（微生物学专业论文）利用基因重组方法生产乙烯的初步研究.pdf

摘要 利用气相色谱方法从2 0 0 0 余株细菌中，确定丁香假单胞菌大豆致病变种( a p 删b m d ，i 嚣 s y r i n g a ep v g l y c i n e a ) i c m p 2 1 8 9 是一株能够产生乙烯的细菌，其最高产率为o 6 t t l m i o d c , o o h 根据已发表的乙烯形成酶基因( e t h y l e n e - f o r m i n g e n z y m e g e n e ，咖) 序列d 1 3 1 8 2 设计引物，从这株 苗中扩增出了乙烯形成酶基因，测序后经序列比对发现与已公布的丁香假单胞菌芝麻致病变种 ( ，s y r i n g a ep v s e s a m i ) 中的a f l 0 1 0 6 0 和a b 0 2 5 2 7 7 、麻致病变种( p v c a n a b i n a ) 中的 a f l 0 1 0 5 9 及大豆致病变种( p v g t y c i n e a ) e e 的a f l 0 1 0 5 7 四条乙烯形成酶基因序列相似性为 1 0 0 。将乙烯形成酶基因在大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) b l 2 1 ( d e 3 ) 中利用t 7 强启动子进 行了过量表达，表达蛋白可达总蛋白的4 5 ，并且表达的乙烯形成酶可以赋予大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 生产乙烯的能力，其最高乙烯产率为o 9 9 p 恤d 伽m 。在丁香假单胞菌大豆致病变种 i c m p 2 1 8 9 中利用细菌本身的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子带动乙烯形成酶基因表达，但是并不 能增加宿主菌的乙烯产率，这说明乙烯形成酶可能不是* 酮戊二酸型产乙烯途径中的控制乙烯 产率的关键因素。在谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u r a ) a t c c l 3 0 3 2 中利用t a c 启动 子、乙烯形成酶的启动子及棒杆菌本身的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子，谷氨酸脱氢酶启动子来 带动乙烯形成酶基因表达，结果发现乙烯形成酶基因并不能赋予宿主菌产生乙烯的能力，说明 谷氨酸棒杆菌可能不适合用于构建高产乙烯的工程菌株。 关键词：丁香假单胞菌大豆致病变种，乙烯形成酶基因( 咖) ，乙烯，表达 a b s t r a c t p s e u d o m o n a so m i n g a ep v g l y c i n e ai c m p 2 1 5 9w a si d e n t i f i e da sa l le t h y l e n e - f o r m i n gs t r a i nf r o m m o r et h a n2 0 0 0b a c t e r i a w i t ht h ee t h y l e n ep r o d u c t i v i t yo f0 6 p l m i o d c , o o h a c c o m i n gt ot h e p u b l i s h e d 弓詹g e n ed 1 3 1 8 2e n c o d i n gt h ee t h y l e n e - f o r m i n ge n z y m e ( e f e ) ap a i ro fp r i m e r sw o m d e s i g n e dt oa m p l i f yt h e 咖g e n ef r o m 只a y r i n g a ep v g l y e i n e ai c m p 2 1 8 9 t h e r e s u l t e dp c rp r o d u c t w a ss e q u c e da n d 协s e q u e n c ew a sc o m p l e t e l yi d e n t i c a lt ot h o s ef r o mps y r i n g a ep v s e s a m i ( a f l 0 1 0 6 0a n da b 0 2 5 2 7 7 ) , p s y r i n g a ep v c a n a b i n a ( a f l 0 1 0 5 9 ) a n dp s y r i n g a ep v g l y e i n e a ( a f l 0 1 0 5 7 ) t h ee s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) w h i c hc a r r i e dt h e 咖g e n eu n d e rt h ec o n t r o lo f1 7 p r o m o t e rc o u l de