（微生物学专业论文）aspergillus+sp脂肪酶催化合成l抗坏血酸棕榈酸酯的研究.pdf

摘要 摘要 论文以有机介质中脂肪酶催化l 。抗坏血酸棕榈酸酯( l a p ) 的合成为目标，开 展了相关方面的研究： 首先，经单因子及均匀设计的试验，确定了a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶的最佳发酵 条件：2g l 玉米淀粉为碳源、7 0g l 豆饼粉为氮源、7m l l 橄榄油为诱导物、起始 p h 为6 0 、摇瓶装量为1 0m l ( 2 5 0m l 三角瓶) 、转速2 5 0r p m 、发酵周期为4d ， 此最佳发酵条件下达到的最大产酶水平约为6 0u m l 。对该酶的温度和p h 考察，得 知该酶的最适作用温度为4 5 ，最适作用p h 为9 0 ，为中温、碱性脂肪酶。 其次，通过研究固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶催化抗坏血酸与棕榈酸的酯化反 应，确立了该固定化酶催化的最佳反应介质为v 丙：v 正= 3 ：1 。在2m l 该体系中，固 定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶催化l a p 合成的最佳条件为：温度4 0 、棕榈酸与抗 坏血酸的摩尔比值7 、酶量0 0 9g 、分子筛0 0 6g 、反应时间7 2h 、转速2 0 0r p m 。 该条件下获得l a p 的最大转化率为5 0 5 6 。 再次，研究糖保护剂对a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶固定化的影响，通过糖共固定化 a s p e r g i l l u s s p 脂肪酶对l a p 的催化反应的影响，筛选出蔗糖为最适合的保护剂。 并确立了在蔗糖保护剂下共固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶催化l a p 酯化的最佳条 件：溶剂v 丙：v 正= 3 ：l ( v 总= 2m l ) 、温度4 5 、棕榈酸与抗坏血酸的摩尔比值7 、 固定化酶0 0 5g 、分子筛0 0 6g 、转速2 0 0r p m 、反应时间7 2h 。此条件下获得l a p 的最大转化率为6 3 2 。 最后，考察了添加蔗糖的共固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶的操作稳定性。连续 反应7 批次后，酶的催化性能没有变化；到反应2 0 批次后，酶的残留活性保存了 5 0 左右。与未添加任何保护剂的固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶的稳定性相比( 反 应4 批次后残留酶活保存了5 0 左右) ，糖共固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶的稳定 性大大增加。 关键词l 抗坏血酸棕榈酸酯，脂肪酶，固定化，酯化，糖保护剂 中文文摘 中文文摘 l 抗坏血酸棕榈酸酯( 简称l a p ) ，是世界公认的最新营养型抗氧化剂，是美 国f d a 认可的食品营养添加剂。它可作为食品、医药、化妆品等的抗氧化剂及强化 剂，减少掺合物质中氧气的含量及自由基的形成，尤其可以防止油脂氧化酸败，延 长油脂及含油食品的货架期。另外，l a p 还具有具有良好的抗肿瘤和抗衰老等作用。 目前，l a p 的合成方法主要有化学合成法和酶催化合成法。由于化学合成法对 设备要求严格，生成成本高，在合成过程中会对人造成伤害及合成的产物不纯等缺 点，因此对生物酶催化法的研究具有重大意义。酶催化法的反应条件温和，选择性 高，副反应少，产物分离相对简单，现成为非水相酶学研究的热点。 论文以研究固定化的a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶催化l a p 酯化反应主，相关的研究 工作包括以下几个方面： 第一，通过对本实验保存的a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶活化培养，在单因素实验的 基础上，通过均匀设计实验，获得该脂肪酶的最佳发酵条件：2g l 玉米淀粉为碳源、 7 0e , m 豆饼粉为氮源、7 m l l 橄榄油为诱导物、起始p h 为6 、摇瓶装量为1 0m l ( 2 5 0 m l 三角瓶) 、转速2 5 0r p m 、发酵周期为4d ，最适发酵条件下达到的最大产酶水平 约为6 0u m l 。 第二，经实验性研究。a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶的最适作用温度4 5 ，最适作用 p h 为9 0 ，为中温、碱性脂肪酶。 