（微生物学专业论文）酸性矿水中微生物群落及其在黄铁矿表面的吸附.pdf

m a s t e r st h e s i s 摘要 摘要 在酸性矿水( a m d ) 微生物中目前研究得最多的是a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s 和l e p t o s p i r i l l u m f e r r o o x i d a n s 菌，研究认为它们是氧化细菌，能够 催化亚铁离子的氧化，因此被认为能够决定硫化矿物的溶解速率，从而在a m d 的产生过程中扮演着非常重要的角色为了更好地完善关于微生物所介导的 a m d 产生机制和微生物矿物界面相互作用机制的认识，本文以此为出发点，研 究了5 个酸性矿水样品中微生物群落组成情况，实验过程中主要采用了不依赖于 培养技术的可用于环境样品的1 6 sr d n a 克隆文库方法限制性酶切片段长度 多态性分析( r f l p ) 方法，传统的分离纯化方法，扫描电镜( s e m ) 观察方法以 及荧光原位杂交( f i s h ) 方法等等。 样品s x l 。s x 2 和s x 3 是采自山西中条山铜矿的不同酸性矿坑水，剩下的酸 性矿坑水样品k 1 和k 2 是采自湖北铜山口铜矿不同生物浸出体系的浸出液。系 统发育分析结果显示5 个酸性矿水样品中的细菌主要是4 大类：p r o t e o b a c t e r i a ( 7 - p r o t e o b a c t e r 两p - p r o t e o b a c t e r i a , a - p r o t e o b a c t e r i a a n d 5 - p r o t e o b a c t e r i a ) ， n i t r o s p i r a ( l e p t o s p i r i l l u m ) , f i r m i c u t e s 和b a c t e r o i d e t e s p r o t e o b a c t e r i a 细菌如常 见的a f e r r o o x i d a n s 在样品s x 3 ，k i 和k 2 中都有存在，而在样品s x i 和s x 2 中却几乎没有；n i t r o s p i r a 细菌比如l e p t o s p i r i l l u mf e r r o o x i d a n s , l e p t o s p i r i l l u m f e r r i p h i l u m 和l e p t o s p i r i l l u mg r o u p1 i i ，在样品s x i ，k i 和k 2 中较多，在样品 s x 2 和s x 3 中很少；f i r m i c u t e s 细菌只发现存在于样品s x 3 和k 1 中： b a c t e r o i d e t e s 细菌更是只在样品s x 3 中发现有少量存在古细菌只在来自湖北 铜山口的样品k 1 和k 2 中发现有存在t h e r m o p l a s m a 和f e r r o p l a s m a 属的古 细菌在两个样品中都大量存在。出乎意料的是，在这两个样品中s u l f o l o b a l e s 和 m e t h a n o t h e r m u s 属的古细菌也有少量被检测到。另外，高浓度的s 元素及其他 金属离子比如f e ，c u , z n 和a g 等似乎是影响微生物群落分布，尤其是一些典 型的铁氧化细菌( 比如a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s 和l e p t o s p i r i l l u m 属的菌种) 的分布的关键因素。 发明了一种新的简单的分离l f e r r i p h i l u m 菌的方法。一株三f e r r i p h i l u m 和 3 株a c i d i p h i l i u ms p 菌成功地从上述酸性矿水中分离得到。这些结果能够进一 步证明前面r f l p 方法所揭示的关于酸性矿水中微生物群落的结果，同时也提供 了一些新的分离lf e r r i p h i l u m 和a c i d i p h i l i u ms p 菌的方法。 关于微生物在黄铁矿块表面的吸附研究主要采用s m e 观测方法。经过一段较 长时间的吸附后( 4 2 天) ，可以观察到黄铁矿块表面吸附的正，菌会自身成核 吸附大量铁矾沉淀，而l e p t o s p j r j l u m 菌表面光滑，且易于聚集成团并在黄铁 t l i m a s t e r st h e s i s 摘要 矿块表面形成一层生物膜。推测在生物浸出后期，丘，菌表面包裹的一层铁矾 沉淀可能降低其氧化黄铁矿的速率，而l e p t o s p i r i u m 菌的表面一直是光滑 的，在生物浸出的整个过程中它们都可能是氧化菌，尤其是到了生物浸出的后期， 它们很可能成为了最主要的氧化细菌。 通过f i s h 的方法检测到a ，菌在黄铁矿块的表面有大量的吸附，这说明 正，菌易于吸附到黄铁矿块表面并且是牢固的吸附。少量的a r c h a e a ， f e r r o p l a s m a 和a c i d i p h i l i u m 菌也有被检测到吸附在黄铁矿块表面。而 l e p t o s p i r i l l u m 菌形成的厚厚的生物膜很可能使得l e p t o s p i r i l l u m 菌细胞的 通透性大大下降，从而降低了探针l f 6 5 5 与l e p t o s p i r i l l u m 菌的杂交效率这 些结果证明了前面r f l p 方法所揭示的关于酸性矿水中微生物群落的部分结果， 同时也揭示了并不是只有a ，或者厶，与黄铁矿块单独起作用，其它一些微 生物如a r c h a e a ，f e r r o p l a s m a 和a c i d i p h i l i u m 菌也很可能在与黄铁矿块作用 的过程中起到重要的作用。在与黄铁矿块的相互作用过程中它们应该是协同作 用。 