（有机化学专业论文）甘油型阳离子类脂的合成及性能研究.pdf

摘要 摘要 论文设计了一类甘油型阳离子类脂，合成共计8 个化合物。建立了中间体n ，n 二 甲基一( 2 ，3 双烷氨基甲酸酯) 丙胺及目标分子的合成路线及工艺。经重结晶分离提纯 后，得到了高纯度的目标产物，全部经过e s i m s 、i r 、1 hn m r 和1 3 cn m r 表征，证 实产物结构与设计相符，h p l c 、m s 纯度达到转染要求。 采用所合成的阳离子类脂制备了阳离子脂质体，采用动态光散射以及z e t a 电位仪等 手段对其进行研究，初步得到阳离子类脂及由其所制备出的阳离子脂质体的结构与性能 的关系。 利用琼脂糖凝胶电泳研究了脂质体与d n a 的结合能力。结果表明，脂质体与d n a 的结合能力随着脂质体d n a 比例的增大而增加；d o p e 的加入对脂质体d n a 复合物的 延滞作用有一定的影响；头部结构、平衡阴离子以及疏水尾链长度对阳离子脂质体亲水 疏水平衡的影响使其与d n a 的结合能力也表现出差异性。 利用所制备的阳离子脂质体作为基因运载工具，转运质粒d n ap g l 3 一c o n t r o l 和 p g f p - n 2 ，对m c f 7 、h e p 2 和h e l a 三种细胞株进行了体外转染，研究了阳离子类脂 结构与其转染效率之间的关系。结果表明：当脂质体与d n a 比例发生变化时，其转染 效率也随着改变，而且存在一个最佳比例( 2 1 3 1 附近) ；转染效率与阳离子类脂头 部平衡阴离子以及助类脂d o p e 使用密切关联而又复杂变化，在这些参数调节的阳离子 脂质体亲水亲脂平衡达到一种较好的状态时可以得到满意的转染效果。与两种商品化基 因转染试剂l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 及d o t a p 进行了对照研究，本论文所合成的阳离子类 脂c p a l 2 、c p g l 2 、c p h l 2 和c p l l 2 的转染效率与商品化转染试剂相当，阳离子类脂 c p a l 4 、c p d l 4 、c p b l 2 和c p d l 2 还需进行深入研究。 采用m t t 法对阳离子脂质体进行了细胞毒性的评价，证明了所制备的阳离子脂质 体经过优化后，细胞毒性较低，具有作为基因载体的应用前景。 关键词：阳离子类脂，非病毒基因载体，体外转染，构一效关系 a b s t r a c t a b s t r a c t as e r i e so fc a t i o n i cl i p i d sw i t hg l y c e r o lb a c k b o n ew e r ed e s i g n e da n de i g h tc o m p o u n d s w e r es y n t h e s i z e d f i r s to fa 1 1 s y n t h e s i sr o u t e sa n dp r o c e s sc o n d i t i o n so fi n t e r m e d i a t en n d o u b l ea l k o x y a m i d o e t h y l n n - d i m e t h y le t h y l e n e d i a m i n ew e r es t u d i e d as e r i e so ft a r g e t m o l e c u l ew e r eo b t a i n e dt h r o u g hc o n t r o l l i n gr e a c t i o nc o n d i t i o n sf r o mt h ea b o v ei n t e r m e d i a t e s a f t e rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nu s i n gr e c r y s t a l l i z a t i o n ，t a r g e tl i p i d sw i t hh i g hp u r i t yw e r e o b t a i n e d a l lt h es t r u c t u r e so ft a r g e tl i p i d sw e r ec h a r a c t e r i z e db ye s i m s ，i r ，1hn m ra n d cn m r t h er e q u i r e dp u r i t yo ft r a n s f e c t i o ni st e s t e db ve s i m sa n dh p l c t h e s ec a t i o n i c l i p i d s w e r e p r e p a r e di n t o c a t i o n i cl i p o s o m e s s o m ep r e l i m i n a r y c o n c l u s i o n sf o rt h es t r u c t u r e e f f e c tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec a t i