（有机化学专业论文）tthbfe化合物的合成、表征及性质研究.pdf

s y n t h e s i s ，c h a r a c t e r i z a t i o na n dr e a c t i v i t y s t u d y o ft t h b - - f ec o m p o u n d s at h e s i s s u b m i t t e di np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t f o rt h em s d e g r e ei no r g a n i cc h e m i s t r y b v ， h a n f a n g p o s t g r a d u a t ep r o g r a m c o l l e g eo fc h e m i s t r y c e n t r a lc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r ：l id o n g f e n g a c a d e m i ct i t l e ：p r o f e s s o r m a y , 2 0 1 1 蜉一 逝a 硕士学位论文 m a s t e r st i t e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：韩芳日期：幻年步月弓f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：韩芳 日期2 0 t l f f - 夕月多f e l 导师张么否砖 日认年厂月1 ) 、日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回重途塞握交后进卮! 旦坐生；旦= 生；旦三生筮查。 作者签名： 日期：年月 日 导师签名： 日期：年月 日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 模拟金属酶的活性部位有重要意义，不仅可以了解酶的作用机制，而且对发展 小分子量仿生催化剂有重要作用。脂氧合酶( l o ) 是一类广泛存在于植物、动物、低 等生物体内的金属酶，主要选择催化含有顺、顺1 ，4 戊二烯结构的不饱和脂肪酸过 氧化。 本论文合成了六个富含多苯并咪唑配体的脂氧合酶模型化合物，利用x 射线单 晶衍射仪测定了化合物的晶体结构，并通过红外光谱( i r ) 、紫外一可见光谱( u v v i s ) 、 电喷雾质谱( e s i m s ) 等测试手段对这些化合物进行了表征，采用循环伏安法( c v ) 测 试了其电化学性能。 合成的化合物都是双核结构，中心铁离子是变形的八面体构型，其中四个化合 物是由双核配体t t h b 合成的，两个中心铁离子配位结构相同，其中每个铁离子分 别都与三个苯并咪哗氮，两个烷胺氮配位，烷氧基占据第六个配位位置，此烷氧基 来源于溶剂分子，它们分别是 f e 2 ( o m e ) 2 ( t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 4 c h 3 0 h ， f e e ( o e t ) 2 ( t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 ，【f e 2 ( i o p r ) 2 ( t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 4 ( c h 3 ) 2 c h o h ，【f e 2 ( n o p r ) 2 ( t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 4 c h 3 c h 2 c h 2 0 h ，另外以t t h b 的衍生物b z 6 一t t h b 为配体得到了 类似的烷氧基f e ( i i i ) 化合物 f e 2 ( n o p r ) 2 ( b z 6 一t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 2 c h s c h 2 c h 2 0 h 和烷氧 基f e ( i i ) 化合物 f e 2 ( h o m e ) 2 ( b z 6 一t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 。 本文采用脂氧合酶模型化合物与含弱c h 的有机底物反应的活性测试方法，检 测含f e ( i i i ) 活性中心的模型化合物夺取底物氢原子的能力，此反应机制类似于已报 道过的酶的作用机制。实验采用底物浓度远大于模型化合物的浓度进行氧化反应， 通过f e ( i i i ) 活性中心的还原求得表观速率常数b 。，每种底物至少做五组不同浓度 的测试，再由b 。