（植物学专业论文）拟南芥atspx1基因的表达模式和功能分析.pdf

硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 致谢 本论文的研究是在导师吴平教授的悉心指导下完成的。论文从选题、研究 计划制定和实施到论文撰写和讨论都凝聚着导师的心血和智慧。这两年来，导师 在学习上给予我无微不至的关怀，使我得以顺利地完成学业。导师对科学事业的 执着追求、严谨求是的科学态度和百折不挠的奋斗精神时刻激励着我，永远是我 学习的楷模，并使我受益终生。 本研究的顺利完成离不丌寿惠霞老师、易可可老师、毛传澡老师、吴忠长 老师、莫肖蓉老师、李靖老师、陈铭老师、陈新老师、陈汉民老师和李燕老师的 鼎力相助与指导，在此致以最诚挚的感谢! 尤其要感谢课题组的段可师姐和黄红 杰同学的齐心帮助，所取得的每一分收获都包含着她们的智慧和劳动。没有大家 的齐心协力地合作，本研究难以付诸实施。在此表示最衷心的感谢! 这里良好的 实验条件、浓厚的学术气氛、团结友爱的精神时刻鼓舞着我，使我获益匪浅。 感谢王芳、周洁、齐晓朋、张麝龙、党磊、于杰、王学敏、李想、何晓薇、 储俊、余晓波、秦诚、王栩鸣等师兄师姐平时给予的指导。感谢杜冠魁、丁沃娜、 朱晴羽、王晓飞、郝西、程龙军、何飞、李静、曹军等同学对我的热心帮助。 感谢父母对我的关爱、支持和鼓励，我的每一分进步都包含着他们的付出。 武为 2 0 0 6 年5 月于杭州紫金港 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 摘要 含有s p x 结构域的蛋白发现距今约十年，迄今为止在包含动物和植物在 内的很多高等真核生物中都发现了含有该保守结构域的蛋白。其中有些蛋白与磷 信号相关，有些蛋白与铁信号相关，但绝大多数这类蛋白的功能都不太清晰。拟 南芥中含有s p x 结构域的蛋白可分为四个家族，与磷的转运相关的p h 0 1 及其同 源的1 0 个成员构成一个家族。本文所研究的a t s p x i 属于另一个由4 个只含有 s p x 结构域的蛋白组成的家族，其中以a t s p x l 与s p x 结构域的同源性最高。对 a t s p x j 基因表达模式的分析发现，它在根、茎、叶、花和果荚中均有表达，并 且受磷饥饿强烈诱导。a t s p x l 融合g f p 的表达载体轰击洋葱表皮细胞显示其定 位于细胞核中，与预测到的双向核定位序列结果一致。增强表达a t s p x l 转基因 到拟南芥中后，发现转基因材料在正常供磷和低磷条件下均未有明显的表型，但 在缺铁条件下表现对缺铁胁迫的反应迟缓。定量p c r 分析显示在a t s p x l 增强转 基因材料中磷饥饿诱导基因a t a c p 5 、p a p 2 、r n s l 的表达都有明显增强，编码 铁蛋白的基因和n r a m p 3 的表达也有显著变化。这些结果说明，a t s p x l 可能在 植物体内磷的活化利用方面起作用，此外还可能参与植物早期发育过程中铁的调 运，推测它是一个双功能的基因。 关键词：拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ；s p x 结构域；磷饥饿；缺铁 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 a b s t r a c t t h es p xd o m a i np r o t e i n s ，w h i c hw e r ei d e n t i f i e da b o u tt e ny e a r sa g o ，h a v eb e e n c o n f i r m e dn o wt oe x i s ti nm a n ye u k a r y o t e s w h i l es o m es p x p r o t e i n sw e r ep r o v e dt o b er e l a t e dt op h o s p h o r u ss i g n a l i n go ri r o ns i g n a l i n g ，t h ef u n c t i o no fm o s to ft h e s e p r o t e i n sr e m a i n su n k n o w n a n a l y s i so ft h ea t s p x le x p r e s s i o np a t t e r ns h o w e dt h a ti t i se x p r e s s e di nr o o t ，l e a s t e m ，f l o w e ra n d s i l i q u e t h ee x p r e s s i o no f a t s p x lc o u l db e g r e a t l yi n d u c e db yp h o s p h o r u ss t a r v a t i o n b i n a r yv e c t o rh a r b o r i n ga t s p x l ：g f p f u s e dg e n ew a sb o m b a r d e di n t oo n i o ne p i d e r m a lc e l l s r e s u l t ss h o wt h a ta t s p x l p r o t e