f f i c i e n t l ye x p r e s st h er e c o m b i n a n tp r o t e i na c c o u n t e df o r4 5p e r c e n to f t o t a lc e l l u l a r p r o t e i n , a n dp r o d u c e de t h y l e n ew i t hap r o d u c t i v i t yo f0 9 9 p 1 m i o d 6 0 0 h ，| s y r i n g a ep v g l y c i n e a i c m p 2 1 8 9 w h i c hc a r r i e st h ee x i i 阻e r e g e n e u n d e rt h ec o n t r o lo ft h ep r o m o t e ro f g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s eg e n ef r o mps y r i n g a ep v g l y c i n e ai c m p 2 1 8 9 c o u l dn o t i m p r o v et h ee t h y l e n ep r o d u c t i v i t y , s u g g e s t i n gt h a tt h ee f em a yn o tb et h ek e yf a c t o rf o rc o n t r o l l i n g e t h y l e n ep r o d u c t i v i t yi nk g ab i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fe t h y l e n e i na n o t h e rs t l 面nc o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u ma t c c l 3 0 3 2 ，t h e 咖w h i c hw a sc o n t r o l l e dr e s p e c t i v e l y u n d e rt h ep r o m o t e r so f g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g c o a s eg e n ea n dg l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s eg e n ef r o mc g l u t a m i c u ma t c c l 3 0 3 2 e y ef r o mps y r i n g a ep v g l y c i n e ai c m p 2 1 8 9 , a n dt a cp r o m o t e rc o u l dn o t e n d o wt h eh o s tw i t he t h y l e n e - f o r m i n ga c t i v i t y t h er e s u l ti n d i c a t e st h a tc g l u t a m 缸u ma t c c l 3 0 3 2 m a yn o tb ea na p p m p r i a t eh o s tf o re x p r e s s i n g 咖g e n e k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v g l y c i n e a , e t h y l e n e - f o r m i n ge n z y m eg e n e ( e # ) , e t h y l e n e , e x p r e s s i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间：2 棚7 年月腭日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生躲轨 导师签名 时间：弘刀年月譬日 时间：m 7 年岛f 留日 中国农业大学硕士学位论文第一章生物乙烯研究进展 第一章生物乙烯研究进展 乙烯是现代石油化学工业的基础原料。通过乙烯的聚合、氧化、卤化、烷基化、水合，羰 基化、齐聚等反应，可以获得多种极其重要的化工原材料，其下游衍生物或制品对整个国民经 济的发展起着重要作用( 黄立道2 0 0 5 ) 因此，世界各国都在极力促进乙烯工业的建设和发 展。目前，我国乙烯消费量为1 5 0 0 万吨，国内乙烯产量仅为6 0 0 万吨，其余9 0 0 万吨完全依 赖于进口，自给率仅为4 3 随着我国经济的持续快速发展，我国对乙烯的需求持续增加，预 计到2 0 1 0 年乙烯需求当量将达2 0 0 0 万吨以上，6 0 以上需要进口( 邹劲松2 0 0 4 ；房广信李 立新，2 0 0 3 ) 。