i v m a s t e r s1 脏s i sa b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o o r g a n i s m s s u c ha sa c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sa n d l e p t o s p i r i l l u m f e r r o o x i d a n sa r et h em o s ts t u d i e da c i dm i l l ed r a i n a g e ( a m d ) o r g a n i s m s ，t h e ya r e i r o n o x i d i z i n gs p e c i e s ，c a t a l y z ef e r r o u si r o no x i d i z a t i o n , t h u sd e t e r m i n et h em t eo f s u l f i d e sd i s s o l u t i o n , a n dp l a yv e r yi m p o r t a n tr o l e si na m d g e n e r a t i o n t op r e s e n t , a m o r ec o m p l e t ep i c t u r eo fm i c r o b i a l l ym e d i a t e da m d p r o d u c t i o na n dt h em e c h a n i s m o fi n t e r f a e i a li n t e r a c t i o nb e “v e e nm i c r o b e sa n dm i n e r a l s t h ec o m p o s i t i o no f m i c r o b i a lc o m m u n i t i e si nf i v ea c i dm i n ew a l b * t s a m p l e sw e r es t u d i e d , u s i n g c u l t u r e - i n d e p e n d e n t1 6 sr d n ab a s e dc l o n i n ga p p r o a c h - r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ( r f l p ) a n a l y s i sm e t h o d , i s o l a t i o n , s c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p y ( s e m ) a n df l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o nf l a s h ) m e t h o d s t h r e es a m p l e s ，n a m e ds x l ，s x 2a n ds x 3 ，w e r eo b t a i n e df r o mt h r e es e p a r a t e a m ds i t e so fz h o n g t i a o s h a nc o p p e rm i n ei ns h a n x ip r o v i n c e , c h i n a t h er e s tt w o s a m p l e s ，n a m e dk 1a n dk 2 ，w e r eg a m e df r o mt w os c p a r a t eb i o l e a c h i n gs y s t e m so f t o n g s h a n k o uc o p p e rm i n e ，h u b e ip r o v i n c e ，c h i n a p h y l o g e n e t i ea n a l y s i sr e v e a l e d t h a tt h e b a c t e r i ai nt h e s ef i v es a m p l e sf e l li n t o4m a j o rg r o u p s ：p r o t e o b a c t e r i a ( t - p r o t e o b a c t e r i a , ，- p r o t e o b a c t e r i a ,a - p r o t e o b a c t e r i a a n d 5 - p r o t e o b a c t e r i a ) ， n i t r o s p i r a ( l e p t o s p i r i l l u m ) , f i r m i c u t e sa n db a c t e r o i d e t e s p r o t e o b a c t e r i ao r g a n i s m s s u c ha sa f e r r o o x i d a n sa p p e a r e di ns a m p l e ss x 3 ，k ia n dk 2 ，b u tw a ss c a r c ei n s a m p l e ss x la n ds x 2 ；n i t r o s p i r ao r g a n i s m ss u c ha sl e p t o s p i r i l l u mf e r r o o x i d a n s , l e p t o s p i r i l l u mf e r r i p h i l u ma n dl e p t o s p i r i l l u mg r o u pi i i ，w e r ep r e v a l e n ti ns a m p l e s s x i ，k 1a n dk 2 ，b u taf e wi ns a m p l e ss x 2a n ds x 3 ；f i r m i c u t e so r g a n i s m sw e r eo n l y f o u n di ns a m p l e ss x 3a n dk 1 ；b a c t e r o i d e t e so r g a n i s m sw e o n l yf o u n di ns a m p l e s x 3 a r e h a e aw e r eo n l yd e t e c t e di nt w os a m p l e sk ia n dk 2f r o mt o n g s h a n k o u c o p p e rm i n e t h e r m o p l a s m aa n df e r r o p l a s m al i n e a g e sw e r ed e t e c t e da b u n d a n t l yi n t h e s et w os a m p l e s u n e x p e c t e d l y , s e q u e n c e sa f f i l i a t e dw i t hs u l f o l o b a l e sa n d m e t h a n o t h e r m u sg e n u sw e r ea l s od e t e c t e di ns m a l la m o u n la d d i t i o n a l l y , h i g h c o n c e n t r a t i o n so fs o m ec h e m i c a le l e m e n t ss u c ha ss ，f e ，c u , z na n da gs e e m e dt 0b c k e yf a c t o r sr e s u l t i n