（动物学专业论文）重金属（镉、铜、锌和铬）对鲫鱼的生物毒性研究.pdf

摘要 本论文在调查广州市市售的经济水产品( 食用鱼类和双壳类) 重金属含量水 平的基础上，确定广州地区几种污染较为严重的重金属即c u 、z n 、c d 和c r 。随 后以这几种重金属作为实验毒物，以鲫鱼为实验动物，应用环境生物技术、火焰 原子吸收分光光度法、邻苯三酚自氧化法、透射电镜等技术研究了重金属c u 、 z n 、c d 和c r 对鲫鱼的急性毒性及其安全浓度评价、混合重金属在鲫鱼幼体组织 内的积累和分布、c d 对鲫鱼鳃和肝脏中s o d 活性的影响、c d 对鲫鱼肝细胞和肾 细胞超微结构的影响等，全面和系统地研究了水环境中重金属暴露对鱼类的毒性 影响，初步探讨了重金属污染对鱼类的个体器官组织细胞分子 等各水平层次的影响，为制定渔业生产上预防性的管理措施提供科学依据，及时 避免或减轻重金属污染对水生生态系统造成的损害。 以高氯酸一硝酸消化法和火焰原子吸收分光光度计测定了广州石牌市场食 i 用鱼类和双壳贝类的c d 、p b 、c r 、n i 、c u 和z n 等重金属的含量。结果表明：双 壳类对重金属积累的能力高于鱼类。鱼类不同组织器官对各种重金属积累能力明 显不同，有毒重金属元素c d 、p b 、c r 和n i 主要分布于鳞片和鳃中，其食用部分 中各重金属含量都远低于“海洋生物污染评价标准”和“人体卫生消费标准”， 具安全的食用价值。但贝类的c d 含量已超过“人体卫生消费标准”，其中牡蛎的 c u 和z n 含量则略超过“人体卫生消费标准”，其食用价值受到严重威胁，应引 起重视。 采用静水法生物测试研究了重金属c u 、z n 、c d 和c r 对丰产鲫( c a r a s s i u s a u f a t u so fp e n z e ( 早) c y p r i n u sa c u t i d o r s a l i s ( 6 ) ) 幼鱼的急性毒性，结 果表明：c u 对鲫鱼为剧毒物质，c d 为中毒物质，z n 和c r 为低毒物质。四种重 金属毒性大小顺序依次为：c u c d z n c r 。c u 、z n 、c d 和c r 对鲫鱼的2 4 h 、4 8 h 、 7 2 h 、9 6 h 的l 分别为0 2 3 、0 1 4 、0 1 1 、0 0 9 m g l ， 1 1 1 7 、8 6 8 、6 8 6 、 5 8 5 m g l ，3 9 0 3 0 、3 1 1 8 0 、2 7 7 7 0 、2 4 4 1 0 m g l ，3 9 4 0 、3 2 2 5 、2 7 2 0 、 2 2 2 5 m g l ，安全浓度分别为0 0 0 9m g l 、0 5 9m g l 、2 4 4 1 m g l 、2 2 3 m g l 。 c u 对鲫鱼的安全浓度略低于渔业水域水质标准，z n 、c d 和c r 的安全浓度远远高 于标准。 研究了安全浓度的混合重金属c u 、z n 、c r 、c d 污染在鲫鱼幼体组织中短期 的积累和分布，实验结果表明：c u 、z n 、c d 和c r 四种重金属之间的联合作用为 毒性剧增的协同作用。c d 和c r 在鲫鱼的鳃和肝脏中有极明显的积累( p c d z n c r t h el g 。o f2 4 h ， 4 8 h 7 2 ha n d9 6 hf o rc ut oc r u c i a nw e r e0 2 3 、0 1 4 、0 1 la n d0 0 9 m g l t h o s ef o rz nw e r e11 1 7 、8 6 8 、6 8 6a n d5 8 5 m g l f o rc da n dc rt h e r ew e r e 3 9 0 3 0 、3 1i 8 0 、2 7 7 7 0a n d2 4 4 1 0 m g l ，3 9 4 0 、3 2 2 5 、2 7 2 0a n d2 2 2 5 m g l t h es a f ec o n c e n t r a t i o n so ft h e s em e t a l sw e r e0 0 0 9 m g l 、0 5 9m g l 、2 4 4 i m g la n d2 2 3m g lr e s p e c t i v e l y t h es a f ec o n c e n t r a t i o no fc ut oc r u c i a n w a s s l i g h t l y l o w e rt h a ns t a n d a r do ff i s h e r yw a t e ro u a l i t y t h e s a f e c o n c e n t r a t i o n so fz n ，c da n dc rt oc r u c i a nw e r ef a re x c e e d e dt h es t a n d a r d t h es h o r t - t e r ma c c u m u l a t i o na n dd i s t r i b u t i o ni ny o u