基因诊断与基因治疗.ppt

生物化学暨分子生物学教研室关亚群,基因诊断与基因治疗,GenediagnosisandGeneTherapy,第一节基因诊断,基因诊断以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。基因诊断方法主要用于诊断下列两种类型疾病1.内源基因的变异基因结构的异常(点突变、插入、缺失、重排、异位)基因表达的异常2.外源基因的插入,基因突变的诊断,点突变的诊断诊断已知的点突变（PCR/ASO）诊断未知的突变PCR/SSCP/测序DNA芯片技术少数核苷酸缺失或插入的诊断大片段丢失或插入的诊断(PCR/多重PCR)基因重排（染色体易位）的诊断基因扩增的诊断,多态性连锁分析,DNA多态性标记限制性片段长度多态性（RFLP）DNA酶切Southern杂交分析DNAPCR酶切电泳分析短串联重复序列（shorttandomrepeat,STR）单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）,基因表达异常的诊断,mRNA的相对定量分析斑点杂交或狭缝杂交RT-PCRmRNA的绝对定量分析RT-PCR/竞争性PCRmRNA长度分析Northern杂交/RT-PCR产物电泳,外源DNA检测,核酸分子杂交PCR技术,基因诊断的原理和方法,一、基因诊断的原理DNA诊断-检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。RNA诊断-对表达产物mRNA质和量表达的分析。,基因诊断的原理和方法,二、基因诊断中常用的分子生物学方法（一）核酸分子杂交（二）PCR（三）SSCP（PCR-SSCP）（四）DNA分子多态性分析（五）限制性核酸内切酶酶切图谱分析（六）DNA序列测定（七）DNA芯片技术,基因诊断中常用的分子生物学方法,（三）PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）单链构象多态性（Singlestrandconformationpolymorphism，SSCP）是诊断未知点突变常用的检测方法之一。单链DNA在中性溶液中可形成一定的空间构象，这种空间构象与其碱基顺序相关。因此当单链DNA中碱基发生变异时，如碱基替换，它的空间构象也发生一定变化。这种单链DNA因碱基变异而引起的空间构象变化的现象称为单链构象多态性。,基因诊断中常用的分子生物学方法,（三）PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率不仅与链长有关，还与单链DNA的空间构象有关，因此碱基变异引起的构象变化也可改变单链DNA的电泳迁移率。利用这种原理可将野生型DNA和突变型DNA区分开来。PCR-SSCP的基本方法,制备DNA样品PCRPCR产物热变性、快速冰浴非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示结果,基因诊断中常用的分子生物学方法,（四）DNA分子多态性分析由于DNA分子突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失，可使人类基因组DNA产生大量的中性突变。基因组的核酸分子碱基排列顺序在同种生物的不同个体之间或等位基因之间存在差异的现象称为基因多态性。DNA多态性可分为位点多态性和重复序列多态性。,基因诊断中常用的分子生物学方法,（四）DNA分子多态性分析1.限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析DNA分子中某些碱基的变异（即位点多态性）可使某种限制性核酸内切酶的酶切位点消失或出现新的酶切位点，因此用同一种限制性核酸内切酶消化不同个体的DNA分子时，会产生各不相同的限制性片段类型。这种现象称为限制性片段长度多态性。,基因诊断中常用的分子生物学方法,限制酶酶切位点的改变造成的RFLP可分为两种情况：限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致酶切位点消失或获得，称为位点多态性。这种多态性只有两个等位片断，即多态位点的有或无。限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重组，限制酶识别序列不发生变化，但它在基因组中的位置发生了变化。这种多态性可以有两个或两个以上的等位片断。,基因诊断中常用的分子生物学方法,RFLP分析法限制酶酶切图谱直接分析法RFLP间接分析法（1）限制酶酶切图谱直接分析法限制酶酶切Southern印迹杂交。PCR限制酶酶切,基因诊断中常用的分子生物学方法,基因诊断中常用的分子生物学方法,基因诊断中常用的分子生物学方法,1.1kb,1.3kb,0.2kb,SS,AS,F,AA,RFLP法检测HbS,SS:HbS纯合子,AS:HbS杂合子,AA:正常,F:被检胎儿,(放射性自显影图谱),基因诊断中常用的分子生物学方法,（2）RFLP间接分析法RFLP连锁分析法甲型血友病疾病种类：X染色体连锁性遗传病缺陷基因：凝血因子基因主要临床表现：出血性疾病,基因诊断中常用的分子生物学方法,（四）DNA分子多态性分析2.单核苷酸多态性分析（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1。SNP分为两种形式：基因编码区的SNP，称为cSNP遍布于基因组内的大量单碱基变异3.DNA重复序列多态性分析,三、基因诊断的应用,1.遗传性疾病：直接诊断-点突变；间接诊断-多态性连锁分析2.感染性疾病（1）病毒性感染；（2）细菌性感染；（3）寄生虫；（4）其他。针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交应用PCR技术扩增病原体基因保守序列核酸杂交技术与PCR技术联合应用,三、基因诊断的应用,3.恶性肿瘤：（1）检测肿瘤相关基因；癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因ras癌基因的检测：ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码子突变（PCR/ASO；PCR-SSCP）p53的检测：p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130290（PCR-SSCP；PCR-测序；PCR-RFLP）（2）检测肿瘤相关病毒的基因；鼻咽癌-EB，宫颈癌-HPV（3）检测肿瘤标志物基因或mRNA。肝癌-甲胎蛋白（AFP）结肠癌-癌胚抗原（CEA）,三、基因诊断的应用,4.法医学中的应用：个人认识；亲子鉴定；性别鉴定。