（微生物学专业论文）酵母酒精发酵相关基因克隆表达条件优化研究.pdf

浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：l 司l 数签字日期：a 艿年夕月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解澎婆太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅本人授权浙垫太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 学位论文作者签名：阀杰芨 签字日期：枷艿年f 月f 争日 导师签名： 签字日期哆秒哆年多月：乙日 浙江大学硕士学位论文 酵母酒精发酵相关基因克隆表达条件优化研究 摘要 本文从二倍体酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 工业菌株出发，用 m c c l a r y 培养基，经2 5 c 、7 天的产孢培养，对z j d 3 系列二倍体菌株进行单倍 体分离，获得单倍体7 1 株。对筛选所得单倍体菌株进行交配型鉴定和发酵性能 测定，得交配型a 的菌株3 0 株，交配型0 【的菌株1 8 株。从中筛选获得发酵性 能较优的单倍体菌株4 株，其中a 型1 株，a 型3 株，分别为：z s 1 l ( a ，z j d 3 7 ) 、 z s - 5 ( a ，z j d 3 3 ) 、z s - 1 3 ( a ，z j d 3 - 7 ) 、z s 一1 4 ( a ，z j d 3 - 1 1 ) ，乙醇产率均比各自 的亲株提高3 以上 后运用基因工程从变异链球菌( s t r e p t o c o c c u sm u t a n s ) 中克隆编码3 磷酸 甘油醛脱氢酶的g a p n 基因，并在质粒p u g 3 6 和p d b 2 0 基础上构建重组质粒 p u g 3 6 一g a p n 和p d b 2 0 - g a p n 。敲除选育所得的高产酿酒酵母单倍体z s - l l ( a ， z j d 3 7 ) 菌株的u r a 3 基因，并将上述重组质粒分别引入u r a 3 敲除的该菌株中， 验证得到阳性转化子。经对工程菌的酒精发酵测定，结果表明：引入g a p n 基 因的工程菌株z s dp u g 3 6 一g a p n ，与亲株z s - 1 1 比较，乙醇产率提高2 9 本研究通过传统产孢及基因工程相结合的方法，实现了构建高产乙醇酿酒 酵母工业菌株的目标。同时，就g a p n 基因引入z s - l l 菌株后，对其胞内代谢流 的可能影响进行了初步分析探讨 关键词：酿酒酵母，产孢，g a p n 基因，基因敲除，酒精发酵，高产乙醇 浙江大学硕士学位论文 c l o n i n ga n de x p r e s s i o nc o n d i t i o no p t i m i z a t i o no fg e n er e l a t e dt o s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ee t h a n o lf e r m e n t a t i o n a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , w ef i r s t l yo b t a i n e dh a p l o i ds a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a es t r a i n s 、析t l l h i g h e re t h a n o lp r o d u c t i o nt h r o u g hs p o r es e p a r a t i o n c e r e v i s i a ed i p l o i dz j d 3s e r i e s w e r ec u l t u r e do nm c c l a r ym e d i u ma t2 5 cf o r7d a y s ，a n d71h a p l o i dw e r er e s u l t e d t h r o u g hm a t i n gt y p et e s t i f i c a t i o n ，3 0m a t aa n d18 删s t r a i n si nt h e71h a p l o i d w e r ed e t e r m i n e d w 胁f e r m e n t a t i o nc a p a c i t ya n a l y s i s ，w es c r e e n e do n em a t aa n d t h r e e 刎7 hs t r a i n s ：z s - ll ( a ，z j d 3 7 ) ，峦- 5 ( a ，z j d 3 3 ) ，z s 一1 3 ( a ，z j d 3 - 7 ) a n d z s 一14 ( a ，z j d 3 - 