n gc r u c i a nt i s s u e o fm i x e ds e c u r ec o n c e n t r a t i o n so fh e a v ym e t a l sc u ，z n ，c ra n dc dp o l l u t i o n w a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta s s o c i a t e di n t e r a c t i o no ft h ef o u r h e a v y m e t a l sw a s s y n e r g i s t i c e f f e c to fa c c u m u l a t e dt o x i c t h e a c c u m u l a t i o no fc da n dc rw a se v i d e n ti ng i l l sa n d1 i v e r s ( p c d z n p b c r 。但这不 是绝对的，不同的鱼种对金属离子的毒性反应顺序可能有变化。如对鲫鱼、真鲷、 娩状黄姑鱼等来说，c u 的毒性大于c d ，但对大马哈鱼鱼苗( h a m i i r o ne ta l ， 1 9 9 0 ) 而言，c d 的毒性大于c u 。另外，在鱼类生长的不同阶段中，重金属对鱼 类的毒性是不一样的，如崔可铎等( 1 9 8 7 ) 报道的对鱼卵孵化的毒性顺序为c u z n c d c r ；而对仔鱼成活的毒性顺序为：c u c d z n c r ；吴玉霖等( 1 9 9 0 ) 报道的对牙鲆胚胎毒性大小顺序依次为：c u z n c d c r ，对牙鲆仔鱼毒性大小 为c u c d z n c r 。同一种重金属在不同的水质中的毒性规律是：无离子水 淡 水 咸淡水 海水( 崔可铎等，1 9 8 7 ) 。 无论是人工培养液还是天然水体中，重金属的种类和数量都不可能是单一的 和固定不变的。重金属对鱼类的毒性受环境中许多物理、化学以及生物因素影响， 包括p h 值、无机阴离子、水的硬度、其它金属离子、络合物及鱼类的自身物质 1 0 等。在酸性条件下( p h 5 6 ) ，铅的毒性增强( 王晓蓉，1 9 9 3 ) 。可溶性有机物， 如胰胨、半胱氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽可以降低重金属的毒性( 王俊等，1 9 9 3 ：杨 居荣等，1 9 9 4 ) 。磷酸盐和碳酸盐能降低铅的毒性，可能是由于形成难溶的铅盐 的结果。水中络合物( 鱼类自身代谢产物、天冬氨酸盐等等) 可消除c 矿的致死 作用( 王俊等，1 9 9 3 ) 。重会属和其它污染物如二氧化硫、氧化氮能产生相互协 同作用，提高相应重金属的毒性。此外，两种或多种化学物同时作用于生物体时， 往往会引起与单一毒物作用完全不同的毒性反应，如a s 与c d 和a s 与z n 离子共 存时的联合毒性均为拮抗作用，而c d 与z n 离子的联合毒性主要为毒性剧增的协 同作用，a s 、c d 、z n 三种离子联合时其毒性为拮抗作用( 修瑞琴等，1 9 9 8 ) 。 1 3 鱼类对重金属的蓄积和清除 鱼类通过吸收、吸附和摄食等途径，能从周围环境中积累、浓缩化学物，目 前普遍认为，污染物质主要是通过鱼鳃从水中吸收积累，也可通过食物链的生物 放大作用在鱼体中蓄积。由于污染物性质稳定，不易分解，脂溶性强、与蛋白质 或酶有较高的亲和力，被摄入动物体内后即溶于脂肪，很难分解排泄，就会长期 残存在生物体内，随着摄入量的增加，这些物质在体内的浓度会逐渐增大。因此， 尽管进入环境中的污染物即使是微量的，由于其难降解和生物放大作用，通过食 物链转移，使处于高位营养级的生物受到毒害，甚至威胁到人类健康。 当重金属离子进入鱼体时，一方面鱼体摄取重金属污染物，表现为重金属在 鱼体内的蓄积：另一方面鱼体发挥自体的解毒功能，将毒物向体外释放，以求保 持内环境的稳定。因而重金属污染物在鱼体内的蓄积、清除始终处于动态平衡状 态。当鱼体生活于污染环境时，重金属污染物在鱼体蓄积占主导，一旦脱离污染 环境则清除占主导。国内学者对h g ”、a g + 、n i + 等重金属离子在鱼体内的蓄积、 清除规律做过报道( 丁树荣等，1 9 8 2 ：黄玉瑶，1 9 8 2 ；吴玉霖等，1 9 8 3 ) ，鱼类 对重金属离子都有较强的吸收和蓄积能力，开始接触时蓄积速度较快，以后速度 减慢，最终达到动态平衡。鱼类因种类、规格、重金属污染物及生存条件相异， 蓄积状况也相异。水体汞污染较其它重金属污染可造成持久的影响。鱼类在受汞 污染水域中，体内汞含量不断增加，甚至水中汞含量很低的情况下，鱼体汞含量 亦可达到一定水平。由于鱼体内各组织器官生理功能、代谢水平存在差异，肾脏、 肝脏和消化系统是重金属污染物主要蓄积场所，肌肉积存的含量是鱼体内各组织 中最低的。重金属污染物的清除，以鳃的清除速度较快，肌肉和骨骼较慢。从不 同的重金属清除的趋势看，n i 和c d 较快，c u 和p b 较慢。