（微生物学专业论文）质粒在微生物采油中作用的探索.pdf

a b t r a c t a h y d r o c a r b o n d e g r a d a t i o n b a c t e r i a 1 6 - 1 , w h i c h c o n t a i n s a p l a s m i d , i s s c r e e n e d o u t w i t h t h r e e f a s t p l a s m i d d e t e r m i n a t i o n m e t h o d s . t h i s s t r a i n i s i d e n t i f i e d a s a p s e u d o m o n a s s p . t h e s i z e s o f t h i s s t r a i n s p l a s m i d i s a b o u t 9 . 4 k b . p l a s m i d e r a s i n g e x p e r i m e n t i n d i c a t e d t h a t t h e a b i l i t y o f d e g r a d i n g c r u d e o i l o f a p l a s m i d - f r e e s t r a i n 1 6 - 1 - 3 i s d e c r e a s e d . b y c o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f t h e a c i d , t h e g a s , a n d t h e a b i l i t y o f d e g r a d i n g l o n g f a t t y h y d r o c a r b o n c o m p o u n d a n d t h e e m u l s i f i c a t i o n a c t i v i t y , t h e m a i n c a u s e o f t h e d e c r e a s e i n 1 6 - 1 - 3 s a b i l i t y t o d e g r a d e c r u d e o i l i s t h e d e c l i n e o f t h e e m u l s i f i c a t i o n t h r o u g h t h e q u a n t i t y a n d a c t i v i t y . q u a l i t y a n a l y s i s a n d c h e m i c a l c o m p o n d a n a l y s i s , t h e b i o s u r f a c t a n t p r o d u c e d b y s t r a i n 1 6 - 1 a n d 1 6 - 1 - 3 i s g l y c o l i p i d . t h e f a t t y a c i d r e s i d u e o f i t i s o c t a d e c a n o i c a c i d , a n d t h e g l y c o s y l r e s i d u e i s r h a m n o s e . t h e e f f e c t i v e c o n t e n t s o f t h e g l y c o l i p i d p r o d u c e d b y 1 6 - 1 a n d 1 6 - 1 - 3 i s 2 g / l a n d 1 . 3 g / l . t h e c m c v a l u e s o f t h e i r g l y c o l i p i d a r e 9 9 m g / l a n d 1 2 0 m g / l . a c c o r d i n g t o t h e s e r e s u l t s , t h i s h y d r o c a r b o n d e g r a d i n g b a c t e r i a s p l a s m i d d o e s n o t d i r e c t l y a f f e c t t h e d e g r a d a t i o n o f l o n g c h a i n f a t t y a c i d a n d t h e a b i l i t y o f p r o d u c i n g g a s a n d a c i d . h o w e v e r , t h e p l a s m i d i s r e l a t e d t o t h e s t r a i n s a b i l i t y o f p r o d u c i n g b i o s u r f a c t a n t a n d t h e p e t r o l e