（植物学专业论文）桃（prunus+persica）两种mads+box基因的克隆及其功能分析.pdf

首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 缩写 ct ab edt a b y bs a dna dn a s e d nt t c e ty l t r ie t h y l . a m m o n iu m b ro m id e 十 六 烷基 三己 基 澳 化 钱 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a c e t i c a c i d 乙 二胺四乙酸 b a s e p a i r s 碱基对 b o v i n e s e r u m a l b u m e n 牛血清白 蛋白 d e o x y r ib o n u c le ic a c id 脱 氧 核 糖 核酸 d e o x y r ib o n u c le a s e 脱 氧 核糖 核 酸 酶 d e o x y n u c l e o t i d e t r i p h o s p h a t e s (u s u a l l y a m i x o f d a t p /d t t p / d c t p / d g t p) 脱 氧 核 昔 三 磷 酸 ( 通 常 为 d a t p /d t t p / d c t p / d g t ? 的 混 合 物 ) l u r i a - b e rt a n i m e d i a l u r i a - b e r t a n i 培养基 c 6 h 1 3 0 n 4 s 2 - ( n - 吗 啡 琳 ) 乙 磺酸 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c tio n 聚 合 酶 链 式反 应 r i b o n u c l e i c a c i d 核糖核酸 r i b o n u c l e a s e a 核糖核酸 酶a d i s t i ll e d w a t e r 蒸馏水 双蒸水 k a n a m y c in 卡 那 霉 素 y e a s t e x tr a c t- p h o s p h a te m e d ia y e a s t e x t r a c t -p h o s p h a te 培 养 基 c e f o t a x i m e s o d iu m 头抱霉素 r i f a m p i c i n 利 福平 m u r a s h i g e a n d s k o o g m e d i a m u r a s h i g e a n d s k o o g 培养基 a - n a p h th a l e n e a c e t ic a c id a 一 蔡乙 酸 6 - b e n z y l a m in o p u r in e 6 - 节 氨 基 嗦吟 o p ti c a l d e n s ity 光 密 度 tr i s edta e t h i d i u m b r o m i d e 澳化乙锭 ea)q lbmespcrrnarnasldhzoddhzl枷yei，cef亩msnaa6-baonteeb 首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 b 5维生素 ( 2 , 3 - d i b r o m o p r o p y l ) p h o s p h a t e 三轻甲基氨基甲烷 聚乙烯毗咯烷酮 s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e 十二烷基 磺酸钠 vbstris阶sds 首 都 师 范大 学 硕 士 学 位 论 文 摘要 了解植物由 营养生长向 生殖生长的转变的调节过程， 对于 控制有花植物的生 长发育是很有意义的。 至今已 经鉴定了 许多参与控制果实和花发育的m a d s b o x 基因。 m a d s b o x 基因多 数是由m, 1 , k 和 c 四个区域构成的， 很少一些m a d s b o x 基 因 在m区上游还具有一段富含碱性氨基酸的n 末端区域。 其中fu r 区高 度保守， 言 编 码真核生物转录因子的d n a结合域， 具有d n a结合和二聚体形成的 作用。 臣 典的“ a b c ” 模型中 所涉及的m a d s b o x 基因 有a , b , c 三类功能， 随后“ a b c 莫 型不断得到充实和完善, d类和e 类功能 基因的出 现壮大了m a d s b o x 基因家 矣 ， a b c d ”模型、 a b c d e ” 模型和 “ 四聚体” 模型相继涌现， 使人们对花 t 育的 机理 有了更深入的了 解。 近来的研究表明 m a d s b o x 基因 家族并不只在花器官的发 育中起调控作用， la d s b o x基因在控制开花时间、决定分裂组织的分化、 控制胚胎发育、根的形 免 以 及种子和果实的发育等方面 都起着重要的作用。 此外研究发现，同一 m a i d s o x 基因 在发育的不同时期可以 起不同的 功能。 