o n i cl i p i d ss t r u c t u r ea n dt h e l i p o s o m e sf o r m e dc o u l d b eo b t a i n e db yu s i n gd y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n ga n dz e t a - p o t e n t i a l g e le l e c t r o p h o r e s i so fc a t i o n i cl i p i d d n ac o m p l e x e sw a su s e dt oa s s e s st h er e l a t i v e b i n d i n gc a p a b i l i t yo fd n a t ol i p o s o m e s r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eb i n d i n gc a p a b i l i t yo fd n a t ol i p o s o m e si n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h el i p i d d n ar a t i o t h eb i n d i n gc a p a b i l i t yo f d n at ol i p o s o m e sw a si n f l u e n c e db ya d d i n gt h eq u a n t i t yo fd o p e t h eb i n d i n gc a p a b i l i t yo f d n at ol i p o s o m e sv a r i e dw i t hb a l a n c ea n i o n sa n dl e n g t ho fh y d r o p h o b i cc h a i n so ft h e c a t i o n i cl i p i d s t n l ep l a s m i d s ，p g l 3 一c o n t r o la n dp g f p - n 2 ，w e r eu s e dt ot r a n s f e c tm c f 一7c e l l ，h e p 2 c e l la n dh e l ac e l li nv i t r o ，b yu s i n gt h ea b o v el i p s o m e sa sg e n ec a r r i e r s ，a n dt h ep r e p a r e d c a t i o n i cl i p o s o m e sc a nd e l i v e r ed n ai n t oc e l l ss u c c e s s f u l l y ，a n dt h ee f f e c to ft h ec a t i o n i c l i p i d ss t r u c t u r e so nt h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yw a sd i s c u s s e d r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yv a r i e dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h el i p i d d n ar a t i o ，a n dt h e r ew a sa n o p t i m u mr a t i oo ft h el i p i d d n a ( t h er a t i oo fl i p i d d n ai s2 1 3 1 ) 。t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nt r a n s f e c t i o ne m c i e n c yo fl i p o s o m e sa n dc o n d i t i o np a r a m e t e r s ( s u c ha sb a l a n c e a n i o n s ，d o p e ) w a sv e r yc o m p l i c a t e da n dc l o s e l yr e l a t e d w h e nt h eb e s tb a l a n c eo fl i p o p h i l i c a n dh y d r o p h i l i cc o n s t r a i n e db yt h e s ep a r a m e t e r sw a so b t a i n e d ，s a t i s f a c t o r yt r a n s f e c t i o n e m c i e n c yc o u l db ea c h i e v e d i nc o m p a r i s o nt ot w oc o m m e r c i a lt r a n s f e c t i o nr e a g e n t s