随底物浓度变化作图求算出化合物夺取有机物氢原子的二级反应 速率常数屯唧，测试的四个化合物都表现出了此活性。 关键词：脂氧合酶模型化合物；结构；活性 a b s t r a c t m o d e lc o m p o u n d st h a tm i m i ct h ea c t i v es i t e so fm e t a l l o e n z y m e sa r ei m p o r t a n tn o t o n l yf o rt h eu n d e r s t a n d i n go fe n z y m em e c h a n i s m s ，b u ta l s of o r t h ed e v e l o p m e n to fs m a l l m o l e c u l a rw e i g h tb i o m i m e t i cc a t a l y s t s l i p o x y g e n a s e ( l o ) a r em e t a l l o e n z y m e st h a te x i s t i nt h ev i v oo fp l a n t s ，a n i m a l sa n ds o m el o w e ro r g a n i s m s ，w h i c hc a t a l y z et h er e g i o a n d s t e r e o s p e c i f i cd i o x y g e n a t i o no fc i s ，c i s - 1 ，4 - p e n t a d i e n e c o n t a i n i n gf a t t y a c i d st o a l k y l h y d r o p e r o x i d e s s i x i r o n ( i i ，i i i ) 一c o n t a i n i n g c o o r d i n a t i o n c o m p o u n d sw i t hb e n z i m i d a z o l y l - r i c h l i g a n d sh a v eb e e ns y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db ys i n g l e c r y s t a lx - r a yd i f f r a c t i o n ， i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( i r ) ，u l t r a v i o l e t - v i s i b l es p e c t r o s c o p y ( u v - v i s ) ，c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n de l e c t r o s p r a ym a s ss p e c t r o m e t r y ( e s i m s ) t h eg e o m e t r i cs t r u c t u r e so ft h e s ed i n u c l e a rc o m p o u n d ss h o wad i s t o r t e do c t a h e d r o n f o u ro ft h e ma r es y n t h e s i z e db ym u l t i d e n t a t el i g a n dt t h ba n dt w oc e n t e ra t o m sh a v ea s a m ec o o r d i n a t e de n v i r o n m e n t ，t h ec e n t e ra t o mi sb o n d e db yt h r e eb e n z i m i m i d a z o l y l n i t r o g e n sa n dt w oa m i n on i t r o g e n e so ft t h b ，t h es i x t hp o s i t i o ni so c c u p i e db ye t h y l o x y g r o u p t h e ya r e f e 2 ( o m e ) 2 ( t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 4 c h 3 0 h ，【f e 2 ( o e t ) 2 ( t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 ，【f e 2 ( i o p r ) 2 ( t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 4 ( c h 3 ) 2 c h o h ， f e 2 ( n o p r ) 2 ( t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 4 c h 3 c h 2 c h 2 0 h ， t h ec o m p l e xo fp a r t i c i p a t i o ni nt h ec o o r d i n a t i o no ft h em e t h o x yi so b t a i n e db yc h a n g i n g t h es o l v e n t i na d d i t i o n , c o m p o u n d s f e 2 ( n - o p r ) 2 ( b z 6 - t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4 2 c h 3 c h 2 c h 2 0 h a n d 【f e 2 ( h o m e ) 2 ( b z 6 t t h b ) ( c 1 0 4 ) 4h a v et h es a m es t r u c t u r a lf e a t u r ed e s c r i b e da b o v e ， t h e ya r es y n t h e s i z e db yu s i n gb z 6 一t t h b a c c o r d i n gt o t h er e p o r t e dc o m p a r a t i v ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so ft h e l i p o x y g e n a s e m i m i c k i n ga c t i v i t y ，t h i st o p i cr e p o r t e da n o t h e rf u n c t i o n a ll i p o x y g e n a s e m o d e l ：af e r r i cm e t h o x i d ec o m p l e xr e a c t sw i t ho r g a n i cs u b s t r a t e si nam a n n e rs i m i l a rt o t h ep r o p o s e de n z y m a t i cm e c h a n i s m ，w h i c hs h o w e dt h ea b i l i t yt oa b s t r a c th y d r o g e na t o m s f r o mo r g a n i cs u b s t r a t e s a l lk i n e t i cr u n sw e r ep e r f o r m e dw i t hal a r g ee x c e s so fs u b s t r a t e t oa c h i e v ep s e u d o f i r s t o r d e rc o n d i t i o n sf o rt h er e d u c t i o no ft h ef e r r i cc o m p l e x e s f o r e a c hs u b s t r a t e ，a tl e a s tf i v em e a s u r e m e n t sw e r em a d eo f sa n dt h ea b s o l u t e s e c o n d - o r d e rr a t ec o n s t a n t s 恕c o r rw e r ec a l c u l a t e db yal e a s t - s q u a r e sf i t t i n gp l o to f s v e r s u ss u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n f o u rc o m p o u n d sa r es h o w e dt h ea c t i v i t y k e yw o r d s ：l i p o x y g e n a s em o d e lc o m p l e x ；g e o m e t r i cs t r u c t u r e ；a c t i v i t y 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 论文主要创新点 通过改进方法合成了含多苯并咪唑的配体t t h b 及其衍生物，同时合成了新的 脂氧合酶模型化合物，六个化合物都为双核结构，中心阳离子f e 为变形八面体构 型，化合物都含有烷氧基小分子配体。设计合成的含烷氧基的f e ( i i i ) 化合物，与含 弱c h 的有机底物反应，表现出了夺取有机底物氢原子的活性。 