（微生物学专业论文）杨树菇液体发酵及其抗生物质的初步研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：鲎妻蚂 日期： 2 弓j ，1 二 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：蛊霆蚂导师签名：必盔日 期：垫；：上：! 圣 摘要 通过对1 4 株食用真菌的抑菌试验筛选，发现杨树菇( a g r o c y b ea e g e r i t a ) 具 有极强的抑菌作用，且抑菌谱广，可以有效抑制细菌、酵母和部分霉菌的生长。 与不同浓度( 0 0 5 、0 ，1 、o 2 、o 3 g m 1 ) 山梨酸、苯甲酸抑菌能力相比， 抑菌效果更为明显。同时，对杨树菇的菌丝进行了液体培养，结果发现其菌丝体 生长良好，菌丝球致密、均匀，说明其易于液体培养。并发现去除菌丝体的发酵 液具用较好的抗茵活性，可有效地抑制格兰氏阳性( g + ) 、格兰氏阴性( g - ) 菌， 对酵母及霉菌的抗性较差。用7 0 的乙醇浸提菌丝体，浓缩去除已醇后的提取液 也具有一定的抗菌活性。 以敏感菌金黄色葡萄球菌为指示菌，以抗菌活性( 抑菌圈的直径，单位： m m ) 为标准，采用单因子设计，并结合正交试验的方法优化了杨树菇的发酵培 养基成分，其较优的组成为：土豆汁1 5 、麸皮汁3 、蔗糖5 、m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 o 1 5 、k h 2 p 0 4o 3 。经研究得出的最适培养条件为：发酵周期7 - 9 天，发酵 温度2 5 ( 2 ，发酵起始p h 值6 0 7 ，0 ，发酵液装量为8 0 1 4 0 m l 5 0 0m l 三角瓶，摇 床转速1 5 0 r m i n ，接种量1 0 1 5 ( v v ) 。发酵液浓缩液经过1 2 1 、2 0 m i n 湿热灭 菌处理后仍具有较强的抑菌活性，表明此类抗菌活性物质较为耐热。 采用4 0 一8 0 的硫酸铵分级沉淀，o 0 1 m 的磷酸缓冲液溶解，超滤除去硫 酸铵，经检测超滤膜截留部分具有良好的抗菌活性。可以抑制金黄色葡萄球菌 ( g + ) 和大肠杆菌( g - ) 的生长，但对酵母菌和霉菌不起作用。经d e a e s e p h a r o s e f a s tf l o w 离子交换层析，得到一个阶段洗脱峰和一个主要的直线梯度洗脱峰， 此梯度洗脱峰具有抗菌活性。后经s d s 聚丙烯酰铵凝胶电泳检测为三条分子量 十分接近的多肽链。研究发现，此粗提物在2 0 - 7 0 ( 2 的范围内比较稳定，最适作 用p h 为5 0 ，在p h 3 6 的条件下其抗菌活性高且比较稳定。某些金属离子特别 是z n 2 + 对其抗菌活性有很强的激活作用，p b 2 + 则有强烈的抑制作用。 关键词：食用真菌抑菌活性发酵条件纯化及性质 a b s t r a c t t h r o u g ha n t i m i c r o b i a le x p e r i m e n to f1 4s t r a i n so f e d i b l em u s h r o o m s ，i tw a s f o u n dt h a ta g r o w b ea e g e r i t as h o w e dg r e a ta n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ，t h ea n t i b i o t i c p r o d u c e db y t h ef u n g u sc a l le f f e c t i v e l yi n h i b i tt h eg r o w t h o f b a c t e r i a , y e a s ta n dp a r t i a l m i l d e w t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yi sm o r ee v i d e n ta sc o m p a r e dw i 血s o r b i ca c i da n d b e n z o i ca c i do f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n ( 0 ，0 5 、o 1 、0 2 、o | 3 g m 1 ) t h r o u g ht h e s u b m e r g e df e r m e n t a t i o no fa g r o c y b ea e g e r i t a ，i tw a se a s yt og r o wa n dg e tm a n y m y c e l i as p h e r e s w h i c hw e r ee v e na n dd e n s e b yt h ea n t i - m i c m b i a le x p e r i m e n to ft h e s u b m e r g e dc u l t u r eo fa g r o c y b ea e g e r i t aw i t h o u tm y