（微生物学专业论文）苏云金素的补料发酵工艺优化与代谢流分析.pdf

华中农业大学硕 ：学位论文2 0 0 6 摘要 苏云金素是一种核苷类抗生素，对多种农业害虫具有良好的杀虫效果，如脉翅 目，双翅目，膜翅目，等翅目，鳞翅目，直翅目，半翅目，蚜虫，线虫和螨虫。 基于对苏云会芽胞杆菌产苏云会素的分批发酵过程和恒速补料发酵过程的分 析，建立了一种新的苏云金芽胞杆菌达姆斯塔特亚种0 3 2 产苏云会素的p h 控制补 料策略。这种新的补料策略同时考虑到了发酵过程中的p h 值变化和葡萄糖的消耗 状况。在分批发酵的后期，将p h 值从6 5 调到7 0 ，再通过补加葡萄糖来控制p h 值7 0 - a ：0 0 2 ；当p h 开始不再受补料控制时，停止补料。通过该策略，有效的避免了 补料不足和补料过量，苏云余素的产量和y p , x 相对于分批发酵分别提高了8 9 5 1 和 1 0 3 2 。 构建了苏云金芽胞杆菌产苏云金素的代谢网络，并测定了正常发酵和实施柠檬 酸盐扰动下的相关底物的消耗情况和代谢产物的积累情况，并运用基于m a t l a b 环境 下的专业代谢流分析软件日觋4 n a l y z e r 对代谢网络的代谢流进行了分析。结果表 明，6 磷酸葡萄糖节点、乙酰c o a 节点是柔性节点，而a 酮戊二酸节点是半柔性节 点，均可以在发酵水平对其进行调控。在此分析的基础上，结合前述的p h 值控制 补料策略，通过添加柠檬酸盐，调节代谢流，在p h 值控制的补料发酵中，使苏云 金素产量相对于分批发酵提高了1 5 4 2 。 本文系统研究了一系列条件下( p h 自5 o 到9 0 ，温度自1 0 c 到4 0 ) 苏云金 素在水中的降解情况。在本研究的范围内，指数衰减模型计算出苏云金素在水溶液 中的半衰期在2 7 2d 与1 6 1 9d 之间，表明苏云金素是一种易降解的抗生素。为了进 一步精确说明苏云会素在不同的p h 和温度条件下的稳定性，利用人工神经网络方 法对降解过程进行描述。建立的精度为o 1 和s p r e a d 值为5 的径向基神经网络很 好的模拟和预测了降解过程，模拟和预测的平均绝对误差分别在2 9p g m l 和1 4 g m l 范围内。 观察了苏云金素粗提物对小鼠连续口服o 0 1e d d 或接触含有o 8 的苏云金素处 理3 0d 后，心、肝、肾、脾等脏器系数的变化。实验结果表明成年小白鼠与幼年雄 性小白鼠在连续口服或接触苏云会素一个月后，其心、肾、肾、脾等内脏器官都没 有显著性的影响的。在接触组试验中，苏云会素对幼年雌性小白鼠的肝、脾的脏器 系数有显著的影响。 华中农业大学颀f 学位论文2 0 0 6 关键词：苏云会素；苏云会芽胞卡t 菌：补料发酵；代谢网络；代谢流分析；降解 人工神经网络：亚急性毒性 2 牛中农业人学硕 ：学位论文2 0 0 6 a b s t r a c t t h u r i n g i e n s i ni sak i n do fn u c l e o t i d ed e r i v a t i v ea n t i b i o t i ca n dh a sab r o a ds p e c t r u m a g a i n s ta g r i c u l t u r a lp e s t s ，s u c ha sc o l e p t e r a , d i p t e r a , h y m e n o p t e r a , i s o p t e r a , l e p i d o p t e r a , o r t h o p t e r a ，h e m i p t e r a ，a p h i d ，n e m a t o d ea n dm i t e a ni m p r o v e dp h c o n t r o lf e d b a t c h s t r a t e g y f o rb a c i l l u s t h u r i n g i e n s i ss u b s p d a r m s t a d i e n s i s0 3 2p r o d u c i n gt h u r i n g i e n s i nw a sd e v e l o p e db a s e do nt h ea n a l y s i so ft h e b a t c hc u l t u r e ，c o n s t a n tr a t ef e d b a t c hc u l t u r e sa n dt h eo r i g i n a lp h c o n t r o lf e d - b a t c h h a v i n gc o n s i d e r e dt h ep hv a r i a t i o na n dt h eg l u c o s ec o n s u m p t i o ns t a t u s ，t h ep hw a s a d j u s t e df r o m6 5t o7 0b ya d d i n gb a s ei nt h el a t ec u l t i v a t i o np e r i o do f b a t c hc u l t u r e 。