（植物学专业论文）葱莲zephyranthes+candidalindlherb凝集素基因zca的克隆、序列分析、载体构建与转化.pdf

中英文摘要 葱莲( z e p h y r a n t h e sc a 田d i d a ( l i n d l ) h e r b ) 凝集素基因 ( z c 衫的克隆、序列分析、载体构建与转化 学科专业植物学 研究方向植物分子遗传 指导教师谈锋教授 唐克轩教授( 复旦大学) 研究生庞永珍( 9 9 1 8 9 ) 内容摘要 同翅目h o m o p t e r a 害虫( 如蚜虫，飞虱) 是一类危害严重的昆虫，在吸食植 物韧皮部的同时传播许多植物病毒，因此很难用传统的育种方法加以控制。迄今 为止，通过人工喂饲实验已经证明从石蒜科克隆的凝集素基因对蚜虫和飞虱表现 抑制作用，其中雪花莲凝集素( g n a ，o a l a n t h u sn i v a l i sa g g l u t i n i n ) 已在植 物基因工程中广泛应用，并对蚜虫和飞虱等表现出较好的抗性，而懑莲属于石蒜 科，应该具有相似的凝集素基因因而可能在抗刺吸式害虫的基因工程中有良好的 、一1 应用前景。，彳一a 爱q 爿挟验采用c d n a 末端快速扩增( r a c e ，r a p i d a m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s ) 技术，首次从石蒜科葱莲( 又名玉帘，z e p h y r a n t h e sc a n d i d a ( l i n d l ) h e r b ) 的叶片中分离克隆出了一条新的凝集素基因，对该基因进行了序列分析和功能预 测，成功地构建了该基因的植物表达载体，进行了转化研究，得到转基因的烟草 和水稻。为今后研究该基因的功能表达及农作物抗虫基因工程的大田应用奠定了 ， 基础。阻体的实验结果如下： 1 、根据石蒜科( a , 嬲_ r y l l i d a c e a e ) 植物凝集素的保守区段，设计引物，采用 r a c e 技术从葱莲中克隆出一条新的长度为6 4 7b p 的凝集素基因，它包含了完整的 编码序列( 4 7 7 b p ) ，编码个全长1 5 9 个氨基酸的蛋白( 已申请中国专利，公开号： 1 3 2 3 8 8 7 ) 。 2 对该基因所推导出的氨基酸进行了信号肽剪切位点、蛋白质结构域、高级 中英文摘要 结构和专一结合糖基化的分析；葱莲凝集素与雪花莲凝集素在蛋白质水平上的相 似性为6 9 ，核苷酸水平上的相似性为7 6 ，推测此基因具有与g n a 相似的抗性 功能，同时通过分析葱莲凝集素与同属的另一个种韭莲凝集素也有一定的相似性， 为同源的凝集素基因。 3 在葱莲凝集素基因克隆的基础上，构建了植物双元高效表达载体p 2 3 0 1 一z p 1 3 0 5 - z c a ，并成功地导入到农杆菌e h a l 0 5 中。 4 通过带有p 2 3 0 1 一z c , ：2 质粒的农杆菌介导，采用叶盘法转化野生型烟草，经 p c r 及w e s t e r nb l o t 验证已成功地将z 船转入烟草中表达，抗虫实验正在进一步 的进行当中。 5 通过带有p 1 3 0 5 一z c b 质粒的农杆菌介导转化成熟胚诱导的水稻品种鄂宜 1 0 5 ，对1 5 株苗的p c r 检测中有6 株为阳性，另外的苗及进一步的分子检测正在 进行当中。， 关键词：葱莲凝集素；基因克隆；r a c e ；序列分析；载体构建；转化 一 - 。 ， 一 i i m o l e c u l a r c l o n i n g o f z e p h y r a n t h e s c a n d i d a ( l i n d l ) h e r b a g g l u t i n i ng e n e ( z c a ) ，s t r u c t u r ea n a l y s i s ，v e c t o r s c o n s t r u c t i o na n dt r a n s f o r m a t i o n m a j o r ：b o t a n y s p e c i a l i t y ：p l a n t m o l e c n l a r g e n e t k t u t o r ：p r o f t a nf e n g p r o f t a n gk e x u a n ( f u d a nu n i v e r s i t y ) p o s t g r a t u a t e ：p a n gy o n g z h e n ( 9 9 1 8 9 ) a b s t r a c t h o m o p t e r a ，t h ev e r yi m p o r t a n tg r o u p so f i n s e c t st h a ts u c kt h ep h l o e mo f p l a n t s ( i n c l u d i n ga p h i d sa n dp l a n t h o p p e r s ) h a v ep r o v e d d i f f i c u l tt oc o n t r o l b y c o n v e n t i o n a l p l a n tb