c e l i as p h e r e s ，i tw a sf o u n dt h a t t h es u b m e r g e dc u l t u r es h o w e dg r e a ta n t i m i c r o b i a la c t i v i t y i tc a l le f f e c t i v e l yi n h i b i t g + 、g a n di t s a b i l i t yo fi n h i b i t i n gy e a s ta n dm e d i u mw a sw o r s e t h ef e r m e n t e d m y c e l i ao f a g r o c y b ea e g e r i t aw e r ee x t r a c t e dw i t h7 0 a l c o h 0 1 t h e e x t r a c t sw i t h o u t a l c o h o la l s oh a v ea n t i s e p t i ca b i l i t y a f t e rf e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g n ， t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u mc o n s i s t e do f c o m p o n e n t sa sf o l l o w e d ：p o t a t oe x t r a c t 1 5 ，w h e a tb r a nb r o t h3 ，s u c r o s e5 ，m g s 0 4q h 2 0o 1 5 ，k h 2 p o , 0 3 ，a n d t h eo p t i o n a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sh a v ea l s ob e e na c h i e v e d t h eo p t i m u mp e r i o d ， t e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp ho ft h em e d i u ma n dt h ei n o c u l a t i o nr a t e f o rt h es u b m e r g e d f e r m e n t a t i o no fa g r o c y b ea e g e r i t aw e r e7 - 9 d ，2 5 ，6 0 - 7 0a n dl o - 1 5 ( v v ) r e s p e c t i v e l y t h ec u l t u r es t i l lh a ss t r o n ga n t i s e p t i ca b i l i t ya f t e rah e a t i n gt r e a t m e n t o f 1 2 1 f o r2 0 r a i n t h e p r o t e i n sa c q u i r e d f r o mf e r m e n t a t i o nb r o t hb y4 0 一8 0 a m m o n i u m s u l f a t e - f r a c t i o np r e c i p i t a t i o n ，u l t r a _ f i l t r a t i o ns e th a v ea n t i s e p t i ca b i l i t y t h e yc a n i n l f i b i tt h eg r o w t ho fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ( g ) a n de s c h e r i c h i ac o l i ( g 一) a f t e r d e a ef a s tf l o w a n t i s e p t i cc o m p o n e n t s ，w h i c hi n c l u d et h r e ep e p t i d e s1 i ms i m i l a r m o l e c u l a rw e i g h t j u d g e db ys d s - p a g e ，w e r ep u r i f i e dp r i m a r i l y t h e c h a r a c t e r i s t i c o ft h e mw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti t w a ss t a b l ed u r i n g2 0 7 0 c ，i t s o p t i o n a lp hw a sa b o u t5 0a n di t w a ss t a b l ef r o mp h 3 ，0t op h 6 0 s o m em e t a li o n s e s p e c i a l l yz n 2 + c