i nw a sl o c a l i z e di nt h en u c l e u s n os i g n i f i c a n tp h e n o t y p ec h a n g ew a so b s e r v e d i nt r a n s g e n i cp l a n t so v e r e x p r e s s i n ga t s p x lc o m p a r e dt ot h ew i l dt y p ep l a n t su n d e r e i t h e rp i - s u f f i c i e n to rp i - d e f i c i e n tc o n d i t i o n t h et r a n s g e n i cp l a n t s ，h o w e v e r s h o w t o l e r a n c et oi r o ns t a r v a t i o nd u r i n ge a r l ys t a g eo fd e v e l o p m e n t q u a n t i t a t i v er t - p c r r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fp h o s p h o r u s - r e s p o n s i v eg e n e sa t a c p 5 ，p a p 2 ， r n s lw a se n h a n c e di nt h ea t s p x lo v e r e x p r e s s i n gl i n e s ，a sw e l la st h ef e r r i t i ng e n e s a n dn r a m p 3 o u rr e s u l t s s u g g e s t e d t h a ta t s p x l m a yp l a yar o l e i nt h e r e m o b i l i z a t i o no f p h o s p h o r u s a n di r o n t r a n s p o r t a t i o nd u r i n ge a r l ys t a g e o f d e v e l o p m e n t o u rr e s e a r c hs u g g e s t st h a ta t s p x lm a y h a v ed u a lf u n c t i o n s k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i s ；s p xd o m a i n ；p h o s p h o r u ss t a r v a t i o n ；i r o nd e p r i v a t i o n 5 硕士学位论文：拟南芥a t s p x f 的表达模式与功能分析 a m p h y g k a n s p o p o r f r t - p c r d e p c g u s g f p o s a t n c b i t i g r c d d 缩略语 a m p i c i l l i n h y g r o m y c i n k a n a m y c i n s t r e p t o m y c i n b a s ep a i r s o p e nr e a d i n gf r a m e r e v e r s et r a n s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d i e t h y l p r o c a r b o n a t e p - g l u c u r o n i d a s e a r a b i d o p s i st h a l i a n a t h en a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n t h ei n s t i t u t ef o rg e n o m i cr e s e a r c h c o n s e r v e dd o m a i nd a t a b a s e 6 烦1 ：学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 第一部分文献综述 s p x 结构域的研究进展 s p x 结构域的发现距今约十年。得名于最早发现的三个蛋白名称的首个字母 缩写( p f a me n t r yp f 0 3 1 0 5 ) 。这三个蛋白是酵母的s y g i ( s p a i ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 和p h 0 8 1 ( c r e a s ye ta 1 ，1 9 9 3 ： o g a w ae ta 1 ，1 9 9 5 ；h u a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) ，以 及人的x p r i ( b a t t i n i e ta 1 ，1 9 9 9 ) ，它们的氮末端都含有一个s p x 结构域。 这些基因参与g 蛋白耦联的信号转导过程，并与磷信号紧密相关。