11 ) ，r e s p e c t i v e l y t h ee t h a n o lp r o d u c t i o nw a s3 h i g h e rt h a nt h e i r o w n p a r e n t a ls t r a i n s g a p ng e n e ，e n c o d i n gg l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，w a sc l o n e d f r o ms t r e p t o c o c c u sm u t a n s r e c o m b i n a n tp l a s m i d sp u g 3 6 - g a p na n dp d b 2 0 - g a p n w e r er e c o n s t r u c t e do nt h eb a s i so fp u g 3 6a n dp d b 2 0 a f t e rd e l e t i n gu r a 3g e n ei n z s - 11 z j d 3 7 ) ，w et r a n s f o r m e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d si n t ot h eu r a 3 一l a c k i n g s t r a i n s ，w h i c hr e s u l t e di na ne n g i n e e r e d h a p l o i d & c e r e v i s i a e s t r a i nz s d p u g 3 6 g a p n ，谢t l l2 9 h i g h e re t h a n o lp r o d u c t i o nt h a ni t sp a r e n t a ls t r a i nz s - 11 t h r o u g ht r a d i t i o n a ls p o r u l a t i o na n dg e n ee n g i n e e r i n g ，w ec o n s t r u c t e d & c e r e v i s i a ei n d u s t r i a ls t r a i n s 谢t l lh i g h e re t h a n o ly i e l d m e a n w h i l e ，w ep r i m a r i l y d i s c u s s e dt h ee f f e c to fh e t e r o l o g o u sg a p n g e n et oi n t e r c e l l u l a rm e t a b o l i cf l u x e s k e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s h 2 e ；s p o r u l a t i o n ；g a p ng e n e ；g e n ed e l e t i o n ； e t h a n o lf e r m e n t a t i o n ；h i g he t h a n o lp r o d u c t i o n 2 浙江大学硕士学位论文 前言 2 l 世纪面临的一个重大挑战是如何满足不断增长的能源需求。近年来能源 短缺的形势日益严峻，从油价暴涨可见一斑：2 0 0 6 年国际原油价格达到了8 0 美元一桶；2 0 0 8 年5 月最新数据显示，油价已经超过1 2 0 美元一桶【l 】更值得 一提的是，未来的能源供给必须以降低温室气体的排放为前提。为了缓解不可 避免的世界能源供应短缺问题，人们已经把兴趣投到了可替代可持续绿色能源 的开发利用上【2 巧1 而生物质能量燃料乙醇的生产与应用是其中代表之一，倍受 全球关注 所谓燃料乙醇是指可以作为燃料使用的无水乙醇，它具有和矿物质相似的 燃烧性能。由于燃料乙醇的生产原料为玉米、薯干、糖蜜及植物秸秆等可再生 的生物能源，所以使用乙醇或乙醇汽油作为部分汽油的替代品，不仅可以节 省石油这种不可再生能源，还可减少污染排放百分之二十以上。如今，燃料乙 醇已经在我国、巴西、美国以及其他一些国家生产应用，而且在未来的2 0 年里 将成为一种主要的可再生生物燃料6 7 1 。目前，酿酒酵母由于其耐高浓度乙醇能 力和高产率，成为工业上应用最广泛的乙醇生产菌株。 