a r lh i g h l yi m p r o v e i t sa n t i s e p t i ca b i l i t y ，b u tp b 2 + h a sg r e a ti n h i b i t i o n t o i t k e yw o r d ：e d i b l e m u s h r o o m s ；a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ；c o n d i t i o n o ft h e f e r m e n t a t i o n ；i s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n 第一章前言 食用菌是指可以食用的大型高等真菌，目前食用菌在人民日常生活及经济生 活中均具有重要地位，食用菌产业已成为农业中继种植业和养殖业之后又一支柱 产业。 食药用菌生产在我国历史悠久，根据大量的史料考证，中国是世界上最早栽 培香菇、草菇的国家，早在8 0 0 年前，我国浙江的庆元、景宁、龙泉三县交界地 区的劳动人民就用砍花法在深山密林中从事香菇种植业；我国也是世界上最早利 用真菌防病治病的国家 1 i 。 食( 药) 用真菌应用广泛，其应用前景十分乐观2 1 ，其应用主要表现为以下 几个方面： 1 抗肿瘤【3 圳l 1 1 多糖的抗肿瘤作用 食用菌的抗癌作用主要来自食用菌中的多糖，这类化合物虽对肿瘤细胞没有 直接的杀伤作用，但能刺激抗体的形成，提高并调整机体内部的防御能力。此外， 食用菌还能降低某些物质诱发肿瘤的发生率，并对多种化疗药物有增效效应。 s a s a k i 等( 1 9 7 1 ) 发现，从树舌子实体中分离的多糖g 一2 可抑制小鼠s 一1 8 0 肉瘤生长。李旭生等发现，灵芝菌丝提取物( g l p ) 对c 3 h 小鼠的肌性纤维恶 性肿瘤有抑制作用，而且对此肿瘤细胞的肺转移病灶也有抑制作用。银耳多糖的 抗肿瘤作用首见于u k a i 等( 1 9 7 2 ) 的报道，发现银耳多糖对鼠s 一1 8 0 肉瘤有 明显的抑制作用。周爱如等( 1 9 8 7 ) 发现，腹腔注射银耳多糖能明显抑制小鼠 艾氏腹水癌生长，井显著抑制腹水癌细胞d n a 合成速率。c h i h a r a 等( 1 9 6 9 ) 首先发现香菇的热水提取物能抑制小鼠s 一1 8 0 肉瘤生长，以后从其中获得香菇 多糖( l e n t i n a n ) ，不仅抑制肿瘤生长而且还能预防化学性和病毒致瘤物的致癌作 用。在日本自古以来就把栗蘑作为野生草药用于治疗胃癌、食道癌、乳腺癌，栗 蘑的抑制作用主要是b d 一葡聚糖。此外，栗蘑中富含有机硒，可作为补硒食 品，若长期食用，几乎可以防止一切癌变。云芝多糖( v s p ，商品名k r e s t i n ) 、 云芝多糖肽( p s ) 、茯苓多糖和羟甲基茯苓多糖、裂皱菌多糖( s c h i z o p h y l l a n ) 、 猪苓多糖等也有抗肿瘤作用对实验动物的移植性肿瘤有抑制作用。 4 1 2 抗肿瘤蛋白【2 2 食用真菌中含有丰富的蛋白质，由2 0 种氨基酸组成，不仅可供营养，而且 对癌细胞亦有明显的抑制作用。如：冬菇中的碱性蛋白质具有抑制癌细胞的作用。 据报道冬菇含有9 0 的碱性蛋白质：民间冬菇经常食用地区癌发病率显著降低； 鼷鼠试验证明，冬菇有延长寿命之功效。此外，香菇中的1 3 ( 1 3 ) 葡萄糖苷酶， 草菇中的异种蛋白，金针菇中的火菇素对癌细胞有抑制作用。 1 3 核酸的抗肿瘤作用 食( 药) 用真菌体内的核酸和核酸类似物抑制肿瘤细胞生长是通过诱导体内 的某些物质，阻止癌细胞的增殖和分裂，达到抗癌的目的。如：双孢蘑菇含有一 种双链的核糖核酸，为干扰素的诱导物，能促使人体释放一种低分子的糖蛋白， 进入癌细胞后，使癌细胞难以增殖，此外，核酸类似物对癌细胞亦有阻止生长的 作用。如：冬虫夏草的冬虫夏草素有抑制癌细胞分裂：草菇的嘌呤浸出物对癌细 胞都有一定的抑制作用。 2 抗菌及作为食品防腐剂 食( 药) 用真菌中有许多种具有抑菌防腐功能，其作为食品防腐剂由来已久。 在英国，人们就在饭菜中添加竹荪以起到延长存放时间的作用，在我国云南，人 们也早就发现竹荪做的菜放置几天而不馊的现象。食药用真菌之所以防腐，主要 是因其可以产生抑菌活性物质。1 9 4 5 1 9 5 0 年间，人们在许多担子菌和子囊菌 的子实体或培养物中发现了抗菌活性物质。英国的w a l k i n s 和美国的r o b b i n s 等 人对高等真菌的抗菌活性进行了广泛的研究。接着，a t k i s o n 、b o s e 、m a t h l e s o n 有更多的发现。目前，研究人员用部分食药用真菌的子实体。菌丝体或发酵液进 行抑菌试验，结果表明：这些食( 药) 用真菌的代谢产物对某些食品腐败菌具有 有效的抑制作用【23 1 ，同时，还有部分食用真菌具备抗病毒的作用。据报道1 2 4 1 ， 目前已发现至少2 7 属，2 2 2 种食用菌可产生抗菌性物质。食药用真菌产生的抗 菌活性物质多属于聚乙炔化合物( p o l y a c c e t y l e n e ) 、萜类( t e r p e n o i d ) 化合物、 类固醇( s t e r o i d ) 化合物以及与核酸有关的化合物。