m a d s b o x基因对生殖生长的调控是近年来 m a d s b o x基因作用研究的重 k 。 为了研究李属 ( p r u n u s s p . ) 果树生殖调控的 相关基因， 对国际公共数据库 ， 的 李 属 植 物的e s t (e x p r e s s e d s e q u e n ce ta g s ) 序 列 进 行了 电 子 拼 接， 获 得了8 个 i d s b o x基因 的 c d n a 序列， 并利用 p c r技术从桃的果实中克隆出 其中的 4个 ) n a ， 分别命名为p p s 2 . p p w s 4 . p p y a d s 6 和p p m a d s 7 , 其中p p a a d s 4 和 * a d s 6 在g e n b a n k 中 的 登 陆 号 分 别 为a y 7 0 5 9 7 2 和a y 7 0 5 9 7 3 . p p m a d s 4 基 因 长 io b p ， 包 含一 个 7 3 2 6 p 的 开 放 阅 读 框 ， 编 码 2 4 3 个氨 基酸 。 乃 )m a d s 6 基 因 长 9 0 6 p ，包含1 个7 6 8 6 p 的 开放阅 读框，编码2 5 6 个氨基酸. p p y a d s 4 和p p s 6 在序列上分别与拟南芥中的a g a m o u s 基因 和矮 牵牛中的 7g 基因 高度同 源。 r t - p c r 分析表明， p p y a d s 4 基因在花瓣、 心皮、 果实及核仁 表达，应属于己 知的花器发育的调控的 c 类 m a r s b o x 基因。 p p n a d s 6 基因在 片、花瓣、心皮、果实及果仁中表达，应属于调控植物由营养生长向生殖生长 首都师范大学硕士学位论文 过渡的a 类m a d s b o x 基因。 为了进一步确定基因的 功能， 对p p m a d s 4 基因进行了 拟南芥转基因分析。 通 过限制性内切酶切割和连接反应， 构建该基因的正 义表达载体，并置于 c a mv 3 5 s 启动子的驱 动之下。 利用农杆菌介导的 浸溃法转化拟南芥。 将通过抗生素筛 选的阳性植株， 使用c t a b法提取成株基因组d n a ，进行p c r检测。 通过对于转基因拟南芥的 表型观察， 发现株型与 花型均发生了 改变， 这些特 征， 与a g a m o u s m因在拟南芥中的异 位表达结果相似。 这些结果表明p p m a d s 4 基 因 应与c 类基因具有相似的功能。 关键词:m a d s b o x基因，桃，花发育，拟南芥 首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 ab s t r a c t u n d e r s t a n d i n g t h e p r o c e s s e s r e g u l a t i n g t h e p h a s e t r a n s i t i o n fr o m v e g e t a t i v e t o r e p r o d u c t i v e g r o w t h i s p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t f o r w o o d y f r u i t c r o p s . i t i s v e ry l i k e l y t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e g e n e s s i g n a l l i n g t h e e n d o f t h e v e g e t a t i v e p h a s e a n d t h e b e g i n n i n g o f t h e re p r o d u c t i v e p h a s e a r e m e m b e r s o f t h e m a d s b o x g e n e f a m i l y . m a r s b o x g e n e s f a m i l y p l a y s a k e y r o l e i n t h e m o l e c u l a r re g u l a t i o n o f fl o r a l d e v e l o p m e n t , a n d m o s t o f t h e m i n p l a n t s b e l o n g t o t h e t y p e ii c l a s s , 山 a t i s , t h e g e n e s e q u e n c e i s c o m p o s e d o f m , i , k a n d c d o m a in s . t h e m d o m a i n , w h i c h e n c o d e s t h e d n a - b i n d i n g s e q u e n c e a n d p l a y s t h e r o l e s o f b o t h b i n d i n g d n a a n d f o r m i n g d i m m e r