第三，通过对高效液相色谱法( h p l c ) 的相关参数试验，确定了l a p 的最佳 检测条件： e c l i p s ex d b c 1 8 柱( 5 岬，4 6m m x l 5 0m m ) ，流动相为水( 含0 5 醋酸) ：乙腈= 1 0 ：9 0 ，流速为o 5m l m i n ，u v 检测波长l = 2 4 9n n ，进样量2 0 斗l ， 柱温3 5 。 第四，通过对固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶催化抗坏血酸与棕榈酸酯化的研究， 确立了该酶作用下的最佳反应体系为v 丙：v 正= 3 ：1 。在2 m l 该体系中，经研究得 出固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶催化l a p 合成的最佳条件：温度4 0 。c 、棕榈酸与 抗坏血酸的底物摩尔比值7 、酶量o 0 9 卧分子筛o 0 6g 、反应时间7 2h 、转速2 0 0r p m 。 第五，通过不同糖类保护剂对酶固定化保护作用的比较，及从经济效益考虑， 确立了蔗糖为最适酶固定冻干的保护剂。在添加蔗糖的作用下，研究了共固定化的 a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶催化抗坏血酸与棕榈酸酯化的反应条件，确定了l a p 酯化的 i v 中文文摘 最佳条件：溶剂v 丙：v 匿= 3 ：1 ( v 总= 2m l ) 、温度4 5 、棕榈酸与抗坏血酸的摩 尔比值7 、固定化酶o 0 5 卧分子筛o 0 6g 、转速2 0 0r p m 、反应时间7 2 h 。 第七，考察了在添加蔗糖的共固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶的操作稳定性。连 续反应7 批次后，酶的催化活性和稳定性一直没变化，到反应2 0 批次后，酶的残留 活性保存了5 0 ，与未添加任何保护剂的固定化a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶的稳定性比 较，蔗糖共固定化a s p e r g i l l u ss p ，脂肪酶的稳定性大大增加。 v a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，s o m er e l e v a n tq u e s t i o n sa r ed i s c u s s e do nt h e b a s i so fs e v e r a l e x p e r i m e n t s ，w h i c ha i ma ts y n t h e s i z i n gl - a s c o r b y lp a l m i t a t e ( l a p ) i no r g a n i cm e d i a w i t hi m m o b i l i z e dl i p a s ea sc a t a l y s t f i r s t l y ，t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fa s p e r g i l l u m ss p 1 i p a s ew e r ee s t a b l i s h e d b ym o n o f a c t o r i a la n dt h eu n i f o r md e s i g ne x p e r i m e n t ：2g lc o r n s t a r c ha sc a r b o ns o u r c e ， 7 0g ls o y b e a np o w d e ra sn i t r o g e ns o u r c e ，7 m l lo l i v eo i la si n d u c e r ，t h em e d i u mp h6 b e f o r es t e r i l i z a t i o n ，s h a k i n gb o t t l ev o l u m e10m l ( 2 5 0m lf l a s k ) ，s p e e d2 5 0r p m ，t h e m a x i m u me n z y m ep r o d u c t i o nl e v e l ，a f t e rf o u rd a y s ，w a s6 0u m l u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fa s p e r g i l l u m ss p 1 i p a s ew e r ei d e n t