且还有一种 高毒农药，七氟菊酯。 除虫菊是一种天然的触杀性杀虫剂，是防治蚊、蝇、虱、蚤卫生害虫、 蔬菜害虫、储粮害虫的理想药剂，具有高效、低毒、击倒快、残留少、对人 畜安全的特点。其缺点是残效期短，易分解失效。2 0 世纪7 0 年代，对除虫 菊的研究有了突破性的进展，合成拟除虫菊酯类农药多种，是人类研究杀虫 剂的新的罩程碑。8 0 年代以来，该类杀虫剂的研究与丌发速度远远超过其它 任何一类杀虫剂，商品化的品种达4 0 余种，其使用面积占杀虫剂总使用面 积的2 5 ，已成为防治卫生、农林害虫的主要药剂之一。 拟除虫菊酯的通性是，都有触杀、胃毒作用，理论上没有内吸、熏蒸作 用。杀虫谱厂，对鳞翅目幼虫有特效，对同翅f 1 、半翅目、膜翅目、鞘翅目、 双翅曰也有一定杀虫特效。药效高，低毒。对光、热稳定，不易分解，能附 着在植物表面，不易被水冲刷，故残效期长，对作物安全。长期连续使用害 虫会产生抗药性，应与其它多种农药交替、连续使用。不能与碱性农药使用。 目i i ，蔬菜中拟除虫菊酯类农药m r l s 限制如下： 第一部分前言 表l 一2 蔬菜中拟除虫菊酯类农鲥晟人残留限苗 t a b l el 一2m r l so fs y n t h e t i cp y r e t h r o i dp e s t i c i d e si nv e g e t a b l e s 农药名称屉人残留限( m g k g )农药名称 最大妓留限( m g k g ) p e s t l e 】d en a m e 氟氰戊菊酯 瓶氯篙【蓊酯 顺，氰戊菊酯 顺j 氯氰菊酯 氯氰菊能 氯菊酯 p e s f l c i d en a m em r l 氰此菊酯00 5 澳氰菊酯02 联苯菊酯05 氟胺氰菊酯1 0 ii讯葡酯05 ( 三) 有机磷农药及残留现状 自二十世纪三十年代，德国g s c h r a d e v 首先发现有机磷杀虫剂后，己 经历了七十余年的历史。几十年来，由于此类农药具有蓟效较高、使用方便、 不少产品具内吸作用、易在自然条件下降解等特点，使其从品种、产量两方 面都成为了各类农药及杀虫剂之首。 在充分肯定上述o p ps 突出优点的同时，也必须指出其明显存在的不足： 1 缺乏选择性。在生产、运输、保管、销售和使用中，若出现粗心大意能 造成人畜中毒，甚至死亡外；同时，对非靶标生物如害虫的捕食性天敌，如 青蛙、蜘蛛、蜂类等以及寄生性天敌，如寄生蝇、线虫等，在杀死害虫的同 时也常常将这些天敌杀死。对除草刺的选择和用量，也必须科学合理，否则， 也会发生草茁一同除掉的现象。2 农药的残留物和残毒问题突出。当前是 人们同益关注环保和生态建设问题的时代，由于无公害、无污染、安全、优 质和营养的绿色食品，日益受到人们的欢迎和青睐，很明显，任何不易降解 有残毒的农药，均禁用在绿色食品巾。这必然迫使有机磷农药，尤其一些剧 毒性农药，应首先要被一些无线毒问题、高效、安全的新农药所逐步取代， 这是大势所趋。3 农药抗药性更大。由于长期使用有机磷农药，一些农作物 l 2 2 0 2 5 o m o 0 2 0 0 沈m 农业入学坝i 学位论义 害虫、病原菌和田问鼠类，对农药产生了抗药性。若要有效的防治害虫，只 有加大药量，这样必然造成害虫的抗药性更大，农民的负担也加重，环境污 染加剧，对非靶标生物伤害更多的恶性循环。 月前，蔬菜中有机磷农药m r l s 限制如f ： 表卜3 蔬菜中何机饼教约最人残留限晕 t a b l el 3m r l so fo r g a n o p | 1 0 s p h o r u sp e s t i c i d e si nv e g e t a b l e s ( 四) 氨基甲酸酯类农药及残留现状 目前，作为农药使用的氨基甲酸酯类化合物约有5 0 多种，主要是杀虫 刺、杀螨荆，也有除草剂和杀菌剂。此类农药能迅速从有机体内排出，因此 对动物和人均较安全。 在大气中，此类化合物会被光解、水解或被空气氧化。在周围的其他介 质作用下，此类化合物的水解、氧化时，也会因其结构小同而发生其他反应。 在d 48 的范围内，氨基甲酸酯类化合物不会产_ 二电离，故而，其吸附作用 基本上为非离子型反应。此类化合物大多溶解度较低，住水中溶解度仅为 6 一l o g l ，但酯类例外。 在上壤中，出于微生物的影响，氮基甲酸酯类会迅速分解，最终生成c 0 z 、 n ，、0 。