u m e m u l s i f i c a t i o n e f f e c t . s o i t c a n b e a s s u m e d t h a t t h e g e n e i s p a r t l y i m p o r t a n t s t r ai n s . c o n t r o l l e d b y t h e p l a s m i d . r e f e r e n c e o n t h e c o n s t r u c t i o n t h i s r e s e a r c h o f b i o s u r f a c t a n t r e s u l t p r o v i d e s a n d s c r e e n i n g o f h i g h q u a l i t y m e o r k e y w o r d s : p l a s m i d m e o rg l y c o l i p i d , b i o s u r f a c t a n t 质粒在微生物采油中作用的探索 硕士毕业论文 前言 一、 微生物采油技术概述 在各种不可再生能源日 益枯竭的今天，全世界对石油开采给予了空前的关注 ( 1. 7 1 。 一 个油田 经过一次 采油 和以 注水 注气来 补充油层能量的 二次 采油以 后， 通 常还会有 5 0 % 以上流动性差的原油剩留在油藏中，这就促使人们大力开发三次 采 油技术。 三次采油的方法主要有化学驱油、 热力驱油、 混相驱油和微生物采油等， 但目 前除蒸汽热力驱油已 达工业规模外， 其它技术还处于试验阶段， 有若干技术、 经济问 题需研究解决。 在这些三次采油方法中， 最具前途的当属微生物采油技术， 其主要优点是 9 ) :可用于枯竭油井、 施工方便、成本低、 增采率高等，目 前己 成 为石油工业界研究的新热点。 微生物采油技术主要是将活的微生物注入油井或贮层中，以 提高原油的 产量， 其机理是 2 , 5 , 6 1( 1 ) 微生物分解烃类，降 低原油粘度，改善流动性; ( 2 ) 微生 物 能产生表面活性剂。生物表面活性剂是一种集亲水基团和亲油基团 ( 憎水基团) 于一身的两亲化合物 49 1 。非极性的亲油基团一般是一长链脂肪酸或是一个。 一 烷 基，0 - f 基脂肪酸;而极性的亲水基团则有多种形式。生物表面活性剂能形成 较强的乳化液，改变岩石表面的润湿性，降低岩石一 油一 水系统的界面张力，从而 有助于原油的开采;( 3 ) 微生物代谢产生低分子量的有机酸。 这些有机酸可有效 的 溶解储油岩层孔隙中沉积的 碳酸盐， 增加油层的 孔隙度和渗透率， 改善原油的 流 动 性: ( 4 ) 采 油 微生 物 产 生的c 0 2 , c 氏 ， 姨 ， n 2 等 气 体25 1 ， 可 增 加 储 油 层 压 力， 部分能溶于原油使其膨胀， 减低原油粘度，改善原油流动性。 在微生物采油技术中，所选用的菌种性状极其重要，它不仅必须适应油层的 温度、压力、矿化度、p h 值等物理化学条件，还需要有突出的降解和乳化原油的 能力， 这些性状优良 与否， 直接影响着增采的效果8 , 3 5 1 。因 此， 选用合适的 微生 物则成为整个技术的基础和关键环节。目 前，用于强化采油的微生物菌种通常是 自 然界筛选的混合菌， 绝大多数是从油井产出液， 油田 污水或其周围的污泥中分 离出来的，一般都能够在油藏条件下旺盛的生长繁殖，其代谢产物 ( 如气体、有 机酸、生物表面活性剂等)有利于提高原油采收率。但此类菌种存在一个缺点， 即菌种的组成比 例在使用中常发生变化，性状的稳定性差。国内外的研究和实践 证明:既能在高温高盐等复杂地层条件下生长又能 适应各种油藏的单一菌株极难 获得。 近年来，随着生物技术的发展，人们自 然的将目 光转移到菌种改良上来，以 质粒在微生物采油中作用的探索 硕士毕业论文 期获得符合要求的多功能菌株。因为石油微生物对烃降解存在 “ 共代谢” 现象， 所以烃降解的遗传系统比较复杂。已知有些微生物既可降解脂肪烃或芳烃，又可 降解合成的烃衍生物和氯化联苯等。降解这些烃类的基因既可由质粒控制也可由 染色体控制， 有时由 质粒和染色体共同控制， 这已 被大量实验证据所证明。 如1 9 7 3 年c h a k r a b a r t y等发现在腐臭假单胞菌中， 短链烷烃( c s c 砂代谢 的基因 都是质 粒 携带 的 ; 1 9 7 6 - 1 9 7 9 年s i n g e r 和f i n n e r t ， 等 证明 不 动 杆 菌h 0 ,- n 中， 所 有 十 六 烷 代 谢 基因 都 位 于 染 色 体 上; 1 9 7 9 年f e n n e w a l d 等 绘出 了 腐 臭 假 单 胞 菌p n g s 中 烷烃氧化所必须的位点的遗传学模型。随 着石油微生物遗传学研究的深入， 采 油 用工程菌的 构建将成为热门 课题2 + . 2 5 , 2 6 1 ， 例如有选择性降解作用的稠油降解工 程菌、高产大分子量聚合物的调剖工程菌或高产表面活性剂和酸以 及有机溶剂的 驱油工程菌等。 