i f i e d ：t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ew a s4 5 c ( m i d t e m p e r a t u r e ) ，a n dt h eo p t i m u mp hw a s9 0 ( a l k a l i n e ) s e c o n d l y ，t h ee s t e r i f i c a t i o n c o n d i t i o n so fl a s c o r b y l p a l m i t a t ec a t a l y z e db y i m m o b i l i z e d a s p e r g i l l u ss p 1 i p a s ew e r e s e t t h eb e s tr e a c t i o nm e d i u mw a s v ( a c e t o n e ) ：v ( n h e x a n e ) = 3 ：l ( t o t a lv o l u m e2 m l ) t h eb e s ts y n t h e s i sc o n d i t i o n so fl a p w e r e ：t e m p e r a t u r e4 0 ，m o l a rr a t i oo fp a l m i t i ca c i dt oa s c o r b i ca c i d7 ，e n z y m ew e i g h t o 0 9g ，m o l e c u l a rs i e v eo 0 6g ，r e a c t i o nt i m e7 2h ，s p e e d2 0 0 r p m u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h eg r e a t e s tc o n v e r s i o nr a t eo fl a pw a s5 0 5 6p e r c e n t o n c ea g a i n ，t h ee f f e c to fs u g a rp r o t e c t i v e - a g e n t so ni m m o b i l i z e da s p e r g i l l u ss p 1 i p a s ew a ss t u d i e d s u c r o s ew a se s t a b l i s h e da s t h eb e s tp r o t e c t i v e a g e n t t h eb e s t c o n d i t i o n so fl - a pe s t e r i f i c a t i o nc a t a l y z e db yi m m o b i l i z e ds u c r o s e l i p a s ew e r ed e c i d e d ： s o l v e n tv ( a c e t o n e ) ：v ( n h e x a n e ) = 3 ：1 ( t o t a lv o l u m e2 m l ) ，t e m p e r a t u r e4 5 ，m o l a rr a t i o o fp a l m i t i ca c i dt oa s c o r b i ca c i d7 ，e n z y m ew e i g h to 。0 5 g ，m o l e c u l a rs i e v e0 0 6g ， r e a c t i o nt i m e7 2h ，s p e e d2 0 0 r p m u n d e rt h e s ec o n d i t i o n st h eg r e a t e s tc o n v e r s i o nr a t eo f l a pw a s6 3 2p e r c e n t f i n a l l y ，s u g a r - i m m o b i l i z e da s p e r g i l l u ss p 1 i p a s es t a b i l i t yw a ss t u d i e d t h ee n z y m e s c a t a l y t i ca c t i v i t ya n ds t a b i l i t yh a dn o tc h a n g e da f t e r7b a t c h e so fc o n t i n u o u sr e a c t i o n s a b o u t5 0p e r c e n to fe n z y m e sr e s i d u a la c t i v i t yw a sp r e s e r v