gi nt h ed i v e r s ed i s t r i b u t i o no ft y p i c a li r o n - o x i d i z e r s ( s u c h 髂 a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n sa n dl e p t o s p i r i l l u ms p e c i e s ) a m o n gw a t e rs a m p l e s an e w s i m p l em e t h o df o ri s o l a t i o no f l f e r r i p h i l u mh a sb e e ne r e a t e x l o n es t r a i no f 工f e m , h i t u ma n dt h r e es t r a i n so f a c i d i p h i l i u ms p h a v eb e e ni s o l a t e df r o mt h ea c i d m a s t e r st h e s l sa b s t r a c t m i n ew a t e r s t h e s er e s u l t sf u r t h e rp r o v e dt h et r u t hp r e v i o u s l yr e v e a l e db yr f l ra n d a l s os u p p l i e ds o m en e ww a y sf o ri s o l a t i o no f l 和”i p h i l u ma n da c i d i p h i l i u ms p 。 t h ea d s o r p t i o no fm i c r o b e so np y r i t es u r f a c eh a sb e e ns t u d i e dm a i n l yb ys e m a f a ra d s o r p t i o nf o ral o n gt i m e ( 4 2 d ) ，a f w o u l ds e tt h e m s e l v e sa sn u c l e u sa d s o r b i n g f e r r o a l u m e np r e c i p i t a t i o n , a n dl e p t o s p i r i l l u ms p e c i e sa d s o r b e do nt h ep y r i t es u r f a c e w e 豫f i k e l yt oa c c u m u l a t et o g e t h e ra n df o r mb i o f i l m t h ef e r r o a l u m e np r e c i l ：i i t a t i o n l a y e rc o v e r i n gt h ea f s u r f a c em a yd e c r e a s et h eo x i d a t i o n r a t eo fp y r i t eb ya f i nt h e l a t e rl e a c h i n gp e r i o d w h i l et h el e p t o s p i r i l l u ms p e c i e s s u r f a c e sa l w a y sk e e ps m o o t h w i t h o u ta n yp r e c i p i t a t i o na d s o r b e d t h e ym a ya l w a y sh a v et h ea b i l i t yo f o x i d i z i n gt h e p y r i t ef t o mt h eb e g i n n i n gt ot h ee n d , e s p e c i a l l y , i nt h el a t e rl e a c h i n gp e r i o d , t h e ym a y b et h em a i no x i d i z e r a f b a c t o i ah a db e e nd e t e c t e dr e l a t i v e l ya b u n d a n ta d s o r b e do nt h ep y r i t es u r f a c e b yf i s h ，t h i sm a yi m p l yt h e yw e r el i k e l yt oa d s o r bo np y r i t ea n da l s ot h ea d s o r p t i o n w a sas t r o n ga d s o r p t i o n as m a l la m o u n to fa r c h a e e gf e r r o p l a s m aa n da c i d i p h i l i u m s p e c i e sa l s oh a v eb e e nd e t e c t e da d s o r b i n go np y r i t es u r f a c e t h et h i c kb i o f i i mm a i n l y f o r m e db yl e p t o s p i r i l l u ms p e c i e sm a ym a k et h ec e l l s p e r m e a b i l i t yb e c o m ep o o r , s o d e c r e a s et h eh y b r i d i z a t i o ne f f i c i e n c yo fp r o b el f 6 5 5 t h e s er e s u l t sm a yp r o v es o m e r e s u l t sp r e v i o u s l yr e v e a l e db yr f l pa n da l s om a yi m p l yt h a tn o to n l ya fo rl f i n t e r a c tw i mt h ep y r i t es i n g l y , b u ts o m eo t h e rm i c r o b e ss u c ha sa r c h a e a , f e r r o p l a s m a a n da c i d i p h i l i u ms p e c i e sm a ya l s op l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ep r o c e s s i n go fo x i d a t i o n o f p y r i t e a l lo f t h e mm a yb es y