二、国内外进展 研究表明， 全球范围内 有4 0 0 6- 4 5 % 的油藏具有微生物采油的巨 大潜力，而微生 物菌种能否在地层条件下生长繁殖、代谢作用及代谢产物能否有效地改善原油流 动性质、改变界面性质，能否保持性状的稳定性是微生物提高原油采收率技术的 关键因素。目 前对采油微生物的生理学、遗传学研究都取得了一些进展。 ( 一)采油微生物生理学研究进展 采油微生物生理学的研究主要集中 在微生物代谢产物的分析( 1 9 3 。以 烃类为 碳源的采油微生物在模拟油藏环境下的代谢产物主要是有机酸、气体、生物表面 活性剂、有机溶剂、生物聚合物等。 这些研究皆 与阐述微生物采油机理相关。 采油微生物产酸主要指产低分子量的脂肪酸。 这些有机酸主要是乙酸、 丙酸、 丁酸及某些二元竣酸。 低分子量有机酸的测定方法国内 外已有不少报导， 通常是 将水样蒸馏浓缩后进行脂化萃取。等速电泳法测定短链有机酸的方法也己 有报导 (s 0 1 ， 该 法是 基于 有机 酸和 无 机盐 等 在有 机 溶剂中的 溶 解度不同， 先 用水 相蒸 发 法 将大量氯离子除去，利用两台等速电泳仪在多种电解质体系中可以 对短链有机酸 进行定性定量分析。 采油微生物产生的 短链有机酸可有效地溶解贮油岩层孔隙中 沉积的 碳酸盐， 腐蚀石英与碳酸盐表面， 从而增大孔隙 度与有效的渗透率，增加原油的流动性， 提高原 油 采收 率， 同 时 酸与 碳 酸盐 发生 化学反 应生 成c 0 2 , c o : 能 溶 于原 油 而降 低 原油的粘度。 采油 微生 物产生的 气体 主 要是c 0 2 , c h h 2 , n : 等 气体。 产生 气 体的 气 相色 质粒在微生物采油中作用的 探索 硕士论文毕业 谱分析多有报导。其采油机理主要是恢复贮油层压力， 气体在高压下溶于原油使 其膨胀，降低粘度，增加原油的流动性。 一 些研究 发 现3 3 烃类 可以 被 其降 解 细菌 通 过 末 端氧 化生 成 脂肪 醇、 脂 肪 酸、再通过p 一 氧化形成酞基辅酶a ， 直至最终被降解。而降解过程中，烃类化合 物的 憎水性是微生物进行代谢、降 解的主要障碍，因为 烃基质必须通过外层亲水 细胞壁 ( 膜) 才能进入细胞内而 被位于细胞质膜中的 烃降解酶所代谢。 最新的一 些研究结果表明 某些细菌可以通过产生表面活性剂而促使烃类乳化并被动扩散进 入细胞内，从而被降 解，所以 说微生物产生表面活性剂是降解烷烃的关键条件。 生物表面活性剂用于提高原油 采收率的 研究已 引 起广泛注意。 例如从按树叶毛虫 体内分离出的一种菌注入油层后产生了大量自然清洁剂，将原油采收率提高到 7 0 % e 采油微生物产生生物表面活性剂是其共有的生物学特性。生物表面活性剂是 微生物在特定条件下 ( 如合适的 碳源、氮源、有机营养物、p h 值及温度等)生长 过程中排出体外的具有表面活性的代谢物。同合成表面活性剂一样，生物表面活 性剂为既含亲水基又含疏水基的 双亲媒性结构。疏水基一般是脂肪酸或烃类;而 亲水基则多为 糖、多元醇、多糖及肤等。 根据其亲水基结构，生 物表面活性剂可 分为下述五类(3 4 ( 1 )以 糖为亲水基的 糖脂系;( 2 )以 低缩氨酸为亲水基的 酞基 缩氨酸系;( 3 )以磷酸基为亲水基的磷脂系;( 4 )以狡酸基为亲水基的脂肪酸系; ( 5 ) 结合多 糖、蛋白 质及脂的高分子生物表面活性剂即生物聚合体。 自 然界中能产生生物表面活性剂的菌种很多，如不动杆菌和微球菌可生产甘 油单酷;棒杆菌可生产甘油双酷;假丝酵母、 棒杆菌、 硫杆菌、及曲霉等能 产生 磷脂;糖脂是生物表面活性剂的一个大品种 ，红球杆菌、 节杆菌、分枝杆菌可 生产不同结构的海藻糖脂，假丝酵母、假单胞菌等能产生鼠李糖脂，节杆菌、棒 杆菌、 和红球菌生产葡萄糖、果糖、 蔗糖脂等。 生物表面活性物质有多 种提取方法， 采用什么样的 提取方法，要视生物表面 活性剂的性质，是水溶性的还是非水溶性的、是离子型还是非离子型、是胞壁结 合型还是胞外产物型而定。不同 类型产物有相应的分离方法，而没有共同的 分离 方法。除经典提取方法外， 最近还发展有随 程提取方法 3 9 ， 超滤提取方法， 如用 截留分子量为 5 0 , 0 0 0的超滤膜提取表面活性剂，可得 9 7 % 纯度的产品。鼠 李糖 脂用超滤膜分离时， 采用1 0 , 0 0 0 的 超滤膜， 收率为9 2 % ， 采用3 0 , 0 0 0 的 超滤 膜，收率为8 0 % ， 而用5 0 , 0 0 0 的超滤膜则收率仅有5 8 . 9 % e 生物表面活性剂的结构分析方法己日 趋成熟g 5 。为了 鉴定糖脂的结构， 在 酷键和 0 - 配糖键的鉴定中， 可用 t l c( 薄层层析)以 及糖、脂特异性鉴定试剂对 其鉴定。然后控制酸性或碱性条件下水解，分别鉴定糖基和脂肪酸结构。以混合 正构烷烃为碳源培养石油微生物时，会导致糖脂产物中出现混合脂肪酸残基，这 质粒在微生物采油中作用的探索硕士毕业论文 将使糖脂中脂肪酸结构分析的难度加大。除糖脂外， 氨基酸类脂的鉴定以 及脂肤 的鉴定方法也日趋成熟。 生物表面活性剂的效能是通过其浓度对表面张力的影响显示出来的。 