r e e d i n g ，a m a t t e rm a d ew o r s e b y t h e i ri m p o r t a n c ea sv e c t o r so f p l a n tv i r u s e s ，u p t on o w , m o s to f t h el e e t i ng e n e st h a ts h o w m o r eo rl e s si n h i b i t i o nt os a p - s u c k i n gi n s e c t s i n c l u d i n ga p h i d sa n dp l a n t h o p p e rb y a m f i c i a ld i e ta s s a y sw e r ec l o n e df r o ms p e c i e so f a m a r y l l i d a c e a e ，a m o n g w h i c ht h el e c t i n ( o n a ) f r o ms n o w d r o p ( g a l a n t h u sn i v a l i s ) i s t h em o s tt o x i ca n dh a sb e e nm o s tw i d e l yu s e di np l a n ti n s e c t - r e s i s t a n tb r e e d i n g t r a n s g e n i cp l a n t se x p r e s s i n gg n a s h o w e ds i g n i f i c a n ti n s e c t i c i d a la c t i v i t yt o w a r d s h o m o p t e r a i n s e c t ss u c ha sa p h i d sa n db r o w np l a n t h o p p e ri nb i o a s s a ya n df e e d i n gt e s t s a s z e p h y r a n t h e s c a n d i d a b e l o n g s t o a m a r y h i d a c e a e ，i t i s s p e c u l a t e d t h a t z e p h y r a n t h e sc a n d i d al e c t i na l s oh a ss i m i l a ri n h i b i t o r ye f f e c to ns a p - s u c k i n gi n s e c t s l i k eo t h e rl e e t i n sf r o ma m a r y l l i d a c e a ea n dm a yp l a yar o l ei nc o n t r o l l i n gs a p - s u c k i n g i n s e c t sb yg e n e t i ce n g i n e e r i n g i nt h i sp a p e ral e c t i ng e n ew a s f i r s t l yi s o l a t e df r o m l e a v e so f z e p h y r a n t h e sc a n d i d a b yu s e i n gr a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n a e n d s ( p a c e ) t e c h n i q u e c h a r a c t e r i z a t i o n ， f u n c t i o n a la n da d v a n c e ds t r u c t u r ep r e d i c t i o n , c o n s t r u c t i o no f p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r a n dt r a n s f o r m a t i o no ft h i sn o v e lg e n ew e r es t u d i e d t h ea n a l y z i n gr e s u l t so ft h eg e n e 3 中英文摘要 a r ev e r yh e l p f u lt of u n c t i o n a le x p r e s s i o na n dp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni ni n s e c tr e s i s t a n c e b r e e d i n g t h em a j o re x p e r i m e n t r e s u l t sf r o mt h i sw o r kw e r e 嬲f o l l o w s ： 1 p r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nc o n s e r v