（微生物学专业论文）富集文库法开发谷子的微卫星分子标记.pdf

摘要 。 谷子( f o x t a i lm i l l e t ，& 幼妇砌厅c 口b e a u v ) 属禾本科( f ，圮钾) 狗尾草属 & 幼妇 ( l ) b e a u v ，是世界上最古老的农作物，并且作为一种重要的粮食作物，在我国北 方粮食生产中占有较重要的地位。谷子许多特殊有益性状是其他禾谷类作物所没有的， 如：抗旱性、耐盐性、高效水利用、耐瘠性、多种抗病抗虫性、人体必需营养相对均衡 等。但由于谷子只是区域重要性作物，相对于禾本科其他作物，如水稻、玉米、小麦等， 其影响小，生物技术研究也相对较少，特别是特异性分子标记、功能基因组研究等领域 基本为空白。 微卫星( s s r ) 是指由1 6 个核苷酸为单位、呈串联重复的d n a 序列，广泛分布 于真核生物的整个基因组中。微卫星标记具有共显性、多态性高、重复性好等特点，是 较为理想的分子标记，被广泛地用于群体遗传研究、遗传图谱构建、数量性状基因q t l 定位、辅助选择等。由于谷子尚未开发s s r 标记，限制了对这些领域的研究，因此急需 开发适于谷子研究的s s r 标记，构建谷子的遗传连锁图谱，并对谷子及近缘种群进行遗 传多样性分析，为谷子功能基因分析、克隆及分子标记辅助育种等工作奠定基础。 本研究的目标是应用微卫星富集文库，开发谷子的s s r 标记：以生物素标记的 ( a c ) 1 5 、( a t ) 1 5 、( a g ) 1 2 、( t g ) 1 2 和( t c ) 1 2 为探针进行杂交，借助磁珠固定筛选出含微卫 星的勋“3 a i 酶切片段，洗脱转入载体后构建了富集相应微卫星的5 个文库；从5 个文 库中共得到2 3 3 3 个克隆，使用相应载体克隆位点两端的m 1 3 + ，_ 及s p 6 l t 7 l 引物和相 应的微卫星筛选探针序列( a c ) l o 、卸l ”( a g ) 1 0 、( t g ) l o 和( t c ) l o 分别为混合引物对这 些克隆进行p c r 二次筛选，鉴定出含s s r 序列的克隆。将经过二次筛选获得的1 1 2 2 个 阳性克隆进行测序，获得了1 1 0 6 个序列，其中含微卫星的克隆有8 4 6 个( 7 6 5 ) ；排 除冗余序列后得到4 1 7 个非同源性克隆，共含有4 6 3 个微卫星位点；对微卫星种类进行 分析，其中( a c t g ) n 、( c g t ) n 和( a g t c ) n 、( q v c t ) n 比例最高( n 5 ) ，共占9 8 9 ， 并发现( a t t a ) n 和四核苷酸重复( g 後c a ) n 、( a c g c ) n 、( g c g t ) n 以及六核苷酸重复 ( a 1 a c a c ) n 。选取从谷子富集文库中得到的合适微卫星位点设计引物，共设计3 9 3 对； 此外利用谷子y a c 文库中1 6 个微卫星序列( 美国提供) 设计出2 5 对引物，共设计谷 子s s r 引物4 1 8 对。 用豫谷1 号检测这4 1 8 对s s r 引物的扩增稳定性，发现部分引物无扩增或不稳定， 优化反应条件后全部稳定扩增出目的条带；随机选取3 9 对非特异条带少的引物，用1 2 i 个谷子和8 个青狗尾草品种检测它们的多态性信息，结果在筛选出的2 2 对( 5 6 4 ) 多 态性引物中共检测到1 8 5 个等位基因，每对引物平均为8 4 1 个；其中引物g t d z 7 7 3 和a g d z 2 3 4 1 检测到的等位基因最多( 1 6 个) ，最少的a g d z 2 3 1 0 中检测到2 个，其 p i c 值分别为0 9 l 、0 。9 0 和o 3 7 ，2 2 对引物平均p i c 值为o 7 6 ，显示出较高的位点变异 频率，说明所开发的s s r 标记适用于谷子和狗尾草属遗传学研究。 利用多态性s s r 引物在2 8 份狗尾草属不同种和品种间扩增，统计各标记的等位基 因频率分布，2 2 个多态性引物总共检测到2 2 1 个等位基因，不同品种间变异范围为2 2 2 个，平均1 0 0 5 个；平均p i c 值为0 7 8 ，变异范围在0 3 7 0 9 3 之间。进一步研究发现， s s r 标记在谷子、青狗尾草及其它种狗尾草中的多样性表现不同，三者中发现的等位基 因数分别为1 3 8 、1 7 5 和1 9 4 个，分别占总数( 2 2 1 ) 的6 2 4 、7 9 2 和8 7 8 ，而且青 狗尾草品种平均p i c 值( o 7 3 ) 高于谷子品种( 0 7 2 ) ，证明谷子间的遗传差异低于野生 青狗尾草；同时数据对比表明，青狗尾草与谷子间的亲缘关系比其它种狗尾草近。根据 这2 2 个标江卉谷子及近缘野生种的变异数据，计算各基因型的遗传相似系数，根据s m 系数进行聚类分析，采用u p c 、f a 法构建狗尾草属遗传进化关系图，结果表明：所用 2 2 个s s r 标记即可将2 8 份材料清晰分为2 大类群( 青狗尾草类群和金色狗尾草类群) ， 3 个小组( 谷子、青狗尾草、金色狗尾草) ，而且谷子与青狗尾草之间的遗传距离小于与 其它种的遗传距离，进一步证实了谷子起源于青狗尾草的观点；谷子相对紧密的聚在一 起，且其间的遗传差异明显小于狗尾草，证明谷子在进化中发生遗传变异的几率相对狗 尾草较低，表明其基因组的相对保守性；而通过对2 大类群间差异的分析得出，金色狗 尾草类群可能早于谷子和狗尾草分化之前就已经与它们分开，从一定程度上揭示了狗尾 草属基因组进化情况。 