c m c 临 界 胶 束 浓度) 值 是测 定表 面 活 性 剂 效率 最 常用的 数 值。 c o o p e r 16 1 和g o l d e n b e r g 报导了表面活性剂乳化性能评价的方法，用力振荡发酵液和等体积煤油的混合 物，过2 4 小时测量乳化效果。 生物表面活性剂的生成量受地层多 种因素的影响，国内 外对生物表面活性剂 的研究和开发多数还处于室内阶段，包括新型生物表面活性剂研制，最适生产条 件选择，结构剖析，性能改进，物化性能测试和室内驱油物理模拟。为了使表面 活性剂能更好的应用于油田开采中，一般从三个方面提高菌株的生物表面活性剂 生成率:( 1 )对生物合成进行控制，调控培养和发酵条件， 使达到最适条件:( 2 ) 用突变等手段筛选高产菌株;( 3 ) 用克隆、 放大、切除、转移基因等方法改变生 产菌基因达到高产。 通过突变等手段筛选高产菌株是微生物筛选中 常用的方法， 有时 可获得惊人 效果， 但这类方法的随机性和盲目 性较大。最近基因工程和分子生物学的进展已 使改变菌种的底物选择性和提高产率成为现实， 例如在 p s e u d o m o n a s a e r u g l n o s a ( 铜绿假单胞菌) 菌株中 插入e . c o l i 大肠杆菌) 的.1 a c 质粒， 便能使 其 具有利用工业废料生产鼠 李糖脂的能力。 总之， 采油微生物生理学方面的 研究以 产酸、产气、 产表面活性剂为主要研 究内容。 ( 二 ) 石油微生物遗传学研究进展 石油微生物遗传学研究主要是建立了细菌以 烷烃、蔡和水杨酸、甲 苯和二甲 苯三类典型烃类物质生长的 遗传学模型4 3 , 4 4 , 4 5 。 在这些研究中，以 解烃质粒的遗 传学研究为重点。 1 9 7 3 年c h a k r a b a r t y 报导了 第一个具有降 解功能的 水杨酸质粒 ( s a l ) . s a l 质 粒是 在 腐臭 假单 胞菌 ( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) r , 菌 株中 发 现的。 降 解水 杨 酸的 酶系位于一个分子量为五百道尔顿的质粒上。最近十几年来，由于分子生物学实 验方法的迅速发展， 特别是d n a 序列分析和重组d n a 技术的日 臻完善，极大地促 进了降 解质粒的 研究。 到目 前为止，己经发现的降解质粒有几十种， 择其主要列 于表1 (3 8 1 质粒在微生物采油中作用的探索 硕士毕业论文 表 1几种常见的降解质粒 降解物质粒分子量 细菌 水杨酸s a l5 1 m d 只p u t i d a r 1 樟脑 c a m1 5 6 m d 尸p u t i d a p p g i 辛烷 o c 1 一2 8 m d 尸p u t i d a p p g 6 蔡n a h 7 5 2 m d 只p u t i d a p p g 7 甲苯t o l7 8 m d 尸p u t i d a m t - 2 菲、联苯p k g 22 0 . 8 m d b e i j e r i n c k i a s p . 3 - 氯苯甲酸p a c 2 5 6 8 m d p . p u t i d a 2 , 4 - d p j p 4 8 0 k b a . e u t r o p h u s j m p 1 3 4 对一 氯联苯p a c 2 16 5 m d 尤p n e u m o n i a e a c 9 0 1 氟 乙 酸p u 0 1m o r a x e l l e s p . 3 ,5 一 二甲 苯酚p r a 5 0 0 5 0 0 k b 只p u t i d a n c i b 9 8 6 9 烟碱n i c尸c o n v e x a p c 1 芳基苯磺酸a s l6 1 m d只 t e s t o s t e r o n e 硫荀 d b t5 5 m d p s e u d o m o n a s s p . 苯胺p c i t 1 1 0 0 k b p s e u d o m o n a s s p . 苯乙酸p e g 3 7 k bp . f l u o r e s c e n a s t 对硫磷郎s 16 0 k 6只 d i m i n u t a 尼龙寡聚体p 0 a d 2 2 8 . 8 m d f l a v o b a c t e r i u m s p . k 1 7 2 ， j. j一互 /、/、/、p 昵1a e r o m o n e s s p . i i 5 - a 1 质粒的提取 在降解质粒研究的初期，一般是通过遗传学方法 ( 质粒消除和转移)证明质 粒的 存在m l , 1 9 7 6 年p a l c h a u d l u r i 设计了 一种分离c a m , s a l 、和。 c t 质粒的 方 法， 制备出 纯化的闭 合环状d n a 。 后来h a n s e n 采用p e g 6 0 0 0 沉淀和c s c l 密度梯 度离心分离并纯化细菌大质粒， 收到了较为理想的效果。此外 c a d 。报导了一种 对大质粒和小质粒都适用的快速检测和分离方法。