a n d t h e nt h ep hw a sk e p ta t7 0b yg l u c o s ef e e d i n g t h ef e e d i n gw a st e r m i n a t e dw h e nt h ep h c o u l d n tb ec o n t r o l l e db y 斟u c o s ef e e d i n ga n y m o r e t h ep r o p o s e df e d - b a t c hs t r a t e g y e f f e c t i v e l ya v o i d e du n d e r f e e d i n go ro v e r f e e d i n g ，a n di ti n c r e a s e dt h et h t t r i n g i e n s i ny i e l d a n dy e x b y8 9 5 1 a n d1 0 3 2 c o m p a r e dt ot h a to f t h eb a t c hc u l t u r e r e s p e c t i v e l y t h em e t a b o l i cn e t w o r ko fb a c i l l u s t h u r i n g i e n s i ss u b s p d a r m s t a d i e n s i s 0 3 2 p r o d u c i n gt h u r i n g i e n s i nw a sd e v e l o p e d t h em e t a b o l i cf l u x e sd u r i n gt h ec u l t u r ea n dt h e c u l t u r ew i t ht r i - s o d i u mc i t r a t ew e r ea n a l y z e db yp r o f e s s i o n a lm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s s o f t w a r e f l u x a n a l y z e ru n d e rm a t l a be n v i r o n m e n t t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h e g l u c o s e 6 - p h o s p h a t en o d ea n dt h ea c e t a t ec o e n z y m ea n o d ew e r ef l e x i b i l i t y , a n dt h e a k e t o g l u t a r a t en o d ew a ss e m i f l e x i b i l i t y b a s e do nt h ea n a l y s i sa n dt h ef o r m e r p h - c o n t r o lf e d - b a t c hs t r a t e g y , 2g l t r i s o d i u mc i t r a t ew a sa d d e dt ot h ec u l t u r e m e d i u mt oa d j u s tt h em e t a b o l i cf l u x e sd i s t r i b u t i o n ，a n dt h ef i n a lt h u r i n g i e n s i n y i e l dw a si m p r o v e db y1 5 4 2 t h et h u r i n g i e n s i nd e g r a d a t i o np r o c e s s e si na q u e o u su n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，w h e r e p hr a n g e sf r o m 5 0t o9 0a n dt e m p e r a t u r er a n g e sf r o m1 0 ct o4 0 c ，w e r es y s t e m a t i c a l l y i n v e s t i g a t e d t h eh a l f - l i f eo f t h u r i n g i e n s i nw a sc a l c u l a t e db ya ne x p o n e n t i a ld e c a ym o d e l ， a n dt h eh a l f - l i f ew a sr a n g e df r o m2 7 2t o1 6 1 9di nt h ec o n d i t i o n sw ei n v e s t i g a t e d t h i s i n d i c a t e dt h a tt h u r i n