重金属在鱼体内的积 累也受多种因素的影响，如周新文等( 2 0 0 2 ) 报道了混合重金属离子相互作用 对c u 在鲫鱼组织中积累的影响，随着重金属离子种类的增加，相互作用对其积 累的影响变得显著，c u 离子在鱼脑和肝脏中的积累浓度升高，在鳃中的积累降 低，在肌肉中的积累无影响。重金属离子相互作用不会改变c u 在鲫鱼组织中的 分布规律，c u 在鲫鱼组织中的积累顺序为肝脏 鱼鳃 鱼脑 肌肉( 周新文等， 2 0 0 2 ) 。 1 4 重金属对鱼类的组织病理学影响 重金属离子被鱼体组织吸收后，一部分可随血液循环到达各组织器官，妨碍 组织细胞代谢过程而出现组织学的超微损伤( 张毓琪等，1 9 9 3 ) 。h g 和c d 能诱 导鱼的味蕾超微结构的改变( b o r o v y a g i ne ta l ，1 9 8 9 ) ：感受微绒毛和纤毛肿 胀，v e r 小管和中心膜极度扩张，溶酶体和巢穴体数目增加，神经纤维肿胀。c d 能引起棘鱼的肾小管上皮细胞破裂，形成组织空泡( o r o n s a y e ，1 9 8 9 ) ，降低鲤 鱼肾单位壁的淋巴细胞的核和细胞质的染色能力( g i1 l ，1 9 8 8 ) 。c d 能使罗非鱼 ( t i l a p i am o s s a m b i c a ) 肝血管充血，肝细胞空泡化，胰腺细胞坏死，外周胰腺 肝细胞脂肪化( u s h ae ta l ，1 9 8 9 ) 。h g 对蛇头鱼肝脏的超微结构的改变包括滑 面内质网的广泛增生和粗面内质网的扩张，线粒体退化，溶酶体增加 ( k h a n g a r o t ，1 9 9 2 ) 。不同重金属对不同鱼类鳃的主要病变也相似，如c d 能使棘 鱼鳃小片增生、末端膨大，邻近鳃小片粘连，鳃丝空泡形成，泌氯细胞数目增加 ( o r o n s a y e ，1 9 8 9 ) ；c u 曝露引起鲤鱼鳃上皮细胞增生，第二鳃片蜷曲，泌氯细 胞改变( k a r a ne ta l ，1 9 9 8 ) ，引起红鳟鳃瓣上皮细胞的细胞程序死亡和鳃瓣融 合( d a o u s te ta l ，1 9 8 4 ) ；无机汞能使红鳟鳃瓣上皮细胞增生和溶酶体数目增 加( d a o u s te ta l ，1 9 8 4 ) 。 鱼鳃是鱼呼吸、接触和吸收水体中重金属离子的重要器官( 方展强等， 2 0 0 1 ) ，肝脏是鱼代谢和积累重金属离子的主要器官( 方展强等，1 9 9 4 ；2 0 0 2 ； 2 0 0 3 ) ，肾脏则是排泄重金属离子的重要器官，重金属对这些器官细胞结构的破 坏无疑将影响到鱼正常的呼吸、代谢、排泄和繁殖功能，从而导致鱼类的死亡 ( o r o n s a y e ，1 9 8 9 ) 。鱼类组织病变的严重性与金属浓度和曝露时问有关，随着浓 度和曝露时问的增加，可观察到更多的病理改变，如果允许曝露时间不问断，可 发生组织器官的完全崩溃，因此，坏死的进程可依据核损伤程度来评估：( 1 ) 核 固缩；( 2 ) 核裂或核膜的的破裂和核染色体的碎片：( 3 ) 核溶解( g 订l ，1 9 8 8 ； 张凤君等，2 0 0 1 ) 。 1 5 重金属对主要分子生态毒理指标酶类的影响 污染物进入机体后，首先将导致机体一系列的生物化学变化，这些变化广义 上说可分为两种：一种是用来保护生物体抵抗污染物的伤害，称之为防护性生化 反应：另一种不起保护作用，称之为非防护性反应。防护性反应的机理是通过降 低细胞中游离污染物的浓度，从而防止或限制细胞组成成分发生可能的有害反 应，消除对机体的影响。非防护性生化反应有多种多样，其作用机理也多样化。 非防护性生化效应的结果之一是产生对生物体有害的影响( 孔繁翔，2 0 0 0 ) 。 1 5 1 对机体内防护性生化反应的影响 1 5 1 1 对金属硫蛋白的诱导作用 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，简称m t ) 首次在马肾中被分离，它是一种 位于胞浆的低分子蛋白，半胱氨酸含量极高，约3 0 ，分子量一般在6 0 0 0 - - 7 0 0 0 道尔顿，对热稳定，金属含量高，多存在于鱼类的肝、肾、鳃和肠中。m t 对二 价金属离子有极高的亲和力，因而在细胞内起着贮存必需的微量金属如z n 、c u 和结合有毒金属如c d 、h g 的作用，它与必需金属的结合起着调节这些金属在细 胞内浓度的作用，而与有毒金属的结合则可以保护细胞器免受金属毒性影响。它 的一个重要特点是可在转录水平上被环境中的金属所诱导，而且这种诱导与环境 中的金属浓度有相关性，可以反映环境中金属的水平，因而是一种重要的分子生 态毒理学指标。 鱼经腹腔注射和水体暴露，z n ，c u ，c d 均可诱导m t 的合成，高金属含量区 域的生物m t 的诱导已在无脊椎动物和鱼中得到了证实。水体暴露后的检测表明， 鱼肝m t 量与水中金属含量相关性极密切，而且也与肝中金属含量相关，可以反 映暴露的程度。翻车鱼暴露于c d 后肝m t 及c d 浓度增加并具正相关。拟鲤暴露 于水体中浓度为1 0 0 u l 的c d 时，肝中的m t 和c d 浓度均增加( b o n w i c ke ta l ， 1 9 9 1 ) 。 