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是与人类关系较为密切的一种酵母菌， 这不仅因为传统上它用于酿酒等与食品药品制造有关的工业领域，而且在现代 生命科学研究中用作真核模式生物1 9 9 6 年，酿酒酵母作为第一个完成全基因 组测序的真核生物，使人类对酿酒酵母的了解更深入，为人类更深入地探研真 核生物的遗传信息与生命活动的基本规律奠定了基础，同时也为我们更好地利 用酿酒酵母创造了有利条件 维持细胞内氧化还原平衡是活细胞维持生长和代谢的最基本需求烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸( n a d h ) 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( n a d p h ) 是氧化还 原代谢中的两种重要辅酶，胞内氧化还原状态在很大程度上取决于胞内 n a d h n a d + 和n a d p h n a d p 十浓度比 在酿酒酵母中，氧化还原辅酶参与了3 0 0 多种相关的生理生化反应【引 n a d h 与n a d p h 两种辅酶所起的作用不同，n a d h 主要用于分解代谢，而 n a d p h 主要参与合成代谢 9 1 酿酒酵母中由于缺乏转氢酶，两者的代谢不相偶 浙江大学硕士学位论文 联【1o 1 1 1 而且，氧化还原对n a d h n a d + 和n a d p h n a d p + 不能跨越线粒体内 膜。因此，为了避免这些核苷酸对的失衡，进而导致细胞生长的减缓甚至终止， 还原态的辅酶必须被重新氧化再生 在酿酒酵母生长过程中，蛋白质、核酸、脂类的生物合成以及代谢物的分 泌会导致细胞质中过多n a d h 的积累【1 1 j 3 1 。在有氧条件下，酿酒酵母可以通过 n a d h 脱氢酶以及3 磷酸甘油穿梭系统，将细胞质中n a d h 的氧化与线粒体的 电子传递链相耦合【9 1 4 】。但在厌氧条件下，n a d h 不能通过电子传递链被氧化， n a d + 再生受阻，细胞需通过糖酵解过程中的产物，如磷酸二羟丙酮作为内源电 子受体使n a d + 再生，从而导致甘油等代谢产物的积累。 氧化还原代谢的调控与中心碳和氮代谢紧密相连，因此改变氧化还原平衡 可能促使代谢流产生相应变化。n a d h 依赖型3 磷酸甘油脱氢酶( g p d h ) 的 过量生成导致碳源更多的流向甘油，而乙醇的产量降低，由于碳流重新分布以 及n a d h 含量下降，乙醛和3 羟基2 丁酮的产生也会有所提高1 7 】g d h l ( 编 码n a d p 依赖型谷氨酸脱氢酶) 的失活以及g l n l 和g l t l ( 分别编码谷氨酰 胺合成酶和谷氨酸合成酶) 的过表达改变了原来谷氨酸合成中的辅酶需求，由 于n a d h 生成的减少，降低了甘油产量，而乙醇产量得到提高【1 8 】 在光合真核生物体内，存在两种磷酸化的d 甘油醛3 磷酸脱氢酶 ( g a p d h ) ，即细胞质内糖酵解糖异生途径中的n a d 依赖型g a p d h1 1 9 以及 叶绿体内光合成c a l v i n 循环中的n a d p 依赖型g a p d h 2 0 1 ，它们在碳代谢途径 中起着重要作用两者催化相同的可逆反应：将d 甘油醛3 磷酸( g 3 p ) 转化 为1 ，3 二磷酸甘油酸( 1 ，3 b p g a ) ，同时伴有一分子无机磷酸的掺入，但却由不 同的核内基因( g a p c 和g a p a b ) 编码，且使用的辅助因子也不1 - 司 2 1 , 2 2 1 此外， 在迄今为止研究的植物和微藻中，还存在着第三种定位于细胞质的非磷酸化 n a d p 依赖型d 甘油醛3 磷酸脱氢酶( g 3 p - n a d p 氧化还原酶，o a p d h n ) ， 由核基因g a p n 编码，它将d 甘油醛3 磷酸不可逆地氧化成3 磷酸甘油酸 ( 3 - p g a ) 细胞质中的g a p d h 催化糖酵解途径中的第一步底物磷酸化反应， 所产生的1 ，3 二磷酸甘油酸在3 磷酸甘油酸激酶作用下释放3 磷酸甘油酸和 a t p ；相比而言，g a p d h n 不需要无机磷酸为底物而直接合成3 磷酸甘油酸， 绕过了a t p 再生反应( 如图1 ) 4 浙太学颂学位论文 圉1 耱酵解途径的磷酸化与非磷酸化代谢支路这两条支路分别在含有细菌n a d 依赖型 g a p d h 和植物g a p d h n 的大肠杆菌重组苗w 3 c g 中起作用，呈现7 糖酵解主干途径及 与其他中心或外周途径的联系中被分隔开在w 3 c g 中不完全的反应用虚线箭头显示 t c a ，三羧醺循环；f a ，魔肪酸：a a ，氟基酸。州 f i 9 1 t h ep h o s p h o r y l a t i n g a n dn o u - p h o s p h o r y i a t t h gb r a n c h e so f t h eg l y c o l y s i s ，t h a ts h o u l d b ef u n c t i o n a li nt h er e c o m b i n a n te e o l iw 3 c gc l o n e sc o n t a i n i n g , r e s p e c t i v e l y , e i t h e rt h e b a c t e r i a ln a d - d e p e n d e n tg a p d h so rt h ep l a n tg a p d h n a r tb o x e di nt h i sm e t a b o l i c s c h e m es h o w i n gt h et r u n