n e r g i s t i ci n t e r a c t i o nw i t ht h ep y r i t e n 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同 工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：进至丝日期：丑年上月日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文 的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文； 学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 c h a p t e r1 i n t r o d u c t i o n 1 1a c i dm i n ew a t e r s 1 1 1o r i g i n s a c i d m i n ew a t e r si n c l u d e su a t u l 试i dr o c kd r a i n a g e ”( a r d ) n a t i a l a c i dl n i n e d r a i n a g e ( a m d ) a n di n d u s t r i a lb i o l e a c h i n gs y s t e m s 1 埘1 1 l em o s tw e l ld o c u m e n t o d t y p e so fw a t e rp o l l u t i o na s s o c i a t e dw i t hm i n i n gw e r er e f e r r e dt oa r da n da m d t h e yw e c o n s i d e r e dt ob ec a u s e db yt h ed i s s o l u t i o no fs u l f i d eo r e s w h i c hw e r e e x p o s e dt oa i r , w a t e ra n dm i c r o o r g a n i s m s t “6 1 。b r i e f l y , m i n e r a l ss u c ha sp y r i t e ( f e s 2 ； t h em o s ta b u n d a n to fa l ls u l f i d em i n e r a l s ) a mc h e m i c a l l y ( a n db i o l o g i c a l l y ) s t a b l ei n s i t u a t i o n sw h e r eb o t ho x y g e na n dw a t e ra 糟e x c l u d e d l j j h o w e v e r , u p o ne x p o s u r et o b o t hm o i s t u r ea n da i r e 例gf o l l o w i n g t h e f r a c t u r i n g a n d e x p o s u r e o f s u l f i d e - c u n t a l n i n gm i n e r a lo r e sa n ds u l f i d i cc o a l s ) s u l f i d em i n e r a l s w i l lo x i d i z e s p o n t a n e o u s l y , w i t he i t h e rm o l e c u l a ro x y g e no rf e r r i ci r o na c t i n ga st h eo x i d a n t t 3 ： f e s 2 + 6 f e 3 + + 3 h 2 0 - 7 f e 2 + + s 2 0 3 6 h + w h i l s ts u l f i d em i n e r a lo x i d a t i o nm a yb ea b i o t i c ，t h er a t eo fr e a c t i o ni sf a rg r e a t e r , b ym a n yo r d e r so fm a g n i t u d e ，i nt h ep r e s e n c eo fc e r t a i nl i t h o t r o p h i c ( r o c ke a t i n g ) p r o k a r y o t e s l 3 a v a r i e t yo fm i c r o b i a la c t i v i t i e sg e n e r a t en e ta c i d i t y i s t h e s ei n c l u d en i t r i f i c a t i o n , a n dt h ef o r m a t i o na n da c c u m u l a t i o no f o r g a n i ca c i d se i t h e rd u r i n gf e r m e n t a t i o no ra s p r o d u c t so fa e r o b i cm e t a b o l i s m m o s tp e r t i n e n t ，h o w e v e r , t ot h eg e n e s i so fa c i dm i n e w a t e r s a r et h em i c r o b i a ld i s s i m i l a t o r yo x i d a t i o no fe l e m e n t a ls u l f u r , r e d u c e ds u l f u r c o m p o u n d s ( r s c s ) , a n df e r r o u si r o n e l e m e n t a ls u l f u rm a y o c c n ri ng e o t h e r m a la r e a s ( e g a r o u n dt h em a r g i n so ff u m a r o l e s ) w h e r ei tf o r m sb yt h ec o n d e n s a t i o no fs u l f u r d i o x i d ea n dh y d r o g e ns u l f i d e ( s 0 2 + 2 h 2 s c 2 h 2 0 + 3 s 3 ) o x i d a t i o no fs u l f u rb y a u t o t r o p h i c a n d h e t e r o t r o p h i cm i c r o o r g a n i s m sg e n e r a t e s