e da f t e rt h ei m m o b i l i z e dl i p a s e w a sr e c y c l e dt or e a c tf o r2 0t i m e s c o m p a r e dt oi m m o b i l i z e da s p e r g i l l u s5 p 1 i p a s e ， w h i c hd i dn o ta d da n yp r o t e c t i v ea g e n t ( t h er e s i d u a l a c t i v i t yw a sa b o u t5 0 a f t e r4 i l a b s t r a c t b a t c h e sr e a c t i o n ) ，t h es t a b i l i t yo fs u g a rc o - i m m o b i l i z e da s p e r g i l l u ss p 1 i p a s ei n c r e a s e d g r e a t l ya f t e rb e i n ga d d e ds u c r o s et o k e y w o r d sl - a s c o r b y lp a l m i t a t e ，l i p a s e ，i m m o b i l i z a t i o n ，e s t e r i f i c a t i o n ，s u g a rp r o t e c t i v e a g e n t i i i 福建师范大学学位论文使用授权声明 福建师范大学学位论文使用授权声明 本人( 姓名)毖态垩学号2 q q 鱼q 2 z z 专业邀生物堂所 呈交的论文( 论文题目：a s p e r g i l l u ss p 脂肪酶催化合成l 抗坏血 酸棕榈酸酯的研究) 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师范 大学有关保留、使用学位论文的规定，即t 学校有权保留送交的学位 论文并允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容：学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名旌垄垒 一指导教师签 签名日期 迎室：6 ：2 第1 章绪论 第1 章绪论 抗坏血酸( 也称维生素c ) 是人类健康不可缺少的物质，不仅在机体新陈代谢 的氧化还原作用中起重大作用，而且参与机体某些组织如胶原蛋白、牙和骨等的合 成，被人们称为祛除百病之王【l 】。但维生素c 却极不稳定，只要在轻微光照、加热 或碱性环境下，就易氧化变色。因此，维生素c 不利于储存或添加到其他试剂中， 这就给相关的食品和医疗等行业带来不便。在油脂性食品中它不能发挥出强大的抗 氧化作用，致使人们在早期用二丁基羟基甲苯( b h t ) 、丁基羟基茴香醚( b h a ) 、 叔丁基对苯二酚( t b h q ) 等人工合成的抗氧化剂【2 训。美国和日本的研究人员经过 动物试验发现，b h t 、b h a 、t b h q 对动物有毒害及致癌作用，使它们在油脂和食 品的应用中受到极大的限制，甚至被禁用p l 。在美国、欧洲、日本及一些国家已经 禁止在婴幼儿和儿童食品中添加b h a 、b h t 、t b h q 6 l 等。 基于上面的问题，急需寻找一种安全、无毒的天然抗氧化剂，如抗坏血酸( 维 生素c ) 、维生素e 等。可由于维生素是水溶性的，最大缺点是在脂质中不溶解也不 具备抗氧化性，为此，人们发现了维生素c 的衍生物一l 抗坏血酸棕榈酸酯、油酸 酯、亚油酸酯、月桂酸酯等引。它们既具有水溶性维生素c 优良的特性，又具有 脂溶性优点，添加到含油物质中，极大抑制了油脂性物质的氧化【l4 1 ，尤其是抗坏血 酸棕榈酸酯的抗氧化性受到更好的青睐。另外，由于抗坏血酸棕榈酸酯的脂溶性， 可以到达维生素c 原先无法到达的生理部位，可为抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等生理 现象作出卓越的贡献，更加受到医药研究者的关注。除了这些，抗坏血酸棕榈酸酯 在其它方面也有巨大的作用。 但目前，国内外销售的抗坏血酸棕榈酸酯都是通过化学合成法获得，由于化学 合成具有仪器要求严格，成本价格高，且在合成过程中易对人造成伤害，合成的产 物不纯等缺点，迫使人们想方设法寻求安全、稳定的生产方式来解决这一难题。我 国每年需求l 抗坏血酸棕榈酸酯将近1 0 0 0 吨，由于我国在这方面的研究刚起步， 还未达到大量工业化生产，因此绝大部分是从国外高成本进口。迫于这两方面的不 足，我们急需寻找低成本、高安全方式的生产路线，因此，本论文就低成本且安全 无毒的生物催化合成l 抗坏血酸棕榈酸酯的方法进行研究i l5 1 。 