从作用来看，大多数可抑制 g + 菌和霉菌，对g 一菌有效者少。如：由鲑贝芝( c o r i o l u sc o n s o r s ) 培养液和菌 体分离的鲑贝芝素( c o r i o l i n ) 能抑制革兰氏阳性菌的生长；由长根菇的培养液 提取的长根菇酮( o u d e n o n e ) 、隐杯伞的隐杯伞索m 和s 有抑制霉菌的能力；灵 芝对大多数细菌和霉菌有一定抑菌作用：头状马勃( c a l u a t i ac r a n i i f o m 鼯) 培养 物中分离的马勃菌酸对革兰氏阳性菌、阴性菌、酵母和霉菌均有抑制效果；竹荪 菌丝对革兰氏阳性细菌( 乳酸菌、枯草杆菌) ，革兰氏阴性菌( 醋酸菌、谷氨酸 菌等) ，甚至对酵母菌、霉菌都有明显的拮抗作用；香菇的香菇素( l e n t i c i n ) 有 抗真菌的作用，毛头鬼伞( c o r p r i n u s c o m a t u s ) 、百换苗( o u d e m a n s i e l l a m u c i d a ) 中也有抗真菌的抗生素。此外，榆干侧耳( h y p s i z y g u s “加口咖) 水粉杯伞的穿 孔蕈炔素( d i a t r e t y n e ) 、截短侧耳( pm u t i l u s ) 产生的截短侧耳素、香菇产的香 菇多糖( l e n f m a n ) 、松乳菇( l a c i t a r i u sd e l i c i o u s u s ) 产生的乳菇紫素均可起抗菌 作用。短裙竹荪( d i c i t y o p h o r ad u p l i c a t a ) 、拟黄孢丛枝菌( r a m a r i aa p i c u l a t a ) ( 亦称尖枝瑚菌) 的去氢醋酸( d e h y d r o a c e t i ca c i d ) 也能起到防腐抑菌作用。 2 孓3 2 1 食品是人类赖以生存的重要条件，食品防腐是人类面临的一个重要课题。食 品防腐剂作为一类食品添加剂，工业发达国家都十分重视其生产和使用。食品防 腐剂作为一类食品添加剂，工业发达国家都十分重视其生产和使用。到8 0 年代 末，化学合成的食品防腐剂已有5 0 多种，主要是山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲 酸酯类、苯甲酸及其钠盐和脱氢醋酸等。此外，国外还借生物技术制成尼生素、 乳酸链球菌素、多马霉素和制酵母菌素等，但其中被f a o w h o 食品添加剂委 员会批准供食品防腐用者只有乳酸链球菌素( n i s i n ) 一种 3 3 】。在我国，食品添 加剂的研究尽管起步不晚，但发展较慢。迄今我国批准使用的食品防腐剂仅有苯 甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、s 0 2 、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠、丙酸钙、丙酸钠、 对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和脱氢醋酸共l1 种i 州，而在美国s 0 2 早 在1 9 8 6 年就已被禁止用于水果加工业。目前市面上所使用的防腐剂绝大多数为 化学合成产物，有一定毒性。长颓摄入这类物质必然会对入f 奉产生一定的危害。 而一些抗生素更无助于控制有害微生物中的抗性菌株。出于对健康的考虑，人们 希望找到一种天然、无毒、无污染的物质来代替化学制剂作为防腐剂和调味剂。 因此，近年来人们热衷于研究从微生物、动植物和食( 药) 用真菌中获得天然食 品防腐剂i ”】。 目前。对微生物来源的天然防腐剂研究较多。由细菌产生的抑菌物质称为细 菌素( b a c t e r i o c i n ) ，它是一种多肽或多肽与糖和脂的复合物。国内外对乳酸菌( 包 括乳球菌、片球菌、乳杆菌和明串珠菌) 所产细菌素的研究较深人，已经发现了 几十种细菌烈3 6 】。如从枯草芽抱杆菌中提取出的枯草菌素( s u b t i l i n ) 能抑制真菌 但对细菌作用很小【3 7 】。由放线菌产生的抑菌物质如：纳他霉素( n a t a m y c i n ) 【3 8 】、 泰乐菌素( t y l o s i n ) f 3 7 l 、聚溶素( p o l y 1 y s i n ) 等能有效地抑制和杀死细菌、霉 菌、酵母、丝状真菌，甚至病毒p 9 蚰】。由酵母菌产生的嗜杀毒素可以杀死同族及 亲缘酵母【4 ”，有的菌株产生的抗菌物质可以有效抑制细菌 4 2 】。霉菌产生的抗菌 素类很多，从作用上看主要作用于细菌，对霉菌、酵母作用较弱 4 3 - 4 7 】。 随着人们对食药用真菌的深入研究，越来越多的研究表明食用真菌所产生的 天然活性物质对人体没有危害，许多研究工作者也都支持食用真菌所产活性物质 无毒的观点，是理想的食品添加剂，迎合了消费者安全环保的要求。但由于食药 用真菌子实体或菌丝体所含成分复杂，提取工序繁琐，不易纯化，所以还没有过 成功的报道。因此，深人研究食( 药) 用真菌中的抑菌有效成分及其作用机制， 进一步大力开发利用该天然食品防腐剂资源，其前景诱人。 