l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0a n dd o t a p ，s o m ec a t i o n i cl i p o s o m e s ( c p a 12 ，c p g12 ，c p h12a n d c p i12 ) s h o w e ds i m i l a rt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y ；o t h e rc a t i o n i cl i p o s o m e s ( c p a14 ，c p d14 ， c p b12a n dc p d12 ) n e e dt ob ee v a l u a t df u r t h e r f i n a l l y ，c y t o t o x i c i t yt e s tb ym t tg a v eas a t i s f a c t o r yr e s u l tf o rt h ec a t i o n i cl i p o s o m e s t h ec y t o t o x i c i t yo fc a t i o n i cl i p i d ss y n t h e s i z e dw a sl o w ，a n dt h e r ea r ep r o m i s i n gc a n d i d a t e s f o rg e n et h e r a p y k e y w o r d s ：c a t i o n i cl i p i d s ，n o n - v i r a lv e c t o r s ，i nv i t r ot r a n s f e c t i o n ，s t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中 除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究 成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确 的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：兰幺兔：三! 毛 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子 文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：二鱼盔址 指导教师签名：罩 迫 签名日期： 卵y 年钿彳日 | 引言 引言 基因治疗的主要原理是将功能性d n a 高效率地转移入真核细胞，以代替缺失或有 缺陷的基因。这种转移通常需要载体，如病毒载体或其他非病毒载体。目前大量应用的 病毒类载体的缺陷是免疫原性高、容量小、制备困难、成本较高，而非病毒类基因载体 可以克服这些缺点，作为非病毒类基因载体中重要的一种一脂质体因其操作简便，转染 的安全性、高效性和通用性而得到广泛应用。 脂质体是由双疏水尾链单极性头基表面活性剂在水相中自组装而成的一种双层膜 包覆微水相的结构。自b a n g h a m 在1 9 6 5 年首次通过电子显微镜发现这种结构以来， 在生命科学领域，它先后被用于细胞膜的模型研究，药物控释载体，基因治疗的载体等。 f e l g n e r 于1 9 8 7 年首次将阳离子脂质体用于转运d n a ，开启了阳离子脂质体作为 基因载体的研究之门。阳离子脂质体的结构与生物膜相似，用它作为一种载体包裹d n a ， 具有可自然降解、无免疫原性、可重复转染、目的基因在靶细胞内高效准确的表达等优 点，被称为基因治疗领域内最有希望的基因转染载体，近年来倍受研究者的重视，从1 9 8 7 年至今，己有数十种阳离子脂质体被研制合成出来。阳离子脂质体在生理p h 值下带有 正电荷，能够与d n a 分子中的磷酸基团自组装形成脂质体d n a 复合物，借静电作用 吸附于细胞表面，通过细胞内吞将基因导入细胞，而发挥基因的治疗作用。此外，阳离 子脂质体物理化学性质是可控的，即可以用化学的手段，以分子设计的思想为指导，构 建生物活性分子。 本论文设计合成了一系列以季铵盐为头部，甘油为骨架，氨基甲酸酯为连接键的阳 离子类脂，制备脂质体d n a 复合物，进行生物学转染实验，提出可能的类脂分子结构 转染效率的关系规律，并筛选出若干个有应用前景的阳离子脂质体基因载体。该研究 可为发有应用前景的基因运载工具材料提供实验及理论基础。 甘油型阳离子类脂的合成及性能研究 第一章文献综述 1 1 基因治疗概述 基因治疗( g e n et h e r a p y ) 是指利用分子生物学方法将人的正常基因或有治疗作用的 基因通过一定方式导入人体靶细胞或组织中，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上 的错乱，杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治疗疾病的一种 现代生物医学新技术。尽管这项技术还处于起步阶段，但是在一些案例中已经取得了成 功。基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞。针对生殖细胞的基因治疗， 因其能引起遗传改变而受到限制。因此，目前开展的基因治疗仅限于体细胞。 随着d n a 双螺旋结构的发现和以d n a 重组技术为代表的现代分子生物学技术的 发展，以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据表明，多种疾病与基因的结构 或功能改变有关，因而萌生了从基因水平治疗疾病的念头和梦想。基因治疗目前主要用 于治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括遗传病( 如血友病、囊性纤维病、家族性 高胆固醇血症等) 、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病( 如艾滋病、类风湿等) 等。与传 统疗法相比，基因治疗方法具有无可比拟的优越性：从根本上修正了疾病产生的原因； 更加经济方便，利用人体自身的表达系统和功能，毋需进行产物的分离纯化；抑病持久 【l ，2 】 o 早在1 9 6 8 年，美国科学家m i c h a e lb l a s e r 在新英格兰医学报上发表了“改变基 因缺损：医疗美好前景”的文章，首次在医学界提出了基因疗法的概念。到了1 9 9 0 年， 美国f r e u c ha n d e r s o n 博士才开始了世界上第一个真正意义上的基因治疗临床试验，他 们用a d a ( 腺苷酸脱氨酶) 基因治疗了一位因a d a 基因缺陷导致严重免疫缺损( s e v e r e c o m b i n e di m m u n o d e f i c i e n c y ， s c i d ) 的4 岁女孩，并获得了初步成功，促使世界各国都 掀起了基因治疗的研究热潮【3 】。截至2 0 0 5 年1 月，全球正在进行1 0 2 0 例基因治疗临床 试验，其中约2 3 处于临床i 期，1 7 处于临床i i i 期。而从所治疗的疾病来看，6 6 的 药物用于肿瘤，其次分别为单基因病( 9 4 ) 、心血管病( 8 1 ) 、传染性疾病( 6 6 ) 。 表明基因治疗具有良好的发展前景。 与欧美相比，我国基因治疗基础研究和临床试验开展得较早，起点也不低。早在2 0 世纪7 0 年代，吴曼院士就对遗传性疾病等的防治提出了基因治疗的问题。1 9 8 5 年，他 再次撰文指出基因治疗的重要目标是肿瘤。到1 9 9 1 年，复旦大学对两例血友病b 患者 进行基因治疗特殊临床试验，这也是我国第一个基因治疗临床试验方案。之后，我国对 单基因遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、神经性疾病、艾滋病等多种人类重大疾病开展 了基因治疗基础和临床试验研究。2 0 0 4 年1 月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界 上第一个基因治疗产品重组人p 5 3 抗癌注射液( 商品名：今又生) 正式推向市场，这是全 球基因治疗产业化发展的里程碑【4 j 。目前，我国已经有7 8 项基因治疗方案进入了临床 试验阶段，并建立了国家“8 6 3 ”计划生物领域病毒载体研发基地，主要开展腺伴随病毒 2 第一章文献综述 载体研发和产业化。另外，还有5 - 6 项基因治疗临床方案正在向国家s f d a 申请临床 试验批文，2 0 - 3 0 项研究已完成或正在进行临床前试验，2 0 个左右项目进入了中试研 究阶段，大多数基因治疗研究都具有创新性。总的来看，我国基因治疗比美国落后了约 4 年，正处在成长的阶段p j 。 在2 0 0 0 年，法国巴黎内克尔医院f i s c h e r 教授对1 7 名患s c i d 的小孩实施基因疗 法，当时疗效很显著，但是在2 0 0 3 年，其中2 名患者出现白血病症状，目前有一个患 病小孩已经死亡，现在第三个小孩也出现了白血病症状【6 1 。除了f i s c h e r 教授的治疗方 案出现严重副作用外，其他的一些基因治疗小组也出现了类似的安全问题。这也就说目 前基因治疗还面临着众多的问题和挑战：包括在病毒和非病毒中微弱的输送系统，基因 被输送后微弱的基因表达，治疗基因载体的问题以及多基因病的问题。人类疾病中转基 因和基因表达低效的的理由是我们仍未掌握应如何构思载体的方法，比如，哪一种细胞 类型适合什么类型调节序列，如何克服体内免疫对抗，如何按我们的要求去制造载体等 等。所以这也就需要研究人员从不同的方面来解决这些问题。 1 2 非病毒载体 将外源基因直接引入细胞中，d n a 会被体内的核酸酶降解，在未进入靶细胞、甚 至未达到靶器官便被降解成小分子核苷酸，从而失去治疗作用。基因载体的作用之一就 是通过与外源d n a 相结合，对其在体内运输的过程中起到保护其免受核酸酶的降解作 用。此外，基因载体还能协助d n a 穿透细胞壁，并与外源d n a 一起进入细胞。用于 基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类【7 1 。目前在临床研究中广泛使用的 主要是病毒载体，他们通常可以包裹治疗基因高效率地进入特定的细胞，表达出相应的 蛋白质【8 9 l 。