1 5 1 2 重金属对鱼组织抗氧化防御系统的诱导作用 重金属离子污染对水生生物的毒性作用机制之一是其造成生物体内的过氧 化胁迫，及过量的重金属离子能导致体内产生大量的活性氧自由基( r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s 简称r o s ) ，如0 、o h 一、h ：0 ：，这些活性氧又可使d n a 断裂、脂 质过氧化、酶蛋白失活等，从而引起机体氧化应激，造成生物大分子和膜脂质过 氧化，从而对机体诱发多种损害。在长期进化中，需氧生物发展了防御过氧化损 害的系统，其组成包括：水溶性组分如谷胱甘肽( g s h ) 、维生素c ；脂溶性成分， 如维生素e ，b 一胡萝h 素；酶如谷胱甘肽过氧化酶( g p x ) ，超氧化物歧化酶 ( s o d ) ，过氧化氢酶( c a t ) 等。目前的研究发现，暴露于可产生氧化还原循环 的物质后，机体抗氧化剂防御系统中的一些成分会改变。如s o d 、c a t 、g p x 等可 被诱导，除了酶活性，g s h 以及活性氧的量也可反映氧化应激的存在，脂质过氧 化也能证明污染物氧化性损伤作用。 过氧化氢酶是一种含铁的氧化酶，它在机体内与d 一氨基酸氧化酶、尿酸氧 化酶、黄嘌呤氧化酶、l n 一羟基氧化酶等产生过氧化氢的酶类相偶联( 武内 忠男等，1 9 8 3 ) ，使过氧化氢分解为水和分子氧。水中一定浓度的c d ，能引起鲫 鱼肝胰脏、肾脏、鳃组织过氧化氢酶活性的显著增强。但在体外条件下，酶反应 液中直接加入不同浓度的c d 后，却不能显著提高该酶的活性。由此可知，c d 中 毒鲫鱼组织过氧化氢酶活性的升高，不是由c d 本身直接引起的，而是由c d 中毒 的异常生理变化间接引起的( 贾秀英等，1 9 9 7 ) 。真鲷幼鱼肝脏c a t 活性较强， 而鳃c a t 活性相对较弱。c u ”对真鲷幼鱼鳃c a t 的抑制大于对肝脏c a t 的抑制， 而z n ”对鳃c a t 的抑制小于对肝脏c a t 的抑制。这可能是不同离子在不同器官吸 收的差异所造成( 戴家银等，1 9 9 8 ) 。曝露于c d 中金鱼肝脏的s o d 和c a t 的活力 明显下降( z i k i ce ta l ，1 9 9 6 ) 。 c d 可抑制红细胞s o d 活性，使体内的活性氧自由基增加，从而导致氧化应激 现象，目前认为氧化应激引起氧化损伤的重要结果为脂质过氧化( l p o ) 。并证明 了c d 染毒后，鱼肝匀浆的脂质过氧化作用增强( 蔺玉华等，1 9 9 8 ) 。脂质过氧化 作用可以导致生物膜上许多生物化学和生物物理学效应，其中包括膜脂流动性的 改变，如脂质过氧化膜脂流动性下降( 吴坤，1 9 9 3 ) 。推测其原因可能是c d 离子 与膜表面的负电荷基团结合，影响膜表面的电荷密度和净负电荷的局部静电场， 并能渗入双脂质层，改变介电常数，从而导致膜流动性的改变。另一方面由于脂 1 4 质过氧化产物丙二醛为短键结构，可进入生物膜水相，与膜脂、膜蛋白上的n ： 交联形成s c h i s 碱，增加膜的韧性，从而使膜流动性降低( 刘键铎等，1 9 9 4 ) 。 1 5 2 对非防护性生化反应酶类的毒性作用 金属离子穿过细胞膜后，以不同的方式与细胞质成分进行络合反应，并对胞 液中特定的配位体、底物及酶的活性产物或酶本身产生极强的亲和力。现已证实， 有毒金属与酶之间可能存在着两种作用形式：( 1 ) 有毒金属置换酶活性中心的必 需余属；( 2 ) 有毒金属结合到酶分子中的咪唑基、巯基、羟基、氨基、肽基等功 能基团而导致酶失活( 吴坚，1 9 9 2 ) 。因此，以酶为指标考察重金属对生物代谢 的影响得到许多学者的重视。 腺苷三磷酸( n a + ，k + 一a d e n o s i n e t “p h o s p h a t a s e ，简称a t p a s e ) 是生物体 内重要的水解酶，存在于所有动物的细胞中，其基本功能是催化a t p 末端的磷酸 水解，并利用核反应的自由能对抗电化学梯度，进行n a + ，k + 的主动运输，因而 它在维持细胞内外离子平衡和一定的电化学梯度方面有着重要的生物学意义，它 不仅参与能量代谢、物质运送、氧化磷酸化的重要生化过程，而且它与膜上磷脂 的结合状态，将影响膜的流动性，从而还会影响膜的其它功能。从分子生态毒理 学的角度来看，a t p a s e 是一项广泛应用于评价污染压力的参数( 徐立红等， 1 9 9 5 ；马广智等，2 0 0 3 ；方展强等，2 0 0 3 ) ，是具有通用性和直接性的指标。已 发现多种生物的a t p a s e 对不同的污染物( 蔺玉华等，1 9 9 6 ；聂晶磊等，2 0 0 1 ) 均 有反应，如：改变细胞的渗透性，干扰正常的水盐代谢，中断氧化磷酸化的偶联 过程，使细胞不能提供正常活动所需要的能量。周新文等( 2 0 0 1 ) 研究了混合重 会属对鱼鳃、鱼脑和肝脏的n 0 ，k 一a t p a s e 活性的影响，发现混合重金属的暴 露浓度与酶活性呈负线性相关，均达到极显著水平( 仄o 0 1 ) ，3 种组织n a + ，k + - - a t p a s e 的敏感顺序为鱼脑 鱼鳃 肝脏。