g i e n s i nw a sa ne a s i l yd e g r a d a b l ea n t i b i o t i c i nt h i ss t u d y , a na r t i f i c i a l n e u r a ln e t w o r k ( a n n ) w a se m p l o y e dt of u r t h e rd e s c r i b et h ed e g r a d a t i o np r o c e s s e s t h e r a d i u sb a s i sn e u r a ln e t w o r k ( r b f ) m o d e l ，w h i c ht h ea c c u r a c yw a s0 1a n dt h es p r e a d v a l u ew a sf i v e ，c o u l dw e l ls i m u l a t ea n dp r e d i c tt h ed e g r a d a t i o np r o c e s s e s t h em e a n 3 牛中农业人学硕i 学位论文2 0 0 6 a b s o l u t ee r r o r ( 蚴肋o ft h es i m u l a t i o na n dp r e d i c t i o nw a sw i t h i n2 9p , g m la n d1 4 p , g m lr e s p e c t i v e l y t h et o x i c i t yo ft h et h u r i n g i e n s i nc r u d ee x t r a c tw a so b s e r v e db yt h ec h a n g eo f c o e f f i c i e n to fv i s c e r a , s u c ha sh e a r t ，l i v e lk i d n e y , a n ds p l e e n ，c o n t i n u o u s l y ，o nt h em u s m u s c u l u sa l b u sw i t h0 1g do r a la d m i n i s t r a t i o no r0 8 c o n t a c ta d m i n i s t r a t i o r l t h ea d u l t a n dc h i l d h o o dm a l et r e a t e da n i m a l s ，t h eh e a r t ，l i v e r , k i d n e y ，a n ds p l e e nc o e f f i c i e n ti n c o n t a m i n a t ea f t e ro n em o n t h ，c o n t i n u o u s l y , s h o w e dn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ta f t e r t r e a t m e n t b u ti nt h ec o n t a c tt e s t ，t h el i v e r ，a n ds p l e e ni n t e r n a lo r g a n sc o e f f i c i e n to f f e m a l e m i c ew e r er e m a r k a b l yc h a n g e db yt h et h u r i n g i e n s i ns a m p l e k e y w o r d s ：t h u r i n g i e n s i n ；b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ；f e d b a t c hc u l t i v a t i o n ；m e t a b o l i c n e t w o r k ；m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ；d e g r a d a t i o n ；a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k s ；s u b a c u t e t o x i c i t y 4 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密否 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：腑文 m 十f - i ：如年月2 0 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和 电子版，并提供目录捡索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学 位论文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者张附女 