由于乙烯是从石油中提炼和加工的，随着石油资源的日益枯竭，进行生物乙烯一 替代石油产品的研究将具有重要的战略意义 1 乙烯的理化性质及用途 乙烯的分子式为c 2 h 4 ，相对分子量为2 8 0 5 ，其凝固点、熔点及沸点分别为1 8 1 ，1 6 9 5 ，一1 0 3 7 ，其密度与空气密度比值为0 9 7 8 ，比空气稍轻。常温常压下为无色气体，稍有 香甜味，难溶于水( c e r t i f i e r sa n du s e 1 9 9 9 ) 乙烯作为石油化学工业的基础原料，通过不同的 化学反应，可以获得多种极其重要的化工原材料( 黄立道，2 0 0 5 ) 。另外，乙烯还是一种重要 的植物激素，对于植物的生长发育具有调控作用，主要包括解除休眠，幼芽和根的生长及分化， 不定根的形成，叶和果实的脱落，一些植物的催花作用，雌雄异体花的雌性诱导作用，花器官 的发育，花和叶的老化，果实的成熟等几个方面( p r a t ta n dg o e s c h l 1 9 6 9 ；o s b o m e 。1 9 7 8 ； l i b e r m a n 1 9 7 9 ；s e m b d n e re ta l 1 9 8 0 ；y a n g ，a n dh o 觚a n ，1 9 8 4 ；b e y e re ta 1 1 9 8 4 ) 2 乙烯的生物合成途径 2 1 卜氨基环丙烷羧酸( a c c ) 途径 1 一氨基环丙烷羧酸( a c c ) 途径主要存在于植物中，几乎所有植物的器官如根，颈，叶， 花，种子等都可以产生乙烯，但是各器官的产量差别很大，并且在不同的生长发育阶段也会有 不同的产量表现( m a t t o a n d s u t i l e ，1 9 9 1 ：r e i d ，1 9 9 5 ) 。具体a c c 途径见图1 1 ( g a s p e r e t a l ， 1 9 9 6 ) 。其过程可简化为m e t s a m + a c c e t h y l e n e 。第一步是甲硫氨酸( m e t ) 经过 甲硫氨酸腺苷转移酶催化作用，将a t p 上的腺苷转移到m e t 上，形成孓腺苷甲硫氨酸( s a m ) ， 此步又称m e t 的活化( b u r g ，1 9 7 3 ；m u r ra n dy a n g 1 9 7 5 ；y ua n dy a n g 。1 9 7 9 ) 。第二步是形 成的s a m 在a c c 合酶的作用下形成a c c 有研究表明a c c 合酶的m r n a 水平与乙烯产量 水平呈正相关，是乙烯途径中的限速酶( a d a m sa n dy a n g 。1 9 7 9 ；y a n ge t a l ，1 9 8 0 ) 。第三步， 是由a c c 产生乙烯( e t h y l e n e ) ，此步由a c c 氧化酶催化，这种酶过去又称为乙烯形成酶 中国农业大学硕士学位论文第一章生物乙烯研究进展 ( e f e ) ，需f e = + 参与，c o z 激活( p e i s e re ta l 1 9 8 4 ；b r u n b u b e re ta 2 0 0 0 ；d o n ge ta 1 1 9 9 2 ) a c c 氧化酶不像a c c 合酶那样受到严密的调控，在植物中表达是呈组成型的 ( s e m b d n e re ta l ，1 9 8 0 ) 。 l l p l l l i u l o n r l c c 捌l a c c 圈1 1 乙烯的a c c 合成途径( $ e m b d n e r e t a l 1 9 8 0 ) f i g 1 1a c cb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f e t h y l e n e 2 22 - 酮一一甲硫基丁酸( k m b a ) 途径 2 一酮4 甲硫基丁酸( k m b a ) 途径虽然也是m e t 依赖型，但是其合成途径不同于植物的 a c c 途径，并且现在发现这条途径只存在于微生物中。k m b a 途径的研究主要集中在2 0 世纪 的7 0 9 0 年代，主要研究的微生物有e s c h e r i c h j ac o i l , c r y p t o c c u sa l b i d u s , s e p t o r i a m u s i v a ( p d m r o s e ，1 9 7 6 a ，b ，1 9 7 7 ；b i l l i n g t o ne ta ，1 9 7 9 ；i n c ea n dk n o w l e s 1 9 8 5 ，1 9 8 6 ； f u k u d ae ta 1 ，1 9 8 9 a ，b ，co 一般认为微生物中m e t 依赖型的产乙烯途径都遵循相同的模式 即k m b a 途径，其过程可简单表示为：m e h k m b a 一日- h y l e n e m e t 经过一个中间产物 k m b a 即可转化为乙烯。