e d s e q u e n c e so f o t h e r l e c t i ng e n e sf r o m a m a r y l l i d a c e a e an o v e ll e e t i ng e n ew a si s o l a t e df r o mz e p h y r a t h e sc a n d i d a t h e f u l l l e n g t he d n ao fz e p h y r a t h e sc a n d i d al e c ：d n w a s6 4 7 b p ，c o n t a i n i n ga l l o p e n r e a d i n gf l a m e ( 4 7 7 b p ) e n c o d i n gap e p t i d eo f1 5 9a m i n oa c i d s ( c h i n ap a t e n tp u b l i cn o 1 3 2 3 8 8 7 ) 2 t h e s i g n a lc l e a v a g e s i t e p r e d i c t i o n , a d v a n c e ds t r u c t u r ep r e d i c t i o n ，b l o c k s a n a l y s i sa n ds u g a r - b i n d i n gs i t e sw e r ea n a l y z e d i t sd e d u c e dp r o t e i n ( z c a ) s h o w e d6 9 s i m i l a r i t yt og n a ，a n di t se d n as e q u e n c e s h o w e d7 6 * 0 s i m i l a r i t yt og n a ，w h i c h i n f e r r e dt h a ti tp o s s e s s e ds i m i l a rf u n c t i o nt og n a a tt h es a m e t i m e ，e d n as e q u e n c e a n dp r o t e i no fz c aw e r ec a m p a r e dw i t ha n o t h e rs p e c i e sb e l o n g i n gt ot h es a m e g e n u s i ts h o w e dt h a tz c a w a s v e r ys i m i l a rt oz g a 3 b a s e do nt h ec l o n i n go fz e p h y r a t h e sc a n d i d aa g g l u t i n i ng e n e ，t w o p l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p 2 3 0 1 - z c a a n d p 1 3 0 5 - z c a w a s s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e da n d i n t r o d u c e di n t oa g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s e h a l 0 5 4 t h ep l a s m i d p 2 3 0 1 - z c ac a r r y i n g 删删衄m d 酬i n l ow i l d 劬p et o b a c c o v i a a g r o b a c r i u m - m e d i a e db yu s i n gl e a v ed i s kp c r a n dw e s t e r nb l o tc o n f i r m e dt h a t t r a n s g e n i e t o b a c c ow e r e o b t a i n e d ，f u r t h e rb i o a s s a yi su n d e r g o i n g 5 m a t u r ee m b r y od e r i v e dc a l l u se l i t ef r o m j a p o n i c ar i c ec v e y l1 0 5w e r eu s e d f o r t r a n s f o r m a t i o n ，v i aa g r o b a c r i u e - m e d i a f m gp 1 3 0 5 - z e a c a r r y i n g z c aw e r e t r a n s f e r r e di n t or i c e ，p r e l i m i n a r yr e s u l t s b yp c r s h o w e d6 t r a n s g e n i cr i c ep l a n t s o u to f15t h a th a db e e nt e s t e dw e r e o b t a i n e d ，f 砥d l l e rs t u d yi su n d e r g o i n g k e yw o r d s ：z e p h y r a n t h e sc a n d i d a ( l i n d l ) h e r b ；g e n ec l o n i n g ；r a c e ；s e q u e n c e a n a l y s i s ；v e c t o rc o n s t r u c t i o n ；t r a n s f o r m a t i o n 4 p 4 8 1 3 3 3 致谢 请允许我籍此毕业之际向所有关心和帮助我的师长和朋友表示真诚 的谢意。 