等简单化合物。这种分解速度与温度、湿度及本身结构有关。分解过 笫一部分前高 程分几个阶段，其生成小同代谢物。在干燥土壤中，其分解速度低十湿润土 壤。另外，微生物种类对分解的影响办很大。 目前，蔬菜中氨基甲酸酯类农药m r l s 限制如下： 表卜4 蔬菜中氦基甲酸酯类农药最人残留限量 t a b l ei - 4m r l so f c a r b m n a t ep e s t i c i d e si nv e g e t a b l e s 三、关于农药多残留分析 ( 一) 关于有机氯农药残留分析 目前，我国关于0 c p s 的国家标准有1 8 个，主要检测六六六、滴滴涕， 还有五氯硝基苯和氯化苦：检测的样品包括烟叶、原油、食品、肉及肉制品、 水、饲料、粮食、蔬菜、海产品、纺织品、空气、土壤、生物质量等；大多 数采用g c 法、还有库仑计法。 国内o c p s 残留分折主要集中在中药材、茶叶、蔬菜、水果四类，其中以 中药材居多，如余建新等( 1 9 9 9 ) 人用大口径毛细管气相色谱法测定果蔬、油 脂中2 0 种o c p s 残留，刘长武等( 2 0 0 3 ) 用气谱法测定蔬菜水果中2 5 种o c p s ， 张曙明等( 1 9 9 8 ) 气谱法测定甘草中1 5 种o c p s ，周洪斌( 2 0 0 0 ) 测定果蔬中1 6 种o c p s ，李月茹( 2 0 0 2 ) 测定桔梗中9 种o c p s 等等。 实验涉及我们所关心的高毒、中毒的所有o c p s ，包括a 一六六六、1 3 六_ 八人、y 一六六六、6 六六六、滴滴涕、艾氏剂、异艾氏剂、狄氏剂、异 狄氏剂、七氯、环氧七氯、毒杀芬、盘氧硝基苯、林月、氯月、硫丹、硫丹 硫酸酯、三氯杀螨醇、三氯杀螨砜。 o c p s 多残留分析方法仍采用常规的步骤：提取剂采用丙酮、丙酮与石油 沈m 农业人学顺i 学位论文 醚、丙酮与二氯甲烷、丙酮与水、乙腈、乙脖与水等，提取剂加入样品中匀 浆再抽滤或将提取剂加入盛有样品的玻璃器皿中进行超声提取，多次重复。 液一液萃取发生乳化现象时，需要加n a ! s o i 或c a c = 破乳。提取液再浓缩， 用一种溶剂石油醚或汇己烷定容。净化时，多采用弗罗单层析柱，用量一般 是5 9 ，有的需要不同程度的活化。试液过柱i 口，一股用正己烷、石油醚或是 与无水乙醚、乙酸乙酯的混合溶剂淋洗过柱。然后试液过柱。最后用极性相 对于淋沈液高一些的混液沈脱，一般把待测物质沈脱下束，而杂质保留在柱 上：电有相反的。洗脱液最后再浓缩，用右油醚定容，上机测定。有的实验 h 法不用过层析柱，利用0 c p s 对酸稳定的性质，采用磺化法净化。检测使 用的色谱柱有填充柱或毛细管柱，如h p l 、h p 一1 0 1 、h p i7 等，使用的检测 器是电子捕获检测器e c d 。需要程序升温。检测时问需要2 0 4 0 m in 。 ( 二) 关于拟除虫菊酯类农药残留分析 目前，国家标准只有1 2 个，包括氰戊菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯的测定， 涉及食品、烟草。采用的方法多是g c 。 国内拟除虫菊酯类农药残留分析多研究中药材，只有少数是有关蔬菜、 水果的。高天兵等( 1 9 9 9 ) 测定中药材中3 种拟除虫菊酯类农药残留，黄雅俊 等( 2 0 0 3 ) 用气相色谱法测定茶叶中7 种，明九雪等( 1 9 8 9 ) 填充柱气相色谱法 测定果蔬、土壤、水样中6 种。邱月明等( 1 9 9 4 ) 用超临界流体萃取法测定粮 食、谷物中3 种。 实验中所研究的农药多是中毒农药，如甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、 氰戊菊酯、功夫菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯；也有低毒的丙烯菊酯、胺 菊酯。实验所使用的仍是经舆的步骤：提取、净化、浓缩。提取剂多用丙酮、 石油醚、正己烷或是它们两两之嵋j 的混合溶剂，提取剂加入样品中匀浆再抽 滤或将提取* f j h u a 盛有样品的玻璃器皿c p 进行超声提取，多次重复。液一液 萃取发生乳化现象时，需要加n a ，s o ，或c a c l 破乳。