具体的k m b a 途径见图1 2 ( f u k u d ae t a l 1 9 9 3 ) ： 2 韩 p 瓤 d h i 攫脯a + 蠡i = , , a d n 锄 x 燃留捉 爷妒舞；，f 轴* u 辑、 俐 图1 2 乙烯的k m b a 合成途径( f u k u d ae t a 伯9 3 ) f i g 1 2 k m b a b i o s y n t h e t i cp a t h w a y o f e t h y l e n e p r i m r o s e ( 1 9 7 6 a b ：1 9 7 7 ) 利用ec o l i 作为研究材料，发现k m b a 途径反应体系中必须 存在k m b a ，f e t e d t a ，n a d h ，0 2 ，这个发现后来在其它菌体中也得到了确认( i n c ea n d k n o 、i e s ，1 9 8 5 1 9 8 6 ) 。在上图中，反应可分为两部分，第一部分，首先2 m o lf e 3 + - e d t a 和 1m o ln a d h 在n a d h f e 氧化还原酶的作用下，生成2 t o o l 的f e 2 + e d t a 和1m o l 的n a o + ， 2 t o o l f e 2 _ e d t a 经2 m o | 0 2 的还原，产生一分子的超氧自由基【f e 2 + + 0 2 f 矿4 - 0 2 1 。0 2 - 经过一步歧化反应，形成过氧化氢【2 0 2 - 4 2 h + 一h 2 0 2 + 0 2 】。过氧化氢随后与f e 2 * 经过f e n t o n 反应产生氢氧根离子【f e ”+ h 2 0 2 一f e ”+ o h i 。第二部分，m e t 在甲硫氨酸氨基转移酶的 作用下，生成k m 队，这步反应在生物体中是普遍存在的。k m b a 与第一部分生成的o h 作用 生成乙烯、甲硫醇和二氧化碳( f u k u d ae ta l ，1 9 8 9 c ，1 9 9 3 ；o g a w ae ta 1 ，1 9 9 0 ：) ，这步反应的 酶系尚不清楚，在大肠杆菌中，研究者认为可能是过氧化物酶和，或葡萄糖脱氢酶参与，而且观 察到有核黄素存在时的光照刺激也可以使这步进行( p d m m s e 1 9 7 6 a 。1 9 7 7 ) ，后来又有研究认 为参与的酶可能是一种转氨酶，而不是过氧化物酶，葡萄糖脱氢酶( o g a w ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 。在对 s e p t o r i am u s i v a 的研究中，参与此步反应的酶也没有得到确认，但是研究者却发现有二甲基二 硫化物和蚁酸伴随乙烯产生( b r o w n s k f o b o te t a l 1 9 8 5 ) 。 2 3a 一酮戊二酸( k g a ) 途径 这条途径目前认识的较为充分，认识这条途径的难点是乙烯直接前体的确定。这项研究主 要是在p e n i c i l l i u md i g i t a t u m 和p s e u d o m o n a ss y d n g a ep v p h a s e o l i c o l a r 两种菌中进行的 在最初的研究中人们发现”c 标记的葡萄糖，甘氩酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸等都可以转化 为乙烯，并且猜想葡萄糖转化为乙烯需要经过糖酵解和三羧酸循环( w a n ge t a l 1 9 6 2 ) 。后来， 其他研究者利用”c 标记的柠檬酸，乙酸，丙酮酸进一步确定了乙烯的形成需要三羧酸循环的 参与( g i b s o n ，1 9 6 4 ；g i b s o na n dy o u n g ，1 9 6 6 ；k e t r i n ge t a l 1 9 6 8 ) 。通过三羧酸循环中的多种 相关物质作为底物如琥珀酸，柠檬酸，苹果酸等，发现a 一酮戊二酸( k g a ) 是乙烯生产最高效的 底物，也因此认为k g a 就是三羧酸循环与乙烯途径的节点( c h o ua n dy a n g ，1 9 7 3 ) 。f u k u d a 等( 1 9 8 6 ：1 9 8 8 ：1 9 8 9 a ，b ) 利用体外系统成功的确定了乙烯合成途径的前体物质就是k g a 及一些 其它的必须成分，之后他们提纯了乙烯形成酶，对其酶学性质进行了研究。他们所提出的途径 3 中国农业大学硕士学位论文第一章生物乙烯研究进展 见图1 3 ( f u k u d ae t a 。1 9 9 3 ) g l u c o s e 图1 3 乙烯的k g a 合成途径( f u k u d ae t a l ，1 9 9 3 ) f i g 1 3k g ab i o s y n t h 讹p a t h w a yo fe t h y l e n e 图中显示k g a 在l - a 叼，f e z * ，d 丌及氧气的参与下，经过一步乙烯形成酶的催化反应， 就可以生成乙烯。