s , i s t h e m o s t c o n s e r v e d r e g i o n . a c c o r d i n g t o t h e c l a s s i c a l a b c” m o d e l , t h r e e c l a s s e s o f g e n e s a c t t o s p e c i f y fl o r a l o r g a n s , n a m e l y s e p a l s ( a o n l y ) ， p e t a l s ( a + b ) ， s t a m e n s ( b + c ) ， o r c a r p e l s ( c o n l y ) ， l a t e r , s o m e n e w f o u n d m a d s b o x g e n e s r e s u l t i n t h e a b c d m o d e l , a b c d e m o d e l a n d q u a r t e t m o d e l . a ll o f t h e s e m o d e l s m a k e t h e u n d e r s t a n d i n g o f fl o r a l d e v e l o p m e n t d e e p l y . r e c e n t s t u d i e s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e f u n c t i o n s o f m a d s b o x g e n e f a mi l y m e m b e r s a r e n o t r e s t r i c t e d t o fl o w e r o r g a n d e v e l o p m e n t . m a d s b o x g e n e s w e r e s h o w n t o b e i n v o l v e d i n i n i t i a t i o n o f fl o w e r i n g , d e t e r mi n a t i o n o f m e r i s t e m i d e n t i t y ， e m b ry o n i c d e v e l o p me n t ， r o o t f o r m a t i o n， d e v e l o p me n t o f v a s c u l a r t i s s u e , a n d s e e d a n d f ru i t f o r m a t i o n . f u r t h e r m o re , a s i n g l e m a d s b o x g e n e m a y h a v e d i ff e r e n t f u n c t i o n s a t d i ff e r e n t s t a g e s o f d e v e l o p m e n t . wi t h t h e a i m o f f i n d i n g g e n e s i n v o l v e d i n t h e fl o r a l t r a n s i ti o n o f p r u n u s s p e c i e s ( p r u n u s s p . ) . t h e e s t ( e x p r e s s e d s e q u e n ce t a g s ) s e q u e n ce s w e re e x t r a c t e d f r o m t h e p u b li c d a t a b a s e s . e i g h t m a d s b o x g e n e s c d n a s w e r e o b t a i n e d . f o u r o f t h e m w e r e c l o n e d fr o m p e a c h ( p r u n u s p e r s i c a ) , n a m e d p p m a d s 2 , p p m a d s 4 , p p m a d s 6 , p p m a d s 7 . p p m a d s 4 a n d p p m a d s 6 h a v e g o t t h e a c c e s s i o n n u m b e r s i n g e n b a n k . ( t h e a c c e s s i o n n u m b e r s a r e a y 7 0 5 9 7 2 a n d a y 7 0 5 9 7 3 ) . t h e p p m a d s 4 f u l l l e n g t h c d n a i s 8 5 0如 i o n g . i t c o n t a i n s a n o p e n re a d i n g fr a m e o f 7 3 2 b p , c o d i n g f o r a p o l y p e p t i d e o f 2 4 3 a m i n o a c i d s . t h e 乃 p m a d s 6 f u l l l e n g t h c d n a i s 1 1 9 0 b y l o n g .i t c o n t a i n s a n o p e n re a d i n g fr a m e o f 7 6 8 印， c o d i n g f o r a p o l y p e p t i d e o f 2 5 6 a m i n o a c i d s . 