提取液再浓缩，用种 溶刺石油醚或异辛烷溶解。净化时，多采用弗罗旱层柝植，也有采用活性碳 第一部分前 层析柱、氧化铝层析柱，有的需要不同程度的活化。试液过柱前，一般用石 油醚淋洗过柱。然后试液过柱。最后用极性相对于淋洗液高一些的混合溶剂 洗脱，如石油醚与乙醚的混合，或是与乙酸乙酯混合。一般把待测物质洗脱 下来，而杂质保留在柱上，也有相反的方法。洗脱液最后再浓缩，用石油醚 定容，上机测定。使用的色谱柱一般为毛细管柱或填充柱，固定相极性是中 等极性或较弱极性，如0 v 1 7 0 1 、s e 一5 4 、0 71 7 等，使用的柱子有p e 一5 、r t x 、 0 v 1 7 、h p 一5 等。多使用e c d 检测器，检测时间需要2 0 3 0 m i n 。 ( 三) 关于有机磷农药的残留分析 目前，o p p s 残留分析主要有四种方法：薄层色谱法快速、简单，在o p p s 确证实验以及野外现场分析中有较多应用，但检出灵敏度和专一性差；气相 色谱法( g c ) 作为o p p s 分析的常规方法在o p p s 残留量分析中的应用最为广 泛，常用氮磷检测器( n p d ) 或火焰光度检测器( f p d ) ，可以实现大多数o p p s 的低残留水平分析；高效液相色谱法( h p l c ) 对于g c 法分析时热不稳定和 或极性较强以及易于在色谱柱上发生吸附的o p p s 分析己显示出明显的优 势；酶抑制法，利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的特异抑制作用发展的酶化 学比色分析法，已广泛应用于痕量和微最o p p s 及m c p s 残留的检测，此方 法简单快捷，适于现场快速检测。 实验室方法开发多着重于蔬菜及中草药，一次测定的品种多达二十几 种。潘元海等利用液相色谱一质谱法( l c m s ) 快速分析水中痕量o p p s ，一次联 机分析仅需1 0m in 。冯秀琼等采用微波辅助提取，c 。一砖胶s p e 柱串联净化， 气相色谱法测定中草药中14 种o p p s 残留量。 样品前处理过程中，提取剂是丙酮、乙酸乙酯或_ 二氯甲烷。净化过程使 用的层析柱多是弗罗罩柱、c 。柱、硅胶柱、c 。、+ 硅胶串联柱或是活性炭 + c e l i t e 5 4 5 的混合柱。沈脱液多是丙酮、丙酮+ 二氯甲烷、丙酮+ 乙酸乙酯等。 常用g c 法+ 毛细管柱，色谱柱固定液有s p b 1 7 0 1 、b p l 0 、c a r b o w a x2 0 m 、b p 1 0 、 沈阳农业人学坝i 学位论史 h p l 7 0 1 ，进样口温度2 10 一2 5 0 。c ，检测器温度2 1 0 一2 8 0 ，柱温5 0 一2 3 0 。 ( 四) 关于氨基甲酸酯类农药残留分析 氨基甲酸酯类农药的测定有很多方法，例如分光光度法、高效液相色谱 法、气相色谱法、超流界流体色谱法、薄层色谱法、免疫检测法等。测定的 样品包括蔬菜、水果、乳制品、水、血浆等。 目前，大多数m c p s 采用h p l c 检测，采用c 。或c 。柱，常用流动相是甲 醇+ 水或乙腈+ 水。早期常用的是紫外检测，近年来多采用二极管矩阵检测器， 或柱后水解和衔生后进行荧光检测。 i c p s 在g c 中不稳定，即使在选择柱条件方面下很大功夫，仍小可避免 m c p s 的分解，于是考虑将m o p s 完全水解，以测定n m c s 的甲胺或酚部分，或 通过热稳定衍生，对不发生分解的n m c s 直接进行测定。冷柱头进样c 0 1 do n c 0 1 u m nj n j e c t ( o c i ) 是分析热敏化合物最好的进样技术，不会在进样过程 中产生降解。m a t t e n 等采用毛细管g c 、o c i 进祥技术和化学电离离子阱检测 器分析了植物组织中西维因、吠喃月和其它农药。 在样品的前处理方面，对土壤及植物样品中m c p s 残留的分析，传统的 方法是溶剂提取附加一些物理方法( 如振摇、索氏提取) ，然后纾过净化除去 干扰物，最后进行色谱分析。m c g a r v e y 曾对水、土壤和植物样品的检测从提 取、净化、回收和灵敏度各方而做了总结。