（微生物学专业论文）海洋微生物乳化活性物质和高温微生物脱硫的研究.pdf

摘要 微生物乳化剂活性物质和高温脱硫菌代谢产物的研究 摘要 2 0 世纪初人们发现有一些微生物能够降解水体中的油污染物，目前，石油污 染物的微生物降解已经从微生物学、分子生物学等理论进入了以生物修复为主的 实际应用，生物乳化剂对于石油类水溶性低的污染物的生物降解具有促进作用。 石油中的有机硫化物是其中的一类污染物，传统的加氢脱硫方法( h d s ) 难 以有效除去有机硫，成本高，操作困难。生物脱硫被认为可以有效补充甚至取代 h d s 。该论文主要对深海环境中筛出的细菌产生的生物乳化剂的活性成分进行了 研究并且对高温脱硫菌的代谢产物进行了分析。 第一部分对2 株模式不动杆菌和本实验室分离的3 株不动杆菌产生的生物乳化 剂的活性成分进行了分析。 本文对3 株深海沉积物来源的不动杆菌和2 株模式菌进行了产生物乳化剂能 力、活性成分及相关基因的分析，结果表明这些菌都能产生生物乳化剂。通过 p c r 检测，5 株菌中只有深海降解菌w p 0 2 4 2 1 获得了与乳化剂e m u l s a n 产生密切 相关的脂酶基因，气质联用仪证明该菌所产的乳化剂含有脂肪酸组分，主要是正 十六烷酸和正十八烷酸，说明菌株w p 0 2 4 2 1 产生的乳化剂与e m u l s a n 类似，糖脂 是主要成分之一。此外，通过p c r 检测，证明了5 株不动杆菌全部编码外膜蛋白 a 基因( o m p a ) 。它们的氨基酸序列与a c i n e t o b a c t e rr a d j o r e s e s t e n sk a 5 3 的 乳化剂a l a s a n 中的主要活性蛋白a l n a 的同源性为7 1 2 6 一8 0 2 3 。以上结果 表明，5 株菌都能产生类似a l n a 的乳化蛋白，而w p 0 2 4 2 1 菌株同时还产生e m u l s a n 中的糖脂。 5 株不动杆菌全部编码外膜蛋白a 基因( o m p a ) ，我们将与a l a s a n 蛋白同 源性最高的w p 0 2 4 2 1o m p a 在大肠杆菌中进行表达。用特异性引物o m p 扩增菌 株w p 0 2 4 2 1o m p a 基因，将w p 0 2 4 2 1o m p a 全长基因连接载体后导入大肠杆菌中 进行表达，o m p a 基因在大肠杆菌中大量表达，但是蛋白产物都是无活性的包涵 体。 即使减少表达时间、降低表达温度和降低i p t g 的浓度，也不能使蛋白质以 摘要 可溶的有活性的形式存在。通过包涵体在n i a g a r o s e 介质上复性和纯化，从菌 体总蛋白中可以得到纯化的重组蛋白，纯化的重组蛋白对不同碳链长度的烷烃有 乳化活性，其中对正十六烷的乳化活性最强。 为了得到大量的可溶性分泌到胞外的蛋白质，将不动杆菌的外膜蛋白基因片 段在酵母中表达。用引物o m p 扩增w p 0 2 4 2 1 外膜蛋白全长基因，e c o ri 和x b a i 双酶切片段，将w p 0 2 4 2 1o m p a 基因连接载体后转入酵母感受态细胞，甲醇诱 导表达。将w p 0 2 4 2 1 扩增的外膜蛋白片段在大肠杆菌和酵母中进行了表达，对 表达蛋白进行了乳化活性的测定，测定结果表明酵母表达w p 0 2 4 2 1o m p a 只对 正十六烷有乳化活性。目前，j c m 6 8 4 1 ，j c m 6 8 4 2 ，b m e 一3 ，b m 8o m p a 基因已 经载入质粒中，线性话后电击转入酵母感受态，筛选出高效表达重组子，甲醇诱 导酵母表达工作正在进行之中，最后对w p 0 2 4 2 1 菌的性质进行了研究。 第二部分是海洋脱硫微生物的研究。 用d b t 为唯一硫源培养基对常温脱硫菌和高温脱硫菌进行筛选，筛出的菌种 分别为d b t - 1 ，d b t - 2 ，d b t - 3 ，d b t - 4 ，d b t _ 6 0 1 和d b t 6 0 2 ，其中d b t - 1 ，d b t - 2 ， d b t - 3 ，d b t - 4 为常温菌，d b t - 6 0 1 和d b t - 6 0 2 为6 0 筛选出的高温菌。经1 6 s r d n a 分析，筛选出高温脱硫菌都是芽孢杆菌，常温脱硫菌分布在假单胞菌属、红球菌 属、短杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属。经鉴定d b t - 1 和d b t 2 都属于芽孢杆菌 属，并且对高温菌的最适生长温度进行了测定，发现它们的最适生长温度为6 0 。 本文研究高温菌d b t - 6 0 1 将d b t 降解途径的方法是将培养液浓缩进入g c m s 分 析代谢产物，结果表明与传统的4 s 途径不同，d b t 降解的经典途径为进行4 s 途 径将d b t 降解为2 羟基联苯，而菌株d b t - 6 0 1 培养液中d b t 的代谢产物为3 羟基 一1 ，1 联苯。 这个途径由d s z a ，d s z b ，d s z c 这三种单加氧酶催化，根据保守序列，设计引物 扩增高温菌d b t 6 0 1 ，d b t 6 0 2 的单加氧酶基因。