首 都师范 *学硕 士学位 论文 即m a d s 4 c l o s e l y r e s e m b l e d t h e a r a b i d o p s f s a g a m o u s g e n e . i t i s a n a g a mo u s - l i k e c c la s s m a d s b o x g e n e a n d e x p r e s s e d i n p e t a l s , c a r p e l , f r u i t a n d n u c l e o l u s a s s h o w n勿 r t p c r a n a l y s i s . p p m a d s 6 i s l i k e l y t o比 t h e p e a c h o rt h o lo g u e o f t h e p e t u n i a p f g g e n e s a n d i t i s a n a c l a s s m a d s b o x g e n e . i t h a s b e e n s h o w n w i t h r t p c r t h a t i t e x p r e s s e d i n s e p a l , p e t a l , c a r p e l a n d f r u i t . i t m a y b e i n v o l v e d in t h e t r a n s i t i o n f ro m t h e j u v e n il e t o t h e a d u l t s t a g e . a n e x p r e s s i o n v e c t o r w a s t h e n c o n s t r u c t e d i n w h i c h p p m a d s 4 g e n e w a s u n d e r t h e c o n t r o l o f c a mv 3 5 s p r o m o t e r , a n d a r a b i d o p s i s t h a l i a n a w a s t r a n s f o r m e d b y fl o r a l d i p m e t h o d m e d i a t e d b y a g r o b a c t e r i u m t u m 响 c i e n s . t r a n s g e n e t i c a r a b id o p s is h a v e b e e n o b t a i n e d b y a n ti b i o t i c s c r e e n i n g a n d p c r s c r e e n in g . t h e fl o w e r m o t 汕o l o g y a n d 川 a n t c o n fi g u r a t i o n o f t h e t r a n s g e n i c a r a b i d o p s is w e r e v a r i e d . t h i s s h o w e d t h a t t h e p p m a d s 4 g e n e p e r h a p s t a k e p a r t i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f fl o r a l o r g a n . f rom t h e a b o v e r e s u l t s , w e p ro p o s e d t h a t 你m a d s 4 h a d t h e f u n c t i o n o f c c l a s s o f 初 刀s 石 a x 9 阳“. k e y w o r d s : m a d s b o x g e n e s , p e a c h , fl o w e r d e v e l o p m e n t , a r a b i d o p s i s t h a l i a n a 首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 二、植物 m a r s b o x 基因 研究进展 科学家最早在 1 9 9 0 年利用转座子突变的方法从金鱼草中 分离并克隆出同源 异 型 基因 d e f ( d ef i c i e n s x s o m m e r e t a l ., 1 9 9 0 ) . 