4 8 - 5 q 杨树菇又名柱状田头菇，柱状环绣伞，日本及我国台湾省称柳松茸，属于担 子菌纲，伞菌目，粪伞科，田头菇属，是从春季至秋季生长的一种木生食用真菌。 杨树菇味道鲜美，盖肥柄脆，气味香浓，是一种食用价值很高的伞菌 5 ”。同时， 杨树菇也是一种药用真菌，在野生资源产地，村民有用杨树菇干子实体治疗胃冷、 7 肾炎水肿的习惯，疗效甚佳：入药可利尿、渗湿、健脾、止泻【”j ，亦具有抗衰老、 降低胆固醇、防癌和抗癌的特殊功效【5 4 ，对小白鼠肉瘤1 8 0 和艾氏腹水瘤的抑制 率分别为9 0 和8 0 i ”j 。 杨树菇子实体中含有丰富的多糖，多糖含量高达6 6 3 ，约是香菇( o 6 ) 的1 8 倍，灵芝( 1 7 2 ) 的四倍。多糖具有增强机体免疫力的功能。可作为 一种免疫激活剂，激活机体的免疫细胞，起到对肿瘤细胞的抑制作用。 蛋白质也是杨树菇子实体或菌丝体的主要成分。其蛋白含量颇高，尤其是必 需氨基酸含量占总氨基酸量的4 0 1 ，比平菇高9 3 5 ，与真姬菇含量4 1 7 接 近【5 7 1 。近年来从杨树菇中纯化出一种6 k d a 的金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n 。m t ) ， 每分子m t 含有1 8 个半光氮酸残基并结合7 个隔原子。可在重金属解毒、环保 和贵重金属回收等领域发挥作用【5 8 1 。此外，杨树菇中还含有抗植物病毒的蛋白组 分。孙慧等人从其子实体中分离纯化了一种具有抑制烟草花叶病毒( t m v ) 侵 染活性的蛋白质，已证明此蛋白为酸性蛋白，不含c y s ，含有少量的h i s 和m e t ， 是一种食用菌凝集素5 9 1 ，其他的生物学活性还有待于研究。 除蛋白质、多糖以外，杨树菇中还含有许多脂肪酸、萜类、皂甙类、氨基酸、 麦角固醇、维生素和微量元素等其它的营养成分，具有不同的生物学功能。在本 论文中就发现杨树菇具有很强的抑菌作用，可以有效的抑制细菌、酵母和部分霉 菌的生长，目前，在国内还没有过这方面的报道。正是由于它的潜在应用价值需 要对其进行深入的研究。 食用菌的生产历来是采用农艺栽培法培养它们的菌丝体和子实体。而其子实 体的栽培对生产存在一些制约。如：栽培时间长，劳动强度大；容易受到农药及 各种有毒物质的污染；子实体生长的过程中容易受到杂菌的污染及病、虫害的侵 蚀等等。而如果采用液体的深层发酵技术直接生产食用菌的菌丝体，获得富含氨 基酸、蛋白质、多糖等营养成分的发酵液，则可以有效地解决上诉问题【6 叭。不仅 可以大大地降低生产周期和成本，还不容易受到污染，更适应了大规模工业化生 产的需要，并为进一步研究和综合开发保健食品和药用品奠定基础。 食用真菌的液体培养在实验室中进行，一般通过摇瓶培养来实现。即将食用 真菌试管母种接入灭过菌的三角瓶培养液中，然后置于往复式或旋转式摇床上培 养。 经过摇瓶培养的菌丝体呈球状、絮状等多种形态。培养液可呈粘稠状、清液 状等状态，并可有清香味或其它异味。因菌液中有菌株发酵产生的次级代谢产物， 可呈不同颜色。在实验室中进行摇瓶培养可摸索菌株液体发酵的适宜生长条件及 生理生化变化等。工业化生产对，先进行摇瓶培养作为接入种子罐的菌种。摇瓶 培养的菌丝体也可作为液体菌种接入固体培养料中。 在食用真菌的液体培养中，影响发酵成功的关键因素有两个：第一是菌种， 第二是培养基。优良的培养基应该具备以下特点：1 目的物产生率高；2 产生目 的物的菌丝体生长良好，发酵周期短；3 培养基成本低、原料来源广：4 培养基 对目的物的提取干扰小，目的物后处理工艺简单、得率高。 1 液体培养基的组成 1 1 碳源 碳源主要用于供应菌株生命活动所需要的能量，构成菌体细胞及代谢产物， 是食用真菌液体培养的主要营养成分。碳源包括糖类( 单糖、双糖、多糖) 、脂 肪和某些有机酸。双糖及多糖首先由菌体产生的酶分解为单糖后再被利用。食用 真菌利用单糖，一般通过有氧分解，最终产物是二氧化碳、水和能量。 为降低培养基成本，药用真菌的发酵常用一些粗粮、杂粮或粮食加工之后的 下脚料作为原料，如玉米、蔗糖糖蜜、甜菜糖蜜等。 1 2 氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物，是食用真菌液体培养的主要 营养成分。常用的氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类。黄豆饼粉、花生饼粉、 棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、麦麸等属于有机氮源；氨 水、硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钠、磷酸氢二铵、氯化铵等为无机氮源。有机 氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸以外，往往还含有少量糖、脂肪、 微量元素及维生素、生长素等。对绝大多数食用真菌，有机氮源比无机氮源更适 合菌体的生长。 不同菌种对氮源种类的要求及利用程度亦不一致，因此在确定培养基前应在 实验室中设法找到菌种所能利用的几种较好氮源及最佳氮源，然后根据成本、原 料来源是否容易等因素确定氮源组成。 1 3 碳、氮比( c n ) 碳、氮比指碳源及氮源在培养基中的含量比。