多残留分析中，最常用的提取试 剂有丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙腈、乙酸乙酯、甲醇等：最常用的净化步 骤是液一液分配( l l p ) 后经过十t 层析或田相萃取( s p e ) 分离。l l p 常用的溶剂 有二氯甲烷、石油醚、己烷和乙腈，柱层析常用的填料有弗罗皂、c e l i t e n u c h a r 、硅胶和氧化铝，经常用于m c p s 的s p e 小柱包括c 。和氨基丙基键合 砖胶。 四、现代农药残留分析先进技术及发展趋势 第部分前高 农药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术，它要求精细 的微量操作手段，灵敏度高，特异性强。由于各类食品样品组成成分复杂， 而且不同农药品种的理化性质存在较大差异，因而没有一种多组分残留分析 方法能够覆盖所有的农药品种。现代农药残留分析主要是多残留分析，回收 率高，重现性好，低检出限，操作简单易行。 食品样品中农药提取、净化等自u 处理方法有其特殊性，对于小同性质样 品中的不同目标物需要采用不同的前处理技术。农药残留分析大多采用有机 溶剂提取目标分析物，但是溶剂提耿主要存在下列问题：选择性差。提取 时带进大量的共提物，需要进一步的分离净化：溶剂消耗大。一般一个样 品的前处理要耗费几百毫升溶剂，既浪费了溶剂义需要浓缩，费时，繁琐： 溶剂毒性大。很多溶剂如甲醇、一氯甲烷、乙腈等具有毒性，对操作人员 健康不利，造成环境污染。随着科学技术的进步，操作简便、具有选择性萃 取的新技术、高灵敏度的检测方法不断出现，如：超临界流体萃取( s f e ) 、 固相萃取( s p e ) 、气相色谱液相色谱一质谱联用、凝胶渗透色谱法( g p c ) 、 吹扫蒸馏、直接光谱分析、毛细管电泳( c e ) 、免疫分析技术( i a ) 等。 目前，农药残留分析总的发展趋势有以下几个方面： ( 1 ) 应用简便、快捷的分析方法进行现场初测，成本低，结果准确可 靠，对呈阳性反应的样品进行实验室进一步确证。 ( 2 ) 提高检测技术的灵敏度，满足食品农残分析中越柬越低的检测下 限要求。用内标法代替过去的外标法。 ( 3 ) 前处理工作正向着省时、省力、低廉、减少溶剂、减少对环境的 污染、系统化、规范化、微型化和自动化方向发展：各种在线联用技术可避 免样品转移的损失，减少各种人为的偶然误差，将是农药残留分析方法研究 的重点。 ( 4 ) 将生物技术与现代理化分析手段相结合，不断丌发出新的分析技 术，对于极性强、难挥发、热不稳定、易分解的农药残留分析有着得天独厚 的优势，发展迅速，前景诱人。 沈阳爪业人学坝卜学位论文 ( 5 ) 现代生物源农药将逐渐取代化学农药，分析重点将从低分子有机 物转向与生物组织成分很难区分的生物大分子农药，因此未来的分析工作将 涉及细胞化学、发酵化学、免疫化学等方面。 五、本项研究的目的和意义 走可持续发展的道路，是我国农业发展的必然选择。当前我国农业的发 展面临着需求、资源和环境约束。一方而，我国农产品供给己山短缺转向总 量基本平衡，丰年有余，市场需求对农业发展的约束作用越来越强；另一方 面，水资源短缺，水土流失生态环境恶化，基础设施萎缩，特别是受坏境污 染的影响，农产品中残留的有毒有害物质的增加，影响着农产品质量和效益 的提高，也制约着农业的可持续发展。农产品供求关系的重大变化和生态环 境的恶化，决定了农业必须推进产业化，必须将农业生态和环境质量安全作 为农业标准化体系的重要内容，为提高农业经济安全运行质量，促进资源的 合理丌发与利用，提供有力的保障。 9 0 年代以柬，我国虽在这方面积极丌展工作，并在某些方向取得了显著 的成绩。但是，从总体上看，面对农业结构性战略调整，面对农产品全球性 竞争愈演愈烈的新形势，我国农业杯准化工作显得十分不适应。如农业质量 安全标准普遍低于国际的标准，使农产品的出口受到严重影响：农业标准体 系不够健全，监测机构和法规体系不完善；监测手段落后，现代化装备水平 低，缺乏客观、公正、科学的依掘，从而导致农产品分级不严，质量小高， 安全性较差，搀杂使假现象严重等问题。因此，这方面的工作任重道远。 为进一步完善有关农产品质量标准体系和标准化工作水平，针对分析方 面，我们所能做的就是研究农产品中有毒有害物质残留等涉及质量安全方面 的限量标准及配套的检测分析方法；研究和丌发适用于现场应用的快速检测 技术和设备。