kg l y c o l y t i cr o u t ea n di t sc o n n e c t i o n sw i t ho t h e rc e n t r a la n d p e r j p b e r a lp a t h w a y s t h er e a c t i o ni nw h i c ht h ew 3 c gs t r a i ni sd e f e c t i v ei ss h o w ni a d a s h e da r p o w s t c a ，t r i c a r b e x y l i ca c i dc y c l e ；f a ，f a t t ya c i d sp o o l ；b a ，a m i n oa c j d sp o o l 本文通过对本实验室保藏的sc e r e v 捃i a e 工业菌株进行诱导产孢，分离到高 产乙醇的单倍体菌株然后借鉴b r o 等人的研究方法，通过构建重组质粒，将 来自变异链球菌( s t r e p t o c o c c u s m u t a r “) 的g a p n 基因引入上述单倍体菌株，试 图通过改变氧化还原平衡来改变代谢流，进一步提高乙醇产量f 2 4 】最终获得乙 醇产量较单倍体亲株提高29 的基因工程苗由此可见，通过传统选育与基因 工程相结合的方法提高酿酒酵母乙醇产量，是行之有效的 ；“照裾o； 浙江大学硕士学位论文 1 菌株及其来源 材料与方法 表1 实验用菌株 t a b l e1s t r a i n sf o re x p e r i m e n t 菌株 来源 变异链球菌s t r e p t o c o c c u sm u t a n si n g b r i t t 浙江大学第一附属医院 大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o bt o p l o本实验室 酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 二倍体 本实验室 工业菌株z j d 3 系列：z j d 3 3 ，z j d 3 - 4 、 z j d 3 7 、z ，d 3 9 、z j d 3 1 l ( a a ) z s - 5 ( m a 免，z j d 3 - 3 系列)本研究产孢获得的单倍体乙醇高产菌株 z s - 1i ( m a t a ，z j d 3 7 系列) z s - 1 3 ( m a t a ，z j d 3 - 7 系列) z s 一1 4 ( m a t a ，z j d 3 11 系列) z s d ( m a t a , u r a 3 厶)本研究昝1 1 敲除u r a 3 基因获得的菌株 z s d p u g 3 6 ( m a t a , u r a 3 2 5 ，p u g 3 6 )z s d 菌株引入空质粒p u g 3 6 ，本研究 z s dp d b 2 0 - g a p n z s d 菌株引入重组质粒p d b 2 0 - g a p n ，本研究 ( m a t a , u r a 3 z ，p u g 3 6 - g a p n ) z s dp u g 3 6 - g a p n z s d 菌株引入重组质粒p u g 3 6 g a p n ，本研究 ( m a t a , u r a 3 2 5 ，p u g 3 6 - g a p n ) 2 培养基 2 1固体斜面完全培养基( y p d ) 【2 5 】 酵母提取物0 1 9 l 蛋白胨0 2 9 l 葡萄糖0 2 9 l 琼脂o 1 5 9 lp h 自然 1 1 5 c 湿热灭菌3 0 m i n ，用于制备斜面和平板 2 2 产孢培养基( m c c l a r y ) 【2 6 j 6 浙江大学硕士学位论文 葡萄糖0 m g l k c l0 0 1 8g i , n a a c0 0 8 2g l 酵母提取物0 0 2 5g l 琼脂0 1 5g l 2 3t y e 培养基 蛋白胨o 1e , l 酵母提取物0 0 5g l , 葡萄糖0 0 5g lk 2 h p 0 41 7 m m 2 4l b 培养基 胰蛋白胨0 1g l , 酵母提取物0 0 5g i , n a c io 1g lp h 7 0 7 2 若需要氨苄抗性，添加1 0 0 1 t g m l 氨苄青霉素 2 5y n b 基本培养基 y n b a a0 0 6 7g l , 葡萄糖0 2g l 琼脂0 1 5 l 1 1 5 0 c 湿热灭菌3 0 m i n ，倒平板。 2 65 氟乳清酸( 5 - f o a ) 选择培养基 a 2 x s d ：y n b a a0 1 3 4g i ,葡萄糖0 4g t ,琼脂o 3g t , ，1 1 5 c 湿 热灭菌3 0 m i n b 5 - f o a0 0 2g l2 4 m g m l 尿嘧啶溶液1 ，低热搅拌约1 h 使固体物 完全溶解，0 2 2 1 m a 滤膜过滤除菌 待2 x s d 灭菌后温度降到6 0 。c 时，将a 、b 混合均匀，趁热倒平板。 