我校蔡宝立、高才昌教授发展 了 一种简便快速， 既可用于检测又可用于制备的 假单胞菌大质粒分离方法 3 q . 随 着降解质粒分离方法的改进和发展，无疑将会促进这类质粒的分子和遗传结构的 研究。 2 烃降解的 遗传学研究 用腐臭假单胞菌作的大量研究证明， 短链烷烃降解代谢的遗传基因位于 o c t 质粒在徽生物采油中作用的探索硕士毕业论文 质粒和染色体上。与此相反， 用不动杆菌和其它微生物所作的研究证明，长链烷 烃分解代谢基因只存在于细菌染色体上。1 9 7 9年，f e n n e w a l d等绘出了腐臭假单 胞 菌p p g , 菌 株短 链 烷 烃 氧化 所 需 基因 位点 的 遗 传 学 模型 ， 如图1 所 示。 这 是 至 今 所了解的烃降解最复杂的遗传系统。 展 搽( 诱导 物) t -一一一一一一 一一一一 念 百- p b人a l k ba l k a a 互 k da l k 只a f k c扭 伙e 厂一 姚经 一卜 讨服m 7 玻 染色仿 a l c 人g l 或降解基因片段转座、染色体 基因扦入，造成突变质粒;也可将质粒作为外来基因的载体，把不同降解能力的 基因克隆， 构建新的杂种质粒，导入合适受体。无论质粒转移，突变质粒筛选、 遗 传工 程技术 应 用， 在降 解微 生 物育 种 方 面， 均 有不 少 成功的 报导(3 7 1 质粒转移构建多质粒菌株:1 9 7 5 年f r i e l l o 等用质粒转化的方法构建了一株 同时含四种降解性质粒 ( c a m , o c t , t o l , n a h )的超级细菌，能快速降解油污染 质粒在微生物采油中作用的探索 硕士毕业论文 物中的烃质。y o k o t a转移 t o l质粒至恶臭假单胞菌，也使该菌株获得了 3 一 甲基 水 杨 酸 的 降 解能 力 u u 蔡操纵子 如h i 一操纵矛 水 扬酸 m澡粼子 加七 2:a纵子 水 i 胶七 几乌埔。 2 4 .l 基 d s . i 2 4 巴兹他隆 a ll il% r 6 2 - 酮茶 4 m a .备 丙酮酸醚+乙醛 呷 拟 湘邵 图2 n a h 7 质粒上的n a h l 和 n a h 2 操纵子座位 利用质粒突变筛选高效降解菌: 恶臭假单胞菌的p a c 2 5 带有编码3 - c b a ( 3 - 氯苯甲 酸)降解的全部酶系，由于起使酶要求底物高度专一性，不能降解 4 - c b a ( 4 - 氯苯甲 酸)和3 , 5 - d c b ( 3 , 5 一 二氯苯甲 酸) ，但p a c 2 5 能编码4 - 氯儿茶酚 氧化酶 ( 4 - 氯儿茶酚是4 - c b a 氧化的 产物) 。 c h a k r a b a r t y ( 2 , 利用t o l 质粒带 有 非专一的苯甲 酸氧化酶系特点， 混合培养含t o l 质粒的4 - c b a 细胞与含p a c 2 5 质 粒的4 - c b a 一 细胞， 通过接合转移， t o l 质粒1 1 7 k 6 中3 9 k b 的基因片段， 转座至4 - c b a - 细胞的染色体上，提供了苯甲酸非特异的氧化酶系，帮助将4 - c b a 转化至4 - 氯儿 茶酚，p a c 2 5 质粒 ( 1 1 7 k b )突变为p a c 2 7 质粒 ( 1 1 0 k 6 ) ， 保持全部3 - c b a 降解基 因，故可继续降解4 - 氯儿茶酚。 利用同 样方法将恶臭假单胞菌氯代苯甲 酸降 解质 粒p a c 2 7( 降 解3 - 氯苯甲 酸、 4 - 氯苯甲 酸) 和p c b 质粒 将氯代二联苯转换为氯 代苯甲 酸) 接合， 组建了 突变质粒的 菌株， 能降 解单氯二联苯和二氯二联苯。 基因克隆的 遗传工程菌: 进入八十年代以 来， 人们对某些降 解基因 进行了克 隆 和表达的 研究， 尤其是涉及降 解途径中的各个基因 或整组基因的克隆及表达研 究。 1 9 8 1 年i n o u y e t . 1 等 先 后 把t o l 质粒中 的x y l b ( 苯乙 醇 脱 氢酶) 、x y l e ( 儿 茶酚 2 , 3 一 二氧酶)基因和 x y 1 d e f g操纵子及其调节基因x y 1 s ，在 e . c o l i 质粒 质拉在微生物采油中作用的 探索 硕士毕业论文 载体上克隆并获表达:1 9 8 3 年， s c h e l l 使蔡质粒n a h 7 中n a h l 操纵子和。h 2 操 纵子的一部分与 质粒载体连接， 并在 e . c o l i 中 获表达;1 9 9 9 年， 瑞士日内 瓦大 学分子生物学家 k e n t i m m i s 和 h a n s k n a c l m u s s 从有关微生物中的降解甲 基氯苯 酚的1 2 个基因统统地整合于一种假单胞菌里，能使污染物甲 基氯苯酚完全降解。 在此方面，我国 李尔场2 s , s o )高峰等用d n a 转化原生 质体的方法构建了 一株 能同时降解四种烃制品的工程菌。 二、选题的 依据及意义 微生物采油是生物工程技术在油田开发领域开拓性的应用。