本研究首次构建了谷子的微卫星富集文库，开发出了首批4 1 8 对谷子的s s r 标记特 异引物，并对其中的2 2 对引物的扩增特性进行了分析，建立了这些标记的多态性遗传 参数，并检验了这些标记在狗尾草属谷子近缘种的跨物种实用性，为谷子功能基因组研 究、分子标记辅助育种，以及狗尾草属和近缘种的遗传进化研究提供了标记数据基础。 i v 关键词：谷子微卫星富集文库磁珠s s r 多态性遗传多样性 a b s t r a c t f o x t a i lm i l l e t ，& 砌，切f 勉船口b e a i l v ，、 r 嬲a l s ok n o w n 嬲n a l i a l l ，g e m 趾，c h i n e s e ， h u i l g a r i a no rs i b e r i a l lm i l l e t ，w i l i c h 、a so n eo ft l ：屺m o s ta 1 1 c i e n tc e r e a lc r o p sm a d e 班a t c o n t 曲u t i o nt oh 眦1 1 a nc i v i l i z a t i o nd e v e l o p m e n t 锄ds t i l lg r o 、) l mi nn o n l l e mc h i 媳h l d i aa 1 1 d o 世l e rd e v e l o p i n gc o u n t r i e s 嬲s t 印l ef o o d f o x t a i lm i l l e tw a l sc h a r a c t e r i z e d 、v i t l li t sd r o u g h t t o l e r a i l c e ，s a l tt o l e r 觚c e ，i n f e r t i l es o i lt o l e m c e ，h i g m ye 伍c i e n c yo fw a t e ru t i l i z a t i o i l ， r e l a t i v e l yb a l a n c e dn e c e s s a 巧n u t r i t i o nf o rh u m a nc o n s 眦吼a t i o na n do t l l e rs p e c i a l 仃a 砥b u t b e c a l l s eo fb e i n gak i n do fr e g i o n a l 一i l n p o r t a n tc r o p ，b i o t e c l l i l o l o g yg e n e t i cd 觚a b a s eo ff o x t a i l i i l i l l e t 、v 嬲a ：h i l o s tv a c a n te s p e c i a i l yi nm ef i e l d so fs p e c i f i cm o l e c u l a rm a r k e r s ，a 1 1 dt h i s l l i n d e r e dt l l eg e n o m i cp r o 黟e s sa n da d v 锄c e db r e e d i n go ft h ec r o p m i c r o s a t e l l i t e so rs i i i l p l es e q u e n c e 鼻印e a t ( s s r ) ，s h o r ts t r e t c h e so ft a 芏l d e m l y ，r e p e a t e d1 t o6n u c l e o t i d es e q u e n c e s ，w e r eu b i q u i t o u s l yp r e s e n ti ne u l 【a r y o t i cg e n o m e s m i c r o s a t e l l i t e s m a r k e r sw e r ec o d o m i n a n t l yi n h e r i t e d ，m g l l l yp o l y m o 印h i ca n dc o n s e e di nc o r r e l a t i v e 砒1 d i m e r r e l a t e ds p e c i e s i th a db e e n 、 ，i d e l ya p p l i e df o rs t u d i n go fp o p u l a t i o ns t m c t l 鹏，g e n e t i c l i n k a g em a p ，q t ll o c a t i o 坞 a s s i s t a n tb r e e d i n gs e l e c t i o n h o 、e v e r ，l ea c t u a lu s eo f m i