迄今为止在包 含动物和植物在内的很多高等真核生物中都发现了含有该保守结构域的蛋白，但 绝大多数这类蛋白的功能都不太清楚。 1s p x 结构域的命名 酵母中交配信息素的信号转换是由g 蛋白完成的，并使得酵母的细胞周期停 滞在g 1 期从而保证交配的正常进行。s y g l ( s u p p r e s s o r o f y e a s t g v a o 的n 一端即 s p x 结构域直接与g 蛋白的1 3 亚基结合，从而阻止b 亚基和a 亚基结合，最终 抑制交配信息素信号的转换，这暗示此类蛋白可能参与g 蛋白相关的信号传递。 酵母的磷信号的p h o 调控体系至少包括5 个p h o 操纵子：p h 0 2 和p h 0 4 为转录激活蛋白；p h 0 8 0 一p h 0 8 5 是细胞周期蛋白和周期蛋白激酶的复合体； p h o s l 则是一个细胞周期蛋白激酶的抑制子。缺磷条件下，p h 0 8 1 被激活，作 用于p h 0 8 0 p h 0 8 5 复合体并抑制它的活性，这个复合体活性的降低又导致 p h 0 4 一p h 0 2 以去磷酸化状态存在细胞核中，这两个转录因子进而激活一系列磷 酸调节基因的表达，如分泌性酸性磷酸酶p h 0 5 和高亲和磷酸转运体p h 0 8 4 等 基因。这些被调控的基因又会提供一种正反馈，保持p h 0 4 的去磷酸化状态从而 使得这些尸肋基因可以持续不断地表达( o g a w a e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。酵母就是通过这种 机制来适应磷的胁迫( 图1 ) 。有研究表明p h 0 8 1 的a n k y r i n 结构域、即c 末端的 8 0 个氨基酸可能直接和p h 0 8 0 结合而起抑制作用，但全长蛋白的抑制能力是 单独a n k y r i n 结构域的6 0 倍，因此p h 0 8 1 的其它结构域、包括s p x 结构域对 其功能也很重要( h u a n g 等，2 0 0 1 ) 。 硕士学位论文：拟南芥a t s p x l 的表达模式与功能分析 x r p l ( x e n o t r o p i ca n dp o l y t r o p i cr e t r o v i r u sr e c e p t o r ) 是小鼠自血病病毒( m l v ) 受体，在人体组织中广泛表达。x p r l 是6 9 6 个氨基酸组成的跨膜蛋白，与酵母 的s y g i 蛋白有3 7 相似性，推测它可能参与g 蛋白耦联的信号转导。x p r i 的n 端亲水区与链孢霉的n u c 2 及酵母的p h 0 8 1 和p h 0 8 5 这些参与无机磷转 运调控途径的蛋白也有一定的同源性，说明x p r l 可能参与信号传导过程，特别 是磷的转运的调控过程。x p r l 与上述这些蛋白的同源性表示它可能作为磷感应 器参与g 蛋白耦联的信号传导过程( b a t t i n ie ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 g 蛋白介导的信号转导途径中，g 蛋白起到将受体与效应物耦联的作用。g 蛋白耦联受体的侧肽链上有磷酸化位点，受体功能受磷酸化调节( d e v r i e se t a l ， 2 0 0 0 ) 。g 蛋白的效应物包括有磷脂酶和磷脂酶a 2 等( m c c u d d e n e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。所 以g 蛋白介导的这种信号转导途径与生物体内磷的水平有着非常密切的关系。 h i g hplow p 上 淋m 附翱坩 、， p h 0 5 c o n s t t t u tj v e m u t a l i o n s 匝蓟毕唧。n e r 圆l p h 0 8 1 c g a i n ) 嗽黔 p 脚 p h 0 4 c ( g a i n ) 图1 酵母中p h o 调控系统的遗传模式( o g a w a e ta 1 ，2 0 0 0 ) 2 真核生物中磷和铁信号途径相关的s p x 蛋白 近年来人们在除酵母以外的真核生物中也发现了许多含s p x 结构域的蛋白。 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 如链孢霉的n u c - 2 基因与酵母的p h 0 8 1 基因编码的蛋白序列有较高的同源性， 其表达量在缺磷条件下可以提高到正常条件下的1 5 倍，然后调控一些磷反应基 因的表达，其功能缺失突变体表现出不能在低磷胁迫条件下生长( p e l e ge t a 1 ， 1 9 9 6 ) 。 拟南芥的p h 0 1 基因主要负责根中的磷向木质部的调运，但其蛋白序列与任 何已知的磷转运体都没有同源性，与哺乳动物的x p r l 和酵母的s y g l 显示出一 定的同源。陡( h a m b u r g e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。拟南芥的p h 0 1 基因家族，由1 1 个基因构 成，包括p h 0 1 和它的1 0 个同源基因跗d ? f 玎一朋d j 剧d 。p h 0 1 家族的蛋 白包括n 一末端的s p x 和c 末端的e x s 两个结构域。s p x 结构域又可以被分成 三个长度在3 5 到4 7 个氨基酸不等的亚域s p x i ，s p x 一2 和s p x - 3 。