2 7y p a d 培养基 酵母提取物o 1g t , 蛋白胨0 2g l 葡萄糖0 2g l 腺嘌呤半硫酸8 0 m g l 2 82 x y p a d 培养基 酵母提取物0 2g l 蛋白胨0 4g t , 葡萄糖o 4g l , 腺嘌呤半硫酸8 0 m g l 2 9 酒母培养基( 一、二级种子培养基) 小麦面粉糖化醪，加糖化酶过夜( 2 0 - , 2 4 h ) 后，醪液用两层纱布过滤，取 滤过液，加水调整其糖度为l o o b x 1 1 5 湿热灭菌3 0 m i n 如暂不使用，应置于2 0 c 冰箱中冷藏，化冻后再灭菌使用。 2 1 0 发酵培养基 2 3 2 6 。b x 的小麦面粉糖化醪，不需要糖化过夜与过滤 加压闷煮l h 后，加糖化酶糖化0 5 h 以上，直接使用 7 浙江大学硕士学位论文 2 1 l 甘油保种培养基 5 0 甘油，分装至甘油管中，6 0 0 p l 管。 1 1 5 c 湿热灭菌3 0 m i n ，用于保种 3 试剂 3 1 2 4 m g m l 尿嘧啶溶液 称取0 2 4 9 尿嘧啶粉剂于1 0 0 m ld d h 2 0 中，低热搅拌溶解，0 2 2 1 m a 滤膜过 滤除菌。 3 2 1 0m o l l 醋酸锂( l i a c ) 溶液 取5 1 9l i a c 定容至5 0 m l ，用稀醋酸调节p h 至7 5 ，室温保存 3 32 0 0 m g m l 的g 4 1 8 溶液 取1 0 0 m gg 4 1 8 加入0 5 m l 超纯无菌水中 3 45 0 p e g ( 3 3 5 0 ) 取5 0 9p e g ( 3 3 5 0 ) 定容至1 0 0 m l ，缓慢加热溶解。 3 5硅精d n a 溶液 溶解2 0 m g 硅精d n a 于1 0 m l 的t e 缓冲液中，在4 c - f ) 罚磁力搅拌器搅 拌4 h ，分装置于2 0 0 c 保存。在使用时用沸水煮沸5 m i n ，迅速转移到冰 水混合物中冷却 3 6t e 缓冲液 1 0m m o l l i r i s - h c l ，1m m o l le d t a ，p h7 4 ( 1 2 1 湿热灭菌1 5 m i n ) 3 71 0 s d s ( 1 2 1 湿热灭菌1 5 m i n ) 3 8 酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 )( 购于上海生工生物工程公司) 3 9 5 u i x lt a qd n a 聚合酶( 购于t a k a r a 生物工程公司) 3 1 02 5 m m o l ld n t p ( 购于t a k a r a 生物工程公司) 3 “合成引物( 购于上海英骏生物技术有限公司) 3 1 2 琼脂糖( 购于上海生工生物工程公司) 3 1 3 2 0 0 0 b p 、4 0 0 0 b pp c rm a r k e r s ( 购于t a k a r a 生物工程公司) 3 1 4d n a 上样缓冲液 8 浙江大学硕士学位论文 0 2 5 澳酚蓝，4 0 蔗糖 3 1 5 5 t b e l 缓冲液【1 6 1 5 4 9t r i s ，2 7 5 9 硼酸，2 0 m l0 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) 3 1 6 1 0 m g m l e b ( 溴化乙啶) 3 1 7 斐林试剂( 廉爱浓法) 【2 7 1 甲液：精确称取分析纯硫酸铜( c u s 0 4 5 h 2 0 ) 6 9 2 7 8 9 ，加水溶解后，稀 释定容至1 0 0 0 m l 。 乙液：称取酒石酸钾钠( k n a c 4 h 4 0 6 4 h 2 0 ) 3 4 6 9 和氢氧化钠( n a o h ) 1 0 0 9 ，加水溶解后，稀释定容至1 0 0 0 m l 。 3 1 8 0 2 标准葡萄糖溶液【2 8 】 取分析纯葡萄糖置1 0 5 1 1 0 干燥1 5 - 2 h ，冷却后，精确称取2 0 0 0 9 ， 溶于水后，稀释定容至1 0 0 0 m l 3 1 9 液化酶2 0 0 0 0 u m l ，华润集团 3 2 0 糖化酶1 0 0 0 0 0 u m l ，华润集团 3 2 1 0 1 n 氢氧化钠【2 8 1 称取4 9 分析纯氢氧化钠( n a o h ) ，溶于少量已煮沸并冷却的蒸馏水中， 弃去下面碳酸钠沉淀物，取上层清液，用上述蒸馏水稀释至1 0 0 0 m l 3 2 l l 次甲基蓝溶液【2 7 】 称取次甲基蓝1 9 加水溶解，稀释至l o o m l 3 2 2 1 酚酞指示剂【2 8 】 称取酚酞1 9 ，溶解于1 0 0 m l9 5 酒精中 4 主要设备与器材 4 1 台式离心机，t g l 1 6 c ，上海安亨科学仪器厂 4 2 烘箱，上海精宏实验设备有限公司 4 3 糖液计，o 1 0 ，1 0 2 0 ，浙江余姚芝林玻璃仪器厂 4 4 酒精计，o 1 0 ，1 0 2 0 ，浙江余姚仪表 4 5 电子天平，m e t t l e rp m 4 6 0 9 浙江大学硕士学位论文 