蔺玉华等用甲基汞染毒鲤鱼的鳃线粒 体在2 4 h 后n a + ，k + - - a t p a s e 活性受到抑制( 蔺玉华等，1 9 9 6 ) 。 谷草转氨酶( g o t ) 和谷丙转氨酶( g p t ) 是广泛存在于动物细胞线粒体中重 要的氨基转移酶，在机体蛋白质代谢中起着重要的作用。在正常情况下，脊椎动 物组织细胞内的转氨酶只有少量被释放到血浆中，因此，血清中的转氨酶活性较 小。鲫鱼受c d 中毒后，肝胰脏、肾脏、鳃等组织的g p t 、g o t 活性降低( 贾秀英， 1 9 9 7 ) 。c d 能抑制肝，鳃和肾中的g o t 和g p t 的活性( g 订1 ，1 9 9 1 ) 。底泥受汞 污染后，鲤、鲫鱼肝、鳃组织g p t 和g o t 活性下降，以肝胰脏最明显，血清转氨 酶活性则相反，随着汞浓度的递增而呈极显著升高( 郑永华等，1 9 9 7 ) 。由此说 明，鱼类在组织发生病变或大面积受损伤时，引起细胞膜通透性增加，细胞内的 转氨酶大量释放出来进入血浆，从而引起血清中该酶浓度上升或活性突然持续性 增强，血清中g p t 和g o t 浓度的升高，主要来源于肝胰脏、肾脏和鳃。不同重会 属对转氨酶的作用是不同的，戴家银等( 1 9 9 8 ) 的研究认为c u 、z n 各暴露浓度 中真鲷幼鱼肝脏g p t 显著下降。c u 2 + 使真鲷幼鱼肝脏g p t 活性降低比z n ”更显著。 碱性磷酸酶( a k p ) 是一种特异性较低的磷酸单酯酶，在生物体核酸、蛋白 质和脂类等物质代谢中起重要作用，主要参与生物体内物质的消化、吸收转运、 生长分化、分泌和骨骼形成等生理过程，凡物质交换、吸收转运旺盛的器官中， 都显示a k p 的高活性。蓝伟光等( 1 9 9 3 ) 的研究表明适量的c u 和z n 能激活真鲷 肝脏a k p 的活性，过量时真鲷肝脏a k p 的活性又会受到明显的抑制，其中，c u ” 抑制作用比z n ”抑制作用大；硒和c u 之间的拮抗作用降低了过量c u 对真鲷肝脏 a k p 活性的抑制作用；不同浓度的c r 对真鲷肝脏a k p 的活性没有明显的影响。 酸性磷酸酶( a c p ) 广泛存在于各种生物体内，是巨噬细胞溶酶体的标志酶， 在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢( 王鑫等，1 9 9 5 ) ，是生物磷代谢的重要 酶类。陈素丽等( 1 9 9 7 ) 研究了重金属对文昌鱼a c p 活性的影响，表明c d 2 + 对a c p 酶活力稍有抑制，而z n ”、a g ”、c u ”、h 9 2 + 对酶活力有明显的抑制作用，其抑制 强度依次为h a 2 + c u 2 + a g ”z n ”。随着h g ”、c u 2 + 浓度增大而抑制作用加强，其抑制 表现为竞争性类型。 c u “、z n 2 + 离子对真鲷幼鱼胃蛋白酶具有抑制作用，其中c u 2 + 的抑制作用比z n 2 + 的抑制作用强( 戴家银等，1 9 9 8 ) 。蛋白磷酸酶( p p ) 是细胞中重要的调节酶， 广泛存在于细胞中，对任何一种蛋白进行催化脱磷酸化作用。蛋白磷酸化与脱磷 酸化是细胞内无所不在的反应，正是这两种反应的特定平衡协调着细胞内许多生 化反应过程。若这两种反应中的任意一种改变了其活性，则由之而来的将是细胞 内一系列生化反应的紊乱，包括促进肿瘤形成的过程。 1 6 重金属的环境激素作用 近年来，环境内分泌干扰物生态风险研究越来越受到人们的广泛关注，这些 化合物通过干扰体内天然激素的合成、分泌、运输，结合、作用、代谢或消除等， 1 6 与相应的受体结合，并随之在细胞内产生效应，干扰血液中激素正常水平的维持， 从而影响野生动物和人类的生殖、发育和行为，环境内分泌干扰物可以模拟自然 激素，抑制激素作用，或者改变免疫系统、神经系统和内分泌系统正常的调节功 能。 鱼体内分泌活动受下丘脑一垂体一靶细胞控制与调节( 方展强等，1 9 9 0 ；刘 筠，1 9 9 3 ) 。国内外已有研究表明多种在环境中广泛存在的某些重金属具有类雌 激素作用，产生对水生生物特别是鱼类繁殖的影响，例如成年的大西洋石首鱼 ( m i c r o p o g o n i a su n d u l a t u s ) 暴露于亚致死浓度的p b 、c d 等重金属后造成类固 醇血液浓度，卵巢类固醇分泌和卵巢发育的显著上升或下降( p i n t e re t a l ， 1 9 9 7 ) 。较高浓度c d 处理引起血清促性腺激素( g t h ) 水平降低，生长激素( g h ) 水平升高；提高水中钙浓度，能使由c d 引起的g t h 水平的降低恢复到正常水平， 并对c d 引起的g h 水平升高起延迟作用；c d 处理使鲤对l h r h a 刺激分泌的反 应性下降，提高水中钙浓度也不能恢复正常。实验结果提示：c d 引起的g t h 和 g h 的变化可能主要是干扰了钙的生理作用( 马广智等，1 9 9 5 ) 。g t h 是鱼类脑垂 体分泌的一种糖蛋白激素，并在鱼类的生殖周期调节中起重要作用，如性腺的发 育，生殖细胞和激素的发生。