在对p e n i c i l l i u md i g i t a t u m 乙烯合成途径研究的基础上，研究者又对p s y r i n g a e 的乙烯合成途径进行了研究，他们发现二者的乙烯形成途径实际上是一样的( g o t oe t a 1 9 8 5 ；g o t oa n dh y o d o ，1 9 8 7 ；n a g a h a m ae t a l 1 9 9 1 a ) 由于后者的乙烯产率是前者的几 倍，所以以后的k g a 途径研究主要以户s y r i n g a e 为研究对象，对具体的乙烯合成机理进行了 深入的研究。 2 4 其它途径 现在人们还发现一些低等植物也能够产生乙烯，比如浮萍植物，苔藓植物，厥类，问荆等 ( o b s o m e ，1 9 8 9 ；t h o m a s e t a l 1 9 8 3 ) 。但是现在已有的研究结果都表明这些植物合成乙烯的途 径是不同于高等植物所普遍遵循的a c c 途径，但是关于低等植物中乙烯合成途径的研究比较 少，所以现在也不能确定是否遵循微生物中的k m b a 途径或是k g a 途径( 1 3 t t l e ，1 9 8 7 ；w a i t e r s a n do s b o r n e 。1 9 7 9 ；o s b o r n e ，1 9 8 2 1 9 9 1 ；o s b o r n ee t a l ，1 9 9 6 ) 。 另外，还有报道称从下水道污泥中分离出一株细菌d e h a l o c o c c o i d s e t h e n o g e n e s1 9 5 ，对 这种细菌的1 6 sr d n a 分析发现与已发现的菌种同源关系很远。它的独特能力是可以把下水道 中的有害污染物四氯乙烯转化为乙烯。这种菌可能被用来做为有害污染物的降解菌用于环境修 复( m a y m o - g a t e l le t a 1 9 9 7 ；h ee t a 2 0 0 3 ) 。 4 中国农业大学硕士学位论文第一章生物乙烯研究进展 在土壤表面的空气中会有一定浓度的乙烯气体存在，这对植物的生长发育有重要的生态学 作用( s m i t ha n dr u s s e l l 。1 9 6 9 ；s m i t h 。1 9 7 6 ；p r i m r o s e 1 9 7 9 ；a r s h a da n df r a n k e n b e r g e r , 1 9 8 8 。1 9 9 0 a 1 9 9 2 ；m u r o m t s e v e t a 1 9 9 3 ；b i b i k e t a l ，1 9 9 5 ；a h m a da n d a r s h a d ，1 9 9 8 ) 这些 乙烯的来源已经被证明是来自土壤中的生物和非生物两个方面但主要是来自生物作用 ( a r s h a da n df r a n k e n b e r g e 2 0 0 2 ) 。土壤中的细菌，真菌及藻类都可以产生乙烯，具体哪一 类群起主要作用现在还有争议。有研究表明从土壤中分离的细菌产生乙烯是在厌氧条件下产生 的( s m i t ha n dc o o k ，1 9 7 4 ；s m i t ha n dr e s t a l l ，1 9 7 1 ，c o o ka n ds m i t h ，1 9 7 7 ) ，但是也有其它研 究表明从土壤中分离的细菌只能在有氧的条件下才能够产生乙烯( p r i m r o s e ，1 9 7 6 ；p a z o u te t a l ，1 9 8 1 ) 。通过向土壤中加入抗细菌物质或是抗真菌物质，人们确定细菌和真菌都可以是乙 烯的生产者( s u t h e d a n da n dc o o k ，1 9 8 0 ；f r a n k e n b e r g e ra n dp h e l a n1 9 8 5 ；a r s h a da n d f r a n k e n b e r g e r , 1 9 9 0 a ) 。有些研究表明土壤可以转化m e t ，k m b a 或是a c c 为乙烯，但是具 体的合成途径不清楚( a m h a da n df r a n k e n b e r g e r , 1 9 9 0 b ；a r s h a da n df r a n k e n b e r g e r , 1 9 8 9 ； f r a n k e n b e r g e ra n dp h e l a n ，1 9 8 5 ) 。此外土壤中存在的低等植物( 绿藻类) 如r e g n e i d i u m d i p h l l u m ，m a s i l e aq u a d r i f o l i a 等也是可以产生乙烯的( c h e m e y sa n dk e n d e 1 9 9 6 ；o s b e m ee t a l 。1 9 9 6 ) 。所以，土壤乙烯的产生很可能是微生物区系中各类群共同作用的结果，其合成途径 应该包括现在已经认识的途径，其它未知的途径也应该存在具体是哪类微生物是产乙烯的主 体，这主要取决于土壤类型及外界环境( a m h a da n df r a n k e n b e r g e r , 2 0 0 2 ) 。 3 产生乙烯的微生物 乙烯在自然界中一个最主要的作用就是做为一种植物激素调控着植物的生长发育( d a v i e s 1 9 9 5 ) 。