首先我非常感谢我的导师谈锋教授和复旦文学峙唐克轩教授给了我 到复旦大学遗传研究所国家遗传工程重点实验室学习的机会雨位导师在 我硕士学习阶段给予我学业上精心曲柏导没有他们的关心，始导与督促 就没有我今天的一切j 他们的学识，为人和敬业精神将永连激励着我为祖 国的繁荣富强而努力工作，他们的高尚的品格对科学的热诚将是我箨生 学习的榜样? 与此同时我也要把我曲谢意迭给雨位导师的夫人冉老师和 孙老师，感谢她们在生活上给予我的关怀和温暖，特别感谢孙老师对我工 作的信任以及朋友般的帮助。 其次，我非幸感谢在复旦土学学习期间拍导我实玲的姚剑虹老师，左 开井、赵凌侠、孔维文博士后，感谢实玲室中与我朝夕相处的各位老师和 同学，感谢他们给予我的手足般的情谊以文学习，生活和工作中给我的关 心和帮助，他们是? 豫建平老师、廖志华，陈敏，赵秀云，赵忌鹏胡全 安，许铁峰，亲友荣、王劲，陈中海、张红宇，责炯叠4 扬、开国银、吴 为升、龚铲，赵小噼、素雪梅等。感谢在曲师的我的老师，同学师兄师 姐师弟师姝我的学生对我的帮助和关心他们是? 汤绍虎老师、孙敏老 师，吴能表老师，郭琳萍、陈先升，张昊l 、陈永文，龙云、邓君、梅虎， 铯顺幕、胡凯，何囊张家晖、黄希贵，董保卫，谭谤反生科院九九的 会体学生。 再次诚挚感谢西师的张采牛，李健老师全家上下擞4 - z 三年多末对 我生话上亲人簟的照顾和学业上的鼓励，诚挚感谢丰t t ，趄玉芳夫妇对 我的丢诚曲帮助和关心。 最后，我也想蒋此机会感谢我的家是我的父母兄杖、昧姝，他们 的期待始终是戒工作的鞭策，他们的支持永逶都是畿蠢j 扦肆的动力特 别感谢我曲先生中国安，是他一直在鼓尉和支持着我没有他曲无私奉献， 我也很幸竞成我的实j ，在我这篇拙作中也浸透詹他的付出和纤小。 庞乐珍 二o o 二年五月 缩写词 箜兰塑 墓塞全整 a a p a b r i d g e da n c h o r p r i m e r a p a d a p t e r p r i m e a pa l k a l i n ep h o s p h a t a s e a s a c e t o s y r i n g o n e 黼融 a b r i d g e du n i v e r s a la m p l i f i c a t i o n p r i m e r 6 b a 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e b p b a s e p a i r b t b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s c a l 讧vc a u l i f l o w e rm o s a i c v i r u s e d n ac o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d d h 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d e p c d i e t h y lp y r o e a r b o n a t e d n t pd e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e ( a m i xo f d a t p d c t p d g t p d t t p ) e be t h i d i u mb r o m i d e e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t m a c e t i ca c i d g n a g a l a n t h u sn i v a l i s a g g l u t i n i n g u sb - g l u c u r o n i d a s e g s pg e n e - s p e c i f i e p r i m e r i p t g i s o p r o p y l t h i o - b - d - g a l a e t o s i d e m r n a m e s s e n g e r r n a n a a a - n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d n p t i in e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e - 1 1 0 d o p t i c a ld e n s i t y p c r