没有克隆到相关基因，可能代 谢途径不同。 石油中除了含有较难降解的物质d b t p i ，还含有其他的含硫化合物硫化物 摘要 降解范围也是细菌降解硫化物能力的指标。高温菌6 0 1 在噻吩，4 甲基d b t ，2 一 噻吩甲酸，2 噻吩乙酸，d b t ，b t h 中都有不同程度的生长，说明高温菌6 0 1 在 脱硫方面有十分广泛的应用前景。 关键词：海洋细菌；生物乳化剂；生物脱硫：o m p a i i i a b s 仃a c t s t u d i e so ne m u l s i f i e r - p r o d u c i n ga n d d b t - d e s u l f u r i z i n g b a c t e r i af r o mm a r i n ee n v i r o n m e n t s i th a sb e e nf o u n ds o m em i c r o b e sc a nd e g r a d es o m eo i lp o l l u t i o ni nw a t e r s t h e r e s e a r c ho fm i c r o b i a l d e g r a d a t i o no fo i lp o l l u t i o nw a sa b o u tt h et h e o r y o f m i c r o b i o l o g ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y , a n dr e c e n t l yi ti sa b o u tt h ep r a c t i c a la p p l i c a t i o n m a i n l yi nb i o l o g i c a lr e s t o r a t i o n b e c a u s et r a d i t i o n a lh d sh a r d l yg e tr i do fo r g a n i c s u l f u r ，j u s t a sd b ta n di t sd e r i v a t i v e sa n di t sh i g hc o s t ，d i f f i c u l to p e r a t i o n ，h d s h a r d l y s a t i s f i e sm o r ea n dm o r e r i g i d s u l f u r - f r e e d e s i r e h o w e v e r ，b i o l o g i c a l d e s u l p h u r i z a t i o nn o to n l yg e t sr i do fo r g a n i cs u l f u re f f i c i e n t l y ，b u ta l s oh o l d s c o m b u s t i o nv a l u e a l s od u et ot h es i m p l eo p e r a t i o n ，l o wc o s t ，a n dl o wl e v e r g r e e n h o u s eg a s ，s ob d sc a ne f f i c i e n t l yc o m p l e m e n t sa n de v e ns u b s t i t u t eh d s t h i s p a p e ra n a l y z e st h ea c t i v em a t e r i a lo ft h ee m u l s i f i e rp r o d u c e dt h em i c r o o r g a n i s mf r o m t h ed e e p - s e ae n v i r o n m e n ta n dt h em e t a b o l i cp r o d u c tp r o d u c e db yh i 曲- t e m p e r a t u r e d e s u l p h u r i z a t i o nm i c r o o r g a n i s m s t h ef i r s tp a r ta n a l y z e st h ea c t i v em a t e r i a lo fe m u l s i f i e r sp r o d u c e db yt h r e em o d e l a c i n e t o b a c t e ra n dt h r e ea c i n e t o b a c t e rs t r a i n si s o l a t e df r o mo u rl a ba n dc o n n e c t i o no f t h e s ed i f f e r e n te m u l s i f i e r s f i v es t r a i n so fa c i n e t o b a c t e rw e r ei