常用的病毒载体，如腺病毒( a d e n o v i r u s ，a v ) 、逆转录病毒( r e t r o v i r u s ，r v ) ， 虽其经改造后去除了病原性，保留了高的基因转染效率，作为基因传递的工具被广泛地 采纳，但因制备困难、目的基因容量小、靶向性差和可控性弱以及自身免疫原性和生物 安全性等问题，限制了它们的应用【1 0 1 。因此，这使得非病毒载体的开发成为必然 1 lj 。非 病毒载体以其安全性、低毒性、低免疫反应、靶向性及易于组装等优点被寄予厚望，对 非病毒载体的研究人们投入了很大的精力，以期在基因治疗方面有所突破。目前所应用 的非病毒基因导入方法很多，如裸d n a 、脂质体和脂质体复合物、阳离子多聚物载体 1 2 1 、 人类人工染色体、复合载体、纳米材料等。 1 2 1 裸d n a ( n a k e dd n a ) 裸d n a 注射将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质 的介导，是最简单的非病毒载体系统，主要应用于d n a 疫苗，可激发机体的细胞免疫 和体液免疫。其优点是对机体无毒无害，操作简便，缺点是基因表达持续时间短，而且 不稳定，需多次给药。电穿孑l ( e l e c t r o p o r a t i o n ) 1 3 】技术和微粒子轰击法( m i c r o p a r t i c l e b o m b a r d m e n t ，此法也称作基因枪) 【1 4 l 的出现，大大提高了裸d n a 的转染效率，而且使 甘油型阳离子类脂的合成及性能研究 d n a 可直接到达细胞核，避免了各种酶对d n a 的降解。目前使用的d n a 疫苗，就是 用编码病毒抗原的质粒直接肌内注射，可获得有效的抗病毒免疫。虽然将裸d n a 直接 用于病变组织是可行的基因转移策略，但是，对于解剖学上不能进入的部位如器官里的 实体瘤，显然给予裸d n a 是无效的。最近，y o s h i a k i 掣”j 还使用高频、低强度的超声 波转染荧光素酶质粒d n a 到培养的人血管平滑肌细胞和内皮细胞。结果显示，在这两 种细胞中的荧光素酶活性显著增加。同样用超声法把抗原癌基因( p 5 3 ) 质粒d n a 转染 到兔颈动脉以治疗血管损伤后再狭窄，结果表明p 5 3 蛋白显著增加，且没有明显的不良 反应，如炎症反应。 1 2 2 阳离子多聚物载体 阳离子高聚物载体是利用带正电的高聚物静电结合浓缩d n a 形成聚电解质复合体 ( p o l y e l e c t r o l y t ec o m p l e x e s ) ，再通过静电作用结合细胞膜或通过携带的靶向配体与细胞膜 上的受体结合，通过内吞、逃离内体和胞质转运的方式，使d n a 进入细胞核，从而表 达目的基因。阳离子多聚物具有易合成和改性，无免疫原性，能与d n a 紧密结合，保 护d n a 免受核酸酶的降解，便于进行靶向性及生物适用性改性等诸多优点，但是由于 形成的复合物正电荷的密度过高而对细胞有很大的毒性，所以也限制了其的应用。 阳离子高聚物的典型代表是聚乙烯亚胺( p e i ) 。p e i 是一有机大分子( 如图1 1 所示) ， 具有高的正电荷密度，是将d n a 和r n a 引入神经元的极高效的载体。聚乙烯亚胺的 第三个原子是可质子化的胺氮原子，人们形象地将它比作“质子海绵”。b a s s i m a 等【l6 】人 用荧光寡核苷酸( 1 1 0 t m ) 与p e i 复合转染神经元细胞，结果表明可标记上8 0 的神 经元细胞。这些神经元细胞是后减数分裂的，这意味着，部分r n a p e i 复合物通过核 膜，或是它们在细胞质内分解，在细胞质中自由的核苷酸呈现出核趋向性。体外转染时， 聚合物中正电菏与d n a 中阴离子的最佳比例稍偏向阳离子一边，并经实验证明这种比 例同样适用于体内。研究表明，p e i 可以像d o g s d o p e 一样用于转染d n a 于新生小 鼠脑细胞中。在后续的研究中，他们又发明p e i 可用于成熟神经系统的转染。b o u s s i f 等1 1 7 j 人用聚乙烯亚胺将荧光素酶报告基因转入不同细胞系和原细胞，结果优于脂多胺。 在后续的研究中，他们用荧光探针做了将寡核苷酸转入胚神经元细胞基因转染到新小鼠 的试验结果与对原鼠脑内皮细胞或雏鸡胚神经元细胞的体外转染一致。聚乙烯亚胺作为 转基因载体的机理可能是对溶酶体的缓冲作用。这种缓冲作用使d n a 免受核酸酶的降 解，并且溶酶体的融胀及破裂又给聚乙烯亚胺d n a 颗粒提供了逃逸的机会。由此可见， p e i 毫无疑问也是适用于其它体内系统的有前景的转染载体。除此之外，常见的阳离子 高聚物还有聚赖氨酸、聚氨基酯、聚脒、壳聚糖树枝状聚合物等。 4 第一章文献综述 罗2 之h ，v 、v 、m ，、n n n n h ，n 、n h ，n 一一v n h 、n h ：n 八n r n 沙斟 ? h s h之 n 4 n 、一n 、一h 2 ul - l l 图1 1p e i 的分子结构 f i g1 1s t r u c t u r e so f p e i 1 2 3 人工染色体 理想的基因治疗载体应该完全由天然染色体成分组成，部分研究人员致力于开发此 类非病毒载体，自1 9 8 3 年酵母人工染色体构建成功来，研究人员试图构建能更稳定遗 传、永久表达的人工染色体。目前构建人工染色体主要有两种方法：一是缩短天然染色 体；二是用人类染色体基本功能单位构建人工染色体。传统的病毒载体很难达到以上要 求，并且存在免疫异源性、插入诱变等许多问题。