构成菌丝细胞的碳、氮比通常 是：8 - 1 2 ：1 。由于菌丝生长工程中，一般需5 0 的碳源作为能量供给菌丝呼吸， 另5 0 的碳源组成茵体细胞。因此培养基中理想碳、氮比的理论值为1 6 2 4 ：1 。 另外，多数菌种都能在较宽的碳、氮比范围内生长。不同的菌种说要求合适的碳、 氮比可以通过试验求得。 1 4 无机盐与微量元素 许多无机盐及微量元素对菌种的生理过程的影响与其浓度有关。不同的菌 种，对无机盐及微量元素要求的最适浓度也不同。比如：磷，它是细胞中核酸、 核蛋白等重要物质的组成部分，是食用真菌液体发酵不可缺少的物质，常加入磷 酸二氢钾以提供磷；镁，它在细胞中起着稳定核蛋白、细胞膜和核酸的作用，是 食用真菌液体培养中不可缺少的物质，一般通过加入硫酸镁以提供镁；其它的微 量元素，钾、钙、钠、硫、铁、锌、锰、钴、铜等的需求量甚少，一般天然有机 原料中均有，可不必另加。 1 5 维生素与生长素 维生素在细胞中作为辅酶的成分，具有催化功能。大多数食用真菌的培养都 与b 族维生素有关，而与维生素a 、k 关系不大。由于食用真菌对维生素的需求 量甚微，因此在使用天然有机原料为培养基时一般不需另加。 2 液体培养基的配制 2 1 以获得物的细胞组成为依据：旨在搞清菌体细胞的碳、氮及微量元素组成后， 提供足够的各种元素供其细胞合成及能量消耗。但这种方法实施起来较为困难。 2 2 以培养基的利用率为依据：液体发酵时，测得不同菌龄时培养液中糖、氮及 微量元素的含量，做出其含量随菌龄变化的曲线图。从曲线中可看出某营养成分 的不足或尽量，从而对配方作进一步调整。 2 3 以目的物的获得为依据：这是当前寻求优良培养基配比的最常用方法。一般 根据经验先选择一个基础培养基，然后进行单因子调整或多因子调整。多因子调 整中要使用正交设计法或均匀设计法。以产生目的物的多少为标准，进行配比的 调整，最终得到最佳培养基。以目的物获得的多少为依据选择培养基无疑是最快、 最好的办法。 3 摇瓶培养的有关参数 影响摇瓶培养发酵质量的诸因素有：培养温度、摇床的振荡频率、瓶子的装料系 数，p h 值、菌龄、接种量、培养液的粘度、光照等。 3 1 温度 食用真菌菌丝的增殖及次级代谢产物的生产都在各种酶的催化下进行，而酶 的催化反应需要适宜的温度，不同的菌种有不周的适宣温度。绝大多数食用真菌 菌丝生长的适宜温度在2 2 - - 3 0 c 的范围内以产生次级代谢产物为目的的培养， 其最适温度也可能与菌丝生长的最适温度不同。 3 2 摇床的振荡频率和瓶子的装料系数 食用真菌液体培养使用的摇床有两种：一是旋转式，二为往复式。旋转式摇 床的偏心距可不同，转速可调或不可调：往复式摇床的振幅可不同，振荡频率多 数是固定的。偏心距、转速、振幅及振荡频率的不同，除了产生对瓶中菌丝体机 械刺激的不同，还会引起瓶中溶解氧的不同。瓶子的装料系数同摇床的振荡频率 有一定的关系，对瓶中的溶解氧也有一定的影响，由于食用真菌的液体培养绝大 多数均为好氧发酵，要求有足够的氧气，所以，要适当的控制摇床的振荡频率和 瓶子的装料系数。 3 3p h 值 食用真菌的液体培养时，要求有合适的p h 值( 即氢离子浓度) ，这是因为： 1 培养液中p h 的变化，会影响到细胞内p h 值的变化，而细胞内p h 值合适与 否，会影响细胞内酶的活性，大多数酶催化反应的最适p h 值为4 8 。 2 p h 值对一些微量元素的利用有影响。一些金属离子形成的复合物在某p h 值下是不溶的。如镁离子与磷酸在酸性条件下呈游离状态，p h 升高会形成不可 溶的复合物，不能被菌丝体吸收利用。铁离子在碱性培养基中形成不可溶的复合 物。钙与锌离子也有类似的现象。 3 口h 值影响细胞的渗透性。在酸性条件下，细胞质膜被氢离子饱和，限制了 阳离子的通行；在碱性条件下，细胞质膜被氢氧根离子饱和，限制了阴离子的通 行。 大多数食用真菌的液体发酵多采用自然p h 或控制在p h 值5 0 6 5 的范围内。 如果需要对培养液的p h 进行调节时，可采用低浓度的氢氧化钠及盐酸进行。 菌液的p h 值是各种生化反应的综合结果。一般发酵培养到了中期，p h 值开始 下降；到了发酵后期，有的菌种菌液中p h 会回升。发酵过程中由于加糖太多而 又供氧不足时，碳源氧化不完全导致有机酸积累，引起p h 下降。一些无机盐如 碳酸铵被菌丝利用后，会引起p h 下降。葡萄糖作为碳源时，因丙酮酸迅速积累， 会引起p h 下降：而以乳糖为碳源时，因乳糖的吸收较缓慢，p h 值下降较慢。 因此，测定不同菌龄时培养液中的p h 值，对了解菌丝的生长、代谢、生理生化 反应等是一重要因素。要精确测定p h 值，可用酸度计进行，也可用p h 试纸先 进行粗测。摇瓶培养的p h 测定必须将菌液倒出测定。 3 4 菌龄 菌龄即菌株液体培养的年龄，是菌种接入培养液后开始计算的累积发酵时 间。食用真菌的液体发酵也要经历适应期、增殖期、平衡期及衰老期等。不同的 菌株，随着菌龄的增加，这几个时期的划分也不一样。 3 5 接种量 摇瓶培养的接种量指一级摇瓶种子对二级摇瓶所接入菌液量与培养液的比 值。接入菌液的菌丝状态将显著影响菌丝的增殖及次生代谢产物的产生。食用真 菌液体发酵的接种量一般都比较大，在5 - - 3 0 之间，但接种量并非越大越好。 例如银耳孢子的液体发酵，但最适接种量为5 一1 0 。