c r o s a t e l l i t e sm 矗k e r sf o ra 1 1 a l y s i so ff o x t a i lm i l l e th a db e e nv e r ) rs c a r c e ，b e c a u s eo ft h el a c k o fs s rp r i m e rs e q u e n c e s n m s ，m e r ew a sa j lu 唱e n c yt od e v e l o pt h es u i t a b l es s rm a 出e r s f b mt h eg e n o m eo ff o x t a i lm i l l e t ，s oa st 6c o l l s t r u c tg e n e t i cl i n k a g em 印a 1 1 dt o a n a l y z e g e n e t i cd i v e r s i t ) ，o f 幻，缸s p e c i e s ，w h i c hs h o u l d1 a yaf o u n d a t i o nf o r 缸l c t i 6 n a lg e l l o m i 6 so f f o x t a i lm i l l e t 1 1 1 eo b j e c t i v e so f “sw o r kw e r et od e v e l o ps s rm a r k e r so ff o x t a i li i l i l l e tu s i n gl i b r a r i e s e 耐c h e dr e s p e c t i v l e l yw i mm i c r o s a t e l l i t e sb yb i o t i n y l a t e d ( a c ) 1 5 ，( a t ) 1 5 ，( a g ) 1 2 ，( t g ) 1 2a n d ( t c ) 1 2o l i g o p r o b e sc r o s s h y b r i d i z a t i o no f 勋“3 m d i g e s t e df r a g r l l e n t so fy ，u g u lg e n o i i l i c d n a ，晰m 让l ea s s i s 伽1 c eo f 瓶m 锣b e 觚e e nb i o t i n y l a t e do l i g o p r o b e sa n d 啦p t a v i d i n m a g i l e s p h e r eb e a d s t a t a lo f2 3 3 3c l o n e s 、e r eo b t a i n e d 舶mt h ef i v el i b r a r i e sc o n s t m c t e d t 1 1 e n ，a 1 1c l o n e sw e r es e c o n d l ys c r e e n e df o rs s rc o n t a i n n i n g b yd o u b l eb a c t e r i a jp c r 谢m ( a c ) l o ，( a d l 5 ，( a g ) l o ，( t g ) l oa i l d ( t c ) l oo l i g o p r o b e sa sp r i r n e ra n dt h e i rc u 盯e n tv e c t o r p r i m e r s a tl a s t ，110 6c l o n e s 舶m112 2p o s i t i v eo n e s 硪e rs c r e e n 吨w e r es e q u e n c e da n d8 4 6 ( 7 6 5 ，8 4 6 1 1 0 6 ) s s rc o 慨n i n g + s e q u e n c e sw e r e6 b “n e d a r e ra l i g i l i i l e n tc o m i ) a r i s o no f v s e q u e n c e s 丘0 mm es a m el i b r a r y ，417n o n - r e d u n d e n c ys e q u e n c e s 、v e r ei d e n t i f i e dw m c h c o n t a i n e d4 6 3s s rl o c i r e p e a tt y p e 锄a l y s i so ft h o s em i c r o s a t e l l i t e si d e n t i f i e ds h o w e dt h a t t h ep r o p o n i o no f ( a c t g ) n ，( c g t ) n ，( a g 厂r c ) na n d ( g a c t ) n ( n 5 ) r e p e a t so c c u r r e d r e l a t i v e l yk g h ，a p p r o x i m a t e l y9 8 9 i na 1 1 t h e