本谍题是关丁“快速测定蔬菜中农药多残留”方法的研究，是 国家农业标准化制定项目，因此具有重大的社会意义和经济效益。 第部分头验 第二部分实验 一、方法原理 蔬菜中2 8 种农药残留量的快速测定方法。采用丙酮和二氯甲烷( v v ， 3 1 2 ) 的混合溶剂提取样品中农药，再用助滤剂( c e l i t e5 4 5 ) 和活性炭 ( m m ，7 3 ) 的层析柱净化，最后丙酮和二氯甲烷( v v ，】1 ) 的混合溶剂作 为洗脱液洗脱。气相色谱一质谱法在选择离子模式下进行快速测定，以保留 时问和特征离子进行定性、定量。 二、实验用品 ( 一) 实验材料 农药标准品：敌敌畏( d i c h l o r v i s ) 、甲拌磷( p h o r a t e ) 、二嗪磷( d i a z i n o n ) 、 百菌清( c h l o r o t h a l o n i l ) 、抗蚜威( p i r i m c a r b ) 、甲萘威( c a r b a r y lj 、 杀螟硫磷( f e n i t r o t h i o n ) 、马拉硫磷( m a l a t h i o i l ) 、倍硫磷( f e n t h i o n ) 、 对硫磷( p a r a t h i o n ) 、三唑酮( t r i a d i m e l o n ) 、联苯菊酯( b i p h e n t h r i n ) 、 甲氰菊酯( f e n p r o p a t h r i n ) 、氯氟氰菊酯( c y h a l o t h r i n ) 、氯菊酯 ( p e r m e t h r i n ) 、氯氰菊酯( c y p e r m e t h r i n ) 、氰戊菊酯( f e n v a le r a t e ) 、溴 氰菊酯( d e l t a m e t h r i n ) 均1 0 0 0 0 g m l 标准溶液，购自农业部环境保护 科研监测所。 农药标准品：克百威( c a r b o t 、l 小l n ) 、o 一六六六( qb t i c ) 、乐果 ( d i m e t h o a t e ) 、口一六六六( bb h c ) 、y 六六六( y b h c ) 、血氯硝基苯 ( q u i n t o z e n e ) 、o p 一滴滴伊( o p 一d d e ) 、p p 一滴滴滴( p p d d d ) 、o p 一 滴滴涕( o p 一dd i ) 、p p 滴滴涕( p p d d t ) 均固体标准品( 纯度 9 8 5 ) ， 购自农业部环境保护科研监测所、s i g m a 公司。 蔬菜样品一甘蓝、黄瓜市场随机购买 沈m 农业人学坝i 学位论文 ( 二) 主要试剂 丙酮分析纯 ，二氯甲烷分析纯 乙腈分析纯 石油醚分析纯 甲苯分析纯 丙酮色谱纯 石油醚色谱纯 氯化钠分析纯 无水硫酸钠分析纯 5 5 0 。c 灼烧4 h ，冷去后，密封，备用 ( 三) 其它实验用品 沈阳化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 天津市天河化学试剂厂 天津市化学试剂研究所 天津市化学试剂研究所 天津市 天津市 沈阳沈一精细化学有限公司 沈阳沈一精细化学有限公司使用前 氧化铝层析用上海上四化学试剂厂 助滤剂( c e i t e5 4 5 ) 中国医药公司上海化学试剂采购供应站 活性炭层析用中国医药公司上海化学试剂采购供应站使 用前6 0 0 c 灼烧2 h ，再用浓盐酸煮沸3 0 m in ，蒸馏水水洗至中性，最后13 0 烘干，冷却后备用。 玻璃层析柱1 5 m m l d 1 8 0 m m 三、仪器设备 6 8 9 0 气相色谱仪，含质谱工作站a g i1e n l 公司 5 9 7 3 n 气相质谱仪a g e n t 公司 s a t o rjl i s1 6 0 2 电子分析天平( 万分之一精度)德国制造 a n k et d l 一4 0 b 型离心机上海飞亚医药公司 s h zd ( 1 1 1 ) 型循环水式真空减压装置河南巩义英峪予华仪器厂 z k 高速自控组织捣碎机江苏省盐城市龙岗医疗器械厂 第一部分实验 k q3 0 0 d e 型医用数控超声波清洗器江苏省盐城市龙岗医疗器械厂 旋转蒸发仪 减压蒸干装置 索氏提取器 m i l l iq 去离予水系统m i l li p o r e 公司 b r a n d 微量移液器德国制造 质谱柱h p 一5 m sp h e n y ls il o x a n e3 0 m 0 3 2 m m 0 2 5 帅 氨气9 9 9 9 9 纯度 四、样品前处理 ( 一)提取：匀浆样品l o g 置三角瓶中，加入6 0 r a l 丙酮和4 0 m l 二 氯甲烷，超声l o m i n ，再加入2 9 氯化钠并超声5 m i n 。