在多数s p x 蛋白中，比如s y g l 和p h 0 8 1 ，这三个亚域是紧密相连的，整个s p x 结构域的长 度在1 8 0 个氨基酸左右。对拟南芥的l1 个p h 0 1 蛋白氮末端的疏水区分析显示， 所有的p h o i 蛋白都含有3 0 0 到3 6 0 个氨基酸不等的s p x 结构域，它们的三个亚 域被一些相似度很低的序列分隔开来。 p h 0 1 基因家族表达分析的结果显示，p h 0 1 的这些同源基因多数在缺磷的 组织中表达都没有变化，删，? 1 1 5 和p h 0 1 ；h 7 在缺磷的茎中表达受到微弱的 下调。只有p h 0 1 ；h 1 在缺磷的叶片中表达受到强烈诱导，同时在根中也有微弱 的诱导。p h 0 1 家族的成员除p h 0 1 功能己知外，其它几个成员在磷营养的吸收 和代谢途径中的功能并不是很清楚。虽然p h 0 1 家族的成员表达部位多种多样， 但是它们主要是在植株各器官的维管组织中表达，根据p h 0 1 的功能推测它们可 能参与了磷向地上部分或韧皮部中的运输( w a n g e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 大麦中的i d s 4 ( i r o n d e f i c i e n c ys p e c i f i cc l o n en o 3 ) 蛋白含有一个由3 9 个氨 基酸构成的s p x 结构域，i d s 4 基因是利用差减杂交的方法从e d n a 文库中分离 出来的，它在根中的表达受缺铁特异诱导，可能在植物的铁吸收和代谢等方面起 着重要的作用( k o b a y a s h ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。蕃茄中的a i l ( a n a e m b i ci d s 4l i k e ) 蛋白是 一种类i d s 4 蛋白，互作于一个亮氨酸拉链结构的转录因子a b z l ( a n a e r o b i c b a s i c l e u c i nz i p p e r ) ，a i l 基因的表达则受到厌氧的诱导，与g 蛋白信号传导相关( s e l l e ta 1 2 0 0 5 ) 。 拟南芥中除了p h 0 1 家族的1 1 个蛋白之外，还发现有另外9 个基因编码的 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 蛋白含有s p x 结构域。不同的s p x 蛋白之间的比对结果显示，s p x 结构域在真 核生物的不同物种中有一些氨基酸的残基非常保守，特别是赖氨酸残基。系统进 化分析提出拟南芥基因组中所有编码含s p x 结构域蛋白的基因可以分成四个基 因家族。一个为p h 0 1 家族，包含所有的p h 0 1 蛋白；第二个家族即为本文所研 究的s p x 家族，包括a t 2 9 2 6 6 6 0 、a t 5 9 2 0 1 5 0 、a t 2 9 4 5 1 3 0 和a t 5 9 1 5 3 3 0 四个亲 水性的蛋白，它们与大麦的i d s 4 蛋白同源；第三个家族包括三个含有一些跨膜 结构域的功能未知的蛋白；第四个家族由两个亲水性蛋白组成，它们的功能也是 未知的( w a n g e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 本文所涉及的s p x 家族包括了预测只含有s p x 结构域的四个蛋白，根据它 们与s p x 结构域的同源性由高到低依次命名为a t s p x i ( a t 5 9 2 0 1 5 0 ) 、 a t s p x 2 ( a t 2 9 2 6 6 6 0 ) 、a t s p x 3 ( a t 2 9 4 5 1 3 0 ) 和a t s p x 4 ( a t 5 9 1 5 3 3 0 ) 。编码这四个蛋 白的基因非常保守，在s p x 三个亚域部分同源性达9 0 以上。拟南芥中a t s p x l 、 a t s p x 2 和a t s p x 3 这三个基因受磷饥饿高度诱导表达( 芯片数据) ，但是它们在磷 的胁迫中所发挥的功能仍然未知。 二、植物磷反应信号传导机制的研究进展 酵母体内存在着一个被称为p h o 体系的磷反应体系( b u n y ae ta 1 ，1 9 9 2 1 9 9 6 ) ，这个体系在磷饥饿胁迫下的转录调控机制被研究得最为详细。研究表明， 缺磷时植物会产生类似于酵母p h o 操纵子的多基因协同表达，组成一个高度协 作的分子网络。植物中许多基因参与对缺磷胁迫的反应，一些基因参与植物特异 的磷高效吸收和利用机制，而其它基因则参与调控缺磷诱导的多基因表达。植物 中对磷饥饿响应的许多基因都己被克隆，并对其表达调控做了深入研究。 1 转录水平的调控 衣藻中的雎耳，基因，是在光合真核生物中第一个被克隆的磷代谢的调节子。 p s r i 蛋白的n 端具有类似于m y b 类转录因子d n a 结合域的一段多肽，c 端 具有富含谷氨酸的转录激活域。船r j 在低磷胁迫下的表达水平可提高1 0 倍，这 个基因的突变体p s r l 丧失了一些对磷饥饿的响应，比如高亲和磷转运子的诱导 表达和酸性磷酸酶的分泌。