人们之所以能够认识到某些微生物能够产生乙烯，主要是基于想要认识这些微生物是 否通过乙烯的激素作用来对植物产生影响这个角度出发的。因此现在所有发现的能够产生乙烯 的微生物都是与植物有关的。如产乙烯的p e n i c i l l i u md i g i t a t u m 是从发了霉的柑橘上分离得到 的( b i a l e 1 9 4 0 ；m i l l e re ta l 1 9 4 0 ) ，p s e d u o m o n a sp h a s e o l i c o l ap k 2 是葛藤的一种病原菌 ( g o t oe t a 1 9 8 5 ) ，a g m b a c t e f i u m 是一种植物的内源细菌( e z u r ae t a l ，2 0 0 0 ；k e p c z y s l i e f a 2 0 0 3 ) 土壤中微生物对植物的生长发育起调控作用一重要个方面是其产生乙烯来介导的 ( a h m a da n da r s h a d 。1 9 9 8 ) 。现在发现的可以产生乙烯的微生物见表1 1 ( a r s h a da n d f r a n k e n b e r g e r , 2 0 0 2 ) 。 襄1 1 产乙烯的微生物( a r s h a da n df r a n k e n b e r g e r , 2 0 0 2 ) t a b l e1 ，1e t h y l e n e - e v o l v i n gm i c r o o r g a n i s m s s p e c i e s r e f e r e n c e a b a c a t e r i a a c i n e t o b a c t e r c a l c o a c e t i c u s a e r o m o n a ss p p a g r o b a c t e r i u mr z h o g e n e s a t u m e f a c i e n e 5 b i l l i n g t o ne t a l ( 1 9 7 9 1 b i l l i n g t o ne ta 1 ( 1 9 7 9 1 s w a n s o ne t a l ( t 9 7 9 ) s w a n o o ne ta i ( 1 9 7 9 ) 塞量奎些銮茎墨圭茎竺丝耋。，。，。，。，。，。，。，。，薹二耋二耋丝三耋：! ! ：i 耋曼 a r t h r o b a c t s r a p p p r i m r o s e ( 1 9 7 6 b ) a z o s p i n l l u ma p p b a c i l l u sl i c h e m f o r m i s & s u b u l i s c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c c u m c i t r o b a c t e r a p p c l o s t r i d i u mb u t y 麻u m c o r y n e b a c t e d u ms p p ca q u a u c u m cp a u r o m e t a b o l u m c o q , n e f o r mb a c t e r i a e n t e r b a c t e r a e r o g e n e s ec l o a c a e e n v i n as m y l o v o r 8 ec a r o t o t o v o r a eh e r b i c o l a e s h e r i c h i ao o l i k l e b s i e l l ao s a e n a e ，( p n e u m o n i a so x y t o c a kp n e u m o l a e m i c r o c o c c u sl u t e u s p s e u d m o n a ss p p pa e r u g i n o s a 户f l u o r e s c e n sv a t r e p t i l l i v o d a ps y n n g a e ps y r i n g a ep v c a n a b i n a ps y n n g a ep wg l y c i n e a pi n d i g o f e r a 户m a r g i n a t a ps y r i n g a ep v m o r i 户s y n n g a e p v a e s a m i p p i s i pp o l y c o l o r p p u t i d a s t r z e k ae ta l ( 1 9 9 4 a ) f u k u d a 甜a h l 9 8 9 a ) m a n s o u r ia n db u n c h ( 1 9 8 9 ) m a n s o u da n db u n c h ( 1 9 8 9 ) p r i m r o s e ( 1 9 7 8 m p a z o u te t a l ( 1 e 8 1 ) 斟m n g t o ne t a ，( 1 9 7 9 ) f u k u d ae t a _ ，( t 9 8 4 。