吸取大约4 2 m l 有机层 到4 5 m 1 的离心管，加入无水硫酸钠使液面达到4 5 m l 刻度处，盖盖，摇匀， 高速离心5 m i n 。准确量取3 5 m l 有机相剑鸡心瓶中，3 0 4 0 。c 浓缩蒸干至 0 5 m l ，。 ( 二)；争化：少量脱脂棉塞住层析柱l | ，加入l c m 高无水硫酸钠， 向柱内加少量石油醚，再将1 9 活性炭与助滤剂的混合物( m m ，3 ：7 ) 加入其 中使石油醚达到混合物的顶部，最后加入l c m 高的无水硫酸钠。 使用前，5 m l 石油醚活化，d h a 提取液，然后用5 0 m l 丙酮+ 二氯甲烷( v v ， 1 ：1 ) 洗脱，收集洗脱液，3 04 0 。c 浓缩蒸干。 最后用1 f n i ，丙酮定容，待上机测定。 五、试验方法 ( 一) 检测条件建立 1 色谱分离条件的优化 实验用2 8 种农药分类简列如表2 一l 沈m 农业人学 【! ； l 学位论义 表2 一i2 8 种农药分类 t a b l e2 - 1c l a s s i f yo f 2 8p e s t i c i d e s 农药分豢 c 1 a s s if yo fp e s ti c i d e s 何机氯 拟除虫菊酯类 农药名羁： p e s t i c i d en a m e d 一六六六、b 六 ，、y 一六六六、o 口浦淌伊、p p7 一滴滴滴、 o d 湍滴涕、p p 滴滴涕 联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯莴l 菊酯、氰伐菊酯、 溴氰菊酯 有机磷敌故畏 氰皋叩酸酯类 j l 它炎 甲拌磷、乐果、 嗪磷、杀蜞硫磷、马拉硫磷、倍硫磷 对硫磷、 兜丌威、抗蚜戚、叮| 蔫成 五氯硝皋苯、丌葡清、二畔削 不同种类农药的分离条件不同，见表22 。 最后拟采用色谱条件为： 进样口：2 5 0 柱流速：1 1 m l m in 色谱柱：毛细管柱h p 一5 m s 3 0 m 0 3 2 m m 0 2 5um 程序升温：7 0 ，2 m i n ：2 5 m i l q ，1 3 0 。c ；2 m i n ，2 2 0 。c ；l o c m i n ， 2 8 0 。c ，1 5 m i n ( 共7 0 4 0 m i n ) 质谱条件为： 色谱一质谱接口温度：2 8 5 离子源温度：2 3 0 。c 四极杆温度：15 0 离子化方式：e i 电子能量：7 0 e v 光电倍增管：1 9 【8 m v 采集方式：选择离子监测方式( s i m ) 、全扫描力式( s c a n ) m z5 0 一4 5 0 溶剂延迟：3 m i n 7 p 磊i u 。o o p o o 三f：po高苎昌pon) 身掣3。ont)三舌np。高 三山。三一三poo一一n u。o高三里u 一p戈n三3onpo一 一三暑pon兰三一po一一一 o_【no毋吣一+三 -o_16_；i型删叵 l一鼍舌撑瞥替 弓盖一譬心互 蓦c_x；一。n捌萼蚤一cj昌n量昌o舌一c_dh掣理霸岬 o_in圭0岫o t|之o豢一肇删五 星一x晨一丰十饕蚤 。一n_6loi_言譬心互 星n f_三n干錾聋。譬【j6一警删互量一岳劓掣普髻 c。nia暑器二。一当。誊警删亘 星n基c巾。颦整日鬻替 一c1山n o e e 三】n o 一占 兽：ds掣型纛忡 e1卜l|o量en o x e o e j昌o口邑n c o e o 岫 e10一ue一oeon 甲d掣型示!10一_d掣如焉悱。中呈掣型i呷 u o o n 。ooo昌 p o 器 蛭髑丑 糖球暑雁旧 磊营i 蕊球器坚弗罹 鬣译蓄罩年 蕊蛛翟承弹一牵 婚嚼；年 ) ( 】 一p 一靼丰 e e 三o u 掣 ! 