硕士学位论炙 m a s t e r st h e s i s 摘 a b s t r a c t 论文主要创新点 目录 第一章绪论” 1 1 1 1 1 1 脂氧合酶的简介1 1 2 脂氧合酶的生理作用”2 1 3 脂氧合酶的结构”2 1 4 脂氧合酶途径一4 1 5 脂氧合酶的催化机理4 1 6 仿生金属酶的进展”6 1 7 脂氧合酶的活性测试一8 1 8 选题及意义“8 第二章合成部分一 1 0 2 1 实验试剂与实验仪器1 0 2 1 1 化学试剂“1 0 2 1 2 实验仪器1 0 2 2 配体的合成与纯化1 0 2 3 配合物晶体培养1 2 2 4 结果与讨论1 3 2 4 1 配体的合成与讨论13 2 4 2 配合物的合成与讨论一1 4 第三章配合物的结构与表征1 5 3 1 配合物的光谱性质“1 5 3 1 1 配合物的红外光谱15 3 1 2 配合物的紫外可见光谱1 6 3 2 配合物的晶体结构”1 7 3 3 配合物的电化学性质2 7 3 4 结论3 0 第四章模型配合物的活性研究 4 1 弓j - 占31 4 2 实验部分3 2 4 2 1 试剂和仪器3 2 4 2 2 底物的合成3 2 4 2 3 实验方法“3 2 4 3 结果与讨论“3 7 结论与展望 3 9 结论3 9 展望3 9 参考文献 附录一 致谢 4 0 4 3 4 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章绪论 动物在受到疾病或天敌侵害时，便会自发启动防御系统，抵抗侵害。研究发现 植物和动物样，当受到干旱、洪涝、温度等逆境胁迫，化学损害或病原体侵染时， 也能通过防御机制来保护自己，而且植物的防御机制与动物的防御机制存在许多相 似之处。脂氧合酶途径在植物抗性机制中非常重要，脂氧合酶途径( l o 途径) 是指多 不饱和脂肪酸及其相应酯经脂氧合酶催化加氧生成脂氢过氧化物，再进一步代谢为 其它生理活性物质，如茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ) 、愈创酸( t r a u m a t i ca c i d ) 等，这些代 谢物质与植物的抗性机制密切相关。脂氧合酶( l i p o x y g e n a s ，缩写l o ) 是一种分布 广泛的氧合酶，不仅存在于植物体内，而且存在于动物体内，在动物体内可催化不 饱和脂肪酸发生过氧化反应，其代谢产物主要是白三烯( l e u k o t r i e n e ) 、前列腺素 ( p r o s t a g l a n d i n s ) 和氧化脂质( l i p o x i n ) 等物质，与肿瘤、炎症、哮喘、动脉硬化等疾 病的发生和发展有关。因此，脂氧合酶已成为化学、医学、生物学等众多领域的研 究热点，本章就对其的一些研究情况进行概述。 1 1 脂氧合酶的简介 脂氧合酶( l o ) 俗称脂肪氧化酶，是一类含非血红素铁或锰的氧合酶，专一催化 含有顺、顺1 ，4 戊二烯结构单元的不饱和脂肪酸及其相应酯的加氧反应训。l o 广 泛的存在于自然界中，不仅存在于动物，植物体内，在一些低等生物例，部分微生物 【4 5 】中也均有发现。l o 最初报道于1 9 3 2 年，来源于植物中的大豆【6 。，而动物中的l o 是在1 9 7 5 年报道的【7 - 8 1 。植物e p l o 分子量一般在9 0 ，0 0 0 1 0 0 ，0 0 0 之间，动物中l o 分 子量比植物的稍小一些，在7 5 ，0 0 0 左右。l o 具有酶的特性，凡含有顺，顺1 ，4 一戊二 烯结构的不饱和脂肪酸，都可以作为其底物进行加氧反应。在植物中，亚油酸 ( l i n o l e i ca c i d ，l a ) 和亚麻酸( l i o n l e n i ca c i d ，l a n ) 是l o 最常见的底物，氧可加在亚 油酸和亚麻酸碳氢链的c 9 位置上，也可加在c 1 3 位置上，因此将植物l o 分为9 - l o 和 1 3 - l o l 9 1 。在哺乳动物体内，花生四烯酸( a r a c h i d o n i ca c i d ，a a ) 是l o 的主要底物。 氧主要加在花生四烯酸碳氢链的c 5 、c 8 、c 】2 、c 1 5 位置上，也可加在c 9 、c i j 位置上， 加氧位置见图1 1 。 亚油酸( l i n o l e i ca c i d )亚麻酸( l i n o l e n i ca c i d ) o o h 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s o o h 花生四烯酸( a r a c h i d o n i ca c i d ) 图1 1 脂氧合酶催化亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸的加氧位置 1 2 脂氧合酶的生理作用 l o 是植物体内的一种催化剂，广泛参与了植物生长、发育、成熟、衰老、防御 等过程的调控。