n v e s t i g a t e df o rb i o e m u l s i f i e rb yp u r i f i c a t i o n ， c o m p o n e n t sa n a l y s i sa n dg e n ed e t e c t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a ta l lt h e5b a c t e r i ac o u l d p r o d u c eb i o e m u l s i f i e r s o n l yf r o m a ni s o l a t ew p 0 2 4 21f r o md e e ps e d i m e n t ，p c r a s s a yd e t e c t e dt h ep r e s e n c eo ft h eg e n eo fe s t e r a s ew h i c hl o c a t e do nt h em e m b r a n e a n dm e d i a t e de m u s l a nr e l e a s ef r o mt h ec e l lt oc u l t u r e g a sc h r o m a t o g r a p h ya n dm a s s s p e c t r o m e t r y ( g c m s ) a n a l y s i s r e v e a l e dt h ec o m p o n e n t so f f a t t ya c i d s a st h e c o n s t i t u e n t so fb i o e m u l s i f i e rp r o d u c e db yi s o l a t e w p 0 2 4 2 1 ，a n di d e n t i f i e da s h e x a d e c a n ea n do c t a c e c a n o i ca c i d s t h er e s u l t so fe s t e r a s ea n df a t t ya c i d si n d i c a t e d t h a tg l y c o l i p i dw a sm o s tp r o b a b l yp r e s e n ti nt h eb i o e m u l s i f i e rp r o d u c to fw p 0 2 4 21 s i m i l a rt oe m u l s a n i na d d i t i o n ，f r o ma l lt h e5s t r m n sb yp c r ，a no u t e r m e m b r a n e p r o t e i nag e n e ( o m p a ) w a sd e t e c t e d i ts h o w e dv a r i e dh o m o l o g i e si nr a n g ef r o m i i i a b s t r a c t 71 2 6 t o8 0 2 3 w i t ht h em a i ne m u l s i f y i n gp r o t e i na i n ai nt h ee m u l s i f i e ra l a s a n p r o d u c e db ya c i n e t o b a c t e rr a d i o r e s i s t e n sk a 5 3 t h i ss u g g e s t st h a to m p a m a y b et h e a c t i v ec o m p o n e n to ft h ee m u l s i f i e rp r o d u c e db yt h e5a c i n e t o b a c t e rs t r a i n s t h e r e f o r e ， b o t hg l y c o l i p i da n do m p ap r o b a b l ye x i s ti ni s o l a t ew p 0 2 4 21a st h eb i o e m u l s i f e r s f i v ea c i n e t o b a c t e rs t r a i n sc a nc o d eo m p ag e n e ，i np a r t i c u l a r l y , w p 0 2 4 2 1 o m p a g e n ew h i c hh a st h ec l o s e th o m o l o g yw i t ha l a s a ng e n eh a sb e e ne x p r e s s e di ne c o l i p r i m e ro m p ai su s e dt oa m p l i f yw p 0 2 4 21o m p ag e n ea n dt h e nw p 0 2 4 2 1 o m p a w h