r ee x i s t e do t h e rm o t i f si n c l u d i n gd i n u c l e o t i d e r e p e a t s( a i t a ) n ， t e t r a n u c l e o t i d e s r 印e a t s( g a c a ) n ，( a c g c ) n ，( g c g t ) n a n d h e x a n u c l e o t i d e sr e p e a t s ( a = i a c a c ) n ( n 芝5 ) a c c o r d i n gt ot h ep r i l l c i p l eo fs s rp r i m e r s d e s i g n i n g ，3 9 3s s rp r i m e rp a i r sw e r ed e s i g n e do u to ft l l e4 6 3m i c r o s a t e l l i t ec o n t a i n i n g n o n r e d u n d e n c ys e q u e n c e s i n a d d i t i o n ，2 5p r i m e rp a i r s 、v e r ed e s i g n e d b y16y a c s s r - c o n t a i n i n gs e q u e n c e sf r o mg e o 唱i au n i v e r s i t y u s a ，a n dt h et o t a ln u m b e ro ff o x t a i l m i l l e ts s r p r i m e rp a i r sw a s 4 18 a l lt h e4l8s s rp m l e rp a i r sw e r et e s t e di ny u g u lf o rt h e i r 锄p l i f i c a t i o ns t a b i l 咄a n di t r e v e a l e dt h a tm o s to ft h ep r i m e rp a i r sc o u l dg i v es t a b l e 锄p l i f i c a t i o nf o rt h ep u t a t i v e f r a g m e n ti n t h e i rf i r s tt t h o s em a tf a i l e di nt h e i rf i r s t n - ) rc o u l da l 驷g i v ep r o p e r a m p l i f i c a t i o nw i t ho p t i m i z e dp c rr e a c t i o nc o n d i t i o n s 3 9 s s r s 、i t hr e l a t i v e l yf e w e r n o n p e c u l i a rb a n d sw e r es e l e c t e d t 0 t e s tt h e i rp o l y m o 印m cb e h a v i o rw i t h2 0 & 纽，妇 g e n o t y p e si n c l u d i n gl2f o x t a i lm i i l e ta c c e s s i o n sa r l d8g r e e nm i l l e t 岱v 护触3 ) a c c e s s i o n s 2 2 p a i r so fp r i m e r s ，o u to ft h e3 9t e s t e d ，s h o w e dg o o da m p l i f i c a t i o na n dp o l y m o 啦i s mi nt h e s a m p l e st e s t e d ，a i l dl8 5a l l e l e sw e r ei d e n t i f i e dt o t a i l y ，8 4 1p e rp r i m e rp a i r ，w i t ha na v e f a g e p o l y m o 印h i ci n f o n n a t i o nc o n t e n t ( p i c ) v a l u eo fo 7 6 o ft h e2 2p o l y m o 印蛐cs s r s ，p r i m e r p a i r sg t d z 7 7 3a l l da g d z 2 3 - 4 li d e n t i 6 e dt 1 m a ) 【i m u m l6a l l e l e sa n da g d z 2 3 - 1 0g a v e t h em i n i m 吼2a l l e l e s ，w h o s ep i cv a l u ew e r eo 9l ，o 9 0a n d o 3 7 ，r e s p e c t i v e l y i te 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c ss