人工载体的优点是容量大可插入任何 大小的基因，不整合入宿主染色体，避免引起插人突变能稳定遗传不需要病毒蛋白质衣 壳能够象天然染色体一样以线状或环状存在，随宿主染色体的分裂而分裂在缺乏选择压 力的情况下，能够以较低的拷贝数在细胞内稳定存在有无限的克隆能力不但能携带靶基 因，还能同时携带其他的调控元件或特异性细胞靶向元件因为来源于人对机体不存在免 疫原性，同时也能被细胞内酶降解而无毒性作用。虽然还没有任何一种人工染色体能真 正应用基因治疗的临床试验，但是由于这类载体具有许多突出的优越点，相信在不久的 将来人工染色体作为一类非病毒载体有可能成为人类基因治疗的理想载体之一。 与以上这些非病毒性基因载体相比，脂质体操作简便，既能包封脂溶性药物，又能 包封水溶性药物，在基因治疗中显示出明显的优越性，而成为近几年来非病毒基因载体 的研究热点。 脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊，其作为抗癌药物的载体对癌 细胞具有靶向性、无免疫原性、缓释时间长、毒副作用低及载药率高等优点。以下将做 详细的介绍。 一s 甘* 日$ 十# 奇合成厦性n 研究 12 4 阳离子脂质体 脂质体最初是由英国学者b a n g b a m 和s t 柚d i s ”将磷脂分散在水中进行电镜观察时 发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各 层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4 纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的取 分子小囊称为脂质体。g r e g o r i a d i s 等【l ”于1 9 7 1 开始将脂质体用于药物载体。它可以将 药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内 主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布， 使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药 物的治疗剂量和降低药物的毒性。 自从1 9 8 7 年f e i g n e r 等 2 0 l 首次利用n - j 1 一( 2 ，3 - 二油酰氧基) 丙基 - n ，n ，n 一三甲基氯 化铵( d o t m a ) 对c o s 一7 等细胞进行成功转染后，脂质体已经发展成为除反转录病毒载 体外应用晟广泛的基因传递方法，特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多。 脂质体中有亲水区( 水溶性) 和憎水区( 油溶性) ，可以包载各种亲水和亲油的化合物】。 它含有一个或多个类脂双层膜( b i o y e r ) ，在每个双层膜结构中，类脂分子中的疏水部 分通过疏水相互作用结合在一起，极性亲水部分指向环境中的水相。膜壁厚度约为5 7 n r n ，而囊的直径一般为2 5 5 0 0r a n 之间。脂质体的这种结构使其能够携带各种亲水 的、疏水的和两亲的物质，这些物质被包入脂质体内部水相，或插入类脂双分子层，或 吸附连结在脂质体的表面。下图是一种脂质体示意图： 图1 2 脂质体的结构示意图 f i g1 2s 饥l c t u r eo f l i p o s o m e s 脂质体是超微型球状体，直径2 5 1 0 0 0 r i m 不等。按结构和粒径，脂质体可分为单 室脂质体、多室脂质体、含有表面活性剂的脂质体。按性能，脂质体可分为一般腊质体 ( 包括上述单室脂质体、多室腊质体和多相脂质体等) 、特殊性能脂质体、热敏脂质体、 p h 敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等。按荷电性，脂质体 可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。 用于制各脂质体的类脂分子包括天然类脂及合成类脂。天然类脂中应用较多的是天 然磷脂，如卵磷脂( 磷脂酰胆碱) ，脑磷脂( 磷脂酰乙醇胺) 等：合成类脂有n 1 - ( 2 ，3 第一章文献综述 二油酰氧基) 丙基】- n ，n ，n 三甲基氯化铵( d o t m a ) ，二油酰磷脂酰乙醇胺( d o p e ) ， 1 ，2 二油烯氧基一3 三甲氨基丙烷( d o t a p ) 等。现代应用在转运基因上的脂质体也多是 由这类合成类脂复合而形成的阳离子脂质体，主要由带正电荷的脂类及中性辅助脂类以 等摩尔混合而成。带阳性电荷的脂质体与带阴性电荷的d n a 之间可有效地形成复合物 ( 1 i p o p l e x ) t 2 2 j ，并通过内吞作用移入细胞内。由于化学合成的脂质体具有物理化学性质的 可控性，所以很有希望投入到临床应用中。脂质体作为药物载体的发展过程中所积累的 经验，也可以在研究基因载体的过程中借鉴。下面将对阳离子脂质体做详细的介绍。 1 2 4 1 阳离子脂质体的构成 阳性脂质体( c a t i o n i cl i p o s o m e ) 介导转染核酸进入真核细胞的方法是从2 0 世纪8 0 年代中期发展起来的一种最具创新性的、高效的转染技术。