导师张陈雩走 签名日期：h 年f 月2 0 日签名日期：2 0 0 年月2 0 日 华中农业人学硕_ 卜学位论文2 0 0 6 第一章文献综述 1 1 苏云金素的理化性质 苏云金素( t h 谢n g i e n s i n ，图1 1 ) ，又称b - 夕h 毒素，是某些苏云金芽胞杆菌 ( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，以下简称b t ) 在营养生长阶段分泌于细胞外的一种热稳定 的核苷类似物( s e b e s t a e t a l ，1 9 8 1 ；r o w ea n d m a r g a r i t i s ，1 9 8 7 ；r o d r i g u e z p a d i l l ae l a l ， 1 9 9 0 ) ，由m c c o n n e l l 和r i c h a r d s 于1 9 5 9 年首先发现。具有杀虫、杀螨、杀线虫活 性( t a n i g o s h ie t a l ，1 9 8 2 ；r o y a l t ye t a l ，1 9 9 0 ；d e v i d a se t a l ，1 9 9 2 ) 。因其对哺乳动物 和人类的毒性比多数化学杀虫剂低，因此是一种具有广泛应用前景的生物杀虫剂。 。、 h 0 h 2 h 3- - - - - o 。一蹦 。多、o 。o h 图1 - 1 苏云金素的分子结构 f i g 1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft h u r i n g i e n s i n 苏云金素由核苷和a d 吡喃葡萄糖结合磷酸化的别粘酸组成( f a r k a se t 以， 1 9 6 9 ) ，所含腺嘌呤、核糖、葡萄糖和磷酸的分子比为i ：l ：l ：1 ( b o n de la 1 ，1 9 6 9 ) ， 分子式为c 2 2 h 3 2 n 5 0 1 9 p 3 h 2 0 。苏云金素的化学本质是一种腺嘌呤衍生物，能被酸性 或碱性磷酸单酯酶脱去磷酸基团，在乙酸盐缓冲液( p h4 4 ) 中水解时，产生脱磷 酸苏云金素。脱磷酸苏云会素的酸性水解作用，除产生腺嘌呤和别粘酸外，还产生 一个由葡萄糖和核糖联结而成的中性双糖，腺嘌呤在第5 位原子上被核塘所取代。 脱磷酸的苏云金素丧失对昆虫的毒性，其分子式为c 2 2 h 3 l n 5 0 1 6 ，分子量为6 2 1 ( 喻 子牛，1 9 9 0 ) 。 苏云金素对热、紫外线和碱相对稳定，能在环境中有较长时间残留，可较稳定 地保存在植株叶面上，从而影响食叶昆虫( m e r s i ea n dm e g h ，1 9 8 8 ) 。在柑桔叶和棉 牛中农业人学颂l 学位论义2 0 0 6 花叶上可分别保存活性4 5d 和6 1 2d ( h a l le t 以，1 9 7 1 ；w o l f e n b a r g e r e l a l ，1 9 7 2 ) 。 苏云金素能与c a 2 + 、b a 2 + 、m 9 2 + 、c u 2 + 、c j + 、m d + 、s d + 、z n 2 + 、p b 2 + 、c 0 2 + 、a 1 3 + 和f e 3 + 等金属离子形成特，所形成的靛在各种不良环境因素影响下稳定性都有所增 强( k i t a g a k i ，1 9 7 6 ) 。 1 2 苏云金素的安全性 微生物杀虫剂与化学杀虫剂来比最大的优点就是对人畜安全对环境友好。苏云 金素对人类则因消化道呈酸性，能使苏云会素失去磷酸根而失去活性，故在适当的 配方制剂及适量的施用下，是安全的。此外苏云金素为天然物质，施用后其残余可 以自然分解，不会对环境造成危害。曾耀铭与王顺成丌展的苏云会素毒理安全实验 资料评估显示，苏云金素不具有口服急毒性、遗传毒性及肺亚慢毒性之前癌病理变 化，仅具中等肺毒性，且其毒性较一般的化学农药低，属较安全的药剂，就此苏云 金素的安全性而言，苏云会素就有相当大的丌发潜能( 曾耀铭等，2 0 0 0 ) 。 对饲喂苏云会素的大鼠进行细胞分析发现，骨髓中期细胞、骨髓瘤细胞和血细 胞的染色体畸变率与对照之日j 没有明显的不同( m e r e t o j ae t a l ，1 9 7 7 ；k a h k o n e ne t a l ， 1 9 7 9 ) 。b a r i a c 等( 1 9 7 5 ) 用小自鼠摄食放射标记的3 2 p 苏云会素，2 4h 内在粪中得 到回收，没有固定在所观察的任何器官上，包括肝、心、肾、脾和肾上腺体，可能 因为它不能穿透肠壁( 喻子牛，1 9 9 0 ) 。这说明含苏云金素的制剂以适当浓度防治害 虫，对其他生物引起细胞遗传学变化的可能性非常小。 v a n k o v a 等( 1 9 7 4 ) 将3 2 p 苏云会素注射小白鼠后，完整的”p 。苏云会素被分泌 到尿中，3 0r a i n 内达总量的2 0 。同时，在分泌过程中经酶促磷酸化作用，迅速分 解成无毒产物，且分解比例很高。