麦角菌产生麦角新碱的 液体发酵，接种量以5 为最好，1 0 次之，1 5 更次之。生产上的最佳接种量 是以目的物的产量及生产成本综合考虑的结果。 3 6 培养液的粘度 在摇瓶培养中，要求菌丝生长快、得率高，形成的菌球小。菌球越大，菌球 中心的菌丝会呈现氧及营养的饥饿状态，不利于菌丝增殖及次生代谢产物的产 生，影响发酵质量及菌丝产量；其优点是有利于菌体与培养液之间的分离。增加 培养液的粘度，有利于菌球缩小，提高产量。 3 7 光照 以获得菌体为目的的液体培养液培养，需要或不需要光照；以获得次生代谢 产物为目的的液体培养，光照可能对次生代谢产物的产生发生影响。如麦角菌的 液体发酵，光照条件下将使麦角碱的产生大大少。是否需要光照，应通过实验决 定。1 6 1 1 本论文的研究工作和研究意义 食物是人类赖以生存的重要条件。为了生存，人类一直关注着减少食物腐烂 的方法。虽然在食品加工过程中经过了一些列的灭菌等处理工序，但在食品中添 加食品防腐剂依然是便捷而行之有效的方法。目前，国内外实际使用的食品防腐 剂多为化学合成的防腐剂，如：苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲 酸酯类等。化学合成的食品防腐剂或多或少的会对人体产生一定的危害，而一些 抗生素类的长期使用则会稳定和强化有害微生物中的抗性菌株。随着人们生活水 平的提高和环保意识的加强，人们希望自己生活得更健康，所以特别关心化学品 对健康的影响，因而，食品防腐剂也面临着新的选择。 食用真菌作为一种可食用的大型真菌，越来越多的研究者支持其产生的天然 活性产物是无毒的观点，而且，这些活性物质中不乏抗菌的活性物质，这提供了 我们进行深入研究的良好前提。目前，国内对大型食用真菌的抗菌活性进行了较 2 多的研究，发现了不少食用真菌都具有抗菌活性，但是，这些研究基本上局限于 菌丝体的抗菌效果及其抗菌谱的水平；也有一些研究者对其活性物质进行了一些 分析，但只是大概推测为哪一类物质。至今，对抗菌活性物质的提取还没有成功 报道。因此，新型食品防腐裁的开发意义重大。面且，本实验室产期从事大型真 菌的培养等研究工作，也做过类似的课题“竹荪、香乳菇的发酵培养及其作为食 品添加剂的研究”( 已通过鉴定) ，具备一定的研究基础。 本文的研究工作分为四个部分：第一部分，通过对1 4 株常见的食用真菌的 筛选，选出一株抗菌活性好，抗菌谱广的菌株，并以此作进一步的研究。第二部 分，对筛选出的菌株进行液体培养，确定其是否适合培养，抗菌活性物质主要为 胞内还是胞外物质，为培养基成分及发酵条件优化提供一个标准。第三部分，发 酵培养基成分及其发酵条件优化，通过单因子和正交法研究发酵培养基的最优组 成，并对发酵条件( 发酵周期、发酵温度、发酵培养基起始p h 、培养基装量、 摇床转速、接种量) 进行研究，提高活性物质的产量。第四部分，抗菌活性物质 的分离纯化及理化性质研究，为将来的应用提供依据。 第二章抗菌活性强抗菌谱广的食用真菌菌株的筛选 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种 待测菌株：杨树菇( a g r o c y b ea e g e r i t a ) ，浓香乳菇( l a c t a r i u sc a m p h o r a t u s ) ，香 菇( l e n t i n u se d o d e s ) ，糙皮侧耳( p l e u r o t u so s t r e a t u s ) ，榆耳( g l o c o s t e r e u m i n c a r n a t u m ) ，黑芝( g a n o d e r m as i n e n s i s ) ，蛹虫草( c o r d y c e p sm i l i t a r i s ) ，蝉花 ( c o r d y c e p ss o b o l i f e r a ) ，冬虫夏草( c o r d y c e p s s i n e n s i s ) ，块菌( t u b e r s i n e n s e ) ， 松乳菇( l a c t a r i u sd e l i c i o s u s ) ，羊肚菌( m o r c h e l l ad e l i c i o s a ) ，安络小皮伞 ( m a r a s m i u sa n d r o s a c e u s ) ，蒙山虫草( c o r d y c e p s m e n g s h a n e n s i s ) 指示菌株： 细菌：大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) ，痢疾志贺氏菌( s h i g e l l ad y s e n f e r i a e ) ， 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b i l i s ) ，金黄色葡萄球菌( s t a p h ) ，l o c o c c u sa u r e u s ) ，铜 绿假单孢菌( p s e u d o m o n u sa e r u g i n o s a ) ，短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) ，肺炎 杆菌( k l e b s i e l l ap e n u m o n i a ) ，滕黄八叠球菌( s a r c i n al u t e a ) ，酵米面假单孢菌 ( p s e u d o m o n u s s p ) o 酵母菌：啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，热带假丝酵母( c a n d i d a t r o p i c a l 捃) ，膜醭毕赤酵母( p f c 俩f m e m b r a n a e f a c i e n s ) 。 