说明p s r l 在衣藻建立对低磷逆境的适应过程中起着 硕士学位论文：拟南芥d t s p x l 的表达模式与功能分析 重要的作用( w y k o f f e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 关于p s r l 在衣藻磷代谢途径中的功能，w y k o f f 等提出了一个模型，即在正 常生长条件下，p s r l 基因也可以表达，但是其表达产物并没有活性，而在低磷 胁迫条件下p s r l 蛋白被激活，瞬时地调节一些特异基因的转录。特异基因的瞬 时调节是由于不同的磷饥饿诱导基因的启动子与p s r l 蛋白结合的程度不同而引 起的。p s r l 蛋白的活性依赖于p s r l 自身同源二聚体的形成。因此，磷饥饿下 p s r l 在核中的积累有利于二聚体的形成，进一步促进基因的转录。磷饥饿2 4 h 后，细胞的生长速率将随着p s r l 的转录水平而下降。这个下降说明可能在衣藻 对磷饥饿响应的后期，其他的调节过程起了主要作用。 r u b i o 等( 2 0 0 1 ) 通过磷饥饿诱导报道基因a 吐陋，? j g u s 来筛选磷饥饿反应 表达缺陷的突变体，从而获得了p h r l 突变体。p h r l 突变体在缺磷条件下，体内 的一些已知的磷饥饿诱导基因对低磷的响应、花色素苷的积累和根冠比的增加等 缺磷症状有所减弱，与衣藻的p s r l 突变体在缺磷条件下的反应类似。p h r l 突变 体与野生型缺磷条件下在花色素苷和根冠比方面的差异，在低氮条件观察不到， 说明p h r l 引起的这种表型是对低磷胁迫专一反应的。p h r l 和p s r l 同属于m y b 转录因子家族的一个亚家族：m y b c c ( e o i l e d c o i l ) 家族。这类m y b c c 转录因 子是植物特异的，在拟南芥中有1 5 个成员。它们都具有一个卷曲螺旋的结构域， 通常是通过折叠的方式参与蛋白和蛋白的相互作用。因为p h r l 突变体中缺磷所 引起的根毛长度和密度增加的表型并没有消失，猜测在拟南芥中可能有其它的信 号途径参与了对部分磷饥饿响应机制的调控。 通过在体外对p h r l 蛋白和a t l p s l 基因的启动子区域进行凝胶阻滞实验发 现，a t i p s l 基因的启动子区中存在一种不完全回文序列( g n a t a t n c ，p 1 b s 序 列) 。p h r t 以二聚体的形式与p 1 b s 序列特异地结合并调控a t l p s l 的表达，a t l p s l 基因启动子中的2 个p h r l 蛋白结合序列的突变，破坏了它对磷饥饿的响应。同 时p h r l 的部分卷曲螺旋结构域缺失也会影响它与a t l p s l 启动子的结合。其它 一些磷饥饿响应基因，包括m t 4 t p s l l 家族的a t 4 基因( b u r l e i g ha n dh a r r i s o n ， 1 9 9 9 ) 、编码高亲和磷转运体的a t p t l 基因( m u c h h a le ta 1 ，1 9 9 6 ) 、编码酸性磷酸 酶的a t a c p 5 基因( d e lp o z oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 、编码核酸酶的r n s l 基因( b a r i o l ae ta 1 ， 1 9 9 4 ) 年na t l p s 3 基因( d e lp o z oc ta 1 ，未发表) ，它们的启动子中都含有这种 硕上学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 p 1 b s ( p h r lb i n d i n gs e q u e n c e ) 序列。同时n o r t h e r n 杂交的结果显示，这些基因在 低磷条件下的诱导表达在p h r l 突变体中受到抑制。这些结果表明，p h r i 是位于 磷信号传递中下游的一个转录激活子，影响一系列磷饥饿反应基因的表达( r u b i o e ta i 一2 0 0 1 ) 。 ， 2 转录后水平的调控 植物适应磷饥饿胁迫要在形态和生理生化方面对胁迫作出响应来调节体内 磷的平衡，这个适应性进化过程中涉及到一系列基因表达的不同程度的改变，这 些基因的功能涉及到各种代谢途径、离子运输、信号转导、转录调控等与生长发 育相关的方方面面( m i s s o ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。虽然植物中己有大量磷响应基因报道 ( h a m m o n de t0 1 ，2 0 0 3 ：w a s a k ie ta 1 ，2 0 0 3 ：w ue ta 1 ，2 0 0 3 ) ，但是这些磷饥饿响 应基因的调控的分子机制仍然有待于研究。 m i c r o r n a ( m i r n 是一类非编码r n a ，通常以碱基配对的方式互补结合到 靶m r n a 上，作为转录后的负调节子起作用( b a r t e l ，2 0 0 4 ；c a r r i n g t o na n d a m b r o s ， 2 0 0 3 ；l e ee ta 1 ，1 9 9 3 ；r e i n h a r te ta 1 ，2 0 0 0 ，2 0 0 2 ) 。