o l eg e n es e q u e n c ei nl i g a t e di n t oe c o l i t h er e s u l ts h o w s o m p ap r o t e i nc a l lb e e x p r e s s e di ne c o l ia b u n d a n t l yi nt h ef o r mo fi n c l u s i o nb o d y c o m b i n e dp r o t e i ni ss t i l li n c l u s i o nb o d ya l t h o u g hi n c u b a t i o nt i m e 、t e m p e r a t u r e 、 i p t gc o n c e n t r a t i o ni sr e d u c e d w ec a ng e tp u r ec o m b i n e dp r o t e i nf r o mt h ew h o l e p r o t e i nb yr e n a t u r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no nn i a g a r o s em e d i u m t h ep u r i f i e dp r o t e i n h a se m u l s i f y i n ga c t i v i t yt oo i l w ee x p r e s so m p ai ny e a s ti no r d e rt og e tm o r ep r o t e i ne x c r e t e de x t r a c e l l u l a r p r i m e ro m pi su s e dt oa m p l if yw p 0 2 4 21o m p ag e n ew i t he n d o e n z y m ep o i n te c o ri a n dx b aia n dt h e nw p 0 2 4 21o m p aw h o l eg e n es e q u e n c ei nt r a n s f o r m e di n t oy e a s t w h i c hi si n d u c e db ym e t h a n 0 1 t h ec o m b i n e dp r o t e i nh a se m u l s i f y i n ga c t i v i t yt o h e x a d e c a n e r e c e n t l nj c m 6 8 41 ，j c m 6 8 4 2 ，b m e 一3 ，b m - 8o m p ag e n e s a r el i g a t e d i n t op l a s m i dw h o s ei sl i n e a r i e di n t oy e a s t t h es t u d ya b o u te x p r e s s i o ni si nt h e p r o c e s s ，f i n a l l y , w es t u d yt h ep r o p e r t yo f t h es t r a i nw p 0 2 4 21 t h es e c o n dp a r ti sa b o u tt h es c r e e no fn o r m a lt e m p e r a t u r ea n dh i g ht e m p e r a t u r e d e s u l f u r i z i n gs t r a i ni nc u l t u r em e d i u mw h i c ht h es u l f u rr e s o u r c ei sd b t , a n dt h e d o m i n a t i o no ft h es t r a i n sa r ed b t - 1 ，d b t - 2 ，d b t - 3 ，d b t - 4 ( n o r m a lt e m p e r a t u r e ) a n dd b t - 6 0 1 ，d b t - 6 0 2 ( h i g ht e m p e r a t u r e ) t h et y p i c a ld b td e g r a d a t i o np a t h w a yi s 4 sp a t h w a yw h i c hd e g r a d e sd b ti n t o2 - b i p h e n y l t h er e s e a r c hm e t h o do fd b t d e g r a d a t i o np a t h w a yi sc o n c e n t r a t i n g c u l t u r em e d i u ma n dt h e na n a l y z i n gt h e m e t a b o l i cp r o d u c t sb yg c m s d