1 9 a ) f u k u d a 甜a 1 ( 1 9 8 9 a ) b i l l i n g t o n 甜n , ( 1 9 7 9 ) m a n a s o u da n db u n c h ( 1 9 8 吼 p r i m r o s e ( 1 9 7 鳓 s w a n s o ne t 乱( 1 9 7 9 ) s w a n s o ne t 札1 9 7 9 ) p r i m r o s e ( 1 9 7 6 坼 p d m r o s e ( 1 9 7 8 b ) ：s w a n s o ne t a l ( t 9 7 9 ) ； s h i p s i o na n db u n c h ( 1 9 8 9 ) ； m a n s o u r ia n db u n c h ( 1 9 8 9 p d m m s e ( 1 9 7 8 b ) p r i m r o s e ( 1 9 7 6 m p d m r o s e ( 1 9 7 6 b 1 m a n s o u r ia n db u n c h ( 1 9 8 钟 p d m r o s e ( 1 9 7 6 阱 m a n s o u da n db u n c h ( 1 9 8 舢 s w a n s o ne ta 1 ( 1 9 7 们 s a t oe t a l ( 1 9 9 7 ) ：s w a n s o ne t a l ( 1 9 7 9 ) s a t oe ta 1 ( 1 9 9 乃 s a t oe ta 1 ( 1 7 ) p r i m r o s e ( 1 9 7 6 吣 s w a n s o ne t 越( 1 9 7 9 ) s a t oe t a l ( 1 9 8 7 ) s a t oe t a l , ( 1 9 9 7 ) s w a n s o ne t a l ( 1 9 7 9 ) ；b i l l i n g t o ne t a l ( 1 9 7 钟 s w a n s o ne ta i ( 1 9 7 9 ) p a z o u t e t a l ( 1 9 8 1 ) ；f u k u d ae t a l ( 1 9 8 9 a ) ； s a t oe t a l ( 1 9 8 7 ) b o n ne t a l ( 1 9 7 5 ) ；s w a n s o ne t a l ( 1 9 7 9 ) ； f r e e b a i ma n db e d d e n h a g e n ( 1 9 6 4 ) ； s a t oe ta l ( 1 9 8 7 ) g o t oe ta ( 1 9 8 5 ) ；g o t oa n dh y o d “1 9 8 7 ) ： n a g a h a m a e t a l ( 1 9 9 1 a ，b ) s w a n s o ne ta f ( 1 9 7 9 ) 6 中国农业大学硕七学位论文 第一章生物乙烯研究进展 r h i z o b i u m t r i f o l lb i l l i n g t o ne t a ( 1 9 7 9 ) s e r r a d al i q u e f a c i e n sp d m r 0 6 e ( 1 9 7 6 b l sm s r c o s c e r l 8 m a s n s o u da n db u n c h ( 1 9 8 9 ) s t a p h y l o c o c c u s8 u r e u s m a s n s o u na n db u r c h ( 1 s s g ) t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s n a g a h a m ae ta 1 ( 1 9 9 2 ) x a n t h o m o n a sc a m p e s t # $ m a n s o u da n db u n c h ( 1 9 8 9 ) xc t # g o t oe ta ( 1 9 7 9 ) xp h a s e o l i s w a n s o l le ta l ( 1 9 7 9 ) xp h a s e o l i v a t ；s o j e n s e s w a n s o ne t a , ( 1 9 7 9 ) xv e s i c a t o r i a s w a n s o ne t a ( 1 9 7 9 ) b c t i n o m y c e 玎e s s t r e p t o m y c e s s p p d a s i l v a e t a l ( 1 9 7 4 ) ；l l a ga n d c u n j s ( 1 9 6 8 ) c f u n g i