g h 是由中腺垂体的g h 细胞分泌的一种多肽激素， 其最基本的生理功能是促进鱼体生长和参与多种促合成代谢作用。c d 引起染毒 鱼的雌二醇和睾酮增加( 蔺玉华等，1 9 9 6 ) 。鱼类性类固醇激素( 睾酮和1 71 3 一 雌二醇) 是体内胆固醇的衍生物，对鱼体性腺发育、卵黄形成和卵细胞成熟具有 重要的调控作用。c d 能引起鲤脑垂体催乳素细胞分泌量增加，血浆中肾上腺皮 质醇质量浓度明显增高，c d 在短时期内导致低钙并对鲤有短期促生长效应( 蔺 玉华等，2 0 0 1 ) 。在金属污染的水中的野生红鳟其下丘脑一垂体一肾上腺轴受到 了慢性刺激( n o r r i se ta l ，1 9 9 7 ) 环境激素对鱼的影响的主要机理是外源性物质对激素受体j 下常结合作用的 协同和拮抗( k a v l o c ke ta l ，1 9 9 6 ；k n u d s e ne ta l ，1 9 9 9 ) 。正常的激素从特 定的靶组织通过与细胞受体或膜受体的直接反应表现其对外界的反应。与受体的 自然配位是激素功能中关键的一步。细胞内激素的核受体，如性类固醇、肾上腺 类固醇，甲状腺激素，维生素d 和视黄酸的受体，通过与特异d n a 序列的反应， 调节基因的转译，合成出新的信使r n a ，加工、翻译以产生新的蛋白质。 1 7 重金属对生物体的致畸致突变作用 重金属能引起鱼类的畸形，特别是在鱼类的生活史早期阶段。如重金属z n 和p b 可 1 起黑鲷仔鱼发生畸形，畸形率分别达5 l 和4 5 。重金属进入生物体 内后，经体内的酶系统活化，产生中间代谢物，这类具有强亲电性的代谢物可与 脂类、蛋白、r n a 或d n a 的亲核中心发生反应，形成稳定的或不稳定的加合物 ( f a v e r n e ye ta l ，2 0 0 1 ) 。脱氧核糖核酸是生物体内重要的大分子，也是生物 体重要的遗传物质，若d n a 发生变化，如形成加合物或甲基化比例改变，当体内 不能及时修复时，其特有的遗传学性质就会受到影响。有毒物质与细胞d n a 相互 作用形成共价结合物被认为是化学致癌致突变过程启动的关键步骤，化学或物 理因子造成d n a 功能或结构的完整性被称为具有基因毒性。在自然环境中，当生 物暴露于基因毒物中时有许多的方法可以用来评价基因毒性作用，这些方法主要 有核酸碱基的修饰、d n a 链的断裂、姐妹染色体的交换或其他染色体的改变、非 程序d n a 的合成、微核形成、点突变及细胞核d n a 含量的改变等。 水体底泥汞污染可引起鱼类血液红细胞微核率的上升，并呈现出较明显的剂 量和时间效应( 郑永华等，1 9 9 7 ) 。低浓度c d 、c r 溶液中暴露的鲤鱼，随时间延 长其红细胞微核率相应升高；。肾组织内c d 、c r 残留量同其微核率呈正相关关系； 但c u 对鲤鱼微核无诱变作用；c d 和c r 、c d 和c u 间协同作用能增大微核的诱发 效应( 朱毅等，1 9 9 9 ) 。重金属离子能与带负电的核酸结合，引起核酸裂解，使 正在进行细胞分裂的细胞染色体被阻断而产生微核，微核是胞浆内的染色质团 块，类似于很小的核。据认为，微核是来自于后期的染色体迟滞或由于有丝分裂 减数分裂扰乱而引起的无着丝粒染色体片段。 c u 、z n 、p b 、c d 及其混合重金属离子极大地提高了鲫鱼肝脏d n a 的总甲基 化水平：随着混合重金属离子浓度的增加，鲫鱼肝脏d n a 的总甲基化水平也有所 增高；混合重金属离子对不同组织d n a 总甲基化水平的影响不同，肝脏 鱼鳃 肾脏( 周新文等，2 0 0 1 ) 。d n a 的甲基化对d n a 的复制、染色体结构和变异频率 方面具有重要意义( m i c h a e le ta i ，1 9 9 6 ) 。混合重金属离子对鱼体各组织d n a 的合成作用呈双向效应，即低浓度时，表现出损伤和修复作用。高浓度时，组织 细胞d n a 的合成受到了抑制作用( 周新文等，2 0 0 1 ) 。周新文等( 2 0 0 1 ) 用非程 序d n a 的合成作为毒性评价指标研究了混合重金属对鲫鱼组织d n a 的毒性作用， 结果表明，混合重金属的毒性作用靶器官是鱼脑和鱼的肝脏；混合重金属中的主 要毒性成分是z n 、p b 和c d 离子，混合重金属对鱼脑组织的毒性大小顺序是 p b c d z n ，对肝脏d n a 的毒性顺序为p b z n c d ；c u 离子能够降低其它3 种离子 的毒性作用，降低的机制在于竞争作用，导致了其它离子的吸收降低。 1 8 本研究立题依据、研究内容及意义 1 8 1 立题依据 随着工农业及其他事业的发展，在其生产或试验过程中排放的有毒物质( 如 重金属离子) 必然对环境造成污染，尤其是对水体的污染更加严重。鱼类作为水 体中的主要生物就成了最直接的受害者，不仅大大地影响了渔业生产的效益，而 且由于食物链的关系，积聚在鱼体中的有毒物质最后必将进入人体内，从而对人 类自身产生极大的危害。本研究所做的前期工作在调查广州市售的水产品的重金 属含量水平的基础上，找出了水产品中污染较为严重的几种重金属如c u 、z n 、 c r 、c d 。