阳性脂质体又称阳离子脂质 体，正电荷脂质体( p o s i t i v e i yc h a r g e dl i p o s o m e ) 是一种本身带有正电荷的脂质囊泡。 它可作为荷负电物质的传递载体，特别适用于蛋白、多肽和寡核甘酸类物质、脱氧核糖 核酸( d n a ) 、核糖核酸( r n a ) 等，所以在基因治疗方面有独特应用，近年来同益受 到各国研究者的瞩目。阳性脂质成分为整个脂质体提供正电荷， 阳离子脂质体通常由一种或多种阳离子类脂分子( c a t i o n i cl i p i d ) 和一种中性辅助类 脂( c o l i p i d ) 组成，其中的阳离子类脂分子是具有不同化学结构的两性分子，多为双链 季铵盐型表面活性剂，为整个脂质体提供正电荷，在转运基因过程起其主要的作用【2 3 。， 而且具有在体外稳定性好，在体内可生物降解的特点，但均有一定的细胞毒性。其中的 中性类脂起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用，在细胞内能促进d n a 释放，同 时提供阳离子脂质体的细胞渗透功能【2 4 。，故又称为助类脂( h e l pl i p i d ) 。下面将分别介 绍。 ( 1 ) 阳离子类脂 用于制备脂质体的阳离子类脂的种类繁多，他们均具有稳定性、体内可被生物降解 等特点。早期研制的阳离子脂质体中常用的阳离子类脂有双十八烷基二甲基溴化胺 ( d o d a b ) 2 5 】、d o t a p 2 6 】、d o t m a 及3 b n ( n , n - - - 甲基胺乙基) 胺基甲酰基】胆 固醇( d c c h 0 1 ) 田】。d o d a b 含有c - n 键，化学稳定性好，但不能被生物降解，不适 于体内实验。而含有酯键的阳离子脂质较易被生物降解，细胞毒性小，但它们的化学稳 定性通常较差。因此，常采用含有稳定的、生物可降解的连接键( 酰胺键和氨甲酰键) 的阳离子脂质【2 3 1 ，d c c h o l 就是最典型的一种。后期的研究表明不同阳离子脂质分子结 构及所带电荷不同对阳离子脂质的基因转染效果影响很大。故开发研制高效阳离子类脂 一直是阳离子脂质体基因转染载体研究的重点之一。迄今为止，科学家们合成了多种新 型低毒的阳离子类脂用于基因运载，主要可以分为三类：第一类阳离子类脂的疏水基团 为胆固醇，连接基团为氨甲酰基，而亲水基团为带有不同氨基数量的链状氨基化合物， 如精胺、精脒等。第二类阳离子类脂疏水基团、亲水基团与第一类类似，但连接基团不 7 甘油型阳离子类脂的合成及性能研究 是氨甲酰基而是氨基或其他基团。第三类阳离子类脂的连接基团与第一类相似，而疏水 基团则为两条长链脂肪酸。下图为用于基因载体的典型合成类脂的结构： o ( c h 3 ) 2 h 蠢( c h 2 ) 2 h n 型。( c h 3 ) 2 h n ( c h 2 ) 2 h n c o dc c h 0 1 第一类阳离子类脂的典型代表 bg b h c h o le s t a no n e第= 类阳离子类脂的典型代表 0 i i 乌丫。人。c 咖一c 邮啷h 3 。 o v ( c h 2 ) 8 c h - - - c h ( c h 2 ) 7 c h 3 0 o do t a p第三类阳离子类脂的典型代表 图1 3 用于基因载体的典型合成类脂 f i g 1 3t y p i c a ls y n t h e t i cl i p i d sf o rg e n et r a n s f e r 在分子结构当中，疏水尾链会影响所形成脂质体的稳定性与流动性，而亲水的阳离 子头部的电荷特性则会影响到所形成脂质体的表面特性，因此，亲疏水平衡对脂质体的 物理化学性质至关重要。 ( 2 ) 助类脂分子 助类脂分子( h e l p e rl i p i do rc o - l i p i d ) 的加入对于提高转染效率至关重要。体外转染 试验表明，在大多情况下，当脂质体中含有等摩尔的d o p e 与阳离子脂质体的时候，其 介导d n a 转染的效率要高于不加入助类脂或其他助类脂( 如d o p c ) 1 2 7 】。d o p e 与d o p c 的结构如下图所示： 8 受n n一 h 也 第一章文献综述 八八八一八八八雕h 2 中c m 。_ _ 一c h 2 赢 八v 、v 霄_ 0 弋h 2 o 弋c + 2 c h 2 n ( c h a ) 3 d o p c 图1 4d o p e 和d o p c 的分子结构 f i g1 4s t r u c t u r e so fd o p ea n dd o p c 产生这种现象的原因可能是d o p e 能够促进脂质体的形成。而脂质体在酸性条件下 会经过一个由脂多层相( 又称三口相) 到反六角形相( 又称协相) 的过渡，这种反六角形 相的状态有利于与膜进行融合，尤其是内吞小体的膜【2 引。d o p e 正是起到了促进反六角 形相形成的作用，而二油酰磷脂酰胆碱( d o p c ) 由于没有上述特点【2 9 1 ，因此其辅助性 也就没这么明显。也有研究表明【3 ，d o p e 可介导阳离子脂质体与阴性脂质体的融合， 这也为研究阳离子脂质体与生物细胞膜的作用机制提供了一定依据。