研 究 发 现 ， 该 基因 编 码的 蛋白 质 与两个己 知的 转录因 子，哺乳 动物的，s r f ( s e r u m r e s p o n s e f a c t o r ) ( n o r m a n e t a l . , 1 9 9 8 ) 和 酵 母 中的 m c m 1 ( m in ic h ro m o s o m e m a in t e n a n c e g e n e ; h e r s k o w itz , 1 9 8 9 ) 的一个保守区 域有很高的同 源性， 这一区 域参与二聚化和与d n a的结合， 在推 测的d n a结合区， 单个的 氨基酸突变均会导致蛋白 质与d n a的结合能力下降， 并导致表型发生改 变，说明d e f可能编码一个具有调控功能的 d n a结合蛋白 ( s c h w a r z - s o m m e r e t a l . , 1 9 9 0 ) . 同年，通过该方法又从拟南芥中克隆了同源异型基因 a g ( a g a m o u s ; y a n o fs k y e t a l., 1 9 9 0 ) ， 它 编 码 的 蛋白 质 与 上 述 转录 因 子具 有高 度 的 序 列 相 似性 ， 即 均在n端含有一 个约5 7 个氨基酸的 保守区域。因 此， 人们根据这四个基因的 名 字的 第 一 个字 母 ， 将 该 保 守 区 域 命 名 为m a d s b o x 区 (m a d s b o x d o m a in ) ， 并 将 具 有 该区 域的 基因 统 称为m a d s b o x 基因 ( m a e t a l., 1 9 9 1 ) . m a d s b o x 基 因 编 码多种具有重要生 物学功能的转录调节因子。在植物中， m a d s b o x 基因调节根、 叶、 花和果实的发育， 特别 在植物的花分生组织和花器官发育中具 有不同 形式的 时空表达模式。 、1 6 4 0 3 b o x 基因的起源、 进化 研 究 发 现 ，在 一 些 细 菌蛋白 中 发 现一 类u s p a的 蛋 白 质 ，它 含 有 一 段 短的 序 列 与m a d s 区 域 有 部 分同 源( y a n o fs k y e t a l ., 1 9 9 0 ) ;在u s p a 蛋白 的 下 游 ，也 存 在一 段 卷曲 的 螺 旋 结 构 ，这 与k - 区 域的 空 间 结 构 极为 相 似(m a e t a l ., 1 9 9 1 ) . 由 此 推 断 ，大 约 在2 0 -3 5 亿 年前 ，u s p a蛋白 可 能 为 原 核 生 物与 真核 生 物m a d s b o x 基因 的 共同 前 体 ( k r u g e r e t a l., 1 9 9 7 ) 约1 0 亿 年 前 ，真 核 生 物m a d s b o x 基 因 开 始 分 化为3 个主 要 类群， 即 a r g 8 0或 s r f m a d s b o x基因家族、 m e f 2 m a d s b o x基因 家族以 及 m ik c m a d s b o x 基因 家 族 ( m u n s t e r e t a l., 1 9 9 7 ) . 目 前 ，前2 类 仅 在 真 菌 和 动 物中 发 现， 而m i k c wd s b o x 基因 仅限于 植物中. 通过序列比 较分析 推断， 约在4 亿年前 植 物m a d s b o x 基因 开 始 分 化 为 a t 类 和 种 子 植 物2 个 族 ( g i ff o r d a n d f o s t e r , 1 9 9 8 ) ; 而约在1 . 3 亿年前， 双子叶植物和单子叶植物发生分化. 首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 , # a d s b o x签因的结构特性 在动物和微生 物中，m a d s 区域 保守性较强， 而之外的 序列几乎未发现保守区 域 .高 等植 物m a d s b o x 基 因由 4 个 保守 程 度不 一 的 区 域 组 成 : m a d s b o x 区 域 ( m ) 的保守性最强; 下游为编码6 5 - 7 0 氨基酸的k区域， 保守程 度也相当高; m a d s b o x 和 k区 域之间的 i 一 区域，及 k区 域之后的 c 一 区 域保守 程度相对较低( m a e t a l . , 1 9 9 1 ) . 因 此，大多 数 植 物 此 类 基因 被 称为m i k c -t y p e d m a d s b o x 基 因 ( m u n s te r e t a l . , 1 9 9 7 ) . m区即m a d s b o x 是位于基因n端的一段高度保守 区， 多数目 前己 经分离的 花同 源异型基因的m a d s b o x 区 域约由5 7 个氨基酸组成 ( m a n d e l , 1 9 9 2 ) 。 分子 生物学研究表明 ， m区 编码真核生物转录因 子的d n a结合域， 为调节蛋白 质中 的d n a结合单元，具有d n a结 合和二聚体形成的作用。m a d s 区 域由反向平 行折叠的。 