4 6 光学显微镜，x s j 1 4 7 血球计数板，x b k - 2 5 ，上海医用光学仪器厂 4 8 l e n g g u a n g 7 2 2 分光光度计，上海精密科学仪器有限公司 4 9 电热恒温水槽，d k - 8 b ，上海精宏实验设备有限公司 4 1 0 磁力搅拌器，上海申安医疗器械厂 4 1l 落地恒温振荡器，h z 9 311 k 、h z 2 0 1 0 k ，太仓实验仪器厂 4 1 2 电热恒温培养箱，d h p 9 0 8 ，上海一恒科技有限公司 4 1 3 冷冻摇床，h z - 9 3 1 0 k ，太仓实验仪器厂 4 1 4电热压力蒸汽灭菌器，z d x 3 5 b i 型，上海申安医疗器械厂 4 1 5d y y 1 2 型电脑三恒多用电泳仪 4 1 6d y c p 3 1 d 型水平电泳槽 4 1 7 复日科技f r 2 0 0 凝胶成像系统 4 1 8 蛋白质核酸定量测定仪，e p p e n d o r f 公司 4 19p c r 仪( b i o m e t r a at - g r a d i e n tt h e r m o b l o c k ) 4 2 0h p l c 色谱柱( a m i n e xh p x 8 7 h ) l o 浙江大学硕士学位论文 5 实验方法 5 1 单倍体的获得 5 1 1 诱导孢子形成的方法1 2 9 i 将酿酒酵母菌株于y p d 固体斜面上2 8 c 培养4 8 h 活化，活化两次后接入产 孢培养基，2 5 c 培养3 7 d ，在显微镜下观察子囊孢子形成情况，计算一个视野 内酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢率 产孢率( ) - 子囊孢子数量总细胞数 5 1 2 子囊孢子分离和单倍体的获得 菌株活化后接入产孢培养基，3 d 后镜检观察，无菌水( 2 m 1 ) 倾于斜面上， 用接种环刮下菌体，收集菌悬液于7 m l 离心管中，6 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 收集菌 体。0 8 5 生理盐水悬浮洗涤1 2 次，分别加入0 7 m l i r i s h c i ( p h 8 0 ，0 0 1 m ) ； 2 0 0 1 , t l1 0 蜗牛酶( 终浓度为0 0 2 ) ；l o o i _ t l1 0 巯基乙醇( 终浓度为 0 0 1 ) ，1 2 0 r p m ( 缓慢振荡) 培养1 6 h 破子囊壁，使孢子释放利用孢子比营养细胞 耐热特性，采用5 8 c 高温致死处理营养细胞，离心收集孢子，并用 i r i s h c i ( p h 8 0 ，0 0 1 m ) 洗涤两次。取适当稀释倍数，涂布于y p d 平板上，2 8 c 培养 2 3 d 5 1 3 单倍体的鉴定 培养后挑取小菌落，镜检观察是否为单倍体将获得的疑是单倍体再接入 产孢培养基，培养7 d 左右观察子囊形成，以确定是否为真正的单倍体。有子囊 形成者基本确认为二倍体，不形成子囊者基本确认为单倍体把确定为单倍体 的菌株分别保种( y p d 斜面、甘油管) 浙大学坝学位论文 s , 2 单倍体交配型的确定1 3 “”1 单倍体菌株与标准菌株在y p d 斜面活化后，分别接种到装有l o m l y p d 液 体培养基的2 5 0 m l 三角瓶中培养，3 0 ，2 0 0 r p m m i n ，2 4 h 。 取l m l 待测的单倍体菌株菌液和l m l 标准菌株菌液接种到新鲜的l o m l y p d 液体培养基十，3 0 c ，2 0 0 r p m m i n 。 镜检观察哑铃彤细胞产生，混合菌液培养过夜后离心( 3 0 0 r p m ，5 m i n ) ，苗 体沉淀后接种到产孢培养基中培养3 7 d ，镜检观察有无子囊产生，确定交配型， 能与a 型标准菌株杂交并且产孢的菌株变配型为：能与a 型标准菌株杂交并 且产孢的苗株交配型为a 。 5 3 基因敲除方法1 ”1 用一步基因置换法( o n e - s t e pg e n er e p l a c e m e n t ) 敲除u r a 3 基因之后，得到 u r a 3 2 3 突变株。利用一步置换法的理论基础如下： 设计用于敲除u r a 3 的引物： 上游引物：5 - 4 0 b p 靶基因的旁侧序列心o b p 选择性标记基因的序列一3 ； 下游引物：5 - 4 0 b p 靶基因的旁侧序列+ 2 0 b p 选择性标记基因的序列一3 如图1 所示： 帅n 】f | l | h ，t 。e “p ”。 c ”p h l 一 、k d z 目目4 _ - 一 ”乍l _ _ _ _ _ i 斗川。r 5 0 b p e “ 。