l o 催化脂质降解的代谢产物，是导致稻谷储存期间品质下降并产生 特殊气味的主要原因之一，l o 还能使植物产生特有的风味物质【l o - 1 1 域者作为储存蛋 白而存在【1 2 】。l o 作为植物成熟和衰老过程中的一类关键酶，它催化不饱和脂肪酸 进行氧合反应，脂质过氧化的产物一氢过氧化物和氧化自由基对细胞膜系统、蛋白 质和d n a 起到毒害作用，从而导致细胞丧失功能，促进组织衰老。在植物体受到外 界生物和非生物胁迫时，会产生一些信号分子，如茉莉酸及其甲酯、脱落酸、愈创 素、植物二烯酸等，它们对植物的抗逆性反应起重要的调节作用。亚油酸经l o 催化 生成亚油酸过氧化物l o o h 以及一系列小分子物质，如醛、酮、酸、酯等，这些物 质与植物的抗性机制相关。l o 作用于亚麻酸形成的氢过氧脂肪酸，进一步裂解生成 1 2 碳( 1 2 氧顺9 十二烯酸) 和6 碳( 己醛或顺3 己烯醛) ，它们经异构化反应可形成 愈创激素或愈伤素，再经非酶氧化形成创伤酸，这些物质在促进细胞分化、愈伤组 织形成、基因调控表达和抗病等方面起着重要作用。总之，l o 广泛参与了植物体内 的生理反应，其作用机制极其复杂，有待于进一步研究。 在动物体内，l o 的报道比较晚，但其生理学功能已基本确定，它主要催化内源 底物花生四烯酸和其他多不饱酸发生过氧化反应，其代谢产物主要是白三烯、前列 腺素和氧化脂质等介导物质。白三烯是一种活性很高的生物活性因子，参与一些炎 症反应，与免疫性疾病的发生，动脉粥样硬化的发生发展，哮喘的发病机制，肝脏 的病理生理过程都有密切关系。前列腺素在呼吸、生殖、消化、神经、心血管系统 发挥着重要作用，可以引发微脉管系统扩张，控制细胞毒素毒害的功能。近几年的 研究表明，l o 通路在人类肿瘤的发生和发展中也有重要的作用，包括胰腺癌，乳腺癌， 前列腺癌，结肠癌等【l 孓1 5 】。因此全面了解l o 的结构和作用机理，可为药物设计提供 理论依据，为疾病的防治带来新的希望。 1 3 脂氧合酶的结构 l o 是一种非血红素蛋白，从研究大豆l o 及其活性部位结构开始，基本确定结 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 构的多种l o 活性部位都是以铁原子为活性中心的。直到后来，o l i w 在小麦全蚀病菌 中发现含有锰活性中心的酶同样可以催化亚油酸和亚麻酸进行氧合反应，这种酶的 催化底物和机理基本与植物l o 相同，并认为其属于l o 1 6 。17 。无论是动物l o 还是植 物l o ( 女n 大豆l o 、兔网状红细胞1 5 l o 和人5 l o 等) 均包含1 个非血红素铁或锰作为 活性中心的催化成分，1 个水分子和5 个氨基酸残基作为铁、锰配基。l o 来源不同， 其氨基酸组成也有所不同，目前l o 结构研究最详尽的是2 种大豆脂肪氧合酶同工酶 ( s l o 1 ，s l o 3 ) 和从兔体内分离的脂肪氧合酶( r l o 1 5 ) 。虽然植物l o 的氨基酸残 基数目和动物l o 的有所不同，但它们的氨基酸序列在某些区域内却有很大相似性，因 而其催化氧合反应的机理基本相同。l o 活性部位的结构尚不完全清楚，其活性部位 的基团可能含有铁、锰、芳香族氨基酸残基和氮氨酸残基等。 目前普遍认为催化中心与离子铁、锰有关，在大豆体内，l o 处于静态时以f e ( i i ) 为配位中心，活化态以f e ( i i i ) 为配位中心。大豆脂氧合酶( s l o 1 ) 是以f e ( i i ) 为其中心 离子，形成六配位的八面体结构，配位原子分别来自h i s 4 9 9 、h i s s 0 4 、h i s 6 9 0 - 三个组氨 酸咪唑氮，天冬酰胺( a s n 6 9 4 ) 的一个羰基氧，异亮氨酸( i l e s 3 9 ) 的一个羧基氧，最后一 个配位原子可能是水分子中的氧，它与异亮氨酸羧基中的另一个氧原子形成氢键( 见 图1 2a ) 。而大豆脂氧合酶( s l o 3 ) 也是以f e ( i i ) 为中心离子的八面体结构，其配位原 子分别来宦i h i s 5 1 8 、h i s t 0 9 、h i s 5 2 3 三个组氨酸咪唑氮原子，天冬酰胺( a s n 7 1 3 ) 的一个 羰基氧原子，异亮氨酸( i l e s 5 7 ) 的一个羧基氧原子，最后一配位原子是水分子中的氧。 一钦h - - - 量o 一f f - n h 埝 嬲舱$ f k i n h 2 嬲嘲s 8 9 4 煳 6 9 0 砥晶 h i s 产l 、l h ( a ) s l o 1( b ) r l o - 1 5 图1 2l o 的f e u 离子态中心结构 兔子体内脂氧合酶( r l o 1 5 ) 的活性部位与s l o 1 、s l o 一3 相似( 见图1 2b ) ，也 是以f e ( i i ) 为中心离子的八面体结构，配位原子分别来i 刍h i s s 4 s 、h i s 3 6 1 、h i s 3 6 6 、h i s s 4 1 四个组氨酸咪哗氮，异亮氨酸( i l e 6 6 3 ) 的一个羧基氧，最后是一个空位，可能接受外 源小分子配体，如水等【1 8 】，水分子配位在l o 催化过程中起着关键的作用。 