一 螺旋基元( m o t if) 所形成特定的二聚体结构， 而与 d n a小沟 ( m i n o rg ro o v e )相互 作 用(g u n te r e t a l ., 2 0 0 0 ) .m a d s 蛋白 与 d n a 保守 序 列结 合 的 位 点 被 称 为。 a r g 盒 c c ( a m6 g g ( p e ll e g r in e t a l., 1 9 9 5 ) .1一 区 域 约由3 0 个 氨基 酸 组 成 ，其长 度常 常 有 所变 化 ( m a e t a l ., 1 9 9 1 ; m u n s te r e t a l., 1 9 9 乃 .研 究 表明 ， 一 些 m a d s蛋白的 i - 区域对二聚体结构的形成起关键作用( r i e c h m a n n a n d m e y e r o w i t z , 1 9 9 乃 一 i ( i n t e r v e n i n g )区较 短，含 有约 3 1 - 3 5 个氨基酸， 位于 m区 和 k区之间， 在各个花同源异型基因 之间 序列保守性较低， i 区可以 帮助二聚体的 转录因 子与 d n a结合形成复合体，在决定哪个m a d s 盒二 聚体可以结 合 d n a方面具有重 要作用。 k区 位于i 区之后， 是一个中 度保守区 域， 是由一段 疏水性氨基酸组成的 调 节序列， 约有7 0 个氨基酸组成， k区编码的蛋白 质的 结构和角蛋白 ( k e r a t i n )的 卷曲 状结构类似， 所以 命名为 k区， k区的结 构显示它能够形成亲水性的a 螺 旋。因此 k区 域能 够作为 二聚体基元， 形成卷曲螺旋结构，调节蛋白 质与蛋白 质之间的相互作用， 促进二聚化 ( m a n d e l , 1 9 9 2 ; p o ll o c k a n d t r e i s m a n , 1 9 9 1 ) . k 区是植物转录因子的 特征性结 构。 c 终 端区 域 ( t h e c a rb o x y l -t e r m in a l ) 位于k区 下 游 ， 主 要由 疏 水 氨 基 酸组 成，约3 0 个氨基酸，序列保守性低， 是m a r s b o x 基因的转录激活区域。 最近 首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 的 研究表明在 c端也存在相对保守的 结构域 ( m o t i f )的编 码区，对其功能是必 需的 ( i a m b e t a l ， 2 0 0 3 ) 0 很少一些m a r s b o x 基因 具有一长度变化富含碱性氨基酸的n终端区域， 位 于m区的上 游， 包括拟南 芥的a g和金鱼草的p l e 位点 ( s c h w a r - s o m m e r e t a l . , 1 9 9 2 ; t r o b n e r e t a l . , 1 9 9 2 ; 见图6 ) 0 图6植物x ! d s b o x 基因不同区 域 3 、 植物a g 4 d s b o x 基因的功能 m a d s b o x 基因 广泛存在于各类植物当中， 它编码具有m i k c 结构的 转录因 子。转录因子m a d s b o x蛋白以二聚体状态执行功能。 研究表明: 植物的m a d s b o x 基因 家族的成员在花发育过程中 调控一些关键 的 步骤。 如在 拟南芥中， 控制花分生组织特性的3 个基因中的 二个( a p 1 和 c a l ) 为m a d s b o x 基因 ( b o w m a n e t a l . , 1 9 9 3 ; j o f u k u e t a l . , 1 9 9 4 ) 。 在花发育的 后期， 三 类a , b , c 基因 控 制拟 南 芥 花 器官 特 性 ( c o e n a n d m e y e r o w ttz , 1 9 9 1 ) ，四 个 m a d s b o x 基因a p i , a p 3 , p i 和a g为这三类基因中控制花器官特性所必须的 基因 ( t r o b n e r e t a l . , 1 9 9 2 ; i r i s h a n d s u s s e x , 1 9 9 0 ) 。 在金鱼草中， m a d s b o x 基因 s q u a ( a p i 的同 源基因) , d e f , g l o和p l 为花分生组织特性基因。 一些m a d s b o x 基因的表达时间处于在早期作用的分生组织特性和晚期作用的花器官特性基 因 之间， 表明 它们在花分生组 织特性 和花器官 特性基因 之间 起调节作用。 这些基 因 包括拟南 芥中的a g l 2 , a g l 4 和a g l 9 ， 白 芥菜中的s a m a d s ， 番茄中的t m s 和矮牵牛中的f b p 2 o 4 、植物a w s b o x 基因 的分类 植物中m a d s b o x 基因 属多基因家族 ， 按照其碱基序列、系统发育关系、 表 达特性和功能可分为几个亚 族 在不同的植物中， 同一亚族的大多数基因功能相 似.p u r u g g a n a n e t a l ( p u e t a l . , 1 9 9 5 ) 根据植物进化过程中的系统发育关系， 将不同 来 首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 源 的m a d s b o x 基因 分为 a g . a p 1a g l 9 , a p 3 , p l 和。 