大多数植物的m i r n a 通过造成 靶m r n a 在编码区的切割降解对其进行调控( b a r t e le ta 1 ，2 0 0 3 ；b a r r e l ，2 0 0 4 ； c a r r i n g t o na n da m b r o s ，2 0 0 3 ；d u g a sa n db a r t e l ，2 0 0 4 ) 。一些植物m i r n a 通过调节 相关的转录因子在叶和花的发育过程中起了关键的作用( b a r t e le ta 1 ，2 0 0 3 ； r e i n _ h a r t e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。除了转录因子之外，m i r n a 还可以广泛地调控很多组织特 异或胁迫响应基因的转录产物( a d a ie ta 1 ，2 0 0 5 ；a x t e l la n db a r t e l ，2 0 0 5 ； j o n e s r h o a d e sa n db a r t e l ，2 0 0 4 ；s u n k a ra n dz h u 2 0 0 4 ) 。m i r 3 9 5 的积累受根生长环 境中s 0 4 2 。离子影响，该m i r n a 又通过修饰靶基因a p s 的转录产物稳定性来调 节s 0 4 2 。的吸收( j o n e s r h o a d e sa n db a r r e l ，2 0 0 4 ) 。研究证实m i r 3 9 9 在正常供磷条 件不表达，受到缺磷的强烈诱导。缺磷条件下m i r 3 9 9 的大量积累引起了e 2 m r n a 表达量在根中的降低，在地上部的影响却并不太大。这种m r n a 编码泛 素结合e 2 酶，是蛋白泛素降解途径中的一个组分( s u n k a ra n d z h u ，2 0 0 4 ) 。 m i r 3 9 9 的增强转基因材料在正常供磷条件下，叶片特别是老叶边缘会出现 枯黄和坏死等高磷毒害症状( d e l h a i z ea n dr a n d a l l ，1 9 9 5 ；s h a a ee ta 1 ，2 0 0 4 a ， 2 0 0 4 b ) 。进一步分析发现在正常供磷条件下m i r 3 9 9 超表达材料从外部环境中吸 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 收的磷更多，根向地上部运输的磷也多于野生型，从而造成超表达材料中地上部 磷的大量积累。这些过量积累在叶片中的磷会滞留在老叶，而不是在地上部重新 分配。叶片中磷含量的测定也证实叶片中积累的磷已经超过可以造成毒害的水平 的倍( m a r s c h n e r , 1 9 9 5 ) 。e 2 的功能缺失突变体也同样表现出地上部高磷毒害的 表型，说明m i r 3 9 9 对e 2 的调控在调节体内磷平衡方面起着重要的作用。 c h i o u 等( 2 0 0 6 ) 由此提出了一个m i r 3 9 9 通过调控e 2 而调节体内磷平衡的可 能的机制。e 2 通常参与蛋白降解途径，由于e 2 的功能缺失突变体会造成磷的过 量吸收从而形成磷毒害，所以正常供磷条件下e 2 需要有一个基本表达量来调节 体内磷吸收和转运的信号系统从而阻止植物对磷的过量吸收。在磷饥饿条件下， m i r 3 9 9 的诱导表达抑制了e 2 的表达，植物才可以从土壤中不受抑制地吸收磷以 克服低磷胁迫。在缺磷条件下，e 2 在地上部的表达并没有因为m i r 3 9 9 的诱导表 达而受到很大的影响，也保证了老叶中的磷可以被转运出来进行重新分配， m i r 3 9 9 的增强表达材料和e 2 突变体都不再具有这种能力。所以m i r 3 9 9 对b 2 的精确调控在植物体内磷平衡过程中起着非常关键的作用，这也是磷平衡调节方 面一种非常重要的分子机制。 m i u r a 等( 2 0 0 5 ) 研究证实拟南芥的s u m o ( s m a l lu b i q u i t i n 1 i k em o d i f i e 0e 3 连 接酶也可以对一些低磷响应进行调控。它的突变体s i z l 具有更为明显的缺磷表 型，如主根受抑制更明显，侧根和根毛密度的增加及花色素苷的大量积累等。磷 诱导基因a t l p s l 和r n s l 在s i z l 突变体中对低磷胁迫的响应比野生型中缓慢， 但总的诱导表达量相同。a t l p s l 和r n s l 是受p h r 调控的下游基因，而实验结 果显示p h r l 是a t s i z l 类泛素化修饰的一个底物。所以a t s i z l 可能是通过对 p h r l 的类泛素化修饰从而激活了它的转录活性，促进了a t l p s l 和r n s l 的表达。 虽然a t s i z l 通过对p h r l 的类泛素修饰而影响了一些低磷响应基因的表达，但 它也同时影响了其它一些不受尸瑚调控的磷饥饿反应，如根毛密度的增加，说 明a t s i z i 的类泛素化作用可能对磷饥饿反应通过多种途径进行调控。 以上研究结果表明泛素或类泛素分子的转录后调控很有可能参与了植物对 磷饥饿响应机制的建立。通过对m i r 3 9 9 的上游和e 2 的下游信号途径的研究可 以进一步了解控制植物体内磷平衡的调控网络。 