。矗、 硕士学位论炙 m a s t e r st h e s i s 1 4 脂氧合酶途径 l o 途径是指具有顺、顺一1 ，4 戊二烯结构的多不饱和脂肪酸及其酯在有氧条件下 经l o 催化生成氢过氧化物，再经下游一系列不同酶的作用生成具有一定生理功能的 活性物质。在植物体内，十八碳酸通常为l o 途径的初始底物，故称十八碳酸途径， 动物体内的初始底物为花生四烯酸，因此又称二十碳酸途径。l o 途径通常处于静息 状态，只有当生物体生长发育到一定阶段或受到环境胁迫时才启动l l9 】。l o 途径的 初始底物多不饱和脂肪酸来自经水解酶或脂肪酶水解的甘油酯，磷脂，因此，广义 的l o 途径包括甘油酯，磷脂的水解过程，狭义的l o 途径是从多不饱和脂肪酸的催 化氧化开始的，动植物体内脂氧合酶途径见图1 3 。 图1 3 植物、动物体内脂氧合酶途径 1 5 脂氧合酶的催化机理 在对s l o 1 稳态动力学研究中，s l o 1 催化底物反应存在滞后现象，证实其在 静态时以f e 2 + 为配位中心存在，不具有催化活性，在催化不饱和脂肪酸氧化之前， 首先要经过一个酶活性诱导的过程，将其氧化成活化态的f e 3 + 活性中心，在生物体 内，f e 2 + - o h 2 由少量的烃过氧化物( r - o o h ) 氧化为f e ”- o h 2 0 j 。在诱导l o 氧化过程 中，l o 由无色的f e 2 + 配位中心氧化生成黄色的含f e ”配位中心的活性f e 3 + - o h ( h a a x = 3 5 0 n m ) ，过量的l o o h 或烷基过氧化物( r o o h ) 会将f e 3 + - o h 继续氧化成紫 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 色的f e 3 + - o o h ( l r n a x = 5 8 5 n m ) ( 见图1 4 ) 。氧化过程中价态和颜色的变化可作为l o 催化作用过程的一个佐证。 舛詈 c o l o r l e s s y e l l o w ) , m a x3 5 0a m a x i a lg = 6 o o r 舛ts； 机金属化合物机理，另外一种是自由基机理【2 1 - 2 3 1 。两种机理中脂肪酸代谢的决速步 ( k 默= 5 5 8 n m ) ，此峰归属为r o o 至l j f e l l l 离子的的荷移光谱，认为可能存在f e 1 与底物 = 八 h = a l a o 、n = a 。h h。ishi,卜i,、xxh 蚰i s h i 。s 夕t , 卜i , 、h i s h i s l i l t , , 兮! a h 、x h 锄i s 一k 心 、 -k 一 阱i r o ， 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 生成氢过氧化物，从f e ( i h ) 活性中心释放出来，然后进入下一循环过程，见图1 6 。 s o m e r i z a t i o no f d i e n e m = m n ，f e 图1 6 底物自由基机理 1 6 仿生金属酶的进展 自然界进化产生的各种金属酶，在生物体内扮演着重要的角色，每种金属酶都 具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型反应。仿生金属酶是通过对酶活性部位 的模拟、设计、合成的小分子模型化合物，这些化合物分子小，结构简单，但含有 酶所具有的主要活性基团以及与酶活性中心相似的空间结构，能够模拟酶的某些关 键性功能。金属酶活性部位的模拟不仅可以了解酶的作用机制，而且对发展小分子 量仿生催化剂有重要作用。 为了在生物体外模拟l o 的催化作用，生物无机化学工作者根据l o 的活性部位 合成了一系列含铁模型配合物，通过催化不饱和脂肪酸代谢产生醇、醛、酮、酸、 脂等来研究其活性。y u z on i s h i d f l 2 4 彩】j 、组用含羧基、苯并咪唑( b z i m ) 、毗唑( p z ) 、 吡啶( p y ) 等配位基团的配体l 1 ，l 2 ，e d t a ，a c e n 合成了单核铁配合物n a f e ( e d t a ) 】、 【f e ( a c e n ) c l 】及双核铁的配合物 f e 2 l 1 ( c h 3 c 0 2 h 。、 f e 2 l 2 ( n 0 3 ) 5 】( e d t a = 乙二胺四乙 酸；a c e n = 1 , 2 一二乙酰丙酮基一乙二胺) 。并以亚油酸和亚麻酸作为底物，跟踪测试 其氧化产物与2 一硫代巴比妥酸( t b a ) 的加合物，通过测定在5 3 2 n m 处吸光度的变化， 推测配合物催化底物时活化氧分子的催化机理。