rp h a n 5 个 群 .根 据m a d s b o x 基因作用时期， 可分为早期作用基因、晚期作用基因和中间作用类型基因. 早期作 用基因决定花序分生组织向 花分生组织转变. 晚期作用基因决定花器官的 特性 ， 拟 南芥 中 的 晚 期 作 用 基 因 有a p i . a p 3 和 a g 等 .中 间 作 用 类 型 基因 如f im ( s im o n e t a l ., 1 9 9 4 ) ,它 们 在 决 定 分 生 组 织 特 性 和 器 官 特 征 之间 起 调节 作 用 .此 外 ，在 拟南 芥 中 还发现一类 u f o基因， 在早期、中 期和晚期 3个阶段均起作用 w i l k i n s o n a n d h a u g h n , 1 9 9 5 ) . 5 、植物a i d s b o x 基因的 分布 m a d s b o x基因几乎遍布整个植物界. 研究表明， 拟南芥和金鱼草存在大量的 m a r s b o x 基 因 (m a a n d d e p a m p h i li s ,2 0 0 0 ; m a n d e l a n d g u s ta f s o n -b r o w n ,1 9 9 2 ; b o w m a n a n d s m i th ,1 9 9 1 ; c o n n e r a n d l iu ,2 0 0 0 ; o k a m u r o e t a l ., 1 9 9 3 ) ,番 茄 、 油 菜、 烟草 和矮牵牛等双子叶植物以及玉 米、小麦、高粱等单子叶植物中也广泛存在; 在植物体不同部位、不同 生长发 育阶段均发现m a d s b o x基因表达; 植物花发育 过 程 中 ，有5 类m a d s b o x 基因 参 与 调 节 ( g u n te r e t a l., 2 0 0 0 ) .从d n a 水 平上 来 看， m a d s b o x 基因是一个庞大家 族， 分散分 布在整个 基因组中( m e y e r o w i t z , 1 9 9 刀 . 6 、 植物a i d s b o x 基因参与植物花发育的调控 一 些 研 究 认为 ， m a d s b o x 基 因 从5 个 阶 段 体平 ) 参 与 植 物 花 发 育 过 程的 调 节 ( g u n t e r e t a l ., 2 0 0 0 ; o k a d a a n d s h im u r a ,1 9 9 4 ) .(1 ) 分 生 组 织 特 性 基因 ， 主 要 调 控 植 物 顶端分生组织由营 养型向 花序型或由 花序型向 花分生组织转变， 如 c a l , a p 1 , p f g 等;(2 ) 定 域 基 因 (c a d a s tr a l g e n e s )，调 节 花分 生 组 织 基因 的 表 达 ，并界 定 花 器 官 特 性基因的 作用范 围 ， 从而 确定花 器官 各轮的 形 成， 如a g等邓) 中间 类型 基因 ( i n t e r m e d i a t e g e n e s ) , 在花分生组织特性基因和花 器官特性基因之间起调节作用， 从 而 使 调 节 花 器官 特 性的 基因 表 达 ，如a g l 2 , a g l 4 , a g l ， 等;()花 器 官 特性 基 因 ， 通过 激 活 其 下 游目 的 基 因 而 决 定 花 器 官 各 轮 的 特 性 ，如a p i .a p 3 . p i . a g , a g l i i 等;(5 )下 游 基因 ，其 作 用 结 果是 导 致 花 器官 各 轮的 形 成. 首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 、 植物a i d s b o x 墓因的生 物学 功能及 其多效性 m a d s b o x基因功能多 样， 除了决定分生组织和花器官的 特性外 ， 也参与营养 生 长 (c a r m o n a e t a l ., 1 9 9 8 ; k a n g a n d h a n n a p e l, 1 9 9 5 ) 、 子 房 发育 (a n g e n e n t e t a l., 1 9 9 5 ; s c h n e itz ,1 9 9 9 ; g u e t a l ., 1 9 9 8 ) 、 种 皮发 育 ( b u c h n e r a n d b o u t in ,1 9 9 8 ) 、 根的 形 成 ( c a r m o n a e t a l., 1 9 9 8 ) 、 胚 形 态 建 成 (h e c k e t a l ., 1 9 9 5 ) 、 共生 诱导 (王 光清 等， 1 9 9 7 ) 等 的 调 节 .最 近 一 些 研究 证 明 ， m a r s b o x 基 因 的 表 达 也 与 抗 逆 境 有 关(k u o e t a l., 1 9 9 7 ; l o z a n o e t a l ., 1 9 9 8 ) .