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 3 其它磷胁迫下差异表达基因 植物受到低磷胁追时，体内的酸性磷酸酶的活性会显著提高( d u f fe la 1 ， 1 9 9 4 ；t r u l la n dd e i k m a n ，1 9 9 8 ) 。酸性磷酸酶是植物体内比较重要的酶类之一， 与有机磷的分解利用及植株体内磷的再利用有密切的关系，而且很可能是磷胁迫 的专一性反应产物。缺磷诱导的拟南芥酸性磷酸酶a t a c p 5 ( t y p e5a c i d p h o s p h a t a s e ) 与哺乳动物的5 型酸性磷酸酶同源性最高，而这种酸性磷酸酶是紫 色酸性磷酸酶的一类。a t a c p 5 基因的表达受磷饥饿强烈诱导，对低磷胁迫反应 灵敏；受低磷胁迫的植物恢复证常供磷后，表达量又会再降低直到不表达( d e l p o z oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。这种对低磷胁迫响应灵敏的基因可以作为种标记基因，应用 于真核生物适应低磷逆境的分子机制的研究中( l e n b u r ga n do s h e a ，1 9 9 6 ； t o r r i a n i ，1 9 9 0 ；v o g e la n dh i n n e n ，1 9 8 0 ) 。 核糖核酸酶是一类核酸水解酶，广泛参与植物体内的各种生命活动。核糖核 酸酶可以降解植物衰老组织中的r n a 和d n a ，把磷元素释放到幼嫩部位重新利 用( t o s h i n o b ue ta 1 。2 0 0 1 ) 。拟南芥中的s 1 i k er n a s e 基因家族包括r n s l 、r n s 2 和 r n s 3 三个基因，它们的表达模式各不相同( b a r i o l a e t a l ，1 9 9 4 ；t a y l o re t a l ，1 9 9 3 ) 。 将r n s i 、r n s 2 反义转入拟南芥后发现，转基因植株表现出花色素苷含量高等缺 磷症状( p a u l i n ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。由于i s l 和r n s 2 被认为通过释放胞外或胞内核 糖核酸中的磷元素参与了磷饥饿的拯救机制，所以这种由剧恬或r n s 2 表达产物 减少而引起的花色素苷积累，可能是因为植物体内磷的循环再利用能力减弱从而 表现出缺磷症状。 在对拟南芥的激活标签插入突变体p a p l - d 的研究过程中，人们发现了拟南 芥中与p a p l 蛋白有7 7 同源性的p a p 2 ，它们同属于r 2 r 3 m y b 转录因子家族。 剧p ? 基因的增强表达与p a p l d 有相似的表型，可以引起花色素苷的大量积累 ( j u s t i ne ta 1 2 0 0 0 ) 。同时我们发现正常供磷条件下，用尸2 只在地上部分表达， 根中几乎不表达；对植株进行缺磷处理后，尉朋的表达被强烈诱导。说明缺磷 引起了剧尸2 基因表达产物的大量增加，而这种积累又导致了植物体内花色素苷 的积累。但磷信号对朋尸2 基因的调控方式还有待于研究。 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 三、植物铁的信号途径 1 植物n r a m p 家族 铁和磷都是植物生长过程中很关键的矿质元素：磷是一种大量元素，而铁是 一种微量元素。这两种营养多数情况下在土壤中是富余的，但是却主要以植物不 易吸收利用的形式存在。 n r a m p ( n a t u r a lr e s i s t a n c e - a s s o c i a t e dm a c r o p h a g ep r o t e i n ) 家族是一类可以调控 二价离子的吸收利用的一类蛋白。n r a m p 家族首先在动物中发现并得以克隆， 随后在植物、真菌甚至细菌中也得以克隆，并对其功能进行了研究。植物的 n r a m p 基因可能参与一种铁素吸收机制一吞噬机制( m o r i ，1 9 9 9 ) 。在这机制 中，n r a m p 基因作为一种高亲和性铁转运蛋白基因，将内吞小体释放出的自由 f e ”转入胞质中，然后再转入细胞器中。 拟南芥中有6 个n r a m p 基因，a t n r a m p l 、a t n r a m p 3 和a t n r a m p 4 都受 到缺铁的诱导。a t n r a m p i 基因的超表达会提高拟南芥对高铁毒害的抗性，说明 它在细胞内铁的运输而不是吸收中起作用。a t n r a m p 3 和a t n r a m p 4 基因的表 达模式相似，都是在根、茎和叶片的维管组织中表达，细胞中的定位都是在液泡 膜上，它们的单突变体都没有明显的表型。这些说明a t n r a m p 3 和a t n r a m p 4 基因功能上可能存在着冗余。a t n r a m p 3 和a t n r a m p 4 基因的双突变导致拟南 芥在缺铁条件下的萌发受到阻滞，并且这种影响可以在f 常供铁后得到恢复。双 突变体的种子中铁含量与野生型相同，但是萌发时却不能有效地从种子中铁的储 存部位一液泡中调运出来。在拟南芥早期发育时，a t n r a m p 3 和a t n r a m p 4 基 因在液泡中储存的铁向外调运的过程中起着极为关键的作用，在发育后期植物形 成了从土壤中吸收铁的有效的系统后，这种作用将会被取代( l a n q u a re ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。 