该小组还用拟酶化合物f e ( n t b ) c 1 3 ( n t b = 三( 2 一苯并咪唑甲基) 胺) 与叔丁基过氧化氢作用，观察到有不稳定中间体出 6 3 脚峨 哪、o笆f鲞 、 胍差 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 现，推测反应过程可能有类似于l o 中f e n - o h 2 、f e r n - o h 、f e m - o o h 几种配位形式 间的转化。l a w r e n c eq u e d , 组以含吡啶的配体t p a ( t p a = 三( 2 一吡啶亚甲基) 胺) 及 其衍生物t l a ( 6 m e 3 t p a ) ( t l a = 三( 6 一甲基一2 一吡啶亚甲基) 胺) 合成了一系列单 核铁的模型化合物，其中合成的亚铁化合物 f e ( 6 m e 3 t p a ) ( p h c 0 2 ) c 1 0 4 与叔丁基 过氧化氢作用，生成桃红色物质，在k x = 5 0 8 n m 处有吸收峰，通过拉曼光谱研究证 明该光谱为r o o 到f e 3 + 的荷移光谱。另外报道的模型化合物还有 【f e ( b p t e t a ) ( c 1 0 4 ) 2 ，【f e ( p y s ) ( m e o h ) ( o t 0 2 u 小剧1 ，【f e t n p a ) ( o h ) ( r c o o ) 】( r = h 、 c h 3 、c 6 h 5 ) 2 8 - 2 9 】，【f e h ( p z b ) 2 】等，几种配体的结构见图1 7 。 h o o c n j h o o c h n o h l l n c o o h o o h t n p a 删 丫 o h l 2 州 m 图1 7 几种配体的结构 7 h h n t b p y 5 ： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 7 脂氧合酶的活性测试 目前已报道的脂氧合酶活性测试方法有：量压法( q u a n t i t yp r e s s u r e ) 、分光光度 法( s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d ) 、氧电极法( o x y g e ne l e c t r o d e ) 、同位素标记法( i s o t o p e s n o t a t i o n ) 、显色法( c o l o rm e t h o d ) 、染色法( s t a i n i n gm e t h o d ) 等。 量压法是在一定体积的密闭体系中，l o 催化底物与氧结合，使得体系内氧气含 量减少，在恒温条件下体系的气体总压下降，通过这个变化值计算出反应的耗氧量， 耗氧量与酶反应强弱呈线性相关，从而分析酶的活性大小。 分光广度法是l o 催化底物反应生成具有共轭二烯结构的氢过氧化合物，其在 2 3 4n l n 附近出现特征吸收峰，通过吸光度测定可知共轭二烯量，进而推算出酶活性 大小。 氧电极法是在底物浓度相同的情况下，随着反应时间的变化，反应体系中氧的 浓度与酶活性大小呈线性相关，即溶液中氧浓度的减少速率与酶活性大小成正比。 同位素标记法是将l o 作用的底物进行同位素标记，根据代谢产物中放射性物质 的量来确定l o 的活性。 显色法有f e ( c n s ) 3 显色法和硫代巴比妥酸显色法，通过l o 催化底物产生的初级 产物与f e ( c n s ) 3 生成有色化合物的特性，来测定吸光度，确定酶活性大小；硫代巴 比妥酸显色法是l o 催化底物氧化的最终产物醛能与2 硫代巴比妥酸结合，生成黄色 或红色加合物，采用分光光度法定量测定酶的活性。 亚甲蓝染色法( m b b ) 是将含有亚油酸的混合物与亚甲蓝等溶液混合生成有特定 吸光度值的有色化合物，测定其吸光度确定酶活性大小；胡萝卜素染色法( c b ) 将含 有亚油酸的混合底物与b 胡萝卜素丙酮溶液快速混合后添5 h i l o 提取物，测定混合物 吸光值确定酶活性大小；淀粉一碘化钾法( k i s ) 是将l o 提取物与亚油酸混合静置后， 加入一定量淀粉与碘化钾等溶液，通过测定吸光度值确定酶活大小。 每种方法都有各自的优缺点 3 0 - 3 3 】。在l o 活性测定的方法上，目前根据不同试验 目的的需求在不断的进行改进。 1 8 选题及意义 脂氧合酶在生物体内有着重要的作用，它不仅参与不饱和脂肪酸的代谢反应， 而且还关系到细胞分裂、老化及胁迫等生理、病理过程。因此在体外模拟脂氧合酶 并研究其活性有着重大的意义，为植物的抗性机制以及一些疾病的药物设计提供理 论依据。