这四种重金属都是环境优先污染物，可考虑选择其作为实验毒物，研究 其对水生生物的毒性作用。重金属溶于水中，有多种络合态，金属离子通常只占 总可溶金属的一部分，是唯一能与细胞膜载体蛋白结合的部分，具生物活性。此 四种重金属在水中均以阳离子为主要存在形式。因此，本实验溶液中的c u 、z n 、 c r 、c d 的总浓度可代表c u ”、z n ”、c r 6 + 和c d 2 十浓度，此方法具有一定的可行性和 相互之间的可比性。 鱼类是水体中的主要生物，对水环境中发生的物理、化学和生物性的各种变 化，反映十分灵敏。鱼类的毒性实验是研究水体中有毒物质对鱼类不良影响的重 要实验，通过鱼类的毒性实验能够在一定程度上综合地反映出水体的污染情况， 为环境保护提供有价值的信息。鲫鱼( 本实验采用的实验鱼为丰产鲫 ( c a r a s s i u u sa u r a t u so fp e n z e ( 早) c y p r i n u sa c u t i d o r s a j i s ( 6 ) ) 是华南 师范大学生命科学学院鱼类研究室利用异精雌核技术培育出的淡水养殖新品 种) ，属鲤形目鲤亚科，是我国主要的经济淡水鱼类之一，其个体大，生长快， 分布面广而量大，性成熟时间短，繁殖季节长，而且在人工控制饲养条件下可常 年繁殖。鲫鱼不属迁徒型鱼类，因此可以考虑选择其作为环境污染的指标生物， 用来对环境中的金属污染进行定期监测。鲫鱼受水中各种物质的影响很直接，通 过对鲫鱼的研究或分析可以较好地反映所处水体的水质状况及是否受到污染。以 1 9 i i - k 关于鲫鱼的研究主要集中于其养殖方面，鲫鱼作为测试环境污染物的研究对象 也较多，且主要集中于有机污染物( 习志群等，1 9 9 5 ；张勤等，1 9 9 7 ；王芳等， 1 9 9 9 ；朱必凤等，1 9 9 5 ) 和药物( 汪开毓等，2 0 0 0 ；郑永华等，1 9 9 9 ) 等方面， 关于重金属对鲫鱼的毒性研究尚少见报道，曾见c u 在鲫鱼体内的分布规律研究 ( 成志强，2 0 0 1 ) 、c d 对鲫鱼组织转氨酶和过氧化氢酶活性( 贾秀英等，1 9 9 7 ) 及 免疫毒性( 董书芸等，2 0 0 1 ) 的影响报道。关于重金属对鲫鱼的综合毒性作用未 见报道。 1 8 2 研究内容及意义 本实验在调查广州市市售的经济水产品( 食用鱼类和双壳类) 的重金属含量 水平的基础上( 杨丽华等，2 0 0 2 ) ，找出几种污染较为严重的重金属即c u 、z n 、 c d 和c r 。随后以这些重金属作为实验毒物，以鲫鱼为实验动物，进一步从各方 面研究水环境重金属污染对水生生物的毒性影响。首先测定了c u 、z n 、c d 和c r 对鲫鱼的急性毒性以评价水环境中各种重金属的毒性大小及其对生物的安全浓 度，为渔业水质监测提供必要的毒性数据( 杨丽华等，2 0 0 3 ) ；然后测定了c u 、 z n 、c d 和c r 四种重金属在鲫鱼组织内的积累和分布，为水产品质量保证提供必 要的数据；最后测定了c d 对鲫鱼组织中s o d 酶活性的影响( 杨丽华等，2 0 0 3 ) 及 对鲫鱼主要器官组织病变的透射电镜观察，初步探讨了重金属污染对生物的器官 组织细胞分子等各水平的影响，评价重金属对水生生物可能产生的 毒性效应，阐明污染物对人类潜在的危害，为制定预防性的管理措施，及时避免 或减轻污染物对水生生态系统造成的损害提供科学依据。 第2 章广州市场食用鱼和贝类重金属含量分析及评价 2 1 前言 改革开放以来，随着珠江三角洲经济的迅速发展，广州地区每年排放大量含 有重金属和有机氯污染物的工业废水通过各种途径进入珠江和河口区海域( 方 展强等，2 0 0 1 ；2 0 0 2 ；2 0 0 3 ) ，有毒的重金属物质在水生生物中经富集作用而蓄 积，达到一定浓度，使本来为人类提供丰富食用蛋白的鱼、贝类等可能成为浓缩 毒物的载体，进而危及人类的健康。在环境科学研究中，十分重视对重金属在生 物体内蓄积水平的研究，尤其对受污染较严重的港口、河口、和部分沿岸的海洋 生物体中的重金属含量及分布的研究工作( 陆超华，1 9 9 4 ：贺广凯，1 9 9 6 ；f a n g e ta l ，2 0 0 3 ；方展强等，2 0 0 3 ) ，而对市售的经济水产品中重金属含量的研究报 道则较少，且多数集中于海洋经济贝类及海洋鱼类的重金属残留量的调查和研究 ( f a n ge ta l ，2 0 0 1 ：黄宏瑜等，1 9 9 8 ) ，但迄今为止，对市场上出售的食用淡水 鱼类的重金属含量测定却较少见有报道。本章报道了广州市石牌肉菜市场上常见 的淡水鱼类和双壳贝类受镉( c d ) 、铅( p b ) 、铬c r ) 、镍( n i ) 、铜( c u ) 和锌 ( z n ) 等重金属污染的状况。旨在了解广州市市售的经济水产品的重金属含量水 平，评价其食用卫生质量，分析不同重金属在鱼体不同组织器官中的分布情况， 同时也为渔业环境政策和水产品重金属含量及食品卫生标准的制定提供有益的 资料。 2 2 材料和方法 2 2 1 样品采集 2 0 0 1 年2 月和4 月分别于广州市石牌肉菜市场，随机抽取一定数量的常见 鱼类和贝类样品，带回实验室。