1 q _ ho ” “”“”卜唑m 一叫，竺“ 日d 啊 图2 一步基因置换法引物设计 f k2 d i g no f p n t t s i a go a e - s t e p g e n er e p l q c e m e a t m e t h o d 把此p c r 产物转化到酵母中，在酵母细胞内发生同琢重组： 浙江大学硕士学位论文 o n e - s _ t e pg e n er e p l a c e r r t e n l 5 e l e o t a b l em a k e rg o n e 澎缀蕊戮浔豳鞠鞠翰翻鞠磁翟麓鞠鞠蕊鞠蕊隧落隧戮鬻缀 图3 一步基因置换法 f i g 3o n e - s t e pg e n er e p l a c e m e n tm e t h o d p c r 产物正确插入到靶基因上后，染色体上靶基因被相应的选择性标记基 因所取代。提取转化子的基因组d n a ，做p c r 验证可以选择正确的目的转化 子。 5 4d n a 分子操作1 3 3 i 5 4 1p c r 扩增反应 以g a p n 基因的扩增为例。 ( 1 ) 从所要扩增基因的5 和3 旁侧序列中各选取一段d n a 序列，设计引物， 如：g a p n u ：5 一g g a c c c g a p d t c a t g a c a a a a c a a n 气t a a 一3 ： g a p n - d ： 5 一t c a a g c c c g t c g a c t t a t t a t t t g a t a t c 3 ( 2 ) 把2 0 0 1 t lp c r 管置于冰上，按以下顺序分别加入各试剂2 0 p l 或4 0 t l 反 应体系： d d h 2 0 1o x b u f f e r d n t p ( 2 5 m m ) g a p n - u ( 2 0 t m ) g a p n d ( 2 0 - t m ) r t a qp o l y m e r a s e ( 5 u “l ) d n a 模板 1 5 3 “l 2 此 0 5i x l 0 5 “l 0 5 “l 0 2 “l 1 “l 总反应体系 2 0 1 工l 1 3 浙江大学硕士学位论文 ( 3 ) 在p c r 热循环仪上建立标准的扩增反应程序新体系的p c r 需要对退火 温度进行梯度设置，进而优化扩增反应条件 5 4 2 琼脂糖凝胶电泳法检测d n a 制胶：称取一定量的琼脂糖，用l x t a e 缓冲液加热溶解，使其浓度为0 7 ， 待冷却至约6 0 时，混匀后倒入制胶板中，插入点样梳，室温下静置3 0 - 4 5 m i n ， 使凝胶充分固化 点样：拔出点样梳将胶移至装有1 t a e 缓冲液的电泳槽中，先选一孔加入 3 1 x ll a d d e r 作为参考；把混有l o a d i n gb u f f e r 的样品逐一加入点样孔，点样量视 d n a 浓度而定 琼脂糖凝胶电泳：1 1 0 v 恒压下电泳约2 0 3 0 m i n 染色：将琼脂糖凝胶放入加有e b 的0 5 x t b e 缓冲液中，浸泡1 5 2 0 m i n 观察：用凝胶成像仪观察和分析形成的d n a 区带，并保存有价值的图片 5 4 3d n a 片段的回收与纯化 ( 1 ) 在紫外灯下切下含有目的d n a 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸进凝胶表面液体 并切碎。计算凝胶重量( 提前记录1 5 m l 离心管重量) ，该重量作为一个凝胶 体积( 如1 0 0 m g = 1 0 0 p l 体积) ( 2 ) 加入3 个凝胶体积的b u f f e r d e a ，混合均匀后于7 5 。c 加热( 低熔点琼脂 糖凝胶于4 0 c 加热) ，间断混合( 每2 - 3 m i n ) ，直至凝胶块完全熔化( 约6 - 8 r a i n ) ( 3 ) 加0 5 个b u f f e r d e a 体积的b u f f e r d e b ，混合均匀；当分离的d n a 片段 小于4 0 0 b p 时，加入1 个凝胶体积的异丙醇。 ( 4 ) 吸取( 3 ) 中的混合液，转移到d n a 制备管( 置于2 m l 离心管) 中，1 2 0 0 0 x g 离心l m i n 弃滤液 ( 5 ) 将制备管置回离心管，加0 s m lb u f f e rw 1 ，1 2 0 0 0 x g 离心3 0 s ，弃滤液 ( 6 ) 将制备管置回离心管，加0 7 m lb u f f e rw 1 ，1 2 0 0 0 x g 离心3 0 s ，弃滤液。 ( 7 ) 以( 6 ) 中同样方法再用0 7 m lb u f f e rw 2 洗涤一次，1 2 0 0 0 x g 离心i m i n ( 8 ) 将制备管置于2 m l 离心管中，1 2 0 0 0 x g 离心1 r a i n ( 9 ) 将制备管置于洁净的1 5 m l 离心管中，在d n a 制备膜正中央加2 5 3 0 “l 1 4 浙江大学硕士学位论文 水或e l u e n t ，室温静置l m i n 1 2 0 0 0 x g 离心l m i n 洗脱d n a 5 4 4d n a 的酶切反应 以本研究中g a p n , i 嗣e c o r i 和s a i l 两种限制性酶进行双酶切为例 混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中： d d h 2 0 1 0 x b u 腩r d n a e c o r i ( 1 0 u 斗l ) s a l i ( 1 0 u i ，t l ) 1 6 6 - x 皿 2g l x 此( 视浓度而定) 0 7 儿 0 7 此 总反应体系 2 0 9 l 3 7 c 酶切过夜，之后电泳检测结果。 