p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l p f u p r o o f - r e a d i n gp o l y m e r a s e r t - p c rr e v e r s et r a n s l a t i o np o l y r n e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a c e r a p i da m p l i f i c a t i o n o f e d n ae n d s r p m r m i n s d ss o d i u md o d e e y ls u l f a t e t a q t h e r m u s a q u a t i c u sd n a ( p o l y m e r a s e ) t d tt e r m i n al ( d e o x y n u e l e o t i d y l ) t r a n s f e r a s e t e t r i s e d t ab u f f e r t - d n a t r a n s f e r - d n a n t u m o r - i n d u c i n g t r i s t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e x g a l 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 一3 i n d o l y l - 1 3 d - g a l a c t o s i d e z c a z e p h y r a n t h e sc a n d i d a ( l i n d l ) h e r b a g g l u t i n i n 兰! 坠兰虫幽箜g 磐型塑2 翌! 趔坠垒望垫 葱莲凝集素基因的克隆、序列分析、载体构建与转化 前言 1 植物抗虫基因工程研究进展 在植物抗虫研究过程中，曾经是十分有效的抗虫手段，如常规抗虫育种、化 学农药、生物杀虫剂及生态防治等方法，渐渐出现了一些弊端( 王关林等，1 9 9 8 ) 。 例如，通过常规的育种手段来获得抗虫作物品种的育种时间长、亲本资源缺乏； 化学农药的大量使用已经引起了一系列的副作用：害虫的天敌也被杀灭、生态平 衡被破坏、自然界中的残毒增加、进而造成了环境污染；生物杀虫剂成本高、不 稳定、抗虫谱窄；生态防治在复杂多变的生态因素作用下。也仅能在一定程度上 控制害虫不成灾。以上这些方法的不足促使人们不断寻找新的抗虫途径。 基因工程技术的发展为培育抗虫作物品种提供了新的手段，利用基因工程手 段培育抗虫作物新品种有以下优点( 易自力等，1 9 9 9 ) ：( 1 ) 它不仅能够利用存在 于植物中的抗虫基因，还可以利用某些动物、微生物中的抗性基因以及人工合成 的抗虫基因，因此基因资源非常丰富；( 2 ) 培育出的抗虫新品种可控制在任何时 期内、任何部位上发生的虫害，并且只杀死摄食害虫，对其它生物无毒害；( 3 ) 抗虫物质只存在于植物体内，不易被环境因素所破坏，同时也不易对环境造成污 染：( 4 ) 育种周期短、成本低、目的性强。 目前，在植物抗虫基因工程中，已被广泛应用的抗虫基因有四类：第一类是 来自细菌苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因( b a c i l l u s 拍耐叫e n s i s i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i ng e n e ) ，简称b t 毒蛋白基因( d u l m a g eh t ，1 9 8 1 ) ； 第二类为植物外源凝集素( 1 e c t i n ) 基因( c h d s p e e l sm j 等，1 9 9 1 ) ；第三类为植 物蛋白酶抑制剂基因( p r o t e i n a s ei n h i b i t o rg e n e ) ( r y a n c a ，1 9 8 9 和1 9 9 0 ) ； 第四类是淀粉酶抑制剂基因( h u e s i n g j e 等，1 9 9 1 ) ，还有其它如几丁质酶基因、 核糖体失活蛋白基因、色氨酸脱羧酶基因、昆虫病毒、蜕皮激素抑制剂基因等( 王 罡等，1 9 9 8 ) 。 1 1b t 毒蛋白基因 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h “r 如e n m s ) ，是一种革兰氏阳性土壤芽孢杆 菌，能产生多种有杀虫活性的毒素，如：蛋白质晶体毒素、耐热性外毒素、卵磷 脂酶c 等，现在被广泛应用于基因工程的是蛋白质晶体毒素即蛋白质晶体毒蛋白。 苏云金杆菌在生长后期于芽孢形成的同时能形成一种菱形或其它形状的蛋白质结 葱莲凝集素基因的克隆、序列分析、载体构建与转化 晶体伴胞晶体，对昆虫主要是鳞翅日类昆虫具有很高的毒性。