该项技术以其成 本低，适应性强、作业简单、对岩层无伤害和无环境污染问题等优势，己 经引起 世界各国的普遍重视。而在此项技术中， 采用的微生物菌种的性状极其重要，它 不仅要 适应油 藏的 温 度、 压力、 p h值 等物理化学条 件， 还要有良 好的降 解和乳 化原油的能力。目 前用于强化采油的微生物菌种通常是自 然界筛选的混合菌，组 成比 例在使用过程中容易发生变化。所以，利用遗传工程技术获得可用于提高原 油采收率的多功能单一菌株意义重大。 质粒既可作为目 的基因的供体， 也可作为外来基因的 载体，很适于进行遗传 操作， 可以 利用质粒转化或作为克隆、表达的载体构建解烃工程菌。 而目 前多集 中于芳香烃降解质粒的研究，质粒对原油直链烷烃降解的研究很少，而质粒在采 油微生物对原油乳化及利用石油烃产酸、产气之间的相关性的研究没有看到有关 资料报导。在本实验中，分离到一株含质粒的解烃菌，对该质粒在微生物采油中 的作用做了初步探讨，为进一步的构建高效能采油菌株奠定了基础。 质粒在微生物采油中作用的 探索 硕士毕业论文 材料与方法 材料 一、菌种: 初筛菌种由本实验室提供 二、油样:原油中8 - 7 2 和原油港3 3 3 三、培养基: 1 . 基础培养基 k h , p o , n a 尹 p 仇 ( n h , ) 2 s 仇 m g s 仇 酵母粉 p h 2 、 肉 汤培养基: 蛋白膝 牛肉膏 n a c l p h 3 、 固体培养基 肉汤+ 1 . 5 % 琼脂粉 4 、 液蜡培养基 基础培养基+ 2 % 液体石蜡 5 、 原油培养基 基础培养基+ 2 % 原油 6 、 产表面活性剂优化培养基 k h 2 p 仇 n a 2 h p o , n a n o , m g s o , 酵母粉 液蜡 p h 四、试剂 由大港油田地质研究院提供 0 . 3 4 % 0 . 1 5 % 0 . 4 % 0 . 0 7 % 0 . 0 0 1 % 7 . 5 1 % 0 . 5 % 0 5 % 7 . 5 0 . 3 4 % 0 . 1 5 % 0 . 2 % . 0 7 % . 0 0 1 % 叭川。 q山甲 质粒在微生物采油中 作用的 探索 硕士毕业论文 1 、质粒检测 质粒检测方法一 t e: p h 8 . 0 p h 8 . 0 s t e 缓冲液: p h 8 . 0 p h 8 . 0 溶液 l p h 8 . 0 p h 8 . 0 溶液 i i : 溶液 i i i : l o m m t r i s 1 m m n a 2 e d t a 0 . 1 m n a c l l o m m t r i s 1 m m n a 2 e d t a 5 0 m m 葡萄糖 2 5 m m t r i s l o m m n a 2 e d t a 1 9 6 s d s ， 2 9 . 4 4 2 g k a c , 定容至1 0 0 m l 2 4 . 2 8 t r i s , 5 . 7 1 m l 冰醋酸 0 . 2 m n a o h 1 1 . 5 m l 冰醋酸 t a e ( 5 0 x) :1 8 . 6 1 2 g n a 2 e d t a 质粒检测方法二 t v悬浮菌体) :5 0 m m t r i s 2 0 m m p h 8 . 0 p h 8 . 0 裂解液: 0 . 4 n n a 2 e d t a n a o h6 9 6 s d s1 : 1 混合 t r i s ， 7 . 0 m甘11 ，上p t s : 4 m n a c l 8 . 0 酬州18 t e ( 溶解质粒 d n a ) : l o m m t r i s i o m m t a e ( 5 0 x) :2 4 . 2 g 8 . 0 6 1 2 8 5 . 7 1 m 1 n a 2 e d t a t r i s ， 冰醋酸 质粒在微生物采油中作用的探索 硕士毕 业论文 质粒检测方法三 溶液 i : 葡萄糖 t ri s 0 . 2 2 2 m l 0 . 1 2 5 m l p h 8 . 0 0%m 勺山1.1 0 . s m n a 2 e d t a 4 . 5 m 1 0 . i m l p h 8 . 0 重蒸水 溶菌酶1 o m g 溶液 h: ( 要求新鲜配制， 使用期最多不超过3 天) i o n n a o h 0 . 2 m l 2 0 % s d s 0 . 5 m 1 重蒸水9 . 3 m ( 要求新鲜配制，不能隔夜使用) 溶液 工 工 l5 m n h , a c 2 、 质粒消除 叮睫橙5 0 u g 加1 3 、表面活性剂分析 类脂展层剂: 类脂显色剂: 石油醚:乙醚:乙酸8 0 : 2 0 : 1 氯仿 :甲 醇: 水6 5 .