5 4 5d n a 连接反应 ( 1 ) 限制性内切酶的失活( 参考酶说明书) 。 ( 2 ) 建立连接体系：待插入基因的量与载体的量，视连接片段的大小和d n a 浓度而定 d d h 2 0 目的基因片段 载体d n a 1 0 x t 4 连接酶缓冲液 t 4 连接酶( 3 u “l ) 1 6 6 - x 止 2 皿 x 此 o 7 止 o 7 此 总反应体系 2 0 1 x l ( 3 ) 以上反应体系，置于4 ( 参考t 4 连接酶的说明书) 反应过夜即可 浙江大学硕士学位论文 5 5 转化方法 5 5 1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 5 5 1 1 大肠杆菌感受态细胞的制备 ( 1 ) 于3 7 c 培养2 4 h 左右的新鲜l b 平板上挑取一个单茵落，接到含有5 m l l b 培养液的摇瓶中，于3 7 ( 22 5 0 r p m 振荡培养过夜。 ( 2 ) 将2 m l 过夜培养的细胞加入到装有2 0 0 m ll b 培养液的l l 三角瓶中， 于3 7 c 振荡培养至o d 6 0 0 值介于o 5 1 之间( 约需2 。3 h ) 。 ( 3 ) 在无菌条件下将细胞培养物转移到一个预冷的2 5 0 m l 无菌离心管中， 在冰上放置2 0 m i n ，使培养物冷却至0 c ( 4 ) 于4 c ，4 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，弃上清，倒置离心管1 m i n 以使残留的 培养液流尽 ( 5 ) 用1 0 0 m l 预冷的0 1 m o l lc a c l 2 重悬细胞，放置冰上至少1 h 。 ( 6 ) 4 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，回收细胞，倒置离心管l m i n 以使残留的培养液 流尽 ( 7 ) 用1 0 m l 预冷的0 1 m o l lc a c l 2 重悬细胞。制备好的感受态细胞可立即 用于转化。 5 5 1 2 大肠杆菌感受态细胞的转化 ( 1 ) 在装有5 0 1 上l 感受态细胞t o p l 0 的1 s m l 无菌离心管中加入d n a 样品 ( 体积s 1 0 “l ，d n a _ 5 0 n g ) ，将管轻弹混匀后在冰上放置3 0 m i n ( 2 ) 将离心管放到预热到4 2 c 的恒温水浴上，放置9 0 s ，不要摇动 ( 3 ) 快速将离心管转移到冰浴中冷却1 - 2 m i n ( 4 ) 向离心管中加入i ml 预热至3 7 。c 的l b 培养液，在3 7 c 摇床上振荡培 养培养4 5 m i n ( 转速不要超过2 0 0 r p m ) ( 5 ) 用离心机以3 0 0 0 r p m 离心2 0 s ，弃去大部分清液，细胞沉淀用剩余清 液5 0 1 0 0 i 工l 悬浮，涂在含有氨苄青霉素的l b 平板上 ( 6 ) 倒置培养皿，于3 7 c 培养过夜 浙江大学硕士学位论文 5 5 2 重组质粒的酵母转化瞰l ( 1 ) 挑取酵母单菌落到5 m ly p a d 液体培养基中，3 0 c ，2 0 0 r p m 培养过夜 1 2 1 6 h ，至o d 6 0 0 约为l x l 0 6 个细胞； ( 2 ) 加1 2 5 x 1 0 8 个细胞( 约吸l m l ) 到2 5 m l 预暖的2 x y p a d 中，至细胞数 达5 x 1 0 6 个m l ，同样3 0 c ，2 0 0 r p m 培养。直到细胞数达2 x 1 07 + m e ，大约 培养4 h 。 ( 3 ) 取一管硅精d n a 变性，煮沸5 m i n ，迅速置于冰水混合物中，制成单链 d n a ( 4 ) 取适量预培养物在室温下4 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，收集细胞，用无菌水洗涤 离心两次，弃上清。 ( 5 ) 用l m l 超纯水重悬，吸1 0 0 p 1 ( 约1 0 8 个细胞) 。 ( 6 ) 转移至1 5 m l 离心管中，1 3 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃上清，待转化 ( 7 ) 每管加入以下配方： p e g 3 3 5 0 ( 5 0 ，w v ) l i a e ( 1 0 m ) 单链d n a ( 2 m g m l ) 质粒或d n a 片段( 加水) 2 4 0 1 上l 3 6 1 d 5 0 m 3 4 1 x l 总体积 3 6 0 1 d 混匀后加入每一管待转化酵母中，搅拌重悬酵母，要作对照 ( 8 ) 在4 2 c 热激3 0 m i n ，在1 3 0