每只小白鼠注射5 0 0 l a g 后5 r a i n ，强p - 苏云金素在 肝中的浓度只有3l a g g 组织，3 0m i n 后只有lj t g g 组织，在肾内的检出率稍高一些。 昆虫则相反，大蜡螟幼虫分解苏云会素很慢，非肠道注射后3h ，8 0 的苏云金素在 血淋巴中( s e b e s t ae l a l ，1 9 8 1 ) 。 脱磷酸的苏云会素对昆虫和对小白鼠都没有毒性( s e b e s t a e l a l ，1 9 6 9 ) ，苏云金 素对哺乳动物的毒性，决定于其分泌到生物体外和生物酶把它脱磷成无毒产物的水 平。将3 2 p 标记的苏云金素腹膜注射小自鼠后2 5 r a i n ，分泌至q 尿中的量达高峰，3 0 r a i n 后很少增加，注射后1 2 0m i n 和2 4 0r a i n ，分泌到尿中的放射活性物只占总分泌放射 活性物的2 3 。在各个器官都检出了苏云会素，但是，它们或者被生物体的酶 降解，或者变成无机磷被再利用。但是t s a i 等( 2 0 0 3 ) 在评估纯苏云金素对小鼠 肺部的毒力性时发现，苏云舍素对小鼠的半致死剂量是4 4m g k g ，用1 6m g k g 的 2 牛中农业人学r 吹i 学位论文2 0 0 6 剂量对肺部毒力研究时，小鼠表现组织学上的变态反应，包括支气管和齿槽的普遍 发炎，在第ld 和第2d 出现支气管细胞的坏死，在4d 到5 6d 出现肠和齿槽f 日j 隔的 细胞渗透和胶原质沉淀造成隔膜增厚。基于这些生化和病理学的参数，纯苏云金素 可能对小鼠有明显的肺部毒性。 1 3 发酵法生产苏云金素 提高培养基的浓度是提高苏云会芽胞柯菌发酵水平的重要手段之一，但高浓度 的培养基往往会产生底物抑制作用，同时在好氧发酵过程中还会导致发酵过程氧的 供应不足或提高能耗。补料分批发酵，是在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜 的培养基的方法。与分批发酵相比，补料发酵使发酵液维持较低的基质浓度，解除 底物抑制、葡萄糖效应和代谢阻遏等；与连续发酵相比，补料发酵染菌的可能性小， 且菌种不易老化，最终发酵液中产物浓度较高( 陈降和李寅，2 0 0 2 ) 。自从1 9 7 3 年 y o s h i d a 等人首次提出f e d - b a t c hf e r m e n t a t i o n ( 现在多称为f e d b a t c hc u l t u r e 或 f e d - b a t c hc u l t i v a t i o n ，简称为f b c ，f e r m e n t a t i o n 现多用于厌氧发酵) 这个术语，并 从理论上建立了第一个数学模型。黾 j o h n s o n 和p e t e r s o n ( 1 9 8 3 ) 首次研究苏云金素分批发酵时，发现发酵液溶氧 ( d o ) 在发酵1 5h 后随着细胞数量增加减到最小，然后芽胞数量在发酵2 4h 后迅 速增加，指出细胞停止生长后苏云金素还持续增加，苏云金素浓度最大值出现在芽 胞形成，产量达1 3 4g l 。喻子牛等( 1 9 9 0 ) 采用币交设计对苏云金素产生菌c t 4 3 的培养基和培养条件进行了优化，取得了良好的效果。t z e n g 和y o u n g ( 1 9 9 5 ) 发现 在发酵过程中添加青霉素g 可以增加苏云金素产量，这可能是由于青霉素g 与细胞 膜上的青霉素结合蛋白( p b p ) 结合，阻碍了细菌细胞壁肽聚糖的合成，使之不能 交联而造成细胞壁的缺损，导致苏云会素更容易分泌到胞外。j o n g ( 1 9 9 5 ) 在气升 式发酵罐中采用适应性反馈控制葡萄糖浓度进行苏云会素补料发酵。葡萄糖浓度由 c 0 2 释放与葡萄糖消耗速率之间的相关方程估计，然后反馈给计算机计算并控制底 物浓度，结果极大提高了苏云会素产量。通过网状通气管改进的气升式反应器，极 大提高了氧气的传送速率并降低了剪切力，苏云会素产量有较大提高( t z e n ga n d y o u n g ，1 9 9 6 ) 。z u o 和w u ( 2 0 0 0 ) 利用混合神经网络( h n n ) 和遗传运算法( g a s ) 建立了一种优化控制连续发酵高产苏云会素的方法，发酵系统模拟混合神经网络模 型决定优化补料速率，系统每- d , 时优化一次，结果大大提高了苏云金素的产量。 2 0 0 1 年w u 和c h e n 以种子的细胞运动强度作为决定最佳种龄的指标，比在对数后 期接种使苏云会素产量提高了3 倍。2 0 0 1 年w u 等用双线网格管通气有效地解决了 牛中农业人学硕1 + 学位论文2 0 0 6 泡沫问题。方法包括两部分：如果泡沫接触到了泡沫探头，通气量回减到一个低值， 如果d o 值低于饱和度的1 0 ，常规的泡沫控制就启动。比起常规的发酵控制，在 应用了泡沫控制后，苏云会素的产量提高7 0 。w u 等( 2 0 0 2 ) 在对苏云金素的发 酵放大过程中研究发现，不同的p h 值对细胞生长和苏云会素产生有着实质性的影 响，但短时f 日j 内不同的p h 没有实质的影响。因此只要保证较短的混合时间，那么 p h 等环境的变化对发酵罐的放大不会造成太大的影响。