在 植 物 生 长 发 育 过 程中 ， m a d s b o x 基因 可能 在 不 同 阶 段、不同部位、不同 组织 器官影响植物的生长发育加 以a g基因为探针， 已 从拟 南芥中 分离到二十几 个a g l i ag l 6 基因， 它们分别在花发育的不同 阶段、 根组织 以 及 胚 胎 等 不同 部 位 表 达 ( p u e t a l ., 1 9 9 5 ; r o u n s le y e t a l., 1 9 9 5 ) ,从 而 对植 物生 长 发育产生不同的 影响， 完成不同的生物功能( m a n d e l a n d g u s t a f s o n - b r o w n , 1 9 9 2 ; b o w m a n a n d s m i t h , 1 9 9 1 ) . 此 外 ， b o n h o m m e e t a l ( b o n h o m m e e t a l . , 1 9 9 7 ) 从 s in a p is a lb a 中 分 离 到 的 s a m a d s d 基 因 对 花 序 发 育 和 花 器官 形 态建 成 起 双 重 影 响 ; r ic h a r d e ta l ( r ic h a r d e t a l ., 1 9 9 9 ) 分 离 到 矮 牵牛 的p f g 基因 ，它 几乎 能 在 植 株的 所 有 部 位 ( 根 、 雄 蕊 和 幼 苗 除 外 ) 或 发 育 时 期 表 达 . 同 样 ， 在 其 它 植物 中 也 分 离到 许 多不同 作用类型的m a d s b o x 基因 p u r u g - g a n a n e t a l 从进化的角 度认为， 在植物发 育中m a d s b o x 基因 从不同 的侧 面或 层次产生各种不同 作用， 这是m a d s b o x 基 因的多效性. a 、 植物m a d e b o x 基因研究存在的问 硬与展望 目 前 ，植 物 生 殖 发 育 研 究 取 得了 巨 大 进展 ，特别 是 有 关 高 等 植 物花 发 育 基因 调 控的研究. 先后在双子叶 模式植物拟南芥 和金鱼草中 克隆了一大批有关的植物生 长发育基因， 提出了 调 控花 发育的 基因互作模式、 花发 育过程中 6类功能 基因形 成的作用网络， 以 及具 有重 要意义和广泛代表性的“ a b c ” 模型. 尽管如此月 前植 物m a d s b o x 基因 研究还存在 一些不足， 归 纳为以下5 个方面. ( 1 ) 水 稻 等单 子 叶 植 物 研 究明 显 滞 后 于 双子 叶 植 物 .主 要 原因 之 一 是 水 稻等 单 子叶植物中发现的 花发育突 变体相对较少. 目 前大多 数研究是利用双子叶植物的 同源序列来筛选水稻c d n a文库， 获取水稻花发育相关基因， 然后通过转基因植物 花的 表型或者反义 r n a 技 术来推测其功能.但因缺乏与性状直接联系的证据， 这 首 都 师 范 大 学 硕 士 学 位 论 文 些基因的具体功能无法确定. 口 卿究 范 围 仍 需 不 断 拓宽 . 目 前 ，对m a d s b o x 基因 的 克 隆 、 功 能 及 表 达 等 研 究主要局限于植物生殖发育过程， 而对营养器官的发生与发育、植株形态发生、 抗逆性等过程的研 究较少. ( 3 ) 注 重m a d s b o x 基因 功 能的 特 异性 和 多 效 性 的 研 究 . 由 于m a d s b o x 基因 序列十分保守， 因 此其功能特异性强. 但研究表明， 在长期进化过程中， 部分 m a r s b o x基因 结构发生 变异淇功能 可能会发生相 应改变， 特别是不同科、 属植物间相 应的m . 4 d s b o x 基因的功能会发生重大变化， 表 现为部分m a d s b o x 基因功能 具有 多效性和广泛性. ()同 源 克 隆 基 因的 局限 性 .利用m a d s b o x 基因 的 保守 序 列 克隆 植 物同 源 基 因 ， 可以方便快速地克隆相关基因 . 但这可能限制一些重要的 新基因的发 现. ( 5 ) 研究对象需要不断扩大. 目 前对不同植物类群、不同生态类型的 m a d s - b o x 基因 研究十分有限. 对非种子植物研究尚未进行; 对地衣、 苔醉等低等 植物， 以及藻 类等水生植物m a d s b o x 基因知之甚微. 三、 本实验研究目的 了 解植物由营养生长向 生殖生长的 转变的调节过程， 对于控制有花植物的 生 长发育是很有意义的。 至今己 经鉴定了许多参与控制果实和花发育的m a d s b o x 基因。 通 过 在 拟 南 芥、 金 鱼 草、 矮 牵牛 等 植物 中 的 大 量 研 究 表明 : m a d s b o x 基 因单独或联合起来作为花器宫发育的调控因子(s h o r e a n d s h a ir o c k s ,1 9 9 5 ; w e ig e l,1 9 9 5 ; t h e i s s e n a n d s a e d le r, 1 9 9 9 ; t h e is s e n e t a l., 2 0 0 0 ) 。 花 5 官 发 育的a b c 模型中的大部分基因均为m a d s b o x 基因。 近来的研究 表明m a r s