i f f e r e n tf r o m4 sp a t h w a y , t h em e t a b o l i s mp r o d u c to f d b ti s3 - o h 一1 ，1 b i p h e n y l t h i sp a t h w a yi s c a t a l y z e db yd s z a ，d s z b ，d s z cw h i c ha r em o n o o x y g e n a s e s a b s t r a c t a c c o r d i n g t oc o n s e r v a t i v e s e q u e n c e s ，w ed e s i g np r i m e r s t o a m p l if y t h e s e m o n o o x y g e n a s e si nt h eh i g ht e m p e r a t u r es t r a i n sd b t 一6 0 1a n dd b t 一6 0 2 ，b u tw ej u s t a m p l i f i e dg l y c e r i nd e h y d r o g e n a s e f i n a l l y ，w ed e t e r m i n e dt h eo p t i m u mg r o w t h t e m p e r a t u r eo ft h eh i g ht e m p e r a t u r es t r a i n e x c l u d ed b tw h i c hi sh a r d l yd e g r a d e d ， t h e r ea r eo t h e ro r g a n i cs u l f u rc o m p o u n di no i l t h ed e g r a d a t i o ns p e c t r u mo fo r g a n i c s u l f u ri st h es t a n d a r do fd e s u l p h u r i z a t i o na b i l i t y t h eh i g ht e m p e r a t u r es t r a i n6 0 1 g r o w t hw e l lo r b a di nt h ec u l t u r em e d i u mw h i c ht h i o p h e n ，4 一m e t h y ld b t ，2 一 f o r m y l t h i o p h e na n d2 - a c e t i c t h i o p h e n ，w h i c hs u g g e s t st h es t r a i nh a sb r o a da p p l i c a t i o n f u t u r ei nb i o d e s u l f u r i z a t i o n k e yw o r d s ：m a r i n eb a c t e r i a ；b i o e m u l s i f i e r ；b i o d u s u l f u r i z a t i o n ；o m p a v 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权 利和责任。 声明人( 签名) ： 2 0 0 7 年d 月引日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 4 ) ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名：椒日期：2 0 0 7 年叼月丐旧 导师签名：3 商c 呼日期：2 0 0 y s t 捐口f e l 刖盖 1 前言 1 1 生物乳化剂 生物乳化剂作为次生代谢产物有利于微生物在烃等水不溶性底物上生长，在 环境保护等方面有潜在的应用价值【3 1 。 1 1 1 生物表面活性剂的定义 2 0 世纪初人们发现有一些微生物能够降解水体中的油污染物，到目前石油 污染物的微生物降解已经从微生物学、分子生物学等理论进入了以生物修复为主 实际应用。人们研究过程中发现，微生物会合成很多种两亲化合物来提高对油的 利用效率。其中分子量小的化合物能明显降低油水界面的表面张力，被称为生物 表面活性剂f l 】。 1 1 2 生物乳化剂的定义和生物乳化剂的结构 分子量大虽不能降低表面张力，但有非常好的乳化能力，被称为生物乳化剂 ( b i o e m u l s o n ) 。生物乳化剂一般是两亲多糖，由一个亲水基团和一个疏水基团 构成，实际上有乳化能力的蛋白质、脂多糖、脂蛋白及其复合物都称为生物乳化 剂。其疏水基团为多为饱和、不饱或羟化的脂肪酸，亲水基团较多样化如脂肪酸 的羟基，糖脂中的多聚糖基。疏水基团和亲水基团的结合可通过酯键、酰胺键或 糖苷键【2 1 。 1 1 3 生物乳化剂及产生菌 多种不同属的细菌都能产生生物乳化剂( 表1 ) ，在不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 中，产胞外生物乳化剂是一种普遍现象【5 1 。