o f t 、a r eo fn t s y s p c 一2 1 1 a sar e s u l t ，i ts h o 、e dt h a ta l lt l l e2 8a c c e s s i o n s 、e r e c l e 耐yd i s t i n g u i s h e d 趾dd i v i d e di n t o 僦og r o u p s g 胁u p 防溉sa n d 研o u pg 肠“t h e 附廊g r o u p 妣l u d e d1 2s 妇，f c 口，8 & 1 ，护f 如，1 弦6 p 毗1 w 州c f 砌幻，l & 彪锨妒妇a n d 1 & g “p p 瑚肠，z 妣口，a n dt h eg 肠“c 口铲o u pi n c l u d e d1sg 肠“，1 p 甜v 如阳，1 p “m 妇 a i l dl 朋砌咖肠a n dt h a t12 & f 细，纪aa c c e s s i o n sc l u s t e r e d t o g e t l l e rc l o s e l y ，s h o 、) ，i n gm e r e l a t i v e l yn e a r e rr e l a t i o n s k pa n df e w e rg e n e t i cv a r i a t i o n f o x t a i lm i l l e tw a ss h o w nc l o s e l y r e l a t e d 谢t l l 铲e e ni i l i l l e ts u p p o r t i n gt h ev i e 、p o i n tt h a t 泐疗h a do r i g i m t e d 舶msv 护翮s w 1 1 e r e a st h e4a c c e s s i o n sf a l l i n gi m ot h eg ：肠“c 口g r o u ps h o 、v e dd i s t a n tg e n e t i cb a c k g r o u n d w 汕t h es p e c i e s 伽i n t ot l l e 所f 如g r o u p ，w k c hs h o w e ds o m ee v i d e n c ef o rt h ea n a l y s i so f 砌，肠s p e c i e se v o l u t i o n t 1 1 i sp 印e rr 印o r t e dt 1 1 ef i r s ts e to f418 p a i r ss s rp r i m e ! r sd e v e l o p m e mu s i n g m i c r o s a t e l l i t ee 血c h e d1 i b r a r i e s ，a n d2 2p r i m e rp a i r sw e r ea 1 1 a l y z e di 1 1d e t a i lf o rt h e i r a m p l i f i c a t i o na n dp o l y m o i p m cb e h a v i o r t h o s ep r i m e r sd e s i g n e d 、张r eu s e di nap r i m a d r s t u d yf o rg e n e t i cd i v e r s i 够a n de v o l u t i o na j l a l y s i so f & 姗肠s p e c i e s ，s o 嬲t 0t e s tm e i ru t i l i t ) ， i i lr e l 砷e dr e s e a r c h a ut l ：屺r e s u l t sd e m o n s 缸a t e d 恤tt h o s es s r p f i m e r sc o u l db eu s e df o r g e r l o i l l i cs t u d yo ff o x t a j lm i l l e ta n di t sr e l a t e ds p e c i e s k e yw o r d s ：f o x t a i l 砌l e t 脚姗衙妇，记口( l ) b e a l l v 】 i n i c r o s a t e l l i t e s m a g l l e t i c b e a d ss s r p o l ”n o 印l l i s mg e n e t i cd i v e r s i t y v 缩略词表 a r ca 嘶l a m i d e ( 丙烯酰胺) a m pa m p i c i l l i n ( 氨苄青霉素) b i s b i s - a c r i l a m i d e ( 甲叉双丙烯酰胺) b p b a s ep a i r ( 碱基对) b 印hb l u eb m m p h e n o lb l u e ( 溴酚蓝) c m c e n t i m o 玛a n ( 厘摩1 c m = 1 交换值) c t a b十六烷基三甲基溴化铵 d m f d i m e n l y lf o m 锄i d e ( 二甲基甲酰胺) d n a d e o x y 曲。