（1）DNA指纹分析（DNAfingerprinting）（2）短串联重复多态性分析（shorttandemrepeat，STR）,第二节基因治疗,一、基因治疗的概念基因治疗是指将外源基因或其他遗传物质转移到患者某些细胞内，通过纠正遗传缺陷、表达治疗性基因产物或灭活致病基因,而使相应疾病得以防止、减轻、代偿或纠正的方法。从基因角度：对缺陷的基因进行修复；将正常有功能的基因置换；增补缺陷基因。,从治疗角度：导入基因以改变患者细胞的基因表达。导入基因：（1）缺陷基因相对应的有功能的同源基因；（2）缺陷基因无关的治疗基因。,二、基因治疗研究的主要内容或策略,（一）基因标记1.用基因标记验证两个问题（1）外源基因能否安全地转移到患者体内；（2）从患者体内取出的细胞能否检测到转移基因的存在。2.常用标志基因：新霉素磷酸转移酶（Neo）基因,二、基因治疗研究的主要内容或策略,（二）基因置换或基因矫正1.概念指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入基因置换基因组内的原有缺陷基因。2.基因置换的必要条件（1）对导入的基因及其产物有详尽的了解；（2）外来基因能有效的导入靶细胞；（3）导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留；（4）导入基因能有适度表达；（5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害。,二、基因治疗研究的主要内容或策略,（三）基因添加1.概念通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。2.基因添加的两种类型（1）针对特定的缺陷基因导入其相应正常基因；（2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表达的基因。3.必要条件：同上。（四）基因干预采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因使之不表达。,二、基因治疗研究的主要内容或策略,（五）导入的方式,体外导入（exvivo）体外将基因导入细胞内再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内使这种带外源基因的细胞在体内表达达到治疗或预防的目的,体内导入（invivo）外源基因直接导入体内有关的组织细胞使其进入相应的细胞表达,三、基因治疗的基本程序,1.治疗性基因的选择,2.基因载体的选择,3.靶细胞的选择,4.基因转移,5.外源基因表达的筛选利用在体中的标记基因,6.回输体内,病毒载体非病毒载体,体细胞生殖细胞,间接体内疗法直接体内疗法,三、基因治疗的基本程序,（一）外源基因的选择与制备外源基因目的基因：与致病基因相对应的有功能的正常基因与致病基因无关、有治疗作用的基因标记基因:新霉素磷酸转移酶（Neo）基因外源基因的获得基因克隆人工合成PCR扩增,（二）载体的选择与构建病毒载体：腺病毒（AV)腺相关病毒（AAV)逆转录病毒（RV)单纯疱疹病毒（HSV)痘苗病毒（VV)人免疫缺陷病毒（HIV)非病毒载体：质粒载体,三、基因治疗的基本程序,（二）载体的选择与构建病毒载体构建（1）去除病毒的致病性结构的基因序列如逆转录病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取而代之；（2）保留其基因的调控序列及包装序列等；（3）插入标记基因如NeoR基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。,三、基因治疗的基本程序,VectorDNA,HelperDNA,EngineeringaVirusintoaVector,wildtypevirus,BasedonKayetal2001,structuralproteins,Packaging,Therapeuticgene,Packagingcell,三、基因治疗的基本程序,Y,vector,Vectoruncoating,TherapeuticmRNAandprotein,Episomalvector,Integratedexpressioncassette,Targetcell,GeneTransfer,三、基因治疗的基本程序,(三)靶细胞的选择可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。选择的原则：(1)便于从体内取出和回输；(2)便于在体外培养与增殖；(3)便于基因的高效转移；(4)能够持续表达目的基因。,生殖细胞:禁止体细胞：淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肌肉细胞、肝细胞、成纤维细胞肿瘤细胞等,三、基因治疗的基本程序,(四)基因转移病毒法：主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。非病毒法：物理方法显微注射、电穿孔、微粒轰击及DNA直接注射、基因枪技术等；化学方法磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体融合法等。受体介导的内吞作用,三、基因治疗的基本程序,(五)基因转染细胞的筛选与鉴定抗性筛选方法：重组载体上插入有标记基因NeoR，导入受体细胞后可使其产生对G418（Geneticin）药物的抗性。在加入G418的培养基中进行选择性培养时，转染NeoR基因的细胞能够存活，而未转染的细胞则死亡；将TK基因导入TK-的靶细胞后，只有转染细胞才能在HAT（次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶）培养基中生长。应用标记基因作为探针进行分子杂交法筛选。外源基因表达的鉴定：采用Northern印迹杂交：检测mRNA的表达测定其表达产物即蛋白质的含量等方法。,三、基因治疗的基本程序,(六)回输体内方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织；采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞；或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管。,四、基因治疗的应用与展望,基因治疗的应用遗传病：替补法，导入正常基因病毒性疾病：阻断病毒基因在体内的转录和翻译肿瘤：基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法,遗传病的基因治疗,1.重症联合免疫缺陷综合征（SCID）2.家族性高胆固醇血症（FH）3.囊性纤维性变（CF）4.Gaucher症5.血友病A和B,感染性疾病的基因治疗,引入治疗基因来抑制病原繁殖方法:Anti-senseRibozymeRNA,基因治疗中有待解决的问题,有些导入的