完整的晶体并 不具毒性，伴孢晶体随着昆虫的摄食进入到昆虫的消化道，并释放出分子量为 2 7 1 4 0 k d 的杀虫结晶蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n ，简写i c p ) ，i c p 通常 以原毒素的形式存在，在昆虫幼虫的中肠道中，借助于蛋白酶的水解，原毒素转 型为毒性的多肽分子，毒性被活化，活化了的毒素可以与敏感昆虫中肠道上皮细 胞表面的特异受体相互作用，诱导细胞膜产生一些孔道，扰乱细胞的渗透平衡， 并引起细胞肿胀甚至裂解。伴随着上述过程昆虫将停止进食，从而达到杀虫的目 的( h i m e n om ，1 9 8 7 ) 。 s c h n e p f 等于1 9 8 1 年首次将苏云金杆菌k u r s t a k i 肋一的b t 毒蛋白基因克隆， 转化大肠杆菌发现表达的晶体蛋白对烟草夜蛾幼虫具有很高的毒杀作用( s c h n e p f he 等，1 9 8 5 ) 。从此b t 毒蛋白基因家族在不断地发展和扩大，目前已有二十多种 b t 毒蛋白基因被分离和克隆。1 9 8 7 年6 b ，比利时植物遗传系统公司v e a c k 首次获 得了转b t 毒蛋白基因的抗鳞翅目昆虫的烟草，并发现转基因烟草中只保留5 编码 毒性核心区域、3 端缺失了的b t 毒蛋白基因具有与全长基因相同的抗虫活性 ( v a e c k 等，1 9 8 7 ) ；在此之后，b t 毒蛋白基因又先后被转入了棉花、玉米、水 稻等作物，获得了其它植物包括向日葵、菠菜、杨树等的转基因植株( 郭三堆， 1 9 9 5 ) ，并表现出对鳞翅目类或鞘翅目类害虫的抗性。目前，国内外利用不同修饰、 改造、部分及全合成的b t 毒蛋白基因和不同的转化方法获得二十多种转基因抗虫 植物，尤其是转基因的烟草、棉花已进入商品化生产( 俞志华等，2 0 0 0 ) 。但由 于b t 毒蛋白的抗虫谱窄，昆虫易对它产生抗性，这在一定程度上限制了b t 毒蛋白 基因在农业上的应用。 1 2 蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r ，p i ) 基因 蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h a b i t o r ，p i ) 是广泛存在于植物各种组织及 器官中的一类天然抗虫蛋白，在大多数植物的种子和块茎中其含量可高达总蛋白 的1 一1 0 。p i 杀虫的机理在于：它们能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作 用，形成酶一抑制复合物( e i ) ，从而阻断或削弱蛋白酶对外源蛋白质的水解作用， 导致蛋白质不能被正常消化。同时，e i 复合物能刺激消化酶的过量分泌，通过神 经系统的反馈，使昆虫发生厌食反应，最终造成昆虫的非正常发育或死亡( n e w e l l c a 等，1 9 8 5 ) 。 目前，在植物中发现有三种p i ，它们是丝氨酸p i 、巯基p i 和金属p i ，并已 葱莲凝集素基因的克隆、序列分析、载体构建与转化 分离出多种蛋白酶抑制剂基因或其c d n a 克隆。其中最引人注目的是豇豆胰蛋白酶 抑制剂基因、马铃薯蛋白酶抑制剂基因和水稻巯基蛋白酶抑制剂基因( 易自力等， 1 9 9 9 ) 。 蛋白酶抑制剂基因有其独特的优越性：首先，从杀虫机理来看，它作用于昆 虫消化酶的活性中心，这是酶的最保守的部位，产生突变的可能性极小，极大地 降低了昆虫产生耐受性的可能性；其次，蛋白酶抑制剂对人畜是无害的，因为人 畜的蛋白消化酶主要存在子肠道中，而蛋白酶抑制剂在胃的酸性条件下被胃蛋白 酶分解；此外，蛋白酶抑制剂基因的抗虫谱比较广泛。这类基因的不足之处在于 昆虫能对蛋白酶抑制剂表现出适应，如昆虫能被诱导合成或昆虫本身具有对蛋白 酶抑制剂不敏感的消化酶；另外，昆虫过量表达现存的消化酶，足以弥补被抑制 的消化酶。因此要达到理想的抗虫效果，其表达量要求远远高于b t 毒蛋白基因的 表达量。 1 3 淀粉酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂( a - - a m y l a s ei n h a b i t o r ，a i ) 是植物界中普遍存在的一类蛋 白质，尤其是在禾谷作物和豆科植物的种子中，其含量更为丰富。它能普遍抑制 哺乳动物及昆虫体内的口一淀粉酶活性，但对植物本身及细菌的a 一淀粉酶不起作 用。其杀虫机理在于它抑制了昆虫消化道内的a 一淀粉酶活性，使食入的淀粉不 能消化水解，从而阻断了昆虫的主要能量来源。而且，a i 和淀粉酶结合成的e i 复合物也刺激昆虫过量分泌消化酶，通过神经系统反馈，产生厌食反应，最终导 致非正常发育或死亡。 小麦和大麦中已有多种a i 基因或c d n a 被克隆。a l t a b e l l a 等把菜豆a i 编码 区和种子特异性表达的蚕豆植物凝集素基因及其调控区融合在一起，插入t i 质粒 中转化烟草，发现a i 在转基因烟草中能够准确表达，并在种子发育过程中积累。 体外分析表明，它能抑制猪胰d 一淀粉酶的活性，对黄粉虫的肠道a 淀粉酶也有 显著的抑制效果。然而，在自然界中，有些昆虫，已知有两种豆象甲虫具有一种 丝氨酸蛋白酶，能酶切a a i 而使其失活，所以a a i 对这两种害虫无作用， 与此同时a i 具有抑制哺乳动物a 一淀粉酶的活性，因此大大地限制了其在粮食作 物基因工程中的应用，故很难评价q a i 在植物抗虫方面的长期意义。