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 庶村潦罩印 扩咯钭芦 图1 8t t h b 的结构 9 矗、 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第二章合成部分 2 1 实验试剂与实验仪器 2 1 1 化学试剂 三乙四胺六乙酸( t t h a ) ，邻苯二胺，9 ，1 0 二羟基葸( d h a n ) ，1 , 4 环己二烯 ( c h d ) ，乙二醇，丙酮，苄基溴，溴乙烷，六水高氯酸亚铁( f e ( c 1 0 4 ) 2 6 h 2 0 ) ( 自制) ， 高氯酸铁( f e ( c 1 0 4 ) 3 9 h 2 0 ) ( 自制) ，乙腈，甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，乙醚，石油 醚，丙酮，二氯甲烷，n ，n 二甲基甲酰胺，蒸馏水，重水，三乙胺，四丁基氢氧化 铵，高氯酸铵，盐酸，浓氨水，浓硫酸，氢氧化钾，氢氧化钠，碳酸钾，硅胶，氢化钠， 氢化钙。 领苯二胺为化学纯试剂( c r ) ，其它均为分析纯试剂( a r ) 。 2 1 2 实验仪器 b r u k e rt e n s o r2 7 型红外光谱仪；w s7 0 1 型红外快速干燥器；显微熔点测定 仪；融g 灿s a t u r n7 2 4 + c c d 单晶衍射仪；t u 1 8 1 0 型u v - s 分光光度计；s p e c o r d 2 1 0 型紫外可见分光光度计；c h i 6 6 0 型电化学分析仪，电解池为三电极电解池： 对电极p t ，工作电极玻碳电极，参比电极a g a g c i 电极；a p l 2 0 0 0 型电喷雾质谱分 析仪；r e 2 0 0 0 型旋转蒸发仪；手套箱。 2 2 配体的合成与纯化 配体是依据已有文献【3 4 】报道的方法合成的，用邻苯二胺和化学纯原料多元氨酸 按适当比例在乙二醇中反应合成。用蒸馏水多次洗涤，过滤，干燥，再用柱色谱分 离提纯得到t t h b 配体，所得配体与苄基溴，溴乙烷按比例在丙酮中反应，蒸发掉 溶剂，蒸馏水洗涤，乙醇纯结晶，过滤，洗涤，干燥得到相应取代基配体。 ( 1 ) n ，n ，n ，n ，n t ，n 六( 苯并咪唑基甲基) 三乙基四胺( t t h b ) 的合成与提纯： 称取1 2 6g 三乙四胺六乙酸( t t h a ) ，1 6 5g 邻苯二胺( 稍过量) 于2 5 0m l 带 支管的圆底烧瓶中( 物质的量比1 ：6 ) ，加少量的乙二醇刚好覆盖反应物，在惰气保 护下加热回流到1 8 0 ，继续反应馏出水蒸气。在加热过程中，固体很快熔成液体， 颜色逐渐加深，待3 小时后，呈现出紫色胶状粘稠物，很难搅动，继续升温至1 9 0 2 0 0 反应6 小时后，停止反应，稍冷，倾倒在p h 约为9 的冰水中，保持粘稠状，用 水多次浸泡洗涤，最后在水中加入少量的盐酸至胶体全部溶解。将溶液高度稀释后， 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 加入少量氨水至溶液由白色絮状物不再析出，过滤，干燥，得到白色固体。干燥后 的固体经柱层析法分离提纯，得1 7 1g 固体，产率为7 2 6 ，经测定，熔点约为 1 5 3 0 1 5 6 8 ，红外光谱与元素分析等方法表征了所合成的物质，与文献报道一致， 该产物分子式为c 5 4 h 5 4 n 1 6 ，m s ( m z ) ：9 2 7 3 ，此分子离子峰符合其结构，合成路线 见图2 1 。 ( 2 ) n ，n ，n ，n ，n ，n 六 2 ( 1 苄基苯并咪唑) 甲基 三乙基四胺( b z 6 t t h b ) 的 合成： 称取2 0gt t h b ，1 5gk o h 于1 0 0m l 圆底烧瓶中，加3 0m l 丙酮于6 0 c 下 搅拌回流，待大量固体溶解后为红棕色的澄清溶液后，滴加2 3g 苄基溴( 稍过量) ， 避光条件下反应6 小时，停止加热，冷却加水，过滤，为浅黄色固体，经乙醇重结 晶，得白色固体1 4g ，产率为4 5 。经测定，熔点1 0 1 1 0 3 ，该产物分子式为 c 9 6 h 9 0 n 1 6 ，合成路线见图2 2 。 ( 3 ) n ，n ，n ，n ，n ，n 六 2 ( 1 乙基苯并咪唑) 甲基 三乙基四胺( e t 6 一t t h b ) 的 合成： 称取2 0gt t h b ，1 5gk o h 于1 0 0m l 圆底烧瓶中，加3 0m l 丙酮于6 0 下 搅拌回流，待大量固体溶解后为红棕色的澄清溶液，滴加1 5g 溴乙烷( 稍过量) ， 避光反应6 小时后，停止加热，蒸发掉丙酮，加水，过滤，为棕黄色粘稠物，将固 体溶于盐酸，稀释，加氨水调节p h 约为7 ，过滤，干燥得白色固体o 7g ，产率为 3 0 。该产物分子式为c 6 6 h 7 s n l 6 ，m s ( m z ) ：1 0 9 5 5 ，此分子离子峰符合其结构，合 成路线见图2 2 。 h o o c h o o c 阿洲2 + h o o c a n n 1 沙n c o o h o