其中鱼类6 种：鳙a r i s t i c h t h y sn o b i l i s ，草 鱼c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ，鲮鱼c i r r h i n a m o l i t o r e l l a ，尼罗非鲫t i l a p i a n i l o t i c a ，鲫c a r a s s i u sa u r a t u s ，胡子鲇c l a r i a sf u s c u s ；贝类6 种：齿舌撷 孔扇贝c h l a m y sr a d u l a ，织锦巴非蛤p a p h i a t e x t i l e ， 毛蚶s c a p h a r c a s u b c r e n a t a ，近江牡蛎o s t r e a “叫a ，j s ，长竹蛏s o l e ng o u l d i i ，翡翠贻贝 p e r n av i r i d i s ， 2 2 2 样品处理 样品用双蒸水清洗，再用纸巾吸干，逐尾测量其体重和体长。然后用不锈钢 刀解剖。鱼类取其肌肉食用部分及分别取鳞片、肝脏、内脏、鳃等其它部分。贝 类耿其整个食用软体组织部分。再将同类的解剖部分聚于一起，不加水，用匀浆 机匀浆。匀浆样品保存在一2 0 冰柜2 4 h 。然后置冰冻干燥机( f d l 冷冻干燥 机，北京博医康技术公司) 冰冻干燥7 2 h ，再将干燥样品准确称重，计算干湿重 比例。干燥样品置于密封瓶中，于o 下保存。准确称量干燥样品约1 9 ，然后黄 于消化管中，加1 5 m i 浓h n o 。( 广东省廉江安铺化工厂，分析纯试剂) 和0 5 m l h c i o 。 ( 上海桃铺化工厂，优级纯) 混匀。置于电热板( 湖南长沙市华光电炉厂s b 一3 1 6 4 电热板) 上，控温约l i o 。c 使样品颗粒溶化消解约1 h ，至棕色气体消失，得到透 明溶液。如果酸消化过程中发现样品炭化，则需再补加浓h n o 。消化后的透明溶 液用双圈牌定量滤纸过滤，再用蒸馏水稀释定容至l o o m l 。 2 2 3 样品测定及数据统计 测定工作在华南师范大学测试中心进行，参照吴邦灿等( 吴邦灿等，1 9 9 8 ) 的方法，使用w f x i f 2 型原子分光光度计( 北京市第二光学仪器厂) 直接测定和 分析了样品中的c d 、p b 、c r 、n i 、c u 和z n 含量。其数据在9 5 置信度的水平 下，用s t u d e n t s t 一检验法进行分析，比较各数据之间的差异。 2 2 4 质量控制 使用标准物( s t a n d a r do y s t e rt i s s u e1 5 6 6 a ，usd e p a r t m e n to f c o m m e r c e ， n a t i o n a lb u r e a ro fs t a n d a r d s ，g a i t h e r s b u r g ) 在与样品分析流程相同条件下 作了对照分析，标准物中的c d 、c u 、z n 、p b 、n i 和c r 的平均回收率达8 6 以 上，表明本实验对样品的分析方法是可靠的。 2 3 结果和讨论 2 3 1 水产品食用部分的重金属含量及分析 实验测定了6 种淡水鱼类的肌肉及6 种双壳贝类软体部分的c d 、p b 、c r 、 n i 、c u 和z n 含量，其结果列于表2 1 。 结果表明，双壳类体内积累的各种重金属含量都比鱼类高。这与双壳类的滤 食食性有关，双壳类生活在受污染的河口区及沿海岸，在大量滤食食物颗粒的过 程中也被动地积累了包括重金属在内的环境污染物。此外，对于软体动物来说， 积累在体内具一定数量的c u 和z n 通常被认为非毒性的，属体内的必需元素。从 表2 1 各类水产品中重金属平均含晕 t a b 2 1 h e a v ym e t a l c o n c e n t r a t i o ni nm u s c l e so f v a r i o u sa q u a t i cp r o d u c t 生物 类别 重金属含量( x s d m g k g w e t ) c dp bn ic r c uz n 鱼类o 0 6 0 0 5 n d0 3 1 4 - 0 1 80 5 8 o 3 50 8 4 o 4 0 5 7 8 4 - 1 5 4 双壳类1 7 6 4 - 1 4 5 0 3 5 4 - 0 0 l0 5 0 4 - 0 2 9o 2 7 4 - 0 1 62 2 9 8 4 - 4 6 8 7 4 98 9 4 - 6 6 7 2 n d ：未检出 生化的角度上看，软体动物血液中运载氧的色素不是含铁的血红蛋白而是含c u 的血蓝蛋白，因此，c u 的含量较高。c d 在两大类生物体中的含量差异较显著， 双壳类 鱼类( 仄0 0 5 ) ：而p b 、c r 和n i 等其它重金属在两大类生物体中的含量 差异不显著( 力0 0 5 ) 。这表明软体动物对c d 的吸收和累积优于鱼类。c d 为一 种公认的动物性金属毒素(