s u l f u r i ca c i d ( s 3 + h 2 0 + i 5 0 2 c h 2 s 0 4 ) w h i c h , i fn o tn e n t r a l i s e db yc a r b o n a t e s o ro t h e rb a s i c m i n e r a l sp r e s e n t ，眦r e s u l ti nad r a m a t i cl o w e r i n go f p hw i t h i nm i c r o s i t e so ro nt h e m a c r o 站a l e f u r t h e ra c i d i t yr e s u l t sf r o mt h eh y d r o l y s i so ff e r r i ci r o nr e a c t i o n ：f e ”+ 3 h 2 0 - - - f e ( o h ) 3 + 3 w 【3 】io fg r e a t e re n v i r o n m e n t a ls i g n i f i c a n c e , h o w e v e r , i st h e g e n e r a t i o no f a c i d i t yw h i c hr e s u l t sf r o mt h em i e r o b i a lo x i d a t i o no f s u l f i d em i n e r a l s s 1 1 1 2c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s w a t e rd r a i n i n gm i l l e sa n dm i n es p o i l sa r et h e r e f o r eo f t e na c i d i c a n df r e q u e n t l y c o n t a i ne l e v a t e dc o n c e n t r a t i o n s ( r e l a t i v et ou n p o l l u t e ds t r e a m s ) o fa l u m i n u ma n d v a r i o u sh e a v ym e t a l s ，s u c ha sc o p p e r , z i n ca n dm a n g a n e s e t h e s em e t a l so r i g i n a t e f r o md i s s o l v e ds u l f i d e s ，a n do t h e ra s s o c i a t e dm i n e r a l s ，a n da r eh e l di ns o l u t i o n b e c a u s eo ft h e i rg r e a t e rs o l u b i l i t yi na c i d i cl i q u o r s t 3 , 7 1 h o w e v e r , i r o n , w h i c hm a yb e p r e s e n ti ne i t h e r ( o rb o t h ) f e r r o u sa n df e r r i cf o r m s ( d e p e n d i n go nw a t e rp h ) i s ，i n m o s to a s e s ，t h ed o m i n a n tm e t a lp r e s e n ti na m d ，s o l u b l ef e r r i ci r o ni m p a r t i n gt h e c h a r a c t e r i s t i cr e dc o l o rt oe x t r e m e l ya c i d i cm i n ew a t e r s w h i l eo r a n g e - y e l l o wf e r r i c i r o n - r i c hs e d i m e n t s 黜c o l n i n o ni nh i g h e rp hs t r e a m s 3 一t h em e t a l l o i da r s e n i c ( o r i g i n a t i n gp r i m a r i l yf r o mt h e o x i d a t i o no fa r s e n o p y r i t e ，f e a s s ，o ra r s e n i c c o n t a i n i n gp y r i t e ) m a ya l s ob ep r e s e n ta tg r e a t l ye l e v a t e dc o n c e n t r a t i o n si na m d w h i l eb o t ha s o i i ) a n da s m a yb ep r e s e n t , t h em o r eo x i d i z e ds t a t e ( e g a r s e n a t e ) t e n d st ob em o r ep r e v a l e n ti n a m d d 7 8 一i nc o n t r a s t , t h ec o n c e n t r a t i o n so f d i s s o l v e d o r g a n i cm a t t e ri na m dt e n d st ob er e l a t i v e l yl o w ( 1 ) a n dw i t ha no p t i m a lp hv a l u er a n g i n gf r o m1 6 t o2 0 1 9 1 o o e b e la n ds t a c k e r b r a n d t 3 5 ，f o u n dt h a tl f e r r 勿h h u mw a f tc a p a b l eo fg r o w i n ga t2 8 ， 3 7a n d4 5 c ，a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a sa r o u n d4 0 c l f e r r o o x i d a n sh a d o p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r e sr a n g i n gf r o m2 6t o3 0 c ，a n d7 , 1 0 工f e r r o o x i d a n ss t r - d m s w e r ec a p a b l eo f g r o w i n ga t4 5 c t l 6 ，1 0 6 , 1 0 y 1 i no n rs t u d y , lf e r r o o x i d a n