肌c l e i ca c i d ( 脱氧核糖核酸) d n t p d e o x y n u c l e o s i d et 邱h o s p h a t e ( 脱氧核苷三磷酸) e b e “d i 啪b r o m i d e ( 溴化乙锭) e d t a e t h y l e n ed i 锄i n ct e t r a a c e t i ca c i d ( 乙二胺四乙酸) e p e p p e n d o r f t u b e ( 离心管) i p t g i s o p o r o p y l “o - p d t h i o g a l a c t o s i d e ( 异丙基一d d 硫代半乳糖苷) l b l u r i a - b e r t a n im e d i u m ( l u r i a b e r t a 皿i 培养基) m b sm e r n b r 锄eb i n d 证gs o l u t i o n ( 膜结合液) m w sm e m b 黜ew a s i l i n gs o l u t i o n ( 洗膜液) o d 6 0 0 o p t i c a ld e l l s 时a t6 0 0 衄( 6 0 0 衄处光密度) p c r ， p o l y m e r a s ec h a i nr e 犯t i o n ( 聚合酶链式反应) p i c p o l y m o 印h i ci i 面r n l a t i o nc o n t e n t ( 多态性信息含量) p v p 聚乙烯吡咯烷酮 r n a s e ar f b o n c l e a s e a ( 核糖核酸酶a ，r n a 酶a ) s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( 十二烷基硫酸钠) s s r s i l p l es e q u e n c er e p e a t ( 简单序列重复) i a et r i s a c e t a t ee l e c 们p h o r e s i sb u 能r ( 瞰s 乙酸电泳缓冲液) 7 i 铀 砌口聊z 螂叼“口如螂d n ap o l y m e r a s e ( 栖热水生茵d n a 聚合酶) t b e t r i s 厂b o r a t ee l e c t r o p h o r e s i sb u 成r ( 强s 硼酸电泳缓冲液) t e t r i s e d t ab u f f e r ( t r i s e d l a 缓冲液) t e m e d n ，n ，n ，n t e 仃锄e 衄le m y l e n ed i 锄i n e ( n ，n ，n ，n - 四甲基乙二铵) n n 。m e l t i n gt e m p e r a 乜始( 解链温度) 7 m s t r i h y d r o x y m e m y la 皿n o m e t h a l l e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 x - g a l 5 - b r o m o 4 一c l l l o r o - 3 i i l c l o l y l d g a l a c t o s i d e ( 5 溴一4 氟一3 吲哚- d 一半乳糖苷) 1 0 6 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文宦锌殳备版开趁名皇如徽遵彦皇稍、曲 ， 是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者( 签名) ：耋球 伽g 年士月协日 指导教师确认( 签名) ： ，年厂月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在年解密后适用本授权书) 论文作者( 签名) ：巷姝 伽g 年上月功日 艚教州签孙驯 力牌厂月枷孕嚷专 引言 谷子是我国北方地区重要的粮食作物之一，由于其抗旱耐瘠、稳产丰产、营养丰富 等特点，成为具有区位优势和比较优势的杂粮作物，在我国北方旱作农业和食品消费多 元化需求方面占有重要地位。虽然谷子生物技术研究取得了一些进展，但同水稻、玉米 和小麦等主要农作物相比差距极大，由于缺乏稳定可靠的特异标记系统( 如s s r 等) 、 基因组文库( 如b a c 、y a c 等) 及c d n a 文库等分子遗传学研究的材料和技术平台， 严重制约了分子标记辅助育种、功能基因分析和克隆等多方面工作的开展，至今谷子的 基因组序列基本空白，其重要农艺性状的q t l 定位的报道极少【l ，2 】。 目前己有大量研究显示s s r 标记在自然群体中揭示的变异频率是最高的，因为s s r 在基因组中具有最高的位点杂合度，并且具共显性遗传，重复性好等特点，因而是谷子 遗传多样性、指纹图谱、比较图谱等研究的有效标记。但迄今为止，s s r 在谷子中应用 极少，现有可供筛选的标记亦很少，引物的数量制约着s s r 标记在构建谷子遗传连锁 图谱研究中的应用，因此开发谷子s s r 标记显得迫切而重要。 