因此，目前研究得最透彻的多聚生物 乳化剂是由不动杆菌属的不同种菌株产生的，成分多为乳化多糖6 1 。值得说明的 是，最重要的乳化剂生产菌株r a g 1 ，起初被误分在节杆菌( a r t h r o b a c t e r ) 属， 后来被鉴定为不动杆菌属，被称为乙酸钙不动杆菌r a g 1 似c a l c o a c e t i c u s r a g - 1 ) ，在美国菌种保藏中心编号为a t c c 3 1 0 1 2 ，最近归为a v e n e t i a n u s ，并 且命名为a v e n e t i a n u sr a g 1 。此外，生物乳化剂产生菌还有酵母菌、假单胞菌、 芽孢杆菌、盐单胞菌、红球菌等。 前言 1 1 4a v e n t i a n u sr a g 一1 和e m u l s a n e m u l s a n 是研究最早最深入的生物乳化剂之一。利用富集培养技术，人们获 得了一种能乳化海水中原油的混合微生物菌群，并从中分离出了一株细菌 r a g 1 ，经鉴定为a v e n t i a n u s ( a t c c3 1 0 1 2 ) 。r a g 1 能降解原油中6 0 的组份， 并能有效地将未降解的原油分散成小液滴( 直径为2 5 “m ) 。起初r a g 1 被来 治理海洋中的石油污染问题，可用于在空舱航行中油轮货舱油污的清除，并成为 了第一个相关专利( 美国专利，n o 3 9 4 1 6 9 2 ) 【9 1 。随后，世界范围内针对r a g 一1 和乳化多糖申请了2 0 多个专利，其中l e s l i em i s r o c k 在t e la v i v 大学获专利并 建立了p e t r o f e r mu s a 公司，实现了产业化。 表1不同微生物产生的生物乳化剂 t a b l e1 ：b i o e m u l s i f i e rf r o md i f f e r e n tm i c r o b e s 2 刚舌 + 在文献【4 】基础上作了补充。 a v e n e t i a n u sr a g 1 能代谢包括废油，长链脂肪酸、乙醇在内的多种碳源， 其中在乙醇或烷烃中产生一种生物乳化剂，命名为e m u l s a n 。当以2 的乙醇为 唯一碳源时，r a g i 能分泌最大量的e m u l s a n ，分子量大约是9 8 0 k d a i 蚓，是不 可透析的。e m u l s a n 是由蛋白质和一个带负电荷的糖脂组成的复合物，其中多糖 是它的主要成分【5 】。但是它的表面活性来自脂肪酸，这些饱和或不饱和脂肪酸 ( c 1 0 c 18 ) 通过o 一酯键和n 酰键与多糖骨架相连，占乳化多糖干重的 5 一2 3 【1 1 】，多糖骨架的化学组分为d 半乳糖胺( 2 5 ) ，l 一半乳糖胺糖醛酸 ( 2 5 ) ，二脱氧一二胺基己糖( 2 5 ) 。 生物乳化剂的微生物合成与菌株特性、培养基成分及生长条件有关，一般 产生于指数生长后期或稳定期的早期，这是微生物对不利环境限制所做出的一种 反应，是次生代谢。以乙醇为底物时培养格兰氏阴性菌发酵时，低浓度的磷会提 高生物乳化剂的产量【4 。1 。有报道称，a v e n e t i a n u sr a g 一1 生产胞外e m u l s a n 是 生长相关型与非生长相关型的混合体t 1 2 】，e m u l s a n 在浓度低到o 0 0 1 0 0 1 时， 仍然可以有效地乳化水中的油滴，而且它也是迄今为止最有效的油滴稳定性，甚 至在水油比例达到1 ：4 时仍然有划1 3 】。 在微生物发酵过程中，e m u l s a n 的化学性质会有很显著的变化 1 引，细菌能将 胞外脂肪酸整合入乳化剂，生物合成乳化剂的化学及物理性质在培养过程中会发 3 刖舌 生变化。为了研究生物乳化剂结构( 主要是脂肪酸成分类型和含量) 与功能的关 系，k a p l a n 等将a v e n e t i a n u sr a g 1 进行转座子突变，转座子的插入会引起涉及 生物素、组氨酸、半胱氨酸或嘌呤生物合成基因组的突变，从而影响整合入乳化 剂的脂肪酸的水平和类型，结果表明在多糖骨架上的长链脂肪酸会影响乳化活 性。这对利用基因工程进一步研究乳化剂产生菌奠定了基础，并且提供了寻找能 降解环境中污染物，用于生物修复以及医疗的具有两亲结构的新型化合物的途径 1 1 5 。 e m u l s a n 中蛋白质并非有活性的生物乳化剂，但是可以提高多糖组分的活 性。去除蛋白质后的e m u l s a n 会产生，一种新乳化剂，称为a p o e m u l s a n ，具有较 低乳化活性，但是乳化活性的下降可以通过加入大量的变性粗蛋白恢复。粗品 e m u l s a n 复合物中蛋白质含量为1 0 一2 0 ，这些蛋白质与e m u l s a n 对底物的 特异性有关，其中与乳化剂复合物密切相关的一种关键蛋白质为一种细胞表面 酯酶，我们从一株深海菌d n a 中扩增出了这种酯酶。