( 易自力 等，1 9 9 9 ) 虽然以上基因对鳞翅目、鞘翅目昆虫有针对性的杀虫效果，然而，针对同翅 葱莲凝集素基因的克隆、序列分析、载体构建与转化 目害虫的抗虫基因很少被分离。同翅目害虫靠吸取植物汁液为食，除了直接严重 危害农作物外，还是许多植物病毒的传播媒介。例如：稻飞虱和叶蝉不但对水稻 的生长造成直接的危害，同时还是水稻普通矮缩病、黄萎病、黄矮病的传播媒介： 小麦的主要害虫蚜虫，也是小麦重要病害黄矮病的传播媒介。因此有效地控 制同翅目害虫的侵袭，不但可以减少害虫造成的直接损失，同时对防治作物病害 有重要的意义，而近年不断被克隆转化的凝集素基因则有很好的针对同翅目昆虫 的优势。 2 植物凝集素 2 1 定义 p e u m a n swj 和v a nd a m m e 在1 9 9 5 年提出了植物凝集素的新定义，即含有一 个或多个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域的植物蛋白称为植物凝 集素( p e u m a n swj 等，1 9 9 5 ) 。 2 2 分类 根据分子结构特点，凝集素可以分成部分凝集素( m e r o l e c t t n s ) 、完全凝集 素( h o l o l e c t i n s ) 、嵌合型凝集素( c h i m e r o l e c t i n s ) 和超凝集素( s u p e r l e c t i n ) 四种类型( 高莹等，2 0 0 0 ) 。部分凝集素只含一个糖结合结构域，它们不能沉积复 合糖和凝集细胞。完全凝集素也只由糖结合结构域组成，但包含至少两个完全相 同或非常相似的糖结合结构域，它们可以凝集细胞和沉淀复合糖。绝大多数具凝 集功能的植物凝集素属此类。嵌合凝集素是一类融合蛋白，由一个或多个糖结合 结构域及一个具酶活性或其它生物活性的结构域共同组成。超凝集素与完全凝集 素类似，至少含两个以上的糖结合结构域，而与完全凝集素不同的是，超凝集素 的糖结合结构域不完全相同或相似，它们识别结构不同的糖类。 2 3 分布 凝集素在生物界是普遍存在的，几乎所有的植物中都有一种或多种糖专性 不同的凝集素。在同一个个体上，不同组织和器官中的含量会有很大的差异，一 种特定的凝集素在有些组织或器官中可能含量很丰富，而在另外的些组织或器 官中含量很低甚至缺失，同一物种的同一组织或器官在不同的发育阶段凝集素的 种类和含量可能也不同。因此要分离一种特定的凝集素要选择适当的组织或器官， 并在适当的时间采样，方能保证良好的结果。 葱莲凝集素基因的克隆、序列分析、载体构建与转化 2 4 作用方式 在许多方面，凝集素，尤其是完全凝集素的作用方式和抗体的很相似。例 如，它们都与防御有关，都可以通过非共价键与其它的生物大分子结合；结合方 式是可逆的，都是在水相中通过范德华力与受体基团结合的。因此有人把凝集素 称为植物中的抗体。但是，凝集素与抗体又是显著不同的。抗体是经过抗原诱导 的特异产生的，而且其特异性是在诱导抗体的过程中形成的，其特异性也不局限 于糖，也可能是磷酸基团等修饰成分；各种抗体的结构高度相似，但是各种凝集 素的结构可以有很大的不同。各种凝集素对糖的专一性是不同的，但是一种凝集 素通常只与一种糖或其聚合物结合。目前已经发现的凝集素主要有以下几种糖的 专一性位点，即甘露糖、半乳糖、n 一一乙酰葡萄糖胺、n 一乙酰半乳糖胺、n 一乙酰 神经氨酸等以及由这些单糖或单糖的衍生物构成的寡糖或者多糖。一般说来，凝 集素虽然可以与这些单糖或单糖的衍生物结合，但是与多糖的结合能力更强。 2 5 植物凝集素的防御功能 分子生物学、生物化学、细胞学、生理学以及进化上都有越来越多的证据表 明植物凝集素在植物自我保护上有着举足轻重的作用。众所周知，各种细菌、真 菌和病毒会给植物带来多种疾病、造成作物的减产、园艺的破坏，而植物凝集素 在对付细菌、真菌和病毒方面可谓功不可没! 近些年研究发现：有些凝集素能够 结合到细菌细胞壁的肽聚糖上，从而抑制细菌的生长；有些植物凝集素能够识别 并结合真菌的细胞壁、抑制真菌的生长，体外研究表明有些凝集索还能抑制真菌 孢子的萌发及有些真菌菌丝的生长。生物医学研究发现；有些植物凝集素对人类 及动物反转录病毒( 其中包括艾滋病病毒h i v ) 具有有效的抑制作用。另外，许 多害虫在咬食植物或吸食植物汁液的同时通过口器将多种病毒病传播给植物，而 植物凝集素就可以有效地防止或减少这些昆虫通过这种方式而传播的病毒病( 王 志斌等，1 9 9 8 ；赵寅生，2 0 0 1 ) 。害虫对于植物来说是除微生物以外又一大致命的 危害，而植物凝集素在抗虫性方面也可谓战功赫赫! 这是因为昆虫消化道上布满 了细胞膜糖蛋白，这就成了植物凝集素的无数作用位点，植物凝集素一旦被害 虫摄食，就会在昆虫的消化道中被释放出来，并与肠道围食膜上的糖蛋白相结合， 影响营养物质的正常吸收；同时，还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，促进消化 道内细菌的繁殖，从而起到杀虫的效果。研究表明，大多数的植物凝集素对哺乳 动物的血细胞有一定的毒害，豌豆外源凝集素和雪花莲凝集素等对害虫有很强的 葱莲凝集素基因的克隆、序列分析、载体构建与转化 毒性，而对人的副作用较小或没有。 