胆固醇是另一种广 泛应用的助类脂分子，尽管它能与阳离子类脂作用形成稳定的脂质体，但该脂质体的体 外转染活性低于以d o p e 为助类脂的情况，而在体内转染试验中，结果恰恰相反，以胆 固醇为主类脂形成的脂质体d n a 复合物表现出了较高的转染活性【3 1 1 。 1 2 4 2 脂质体的制备方法 脂质体的制备方法在七八十年代的文献中多种多样，各种制备方法具有不同的特 点，制备的脂质体性能也各有不同。一般包括三个或四个步骤：脂质体的干燥、脂质体 的水中分散、脂质体的纯化、最终产物的分析。常用的制备脂质体的方法有以下的几种： ( 1 ) 手摇法( 也称薄层分散法) ，又称b a n g h a m 法，是脂质体制备方法中最原始的， 但也是至今为止最基本和应用最广泛的方法【3 2 1 。将磷脂、胆固醇等类脂质及脂溶性药物 溶于氯仿( 或其它有机溶剂) 中，然后将氯仿液在一玻璃瓶中旋转蒸发，使其在器壁形 成薄膜，将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中，加入瓶中不断搅拌，即得大多孔脂质体。 本方法优点是方法较温和，包封率高而且被氧化的可能性较小，缺点是速度慢不适合大 量制备。( 2 ) 非手摇法，这是一个慢水合的方法，可以提高其包封率1 3 列。在类脂膜形成 后，首先将湿的氮气流通过薄膜1 5 m i n ，然后再加水膨胀、水合，并慢慢搅拌形成脂质 体。它的直径可达几百微米，但是只有在无离子和蛋白质时才能形成。( 3 ) 超声波分散 9 甘油型阳离子类脂的合成及性能研究 法【3 4 】，超声波分散法是在薄膜分散法基础上，再经超声波处理，制得均匀的单室脂质体。 ( 4 ) 微乳化法( 也有称为s u v ) ，k r e m e r 3 5 】报告了用一个高压均质器从浓的类脂悬浮液 中制备小的脂质球( m l v ) 的方法。反应室内产生强大的剪切个装置可以用空气泵或电 力水压增强泵产生非常高的液体压力( 可达2 1 0 0 a t m ) ，利用高压流经过精确规定的微 细通道，流体立刻被加速到极高的速度，并在特制的、冲击及空化作用，形成预期的精 细密集及极为均一的脂质体。该法有以下几个优点：重复性好，能大规模生产，微粒均 匀，稳定性好，包封率高，能达到7 5 以上。( 5 ) 膜挤压法【36 。，是采用特定孔径的聚酯 膜，用注射器进行过滤挤压。所得脂质体一般粒径分布比较均匀。该法的优点是可以选 择膜的孔径来决定粒径的大小，而且经过几次后粒径分布也比较均匀。( 6 ) 注入法1 3 ， 将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物共溶于有机溶剂中( 一般多采用乙醚) 。用注射 器缓缓注入加热至5 0 ( 并用磁力搅拌) 的磷酸盐缓冲溶液中( 或含有水溶性药物) ， 加完后，不断搅拌至乙醚除尽为止，即制得大多孔脂质体。( 7 ) 逆相蒸发法1 ) 引，将磷脂 等膜材溶于有机溶剂( 如氯仿、乙醚等) 中，加入待包封药物的水溶液进行短时超声， 直至形成稳定的w o 型剂，然后减压蒸发除去有机溶剂，达到胶态后滴加缓冲溶液， 旋转帮助器壁上的凝胶脱落，然后在减压下继续蒸发，制的水性混悬液，通过凝胶色谱 法或超速离心法，除去为包封的药物，即得到单层脂质体。此法适用于包封水溶性药物、 大分子生物活性物质。 1 3 阳离子脂质体d n a 复合物( 1 i p o p l e x ) 介导基因转染机理 阳离子脂质体d n a 复合物介导基因转染机理较为复杂，目前尚未完全清楚。转染 过程通常分为三步【3 9 , 4 0 1 ：首先，阳离子脂质体与带负电的d n a 分子通过静电作用形成 阳离子脂质体d n a 复合物，让阳离子脂质体过剩，使复合物中的d n a 处于高度压缩 紧凑的状态，这样可以免于核酸酶的降解和利于细胞摄取，整个复合物带j 下电；然后， 带正电的阳离子脂质体d n a 复合物由于静电作用吸附于带负电的细胞膜表面，然后通 过与细胞膜融合或内吞作用( e n d o c y t o s i s ) 进入细胞；最后，阳离子脂质体d n a 复合 物在细胞内发生分离，阳离子脂质体连接键断裂形成小分子再通过新陈代谢排出细胞， 而基因进一步被传递到细胞核内，并在相应的位点整合、转录和翻译，最终产生目的基 因编码的蛋白质，使转染基因得以表达 4 1 , 4 2 】。下面对整个的转染过程进行具体阐述。 1 3 1 阳离子脂质体d n a 复合物的形成 最初人们认为，阳性脂质体的表面带正电荷，能被核酸中带负电荷的磷酸根所吸附， 这样，通过阳性脂质体的介导，可以把核酸物质结合到细胞膜上。g e r s h o n 等1 4 3 j 使用电 镜技术，研究了复合物的形成和结构特征。他认为，阳性脂质体最初结合到d n a 分子 上，在核酸分子上形成成束的囊泡聚合物。当聚合达到一定程度时，d n a 诱导的脂质 体膜融合和脂质体诱导的d n a 断裂同时发生，断裂后的d n a 分子被包封于重新形成 的脂质体中。后来，s t e f a n 等【删系统地阐述了复合物的结构特征及形成机理。他指出， 1 0 第一章文献综述 复合物的形成与脂质体d n a 的电荷比例有密切联系。复合物有3 种形式：( 1 ) 由d n a 包 裹的单层囊泡；( 2 ) 由单层囊泡组成的寡聚复合物；( 3 ) 多层囊泡聚合物。并且他提出“脂 质体滚动”：当一个由d n a 包裹的单层囊泡被另一个“模板”囊泡吸附，随即发生断裂， 沿着“模板”囊泡“滚动”，