本研究利用各种性状表现优良且已大面积推广的豫谷1 号来构建微卫星富集文库， 在谷子中提出一种有效的微卫星筛选分离策略，适用于其大规模微卫星标记开发，以此 为谷子s s r 遗传连锁图谱的构建提供标记材料，为谷子核心种质与功能基因组研究搭 建技术平台，对谷子种质创新、重要农艺性状的q t l 分析和分子遗传学研究具有重要 现实意义。此外，本研究还利用多态性微卫星引物在部分谷子和狗尾草种间进行扩增， 研究把谷子s s r 引物用于狗尾草属其他种的可行性，为进一步研究狗尾草属遗传多样 性及进化关系打下基础。 随着对谷子研究的深入，基因组测序量会不断增加，从中挖掘微卫星序列进而开发 微卫星标记将会成为一种有效的手段。本研究利用美国谷子y a c 文库序列开发s s r 标 记，增加了谷子s s r 标记开发的途径，丰富了谷子s s r 标记数据库。 1 文献综述 1 1 分子标记概述 1 1 1 遗传标记的概念 遗传标记是指切受基因控制的，能够稳定遗传的，且能代表个体或群体的遗传特 性，并可被用作遗传分析的物质。遗传标记经历了形态学标记、细胞学标记、生化标记 和分子标记4 个阶段，其宗旨都在于揭示遗传物质的多样性。前三种标记都是以基因表 达的结果( 表现型) 为基础，是对基因的间接反映；而分子标记则是建立在d n a 序列 多态性基础之上，它是对基因的直接反映( g d b 网站h 婶：w 州g d b o r g 上对各种遗传 标记进行了总结) 。 广义的分子标记( m o l e c u l a rm 破e r ) 是指可遗传的并可检测的d n a 序列或蛋白质： 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白、同工酶和等位酶；狭义的分子标记概念仅指d n a 标记， 而这个界定现在被广泛采纳。 与前三者相比，分子标记具有许多明显优点：( 1 ) 直接以d n a 形式表现，不受 环境、季节及基因表达与否限制，不受个体发育阶段影响，而且无组织及器官特异性； ( 2 ) 从理论上讲，分子标记的数量几乎是无限的，在基因组中具有极大丰富性； ( 3 ) 多态性水平高，无需专门创造特殊的遗传材料；( 4 ) 许多分子标记表现为共显性，从 而能够鉴别基因的杂合与纯合；( 5 ) 对生物体通常没有不良影响，表现为“中性”， 不影响目标性状的表达【3 吲。 1 1 2 分子标记的种类及其原理特点 分子标记现己广泛应用于遗传育种、群体结构与遗传多样性研究、指纹图谱绘制、 性别鉴定、遗传图谱构建和数量性状基因q t l 定位等诸多方面。一般依据d n a 多态性 的检测手段或所用的分子生物学技术可将其分为以下三代四类： 1 1 2 1第一代分子标记技术：以分子杂交为核心r f l p i 江l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n 西hp o l y m o 印h i s m ，限制性片段长度多态性) 是发现 最早的分子标记技术，它的多态性来源于不同基因型之间限制性片段长度的差异，这种 差异是由限制性酶切位点的碱基突变所引起的，如点突变( 酶切位点消除或新位点的产 生) 和d n a 重组( 插入、缺失、重排等造成酶切位点间的长度改变) 等。该标记技术 基本原理是：利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同生物体的d n a 分子，然后用 2 经标记的特异d n a 探针与之进行杂交，通过放射自显影( 通常为3 2 p ) 或非同位素( 如 地高辛) 显示技术来揭示d n a 的多态性，如果某个限制性位点发生了突变，对应限制 性内切酶将不再识别该位点而不进行酶切反应，此时产生片段的大小由邻近的限制性酶 切位点决定。r f l p 技术主要包括5 个步骤，即：d n a 提取、酶切、电泳、d n a 转膜、 杂交显示及结果分析【9 1 。 i 江l p 标记具有共显性的特点，能够提供单个位点上的较完整的资料。虽然其结果 稳定可靠，重复性较好；但对d n a 的需要量大( 5 1 0 嵋) 、技术流程复杂，此外对d n a 多态性检出的灵敏度较差，探针的种属特异性较强，费用昂贵且费时费力，仅可在有条 件的实验室进行，故而限制了其应用的范围。 1 1 2 2 第二代分子标记技术：基于p c r 或与限制性酶切技术结合 随着技术的进步，部分研究者发展出基于p c r 或p c r 与限制性酶切技术相结合的 第二代分子标记技术，简化了操作，降低了试验的成本及危险性。 1 s s r 作为以p c r 为基础的、近1 0 多年来发展起来的第二代分子遗传标记的代表s s r ( s i i n p l es e q u e n c er e p e a t ，简单重复序列) 【1 0 1 ，又称为微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ) 【l l 】，长度 一般在2 0 0 b p 以下，广泛分布于基因组中的不同位置。 ( 1 ) s s r 的结构及分类 s s r 是指在生物基因组中存在的一个或几个碱基的短串联重复序列( s h o r tt a n d