2 植物铁蛋白 作为铁的储存蛋白质，铁蛋白是一类多聚体蛋白。铁蛋白的基本功能是吸收 铁，并以无毒害的形式储存起来，根据代谢功能的需要再将铁释放出去。在种子 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 萌发的头几天，就发现有铁蛋白的降解，以及铁的释放，说明铁蛋白在植物发育 的早期起重要作用( m a r i n o s ，1 9 6 7 ) 。植物铁蛋白除了在发育过程中作为预备性 铁库的作用外，在植物体中还可以作为一种胁迫反应蛋白。它的积累受各种环境 信号的诱导。在有病害的植物组织中和处于一些生理胁迫下的植物体中都发现铁 蛋白的表达受到诱导( d e f i ke ta 1 ，1 9 9 9 ) 。铁过量会导致氧胁迫，由于植物铁蛋白 具有高容量的铁储存能力，并能将高毒性的f e ( i i ) 转化为无毒的p e ( i i i ) 螯合 物形式，所以植物铁蛋白在保护细胞的抗氧化性胁迫中起重要作用( g a y m a r de t a 1 ，1 9 9 6 ) 。 玉米中的研究表明，铁诱导铁蛋白m r n a 的积累是短暂的，在叶中较多，而 在根中受铁的影响则较叶片要j x ( l o b r d a u xe ta 1 ，1 9 9 2 ) 。其它一些因素如外源激 素和环境胁迫等也诱导铁蛋白基因的表达( f o b i s l o i s ye ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 拟南芥的基因组中包括4 个编码铁蛋白的基因。这4 个铁蛋白都定位于质体 中，n 一端具有一段导肽序列。成熟的铁蛋白都含有一段保守的突出肽，是植物 特有的序列，可能是体外蛋白质稳定性调控的一个重要决定因素。虽然这四个铁 蛋白在结构上具有很高的保守性，它们的基因在植物不同的生长发育阶段对不同 信号的响应方式存在着差异。a t f e r l 和a t f e r 3 基因在铁过量时受到诱导，而 a t f e r 2 基因则对铁不响应。a t f e r 2 也是4 个基因中唯一一个在种子里大量表达、 而在根、茎、叶、花、未成熟果荚、萌发种子中基本不表达的基因，其它三个基 因在植物的各种器官中都表达( p e t i te ta 1 ，2 0 0 i ) 。 四、植物铁信号与磷信号途径的互作 在植物体内，植酸( 肌醇六磷酸) 作为一种磷的储存方式大量存在，以植酸形 式储存的磷占燕麦种子总磷含量的5 3 。植酸可被植酸酶水解从而释放磷，在燕 麦种子萌发的早期，植酸酶的含量明显提高，释放出的磷进入了生长点处的各种 合成反应，参与种子萌发过程中对储存磷的调用和运输( h a l la n dh o d g e s ，1 9 6 6 ) 。 另一方面，植酸可以通过对植物体内f e 3 + 的螯合，对高铁引起的羟基形成起到阻 断作用并强烈抑制脂类的过氧化反应，从而阻碍植物的老化和果实的腐败等 ( g r a fe ta 1 ，1 9 8 7 ) 。植酸同时作为磷的储存形式和铁的螫合剂，既在种子萌发阶 段参与磷的调用和转运，又可能受到体内铁浓度调控的并通过对游离的铁离子螯 硕士学位论文：拟南芥a t s p x i 的表达模式与功能分析 合调控下游反应。植酸在磷和铁两种信号途径中的功能是否存在关联仍然未知。 对蕃茄根部缺磷、缺铁和缺钾条件下芯片分析的结果显示，在这些参与植物 营养信号传导途径的基因中有很多是在磷、铁和钾三种营养胁迫的条件下都能够 诱导表达的，说明了植物中磷、铁和钾的信号系统在分子水平上有一定重叠并可 能相互作用的。比如m a p 激酶在磷、铁和钾的胁迫条件下均可被诱导表达，这 些基因在营养的体内平衡和信号传导方面都起着一个较为基本的作用。可以说磷 和铁有着不同的信号传导途径，但是这些不同的途径却包含一些相同的基因。鉴 于人们已经发现些非生物胁迫的信号途径存在着相互作用，这些营养相关的不 同信号传导途径中也可能会拥有一些共同的调控因子从而引起信号途径的互相 作用( w a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 缺磷和缺铁引起植物在形态学上一个共同的改变是根毛长度和密度的增加。 许多研究提出生长索和乙烯可能参与了缺磷和缺铁条件下根系的发育，缺磷和缺 铁条件下乙烯的水平会提高，外源旌加的生长素和乙烯能够模拟植物在缺磷和缺 铁条件下根的形态( b a t e sa n dl y n c h ，1 9 9 6 ；l a n d s b e r g ，1 9 9 6 ；s c h m i d te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 s c h m i d t 等( 2 0 0 i ) 通过研究发现，一些生长素或乙烯不敏感的突变体在缺铁条件 下本应该受到诱导的根发生几乎被完全抑制，而缺磷条件下根毛的诱导发生却并 未受到显著的影响，同样的现象也发生在施加t i b a 等生长素和乙烯拮抗剂的植 株中。为解释这一现象，提出了一个缺磷和缺铁诱导根毛发生的机制( 图2 ) 。缺 铁可能激发两条不同的途径：一条依赖乙烯信号传导，依赖于e i n 2 和e t r 的功 能；另外一条是之| j i m a s u e c i ( 1 9 9 6 ) 提出的不依赖于乙烯的，通