2 6 几种重要的凝集素 2 6 1 雪花莲凝集素( g s l a n t h u sn i v s l i sa g g l u t i n i n ，g n a ) 基因 雪花莲属于石蒜科( a m a r y l i d a c e a e ) 植物，其外源凝集素( g n a ) 只专一识 别并结合d 一1 ，3 和a l ，6 甘露糖。g n a 存在于雪花莲植物的大多数组织中，也 是首次报道的受植物生长调节的一类凝集索( b a r r ea 等，1 9 9 6 ) 。 1 9 9 5 年，p o w eks 等将g n a 、w g a ( 麦胚凝集素) 、l p o ( 大豆脂肪合成酶) 分 别以0 1 ( w v ) 的浓度人工饲喂成熟的水稻褐飞虱，结果表明，g n a 对褐飞虱的 抗性最有效，饲喂含g n a 的褐飞虱蜜露分泌量比对照减少9 6 。对其三龄幼虫剂量 实验表明，g n a 毒性也最强，浓度范围在0 1 - 0 0 1 ( w v ) 即对害虫发育有显著 抑制作用，没有成虫产生，尽管有一些幼虫在最低浓度下存活到2 5 天( p o w eks 等。1 9 9 5 ) 。1 9 9 6 年，s a u v i o n 等研究了g n a 和其它结合甘露糖的凝集素对桃蚜发育 和生殖的影响，也获得了类似结果( s a u v i o n 等，1 9 9 6 ) 。同年h i l d e r 等将g n a 置于 c a m v 3 5 s 启动子后在烟草中得到g n a 高水平表达，叶盘及整株抗蚜实验均表明转基 因植物对蚜虫的抗性增强，其中校正死亡率为3 3 ，而存活的蚜虫其平均大小也 显著小于对照。蚜虫群体生长率整株实验表明t d ( d o u b l i n g t i m e ) 为2 4 7 天，而对 照t d 为1 6 2 天。s u nxf 等( s u nxf 等，2 0 0 1 ) 报道已获得表现出对褐飞虱抗性 的转占加基因水稻纯系。 2 6 2 豌豆凝集素( p e a - l e c t i n ，p - l e c ) 基因 豌豆外源凝集素( p e a - l e c t i n ，p - l e c ) 基因跟其它许多外源凝集素基因一样， 不含有内含子，其基因也是单拷贝的。它的初始产物是一个2 5 k d 的前体蛋白，长 2 7 5 个氨基酸，该前体被转运到内质网后裂解产生成熟外源凝集素的a 和b 亚基。 前体蛋白从n h 。一末端开始依次是疏水的前导肽、b 亚基和n 亚基。另外，比较a 链的氨基酸序列与编码基因的序列，发现d 链内部还经过了进一步的翻译和修饰， 不同的修饰形成了在豌豆不同组织中存在的同源异型凝集素。昆虫饲喂实验表明， p - l e c 能抑制豇豆象的生长( e w a r d sga 等，1 9 9 1 ) 。g a t e h o u s e 等证明表达p l e c 基因的转基因烟草可以抑制鳞翅目的烟芽夜蛾的生长( g a t e h o u s e 等，1 9 9 2 年) 。 2 6 3 麦胚凝集素( w h e a tg e r ma g g l u t i n i n ，胃g a ) 基因 w g a 代表了来自禾本科植物凝集素家族的基本结构特征，其分子量为3 6 k d ，包 含2 个相同亚基的双体分子，亚基之间通过二硫键相连，对b l ，4 一n 一乙酰氨 6 葱莲凝集素基因的克隆、序列分析、载体构建与转化 基葡萄糖有特异亲和性。现已从小麦胚芽中分离到三种w g a 同工凝集素的e d n a 克隆即w g a i 、i i 和i i i ，用p c r 方法对w g a i i 基因进行修饰，通过基因枪法转化玉 米胚性悬浮系，获得了对欧洲玉米螟有较好抗性的转基因植株( 高燕会等，2 0 0 0 ) 。 p o w e l lks 等人w g a 以0 1 ( w v ) 饲喂稻褐飞虱( n i l a p a v e t al u g e n s ) 昆 虫超过2 4 h ，同对照相比蜜汁滴数显著降低了5 4 ，尽管平均喂w g a 的昆虫分泌 蜜汁体积小于对照，但差异并不显著( p o w e l lks 等，1 9 9 5 ) 。 2 6 4 半夏凝集素( p i n e l l at e r b a t aa g g l u t i n i np t a ) 基因 天南星科属三叶半夏为我国特有的一种多年生草本药用植物，其块茎为多用 途中草药，凝胶过滤法测其分子量为4 4 k d ，由4 个约1 2k d 相同亚基组成，结合甘 露糖，与g n a 相似。p t a 具有凝集细胞和促使细胞分裂的作用。p t a ；基因是一种有重 要价值的抗虫基因。p t a 粗提液对刺吸式同翅目害虫( 如棉蚜等) 有显著致死作用。 另有研究指出p t a 能和生长旺盛的肝癌细胞结合，并使其凝集显示出在治疗肝癌上 的应用前景( 王志斌等，1 9 9 8 ) 。由于p t a 抗虫作用显著，国内已有几个实验室正在 进行p 纽分离及其转化研究工作，以期能尽早应用于抗病虫基因工程，复旦大学遗 传工程国家重点实验室植物遗传工程组已经克隆出其基因家族中的一条凝集素基 因( y a ojh 等，2 0 0 1 ) ，并已经利用农杆菌转化系统将p t a i 或功地转化进双子叶 植物烟草，转p t a 的烟草表达了很高的抗蚜虫的能力，同时已得到转半夏凝集素基 因的水稻植株，抗虫实验正在进一步的进行当中。 3 植物基因分离与克隆的研究进展 基因的克隆就是利用d