c h e n 等( 2 0 0 3 ) 根据细胞 运动强度柬控制补料，在细胞运动最剧烈的时候开始补料，在细胞运动减弱时停止 补料，采用这种补料策略后苏云会素产量与批次发酵相比提高3 4 。 1 4 代谢流分析 1 4 1 代谢流的分析方法 代谢流分析( m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，简称m f a ) 是代谢工程的重要研究方法之 一。美国学者b a i l e y 在1 9 9 1 年首先提出了代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 的概念， 即用重组d n a 技术操纵细胞的酶合成和调节功能束改进细胞的活性。代谢工程是一 种提高菌体生物量和代谢产物产量的理性化方法。研究内容主要涉及细胞的代谢过 程和途径的深入了解和改进，建立新的代谢途径，产生新的代谢物或生产异源蛋白 质。 目前代谢工程的研究工作主要集中在代谢流分析上。对己知途径而言，进行代 谢流分析是要了解生物过程环境的变化对代谢分御的影响，确定流向终产物的比例； 对未知途径而言，主要是途径的鉴别，副产物途径的了解，以便指导遗传操作，克 服微生物自身的遗传抑制。代谢流分析是一种计算流经各种代谢途径的物流的技术， 用于描述不同的途径的相互作用和围绕支点的物流分布。代谢流分析所采用的概念 来自反应工程，涉及的是整个生物反应网络。要想提高某一方面的代谢和细胞功能 应从整个代谢网络的反应而不是个别反应去考虑，重点放在途径的放大或重新分配 上。代谢网络中存在的分支之处称为节点，在不同条件下，代谢流分布变化较大的 节点成为主节点，主节点的代谢分布需要作重点考虑( k a u f f m a ne t a l 。2 0 0 3 ) 。 代谢流分析包括代谢网络结构的确定、量化代谢网络分支点的通量和确定代谢 网络内部的控制结构。为了确定代谢网络结构，需从大量的生化文献中获取信息。 尽管大多数重要的工业微生物的主要代谢途径现已确定，但在许多情况下，其完整 的代谢网络结构仍然未知，在此情况下，可通过酶的检测及辅助因子的需求来证实 某一途径的存在( p e d e r s e ne ta 1 。1 9 9 9 ) 。代谢流的分析方法主要有同位素示踪法、 4 华中农业人学硕f 。学位论文2 0 0 6 物流平衡法和基于代谢信号图的代谢流分析。同位素法是一种重要而古老的方法， 一般采用”c 标记葡萄糖底物再分析胞内代谢物( c h r i s t e n s e na n dn i e l s e n ，1 9 9 9 a ) 。 标记模式可用n m r ( s z y p e r s k i 。1 9 9 8 ) 或o c m s ( c h r i s t e n s e na n dn i e l s e n 1 9 9 9 b ) 进行分析，后者分析速度快且敏感度高。代谢信号图法也需要同位素示踪，步骤繁 琐，费用昂贵，不适于实际应用和普及。确定代谢网络结构还涉及到用凸分析法评 估生成某一代谢物的不同途径，l i a o 等人( l i a oe t a l ，1 9 9 6 ) 利用该法确定了ec o l i 高产芳香族氨基酸的最优代谢途径结构。确定代谢网络结构之后，就应量化网络各 分支点的通量。 测定通量最简单的方法是利用代谢物平衡的概念( k a u f f m a ne l a l ，2 0 0 3 ) 。通过 建立每一代谢物的物质平衡方程并做拟稳态假设，可得到与通量有关的一组方程， 这些方程为单一反应的通量提出了限制条件。经测定部分通量并利用线性规划法， 就可以计算出网络中所有分支点的通量( s t c p h a n o p o u l o se t a l ，1 9 9 8 ) ，该法已在许多 不同的微生物系统中得到证明( n i s s e ne ta 1 ，1 9 9 7 ；p r a m a j ka n dk e a s l i n g ，1 9 9 7 ； p e d e r s e ne ta l ，2 0 0 0 ) 。 物料平衡法是基于物料平衡的原理，根据代谢路径中各反应的计量关系，以及 实验的某些底物、产物的通量及细胞组成等确定整个代谢网络的通量分布( s c h u s t e r e r a ，1 9 9 9 ) 。准稳态假设是该方法的基础假设：假设细胞内的中间代谢物均处于准 稳态，即其浓度变化速率为0 。这样由m 个中间代谢物即可得到m 个关于速率的约束 条件( 由计量关系确定) ，若选定的速率的总数目为j ，则待解闯题的自由度为f = j m 。 这样，通过实验测出f 个不相关速率可确定整个通量分布。式( 1 i ) 即为计算代谢 物质量平衡的方程式： d x ；_ m e ! ：一以。 d f 1 m 、“ 式( 1 1 ) 中，是胞内代谢物的浓度向量，r m 。，是一个包含在j 个反应中的胞 内代谢物形成的净速率的向量。普遍认为大多数代谢物质有着非常高的周转。即使 在细胞所在的环境收到强烈扰动后，代谢库也能迅速调整到新的水平。因此，假定 拟稳态假设是合理的。所以上式可以写成： r m n p x 。d = 0 ( 1 2 ) 式( 1 2 ) 右边第一项表示j 个反应中中间物的净合成速率，第二项表示由于生物 质生长而对代谢库的稀释作用。