霉菌：黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) ，黄曲霉( a s p e r g i l u s 伽v 船) ，桔青霉 ( p e n i c i l l i u mc i t r i n u r a ) ，毛霉( m u c o rs p ) ，木霉( t h c h o d e r m as p ) 。 t 以上菌种均由山东大学生命科学学院菌种室提供。 1 1 2 培养基懈i 细菌用培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g ，蛋白胨1 0g ，n a c i 5g ，琼脂1 5 2 0g ，蒸馏水1 0 0 0m l ，p h7 0 7 2 ，1 2 1 c 灭菌1 5m i n ，备用。 4 牛肉膏一蛋白胨半固体培养基：配方同上，其中琼脂加量为8g 。 霉菌用培养基：p d a 固体培养基：马铃薯2 0 0g ，麸皮5 0g ，蔗糖2 0g ，k h 2 p 0 4 3g ，m g s 0 4 7 i - 1 2 01 5g ，琼脂1 5 2 0 g ，水1 0 0 0m l ，p h 6 0 。将土豆去皮洗净， 切成小片，放在水中连同麸皮煮沸3 0r a i n ( 注意不要糊底) ，用纱布过滤，滤液 加水稀释至原来的体积再加入剩余的其它成分，1 2 1 灭菌3 0m i n 。p d a 半固体 培养基：配方同上，其中琼脂加量为8g 。 酵母用培养基：麦芽汁固体培养基：称取一定量的麦芽，用粉碎机磨成麦芽 粉，加入4 倍的水，在5 8 - 6 0 。c 下糖化，用糖度计测定麦芽汁的糖度，直到麦 芽汁糖度到1 2 b x 为止。煮沸后用纱布过滤，调节p h 至6 0 ，n x 1 5 2 0g 琼 脂，1 2 1 灭菌3 0m i n 。麦芽汁半固体培养基：配方同上，其中琼脂加量为8g 。 琼脂水培养基：琼脂1 5 2 0g ，水1 0 0 0m l ，p h 自然，1 2 1 c 灭菌1 5m i n 备用。 1 1 3 试剂 山梨酸，苯甲酸 1 1 4 主要仪器 h z q - f t 6 0 全温振荡培养籀，啥尔滨市东联电子有限公司 h hb i i 型电热恒温培养箱，山东潍坊医疗器械厂 y x q g o l 型蒸汽消毒器，山东新华医疗器械厂 f i n n p i p e t t e 可调试移液器，上海雷勃分析仪器有限公司 1 2 方法 1 2 1 抗性菌株的初筛1 3 5 6 3 菌株的活化：将试验所需菌种，细菌通过接种针划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基 试管斜面，霉菌、食用真菌接种于综合土豆汁麸皮固体培养基试管斜面，酵母接 种于麦芽汁培养基试管斜面进行活化。细菌3 7 恒温培养，霉菌、酵母、食用 真菌2 8 - - 3 0 c 恒温培养。 平板抑菌试验筛选：将活化的供试菌种切成小块接种在综合土豆汁培养基平板中 央，2 8 c 培养约5 天时间，待平板上菌落生长至直径3 4c m ，用直径0 8c m 的 打孔器把菌种分别打成琼脂柱，放入综合土豆汁培养基的平板中，2 5 进行延迟 培养。当供试菌在综合土豆汁麸皮培养基的平板中进行延迟培养两天时间后，倒 入接种了指示菌的半固体培养基混合液( 细菌采用牛肉膏蛋白胨半固体培养基： 霉菌采用p d a 半固体培养基；酵母采用麦芽汁半固体培养基) ，使平板中底层培 养基上附有薄薄的一层含有指示菌及其相应的培养基的混合液，以细菌作为指示 菌的3 7 c 恒温培养，以酵母、霉菌为指示菌的2 8 - - 3 0 c 恒温培养，2 4 小时后观 察平板，记录抑菌结果并测量抑菌圈直径。 1 2 2 抗性菌株的复筛1 6 4 , 删 复筛菌株的选出：根据初筛的结果选出抗菌活性强，抗菌谱广的菌株作为复筛的 出发菌株，扩大抗菌谱，进行进一步的筛选。 复筛试验：方法同1 2 1 抗性菌株的初筛 1 。2 3 不同浓度山梨酸抑菌效果对照试验 将山梨酸分别配制成0 0 0 5 、o 1 、0 2 、0 3 g h a ，备用。将延迟培养 了的杨树菇平板中加入含有相应指示菌的半固体培养基，用无菌的镊子小心地将 牛津小杯竖直放到平板上，接着用可调式移液器分别吸取不同浓度的山梨酸 1 0 0 u l 。加入到牛津小杯中，以细菌作为指示菌的3 7 c 恒温培养，以酵母、霉菌为 指示菌的2 8 - - 3 0 c 恒温培养，2 4 小时后观察平板，记录抑菌结果并测量抑菌圈 直径。 6 1 2 4 不同浓度苯甲酸抑菌效果对照试验 测定方法同1 2 3 不同浓度山梨酸抑菌效果对照试验 2