有研究表明e m u l s a n 从细 胞表面释放是由这种酯酶介导，酯酶在有活性的e m u l s a n 一蛋白复合物中是一个 很重要的组分【l 引，这个蛋白质的分子量为3 4 5 k d a ，而且用h i st a g 系统连接在 p h a g e t 7 启动子之后在ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中克隆并且过量表达。过量表达后，在 包涵体里发现了8 0 9 0 的蛋白质，过量表达的酯酶可以通过去氧胆酸盐恢复活 性，在慢性透析后，用金属鳌合亲和层析提纯。当活性较低的a p o e m u l u s a n 和 分离自细胞提取液中有活性的可溶性重组酯酶或分离自包涵体中溶解的失活酯 酶混合时都能够成能有效稳定的油水e m u l s a n 。其他的蛋白质，如来自a c a l c o a c e t i c u sb d 4 在h i s t a g 系统中过量表达的酯酶则不能提高a p o e m u l s a n 的 活性。 1 i 5a r a d i o r e s i s t e n sk a5 3 与a l a s a n n a v o n v e n e z i a 等从醋酸盐作为碳源和能源的标准富集培养基中分离出 a c i n e t o b a c t e rr a d i o r e s i s t e n sk a 5 3 中，在乙醇培养基中它能产生一种新的生物乳 化剂a 1 a s a n 【1 9 】。研究其性质后发现a l a s a n 是含丙氨酸的由阴离子多糖和蛋白质 组成的高分子量生物乳化剂复合物。a l a s a n 能明显提高菲，荧葸和芘的水溶性， 且能促进菲和荧蒽的降解。研究还表明a l a s a n 是通过物理作用溶解p a h ，而且 4 刖舌 p a h 水溶性的增加不依赖于a l a s a n 的构象变化，也不会受到因过饱和而引起的 分子聚集的影响【2 0 1 。 a l a s a n 为胞外不可透析乳化剂，用硫酸铵沉淀可得到2 2 9 l 乳化剂，能稳 定1 0 碳以上的烷烃、芳香烃、石蜡油、大豆油和粗油。在中性或碱性条件下， 当加热至1 0 0 时a l a s a n 活性能提高2 5 3 0 倍。有研究表明，加上游离a l a s a n ， 大量有乳化活性的乳化剂仍然是与细胞结合的。与e m u l s o n 不同的是，a l a s a n 的乳化活性物质主要是蛋白质，含量为1 7 ，a p o a l a s a n 蛋白质含量为4 。 用s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出了分子质量分别为1 6 k d a 、3 1 k d a 和 4 5 k d a 的3 种蛋白质复合物，依次命名为a l a c ，a l a b ，a l i 认。其中4 5 k d a 复 合物乳化能力最强。酸解4 5 k d a 复合物会产生还原性糖，表明它可能是一种糖 蛋白，高效液相色谱结构分析表明在非变性情况下形成二聚体而且与1 6 k d a ， 3 1 k d a 蛋白质相互作用形成分子量大于4 0 0 k d a 的复合物2 1 1 。最近，该复合物 蛋白质已被纯化，其n 未端序列与分离自e c o l i 中的外膜蛋i 兰t ( o m p a ) 的序列有 很高的相似性，而且我们在三种菌d n a 中都扩增出相似的外膜蛋白( o m p a ) 。 但是e c o l i 外膜蛋白没有乳化活性。对比这两种蛋白质的氨基酸序列发现4 5 k d a 蛋白质有四个疏水区域，而e c o l i 中没有。利用定点p c r 突变发现这四个疏水 区域对乳化活性都是必要的，而且突变的蛋白质仍然黏附烷烃，表明蛋白质形成 特定的结构阻止油滴之间的结合。而且4 5 k d a 蛋白质的基因己被克隆测序并且 在e c o l i 中表达。重组蛋白质a l n a ( 无前导序列，大小为3 5 7 7 k d a ，含3 4 9 个 氨基酸) 与e c o l i 外膜蛋白的氨基酸序列相似，仍具有天然4 5 k d a 蛋白质的乳 化特性，并且其乳化活性是天然复合物a l a s a n 的2 4 倍【2 2 1 。除了能乳化油滴外， 天然4 5 k d a 蛋白质和重组蛋白a l n a 在溶解菲时均表现出很高的效率。特定基 因的表达产物能乳化和溶解水中油份，使得生物乳化剂的结构功能研究成为可 能。 为了能够阐明a l a s a n 的性质，b e k e r m a nr 等克隆了编码a l n b 的基因，对其 进行测序并且在e c o l i 中过量表达。总长5 6 1 b p 的蛋白质无论是保守区域还是 非保守区域对于催化活性都是十分必要的，与硫醇特异性抗氧酶家族的过氧化氢 还原酶有高度特异性。转基因过量表达的蛋白质对异丙基苯过氧化氢物抗性增 5 月u 茜 加，重组蛋白质没有乳化活性但是能够稳定a l a s a n 产生的油水乳滴【2 3 1 。 