a c r a s i sm s e 8 a m a g ia n dm a e d a ( 1 9 9 a a g a r i c u sb i s p o r u s l o c h a r da n dk n e e b o n e ( 1 9 6 2 ) ；w o o da n d h a m m o n d ( 1 9 7 7 ) ；w a r de t 州1 9 7 8 ) ； b a b i k e ra n dp e p p e r ( 1 9 8 4 ) a c a n d i d u si l a ga n dc u r t i s ( 1 9 6 8 ) b l a s t o m y c e $ d e t t n a t i u d u s n i c k e m o n ( 1 9 4 8 ) v o t o d d ss p e c t a b i l i sl l a n ga n dc u r t i s ( 1 9 6 8 ) c a c a r i s p o # u m p a r a s i u c u m h a n k ea n dd o l h v e t ( 1 9 7 6 ) c a n a d m av a r t i o v a a r a i a m h a da n df r a n k e n b e r g e r ( 1 9 8 9 ) ： b a b i k e ra n dp e p p e r ( 1 9 8 4 ) c e n o c o c c u mg e o p h i l u m g r a h a ma n du n e r m a n ( 1 9 8 0 ) c e p h a l e s p o d u mg r a m i n e u r n l l a ga n dc u r t i s ( 1 0 8 ) c e r a t o c y s d sf i m b n a t a c h a l u t za n dd e v a y ( 1 9 6 9 ) ； f u k u d aa n do g a w a ( 1 9 9 1 ) cc h l a m a l o i d e si l a ga n dc u r t i s ( 1 9 6 8 ) c o l l e t o t r l e h u mm u s a e p e a c o d a n dm u i r h e a d ( 1 9 7 4 ) c o n o l u s h i r s u t u s t a n a k ee t a ，( 1 9 s 6 ) c o r i o l u sv e r s i c o l o r t a n a l ee ta ( 1 6 ) c t y p t o c o c c u sa l b i d u s f u k u d ae t a l ( 1 9 8 9 a l cj a u ，w 瑚f u k u d a 酣a l ( 1 9 8 9 a ) ；f u k u d a ( 1 9 8 4 ) cl u n a t ae i - s h a r o u n y ( 1 9 8 4 ) cd a m a u u mv a r t r a n c a t u mt z e n ga n dd e v a y ( 1 9 8 4 ) c y l i n d r o c a r p o ns p p e i s h a r o u n y ( 1 9 8 4 ) c y l i n d r o c l a d i u mf l o d d a n u m a c e l r o o d - m c c a r t h ya n dl i n d e r m a n ( 1 9 8 1 ) cs c o p a d u m a c e l r o o d - m c c a r t h ya n dl i n d e r m a n ( 1 9 8 1 ) c y t o s p o r ae u c a l y p b c o l a w i l k e se ta 1 0 9 8 9 l d a e d a l e ad i c k i n s i l t a n a k ae t 酿( 1 锄旧) d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i f u k u d ae ta ( 1 9 a ) d e m a u u mp u l l u d a n si l a ga n dc u r t i s ( 1 9 6 8 ) d i c t y o x t e l i u md e i s c o i d e u m b o n n e r ( 1 9 7 3 ) ；a m a g a ia n dm e e d a ( 1 9 9 2 ) 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章生物乙烯研究进展 n n u c o t o 幽$ a m a g a ia n dm a e d a ( 1 9 9 2 ) ；a m a g a