因为大部分途径代谢物的胞内水平是非常低的，所 以这种稀释影响一般很小，特别是对影响同一个代谢物的其他通量相比较，情况更 是这样。所以，上式中的最后一项一般可以忽略。于是可以得到更简单的平衡式： 牛中农业人学硕 擘位论文2 0 0 6 0 = 。= g r m 。 ( 1 3 ) 式( 1 3 ) 中g 为化学反应计量式的系数矩阵，r m e t 为相应代谢反应的速率。 拟稳态假设的一个推论是只需要考虑位于代谢网络分支点的代谢物，没有分支的反 应可以被合并，这就使在通量分析中用到的化学计量模型的复杂性明显下降，从而 有利于迅速的计算和分析。 尽管代谢物平衡方程简单实用，但仍有其局限性( r o l l i n ge t a l ，1 9 9 5 ) 。若根据 辅助因子( 如n a d h 及n a d p h ) 平衡方程计算通量，确定包括细胞中所有涉及这 些辅助因子的反应，由于不可能确定所有的反应，因此所计算出的某些通量将不准 确。在此情况下，利用同位素标记底物及n m r 或g c m s 分析胞内代谢物的标记模 式，就能对单一碳原子建立平衡方程( s c h m i d te t a l ，1 9 9 9 ；w i e c h e r te t a l ，1 9 9 9 ) ，由 此可获得另一组限制条件，从而可：晦辅助因子的平衡方程排除在外。此外，由于有 许多单一碳原子平衡方程可供利用，常得到一个超定系统( 方程数目大于未知通量 数) ，这种方程冗余能更加准确地估算未知的通量。近年，该法己在不同微生物系统 中得到运用( c h r i s t e n s e n a n d n i e l s e n ，2 0 0 0 ；c h r i s t e n s e ne t a l ，2 0 0 0 ) 。 量化分支点处的通量之后的下一个问题就是如何控制通量的分布，这也是代谢 工程的关键问题。通量控制由动力学及热力学施加的限制所决定，因此有必要了解 网络分支点外的酶是如何被调控的。此外，各种代谢物的信息也很重要，代谢物与 代谢途径中的酶的亲和力大小为研究胞内代谢调控的机理提供了宝贵的信息。测定 胞内代谢物有两个基本要求，即如何迅速终止细胞代谢和如何建立测定复杂基质的 有效方法。 快速取样至冷甲醇或其它冷的缓冲液中，能使细胞代谢迅速失活。利用g c m s 、 l c 或l c m s ，不但能快速测定许多代谢物，还能揭示如何控制不同生长条件下的 细胞的通量。为了对通量的控制进行量化，引入了代谢控制分析( m e t a b o l i cc o n t r o l a n a l y s i s ，m c a ) 这一概念。在m c a 中，通量控制可量化为通量控制系数( f l u xc o n t r o l c o e f i c i e n t s ，f c c ) 。f c c 表示代谢网络中某一通量随某酶酶活力增加的相对增量， 现已有几种不同的方法测定其大小( f e l l ，1 9 9 2 ) ，方法之一是根据酶动力学信息。利 用特定代谢途径的动力学模型及所测定的代谢物浓度，现已经测定出s c e r e v i s i a e 糖 酵解途径中的酶的f c c ( r i z z ie ta 1 ，1 9 9 7 ) 及pc h r y s o g e n a m 青霉素合成所需酶的 f c c ( p i s s a r r ae la 1 1 9 9 6 ) 。 细胞的代谢通量除了直接由胞内酶决定之外，还间接受到了转录与转译的控制， 具体表现在五个不同的水平上：转录水平；控制m r n a 降解；翻译译水平；蛋白质 激活或失活；异构酶调节。细胞的这种级层控制结构使预测基因改造的总体效果变 得很困难。胞内遗传物质的改变将导致酶活力或酶量的变化，代谢物浓度也随之改 6 毕中农业人学坝t 学位论文2 0 0 6 变，这迸一步影响到调节蛋白，致使在转录水平及蛋白组水平发尘级联效应。但随 着d n a 芯片等新技术的出现，使测定转录组与代谢组所发生的变化成为可能，它 不但能详细分析全细胞水平下的控制结构，还能提供不周水平下的控制信息，据此 可设计出用于代谢工程的更好的方案。 1 4 2 代谢流分析的意义 工业微生物菌种改造的标准方法是先将菌株进行物理或化学诱变，再根据合适 的表型筛选出部分突变株，最后检验其产量或产率是否得到提高。由于诱变具有非 专一性效果，所以不容易确定亲本菌株基因组的具体改变，因此突变株的遗传改造 往往带来负效果。尽管基因工程技术能减少非专一诱变的模糊性并对亲本进行遗传 定向改造，但需要修饰的、有助于目的产物高产的酶经常是未知的。因此，为了提 高现有工艺过程的产量，必须首先分析涉及形成目的产物的代谢途径及其与细胞整 体功能之间的互相作用。在生产乙醇、乳酸、氨基酸、维生素等低附加值的初级代 谢产品时，其经济性主要由产量及产率决定。尽管通过解除胞内的反馈调节机制能 提高产量，但大幅度的提高则需要将来自底物的碳通量重新定向至目的产物( n i e l s e n , 2 0 0 1 ) 。 通常认为目标产物的产率偏低是由于相关酶系或酶级联反应限制了产物的合成 能力。