习 kjp日hbep p-ohou。一o p一掣羽球毒蘸嚣颦 -11_dmal|p ；一三 一p一趟垂丁茸剖 口hu叫一n-oh一一u 粼末螺 暑!l!s苎苫u们墨。1ck拦lpcoll。o苟p。互dbj哥。苛eo。舌luu-gian三一 芒媒姆叫叵悻垤戈娶粼是叵专嚣钽甲“氍 掣林采茬1 牡 沈阳农业犬学硕l 学位论文 调谐方式：自动调谐 根据2 8 种农药标准品在此色谱、质谱条件下的实际保留时间，再进行 优化。 2 建立拟除虫菊酯类农药标准谱库 e l m s 中碎片较多，在农药的结构确证方面可提供丰富的结构信息，有 利于农药的定性及结构确证工作。鉴于实验室工作站农药标准库中只有2 2 种农药质谱图的情况，针对没有标准质谱图的农药，通过每种农药标准品 1 0ug m l 单标溶液在全扫描条件下来获得它们的质谱图。谱库中没有的农 药品种只是拟除虫菊酯类农药，包括：氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊 菊酯、联苯菊酯、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯。 3 定性分析依据 由于仪器检测常常受到样本杂质及周围环境因素的干扰，特别是气相色 谱、液相色谱检测多种残留农药组分时，往往几种农药或农药与样本中干扰 物的色谱峰具有相同的保留时间，所以必须对色谱峰进行确证。常用的方法 很多，可以使用色一质联用法，红外光谱法、核磁共振等进行结构鉴定；可 以采用共同色谱法，如多柱定性，用几根不同极性固定相的色谱柱测定，其 保留时叫分别与农药标准品相同：或以气相、液相、或薄层色谱法互相确证。 本实验，采用保留时叫与质谱双重定性。农药定性分析包括农药单标保 留时间、定性离子、定量离子、时问分组等方面。在一定色谱条件下，比较 全扫描方式( s c a n ) 和选择离子监测方式( s i m ) 所得的扫描图谱以及每种农 药的结构特性，再比较，最终确定保留时| 日j 、定性离子、定量离子、时间分 组。 4 定量分析依据 利用外标法定量。 配制一系列不同浓度的农药标准溶液。其浓度范围在检测器线性响应区 域内。在仪器稳定后，用微量注射器，注射相同体积的不同浓度的标准溶液， 籀一部分实验 进行气相色谱分析，测得的各峰的定量离子峰的丰度作为纵坐标，标准溶液 中的农药浓度作为横坐标，绘出标准曲线图。 将被测试样提取液( 与标准溶液相同体积) 注入色谱仪内。在色谱图上 测量定量峰面积，在从曲线上查出相应的农药浓度。 5 农药标准品的可靠性分析 ( 1 ) 线性范围 ( 2 ) 灵敏度( 仪器最低检出限) ( 3 ) 精密度( 保留时间) ( 二) 样品前处理方法优化 1 提取优化 ( 1 ) 提取溶剂的选择 当开发一个多残留分析方法的时候，溶剂的选择是个最关键的问题。 提取总的要求是尽可能的选择溶解残留危害物质及其代谢产物，而不溶解或 少溶解食品基体与杂质干扰物的溶剂作为提取剂。冈此，必须综合考虑多方 面，包括：能够覆盖整个待分析农药的极性( 例如，从极性端的有机磷到非 极性端的有机氯及拟除虫菊酯类农药) ，在提取、分配、净化过程中都可以 利用的选择性，提取剂的沸点、毒性、价钱等方面。 经常使用的多钱留分析溶剂足乙腈、丙酬、乙酸乙酯，这三种农药都有 很好的回收率：但考虑到选择性和实际应用，又都有一定的优点及缺点。例 如乙腈和丙酮与水易互溶，形成均体，只有当样品中含有较高的糖分时， 才会形成两相；丙酮需要另一种非极性溶剂束更好地分丌水相和有机相，而 乙腈则不需要；同丙酮、乙酸乙酯相比，乙腈萃取m 束的脂类物质更少一些， 与正己烷这类非极性溶剂可以很好的分层，这样有利于下一步净化：乙酸乙 酯在储存过程中易有酸性物质累积；同丙酮、乙酸乙酯相比，乙腈的缺点是 挥发性低，价钱贵，毒性高( m i c h e l o g e l oa x a s t a s s i a d e s 等，2 0 0 3 ) 。 沈阳农业人学硕 学位论文 l u k e 等在1 9 7 5 年提出，用丙酮代替乙腈，提取水果、蔬菜中有机氯、 有机磷、氨基甲酸酯类农药，共测定了二十八种农药残留量，回收率也很好。 不同种类农药的提取剂不同，见表2 3 。 