-巧: 2 ( 铝酸钱一 高氯酸显色剂) 溶液a : 3 g 铝酸按溶于2 5 m l 水中 溶液b : 1 n h c l 溶液 c : 6 0 % 高氯酸 a , 3 0 m l 6、1 5 m l c 混合 糖脂显色剂:( 二苯胺显色剂) 1 0 % 二苯胺一 乙 醇溶液2 0 m l ， 然后加入1 0 0 m 1 浓盐酸和8 0 m l 冰醋酸稀释 单糖展层剂:正丁醇: 醋酸:水 4 : 1 : 2 单糖显色剂:( 苯胺磷酸盐一 丙酮显色剂) 溶液a : 按顺序棍合2 0 m l 苯胺、 2 0 0 m l 水、1 8 0 m 1 醋酸 和 l o m l 磷酸 ( 4 保存) 溶液b :丙酮 a : b 2 : 3 质粒在微生物采油中作用的探索硕士毕业论文 五、药品 薄层层析硅胶g - 6 0 型 ( 中国青岛海洋化工集团) 梭甲基纤维素钠 ( 上海试剂一厂) 甲 酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己 酸 ( a . r . ) 氯仿 ( a . r . ) 、甲醇 ( a . r . )( 天津化学仪器一厂) 蕙酮 ( a . r . )( 上海试剂一厂) 其他药品均为分析纯。 六、主要实验仪器设备: 台式离心机t g l - 1 6 g( 上海安亭科技仪器厂) 恒压恒流电 泳仪d f - c( 北京东方仪器厂) 界面张力仪j z h y l - 1 8 0( 承德市材料实验机厂) 旋转薄膜蒸发器z f q - 1 0 l( 天津玻璃仪器厂) 7 2 1 可见分光光度计 ( 上海第三分析仪器厂) 7 5 2 紫外光栅分光光度剂 ( 上海第三分析仪器厂) n d j - 7 9 型旋转式粘度计 ( 同 济大学 机电 厂) 笔式酸度计 ( h a n n a 公司) g c - 7 a 气相色谱仪 旧 本岛津) 气相色谱数据处理器c - r i b( 岛津) 磁力搅拌器 ( 常州国华电器设备有限公司) d d b - 3 0 0 多通道电 子蠕动泵 ( 浙江象山电 子仪器厂) 红外b i o - r e d f t s 6 0 0 0 - u m a 5 0 0 显微镜 高效液相仪 ( w a t e r s 5 1 0 泵，w a t e r s 4 1 0 视差折光检测器) 质粒在微生物采油中作用的探索 硕士毕业论文 s p 2 3 0 5 全型色谱仪 ( 北京分析仪器厂) 微量注射器 c l u l )( 上海医用激光仪器厂) 玻璃管硅胶层析柱1 . 8 c m x 2 1 c m( 自 备) 水浴摇床 ( 江苏太仓实验仪器厂) 质粒在微生物采油中作用的探索 硕士毕业论文 方法 一、 研究路线 混合菌株 单一菌株 质粒消除 对原油作用测定 对原油作用测定 1 分类鉴定 对比有差异 产酸分析 ( 对比无差异) 产气分析 ( 对比无差异) 对长链脂肪烃降解 ( 对比无差异) 乳化活性分析 ( 对比有差异) 糖脂 月 旨 肪酸分析 质粒在微生物采油中作用的探索硕士毕业论文 二 、 研究方法 ( 一)菌种分离 对本实验室保留得菌种进行划线分离培养，得 1 5 0 株单一菌株。 ( 二)质粒检测 方法一4 1 1 1 . 3 7 过夜培养物装入1 .5 m l 离心管中，1 2 0 0 0 r p m离心1 m i n ，弃上清。 2 ，充分干燥后加入0 . 5 m 1 s t e , 1 2 0 0 0 r p m离心l m i n ,弃上 清。 3 . 加1 0 0 11 1 冰预 冷的 溶 液i ， 剧 烈 振 荡。 4 加入2 0 0 4 1 溶液1 1 ，温和振荡，冰浴3 m i n e 5 . 加入1 5 0 11 1 冰 预冷的 溶液 ii i ， 冰 浴5 m i n , 1 2 0 0 0 r p m离心5 m i n o 6 . 取 上 清至另 一l .s m l 管中 ， 加 等 量的 酚: 氯 仿， 1 2 0 0 0 r p m离 心2 m in a 7 .取上清用氯仿抽提一次。 8 . 用2 倍 体 积 无 水乙 醇 沉 淀d n a ， 冰 浴2 h , 1 2 0 0 0 r p m离 心l o m in ， 弃 上 清。 9 .真空抽干后溶于适量t e 中。 1 0电 泳检测:使用稳压稳流电泳仪，水平电泳槽，琼脂糖浓度为 0 .9 %, 电压为70v. 方法二3 1 1 i . 取 菌液1 - 2 m i 于5 m l 离 心 管中， 1 2 0 0 0 r p m 4 m i n ， 收 集菌 体。 2 .加0 .5 m l t e ( 5 0 m mtr i s , 2 0 m m n a 2 e d t a p h 8 .0 ) ，悬 浮 菌 体。 3 . 加l m l 裂解液( 0 .4 n n a o h ,6 % s d s , l : l 混合) ， 室温1 8 - 2 5 1c 裂解8 - 1 o m i n o 4 .b u 0 . 5 m l t s( 1 m t r i s , 4 m n a c l , p h 7 . 0 ) 立即 摇匀， 冰浴i h a 5 . 室 温1 2 0 0 0 r p m 6 m i n 。 收集 上 清。 6 加 2 m 1 9 5 %乙醇，冰浴3 0 m i n( 颠倒两次) 口 7 . 室 温1 2 0 0 0 r p m 6 m i n ， 弃上 清， 空 千， 用o . i m l t e ( i o m m tr i s , 1 m m n a 2 e d t a , p h 8 .0 ) 溶 解d n a 沉淀 ， 转移到1 . 