用1 h 和1 3 c 核磁共振对a p o a l a s a n 和弱酸处理后的a p o a l a s a n 进行了结构 分析，数据表明：( 1 ) a p o - a l a s a n 含有6 个羰基碳原子( 1 7 7 1 1 6 7 8 p p m ) ，这与 结构中的n 酰基氨基糖，尿酸和丙氨酸是一致的；( 2 ) 至少有6 个异头碳原子 ( 9 5 1 0 3 p p m ) 。( 3 ) 氨基糖中有四个c 一2 碳原子( 5 0 5 6 p p m ) ( 4 ) 丙氨酸的 c h 为4 9 5 和4 2 p p m 。( 5 ) 包括丙氨酸的甲基( 1 7 4 和1 2 5 p p m ) ，有5 - 6 个甲 基群为1 4 8 2 1 9 p p m 8 1 。 有数据表明a l a s a n 有三个重要性质与r a g 1e m u l s a n 不同：( 1 ) 碳源底物 特异性。( 2 ) 在中性或碱性条件下高温激活。( 3 ) 共价结合丙氨酸。水解a l a s a n 和a p o a l a s a n 的氨基酸分析表明丙氨酸为唯一主要氨基酸，丙氨酸占a p o a l a s a n 总重量的7 。 1 1 6a v e n e t i a n u sm m 5 与生物膜 很多微生物都能分泌出可以形成一层有机膜的大分子，一般来说这些膜整合 进活微生物细胞，被定义为生物膜，其中有一些乳化剂的结构与细胞膜类似，被 认为与细胞膜合成有关。生物膜有利于微生物最佳定位以吸收营养，生物膜对油 降解菌来说具有生态优势，但是生物膜也会导致生物退化。e m u l s a n 在生长指数 期时累积于细胞表面，当蛋白质合成下降时释放到培养基中【2 4 1 ，而且发现当剪 切力增加时，胞壁结合的多聚物与细胞干重的比例会下降【2 5 1 。 从油污中分离或鉴定出一种菌a 。v e n e t i a n u s ，编号为m m 5 ，这种菌象r a g 1 一样能在油及油与芳香化合物的混合物中生长并且能乳化这些化合物。用光学显 微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜拍摄的图片表明，在水一油中生长时， 微生物定位在由菌体产生的膜多聚体所包围的液滴表面上。因为a v e n e t i a n u s m m 5 在以疏水或亲水化合物为底物生长时能形成一层膜，细菌在生物膜上通过 细胞表面锚定实现胞内连接形成一个复杂的网络【2 6 】。( 见图，引自m a r i nm ，1 9 9 6 ) 6 图1图2 图1 为以燃料油为底物生长时a c i n e t o b a c t e rv e n e t i a n u sm m 5 细胞上黏附乳滴的 扫描电镜照片( 大小范围：l u m ) 。 图2 为以正十六烷为底物生长时a y e n e t i a n u sm m 5 细胞和黏附乳滴的扫描电镜 照片( 大小范围：5 u r n ) 。 f i g 1 2s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p h so fa c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u sm m 5 c e l l s a d h e r i n g t oe m u l s i o n d r o p l e t sd u r i n g g r o w t h o n h e a t i n g o i l ( f i 9 1 ) ，t e t r a d e c a n e ( f i 9 2 ) f i g l ：5 u r nf i 9 2 ：l u m a v e n t i a n u s ( a t c c3 1 0 1 2 ) 是从海水中分离的具有原油乳化能力的一株细 菌，是目前研究生物乳化剂最重要菌株，它在乙醇或烷烃中能产生一种生物乳化 剂，命名为e m u l s a n 。e m u l s a n 是由蛋白质和糖酯组成的复合物，其糖脂组分是 由饱和或不饱和脂肪酸( c 1 0 一c 1 8 ) 通过o 酯基和n 酰基与多糖骨架相连而成。 e m u l s a n 粗提物中还含有1 0 一2 0 ( w t w t ) 的蛋白质，其中有一种酯酶与乳化剂 的产生密切相关，这种酶能够水解甘油三酸酯和烷烃酯中的酯基基团，e m u l s a n 也是这种酶的底物，酯酶能与酯化的e m u l s a n 特异反应，但是不能与无酯的 e m u l s a n 作用【2 】o 有研究表明，培养初期e m u l s a n 形成小包囊在细胞表面积累， 当细胞到达稳定期时，酯酶介导小包囊从细胞表面释放成为有活性的乳化剂进入 培养基中，当除去细胞表面的酯酶，细胞就不能释放e m u l s a n 3 1 。所以，对于有 活性的e m u l s a n 一蛋白复合物，这种酯酶是很重要的组分【4 1 。 此外，n a v o n v e n e z i a 等从a r a d i o r e s i s t e n sk a 5 3 中发现了另一种有别于 前言 e m u l s a n 的新型乳化剂，命名为a l a s a n 5 1 。研究其性质后发现a l a s a n 是阴离子多 糖和蛋白质组成的高分子量乳化剂复合物。与e m u l