表2 - 3 不同种类农妁的提取剂的选择 t a b l e2 - 3s e l e c t i o n so f e x t r a c t i n ga g e n to f d i f f e r e n ts o r t so f p e s t i c i d e s 农药种类 c 1 a s s i f v0 f 口p s llr i d e s 提取剂 e x t l - a c t l n ga g e r i 有机氯农药 拟除虫菊酯类农药 有机磷农药 氨摹甲暄酯娄农药 其它类农药 山削、山酬+ 白油醚、山酮+ 一氯r r | 烷，乙腈 内酮、内酮+ 矗油醚、右油醚、内利+ 正已烷 丙酮、乙酸己酯、二氧甲烷 内剩、一氯甲烷、石油醚、乙腈、乙酸乙酯、甲醇 内酮、一氯r p 烷、内酮+ 水 根据蔬菜样品的不同种类、特点以及农药不同种类的各自特点，选择两 种提取剂：丙酮+ 二氯甲烷混合提取剂、7 , j 青进行优化。 ( 2 ) 提取方法的选择 常用提取蔬菜样品方法有匀浆法、抽滤法、超声波提取法、过夜浸提法、 索氏提取法等。本实验对这四种方法进行对比，在其他条件小，叟的情况下， 比较回收率和操作的难易程度，选择最简便、回收率适宜的提取方法作为本 实验的提取方法。 2 净化方法的优化 对于蔬菜样品在提取后提耿液中除了残留农药外，还贪有色素和其他 天然物质。在测定之前，必须要分离除去干扰测定的杂质。这步操作称为 净化。 实验室罩常用的净化方法有很多例如液液萃取法、柱层析法、磺化法、 冷冻法等等。本实验测定的是农药多残留，液液萃耿法、磺化法不能满足大 多数农药的净化要求，而冷冻法又要求特殊的低温条件，所以选择常规的柱 层析法。 柱层析法有吸附柱层析法、分配柱层析法和凝胶柱层析法等。 吸附柱层析法：利用农药分子与杂质在吸附荆上的吸附一解吸附能力 第一部分实验 的不同而进行分离的净化方法。它是最常用的净化方法之一，常用的吸附剂 有弗罗里硅上、氧化铝( 中性、酸性、碱性) 、硅胶、活性炭、硅藻土等。 分配柱层析法：在柱层析内装惰性填充物( 称之为载体) ，在它上面牢 固地吸附着某一种溶剂。这种溶剂称之为静相溶剂。向柱内加入的淋洗溶剂 作为动相溶剂。分配柱层析法是先把静相溶剂涂到载体上，装入柱内，再用 动相溶剂淋洗。这时，试样中各组分在两相分配，经过反复分配，同样可以 达到净化目的。常用的溶刺有：乙腈一一己烷( 石油醚) 、二甲甲酰胺 己烷、二甲亚砜己烷( 石油醚) 。 凝胶柱层析法：将多孔凝胶填入柱内，用溶剂淋洗，利用凝胶的网眼大 小来筛分，使分子量大小不同的化合物达剑分离的目的。根据这种原理将要 测的农药与于扰物质分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶。 根据各类农药钱留常用净化组合表24 ，综合选择采用吸附层析柱法， 如表2 5 ： 表25 吸附层析柱法的吸附剂、活化剂、洗脱液的选择 t a b l e2 - 5s e l e c t i o n so f a b s o r b e n t ，c o n d i t i o ns o l v e n t ，e l u e n to f a b s o r p t i o nc h r o m a t o g r a p h y 通过试验优化，最后确定最佳的吸附剂用量及配比、淋洗剂用量及流速、 洗脱剂用量及流速等。 3 浓缩的优化 经过提取、净化后，待测液的体积不同。因此在进行检测前，需要 沐缩定容。很多研究结果指出，浓缩过程中待测物最容易损失。这就要求浓 缩过程中，要注意减少待测样品的损失，同时要求浓缩速度不能太慢。常用 的浓缩方法很多，如自然挥于、氮气吹干仪、减压蒸干、旋转蒸发、冷冻蒸 千等。 本实验主要考察了减压蒸下、旋转蒸发这两种浓缩方式。比较实验结果， ” 堰 兀 出 疆 匿 ， 】旺 ! 踞卧卧 皋球豫 球 西二，)蜗_己h+匿窿 一ion)匿rl+蟮叫薛 疆rz避f2+匿窿，堪鞣+匿窿，匿腔 糟心+裁要悼，龌心籍心+越最u 饕嚣舞n舻懵*鼎型鼙 蠼叫拦 埕衄嚣搿要峰 龌l z 溢z ，娃rz*懈 ，搿最悼，娱_己目 甓 ，甾蚓皇譬lio=一ou，酬盹豫 =no=1。竿聪型烬 ，誊哥釜世弋u，g栏：一鼍酬酞玳 唧弧荣，非s辑，聪蚶蜒 刚酞歌 特醐器1誊情 蜒耀阻 糯糕嚣谣醐城 蠕萑罨啦 5主球龌擦讲篮话 主嚓幂瓣 芒譬函 疑醛嚣 宣u 警 曲c兰譬q- 饕蠼蒸 co三口=ou 芒o q j 昌 plullsqa苫营器石 幂毒蝗