5 m 1 离心 管中。 8 .用0 . 1 m 1 氯仿抽提蛋白 ， 离心3 m i n ， 上相转移到新管中。 9 ， 电 泳检测:使用稳压稳流电泳仪，水平电 泳槽， 琼脂糖浓度为0 .7 %, 电压为 5 0 v o 方法三4 2 1将菌株接入5 m 1 l b 肉汤培养基中，3 7 过夜振荡培养。 分一一 一一- . . . . . . . . . ， - - - - 味 自 . . . . . 呻 质粒在微生物采油中作用的探索 硕士毕业论文 2 .取 1 - 1 . 5 m l 培养物于1 . 5 m l 离心管中1 5 0 0 0 r / m i n转3 m in , 弃上清。 3 .加入1 0 0 11 1 溶液i ，溶解， 置冰上3 0 m in . 4 ， 再 加入 ( 沿管壁缓慢加入) 2 0 0 1 1 1 溶液i i ， 轻轻混合， 置冰上1 0 - 2 0 m i n o 5 . 迅速加入2 0 0 11 1 溶液i ii , 立即混匀，置冰上3 0 - 4 5 m i n( 可偏长) 。 6 . 1 5 0 0 0 r p m 5 m i n ， 取上 清0 .5 m l 冷异 丙醇 ， 置 冰上1 0 m i n e 7 . 1 5 0 0 0 r p m 5 - 1 0 m i n ， 弃 上 清。 8 .加入l m l 冷无 水乙 醇， 1 2 0 0 0 r p m 3 m i n ， 弃上 清。 9 .干燥，将质粒d n a溶于2 0 u 1 t e 中。 1 0 . 电泳检测; 使用稳压稳流电 泳仪， 水平电 泳槽， 琼脂糖浓度为0 .7 % , 电压为 1 2 0 v. ( 三)菌种鉴定 按照 一般细菌常用鉴定方法鉴定4 0 1 ( 四)质粒消除 配制含叮咤橙5 0 u g l m l 的 培养基 l o m l ， 接培养三天的菌 液 1 m 1 , 3 7 培养 3 天后， 将菌液进行划线分离，随 机挑选5 0 株菌进行质粒检测。 ( 五)消除质粒前后菌株对原油作用 1 粘度和凝固点测定 将5 0 株菌分别以3 0 % 的接种量培养在中8 - 7 2 原油培养基中， 油含量为4 0 %, 3 7 c ，摇床转速为 1 5 0 r l m i n ，培养7 天， 发酵液滤出液体，残油 7 5 脱水两次， 取脱水原油测粘度、 凝固点。 粘度测定采用n d j - 7 9 型旋转式 粘度计 5 0 c 测定: 凝固点测定是将油样置于5 0 c 恒温水浴箱中， 待油样完全溶解之后，迅速倒入凝 固点 测定仪中主刻度线， 插上温度计，使水银球位于油样中， 至倾斜 4 5度时油 无明显流动迹象时读取温度，即为凝固点。 2 . 孚 l 化分散作用 2 5 0 m 1 锥形瓶装原油发酵培养基 l 0 0 m l ，接入种子液5 m 1 , 密封瓶口， ,3 7 c 摇床转速为1 5 0 r / m i n ， 振荡培养4 d , 置室温观察微生物对原油的乳化分散状态。 3 . 油分解量测定 用己 烷8 0 m l 洗发酵液，于5 0 0 m l 分液漏斗中萃取， 弃水相，将油相小心移 出， 稀释 1 0 0 0 倍， 于7 5 2 紫外分光光度计下2 5 5 n m 测吸光度。与 标准曲 线对比， 一-，户， 户 . .户 种 户 ， 一 ， 一 一一 质粒在徽生物采油中作用的探索 硕士毕业论文 计算油分解量。 ( 六)代谢产物分析 1 、产酸分析 取 1 6 - 1 菌株和质粒消除后的1 6 - 1 - 3 菌株， 2 %接种量， 接种于液蜡培养基， 摇床 1 5 0 r / m i n 振荡培养， 3 天后，发酵液 8 0 0 0 r / m i n离心， 上清液用笔式酸度 计测定p h 值。 2 、产气分析 用 5 0 0 m 1 输液瓶，液蜡培养基接。 .3 % 酵母粉， 1 6 - 1 菌株和质粒消除后的 菌株 1 6 一 卜 3以2 0 % 接种量，内 壁涂油， 3 7 静置培养，倒置于同 样培养条件 的广口容器中。观察产气量。 3 .原油组分分析 经菌株 1 6 - 1菌株和质粒消除后的 1 6 - 1 - 3菌株，接种于原油培养基， 1 5 0 r l m i n 摇床振荡培养， 3 天候， 发酵液过滤. 残油 溶于己 烷， 进行气相色谱 分析。 气相色谱条件 色谱柱: s e -( 甲 基硅橡胶) 交联石英毛细柱 ( 3 0 m x 2 . 5 m m ) 检测器:氢离子化检测器 f 工 d ) 柱温:1 1 0 恒温1 6 m i n ，以4 c / m i n 升至3 2 0 c , 厦 温l 6 m i n 气化室和检测室温度:3 3 0 0c 尾吹:6 0 m l / m i n 载气: 氮气， 线速1 2 c m / s e c 燃气: 氢气， 流 量3 0 - 5 0 m l / m i n 助燃气:空气， 流量3 0 0 - 5 0 0 m l / m i n 4 、乳化活性分析 质粒在微生物采油中作用的探素 硕士毕业论文 将 1 6 - 1菌株和质粒消除后的 1 6 - 1 - 3菌株的 液蜡发酵液离心， 取上清 液用