尽管与特定产物合成途径相匹配的全部酶活性控制着产物的合成速率，但产 物的最终产量却是各种中j 日j 代谢物分支点处通量分配的综合结果。细胞内同时进行 的数千个生化反应构成了错综复杂的细胞代谢网络体系，其中的各反应速率决定了 整个网络的代谢通量，而这些反应的速率受相应的酶活水平以及参与反应的代谢物 浓度的影响，它们同时又受细胞性状和所处环境的制约。代谢控制分析理论认为， 代谢通量的控制是由组成代谢途径的各个步骤及相互之间的关系决定的，并且分布 在整个代谢途径上。生物大分子和效应物并不能直接产生控制，而是通过作用于所 在的反应而影响整个代谢系统的控制，限速步骤不是固定的，但系统控制系数的总 和却是固定的，它可以定量描述各个步骤对整个代谢控制发挥作用的相对程度，从 而使实验结果的解释更趋合理( s t e p h a n o p o u l o se l a l ，1 9 9 8 ) 。 将代谢通量的定量分析方法与代谢通量控制的分子生物学技术完美结合在一 起，合理地修饰生物细胞的遗传性状，是代谢工程的基石( s t e p h a n o p o u l o sa n ds i n s k e y , 1 9 9 3 ) 。系统研究代谢通量及其控制机制有三大基本骤：( 1 ) 尽可能多地观察途径并 测定其流量：( 2 ) 在代谢网络中施加一个已知的扰动，并确定系统达到新的稳态时 的代谢通量；( 3 ) 系统分析代谢通量扰动的结果。若某个代谢通量的扰动对其下游 代谢通量未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游扰动的反应是 7 半中农业人学坝f 学位论文2 0 0 6 刚性的，反之则为柔性。在刚性节点处，试图通过改变上游酶活性来影响下流代谢 通量的做法是徒劳的。 代谢流分析能够量化每个途径的通量，提供关于细胞的重要生理特性方面的更 深的洞察力。其意义归纳起来有一下四点( s t e p h a n p o u l o sa n dv a l l i n o ，1 9 9 1 ) ： l 、细胞途径中分支点控制形式的谚 别：通过比较不同操作条件的变化，或不同 变异菌株导致的分支点的分配比的变化，对一些重要的节点的柔性和刚性进行评估。 2 、替代途径的识别；对于许多微生物柬说可能不清楚一些具体的反应路线，那 么通过代谢流分析能够帮助识别几条代替途径并且知道是在不同条件下产生的。其 同样好地重复产生胞外代谢物的宏观通量测定( s c h u s t e r e l a l ，2 0 0 0 ) 。 3 、未测定的胞外通量的计算；有时，能被测的胞外通量的数目小于计算未知胞 内通量所需的数目。在这种情况下，利用先前的实验通量分配比，可以计算胞外未 知的通量。例如各种副产物的产生速率，可用化学计量模型和已知的通量束计算 ( e d w a r d sa n dp a l s s o n 19 9 9 ) 。 4 、最大理论得率的计算。在复杂的代谢网络中，以代谢流分析为基础的最大理 论得率计算更为正规可取。理论得率的计算实际上是为寻找最优控制策略提供一个 基准，为优化发酵过程或进行基因改造提供有益的参考( s a u e re t a l ，1 9 9 8 ) 。 1 5 神经网络算法及其应用 神经网络非常适合于复杂系统的建模和控制，特别是当系统存在不确定因素时， 更体现了其优越性，因此，神经网络在控制领域倍受重视。神经网络控制是指在控 制系统中采用神经网络这一工具对难以描述的复杂的非线性对象进行建模，或充当 控制器，或优化计算，或进行推理，或故障诊断等，以及同时兼有上述某些功能的 适当组合。神经控制最初是于1 9 9 4 年出现在i f a c 的杂志a u t o m a t i c a ) ) 第1 1 期 上，它源于1 9 9 2 年h 。t o l l e 和e e r s u 的专著n e u r o c o n t r 0 1 ) ) 。但从8 0 年代以来， 用神经网络来描述非线性系统，从而用其进行控制就已成为国际上的研究热点之一。 1 5 1 人工神经网络的发展 人工神经网络是人们从模仿生物脑结构和功能的角度出发建立的一种信息系 统，它能智能地对信息进行表示、存储和处理并具有一定的学习、推理功能。神经 网络的发展可以分为以下几个发展时期： l 、2 0 世纪4 0 年代。1 9 4 3 年，美国生理学家w | s m c c u l l o c h 和数学家w p i t t s 合作首先提出了兴奋与抑制型神元二元m p 模型：1 9 4 9 年，心理学家d o h e b b b 牛中农业人学硕 学位论文2 0 0 6 提出了神经元联接强度的修改规则，他们的研究成果至今仍是许多神经网络模型研 究的基础。 2 、2 0 世纪5 0 年代未至6 0 年代仞。这是神经网络理论研究的第一个热潮。1 9 5 8 年，f - r o s e n b l a t t 提出了感知器( p e r c e p t r o n ) 模型，试图模拟人脑感知能力和学习 能力，这是第一个完整的人工神经网络，初步具备了诸如并行处理、分布存储和学 习等神经网络的一些基本特征从而确立了从系统的角度研究人工神经网络的基础。 同年b w i n d r o w 和m e h o f