1 1l 抗坏血酸棕榈酸酯主要应用及作用机理 l 抗坏血酸棕榈酸酯【1 6 】( l a s c o r b y lp a l m i t a t e ，简写l a p ) ，化学命名为6 棕榈 福建师范大学张杰平硕士学位论文 酰l 抗坏血酸，分子式为c 2 2 h 3 8 0 7 ，结构式如图1 1 所示，分子量为4 1 4 5 4 ，为白 色或微黄色粉末，有轻微柑橘气味，熔点为1 0 7 - - - - 1 1 7 ，难溶于水，易溶于无水乙 醇、甲醇和动植物油，性质较稳定。它是世界上公认的最新营养型抗氧化剂，并被 各国予以编号认可，它的国际编码( i n s ) 为i n s3 0 4 ，化学文摘分类号为c a s 1 3 7 6 6 6 ，欧共体( e e c ) 编码为e e cn o e 3 0 4 ，f a o w h o 编号为3 0 4 ，它是美国 f d a 认可的食品营养添加剂【1 7 j 。 f ) h h h 0 图1 1l 抗坏血酸棕榈酸酯结构 f i g l - 1s t r u c t u r eo f l - a s c o r b y ip a l m i t a t e 1 1 1l 抗坏血酸棕榈酸酯的应用 l a p 可作为食品、医药、化妆品等行业的抗氧化剂及强化剂，可以抑制或减弱 与其掺合物质的氧化，可以防止油脂氧化酸败，延长油脂及含油食品的货架期【1 8 】。 由于l a p 的安全无毒性，加上其结构的特殊性，使其成为备受人们青睐的“绿色” 氧化剂。 1 1 1 1 在深炸食品中的应用 快餐业的接踵而至，使得大部分食用油脂被用作深炸食品。在食品煎炸过程中， 油脂长时间地受到光、热、空气的作用，其物理、化学性质将发生巨大变化。如色 泽加深，粘度加大，且长期在高温下易于氧化生成大量的逆态脂肪酸( t f a ) 、杂环 胺、多环芳烃类强致癌物质 1 9 , 2 0 】。 为防止上述变化，g w oyy 川等人在深炸油脂中加入0 0 2 的l - a p , 在不同时 间段对油脂进行各种质量测评，通过比较发现，l - a p 的加入对油脂的各种品质有明 显的改善作用。c o r t w m 【1 4 】等把l a p 添加到菜籽油和大豆油中进行研究，发现添 加0 0 1 的l a p 即可对菜籽油和大豆油起到抗氧化作用。同时l a p 的加入可增加 油脂的耐高温性。 1 1 1 2 在食品中的应用 第1 章绪论 r i c h a r dlk o c h 2 2 等人在研究面包制作过程中发现，加入0 3 8 的l a p ，可以 缩短面包醒发时间，防止面包老化，使面包变得酥软，尤其能促进人体对面包中非 血红素铁离子的吸收。 在卤制的肉类食品中添加l a p ，可以防止亚硝酸胺和亚硝酸的形成，同时还能 加强亚硝酸盐抗肉瘤杆菌的作用，为人类的健康提供一定的保障【2 3 】。 c l o e d a h a l l 2 4 等人研究发现，l a p 可作为奶粉、人造奶油等的特效抗氧化剂。 1 1 1 3 在医学上的应用 l a p 可以穿过细胞膜和血脑屏障，易于被细胞吸收，可以到达抗坏血酸本身无 法达到的细胞内部组织和器官，保护机体内细胞膜等脂质部分不被氧化，因此具有 良好的抗肿瘤和抗衰老等作用【2 5 之7 1 。k a g e y a m ak t 2 8 1 等人经过研究发现，l 抗坏血酸 脂肪酸酯能强烈地抑制e h r l i c ha s c i t e s 癌细胞的d n a 合成，能分解癌细胞细胞膜的 磷脂，是良好的抗癌物质。n a i d u 2 9 】等人的研究发现，l 抗坏血酸脂肪酸酯能抑制神 经胶质瘤细胞、人脑瘤细胞和肾癌细胞的增殖。另外l a p 还能作为药物软膏和胶 囊的稳定剂。 1 1 1 4 在其它方面的应用 近些年来，l 抗坏血酸棕榈酸酯显著的作用己从食品领域发展到其它一些领域。 尤其是化妆品行业备受关注【3 0 碰】，添加有l a p 的化妆品能防止紫外线诱发的皮肤氧 化、枯黄和衰老。l a p 添加到热敏纸中能增加纸张的稳定性。l a p 对枯草杆菌等具 有一定的抗菌活性。 1 1 2l 抗坏血酸棕榈酸酯的作用机理 l a p 作为食品、医药、化妆品等的抗氧化剂，其主要原理是通过l a p 中的c 2 、 c 3 之间的烯醇键的氧化来减少油脂中氧气的含量及自由基的形成，达到防止油脂氧 化酸败，延长油脂及含油食品的货架驯3 3 , 3 4 】。耿志明【3 5 】等人研究了l a p 与0 2 、自 由基反应的机理及与v e 共同增效作用的原理。 1 1 2 1 与自由基作用 自由基进攻油脂分子产生烷基自由基导致了油脂的酸败。在l a p 的存在下， 此反应被终止，反而会产生l 抗坏血酸棕榈酸酯自由基( l a p ) 。l a p 不能形成 双环结构，它的一个未成对电子与六个原子共享，接着会发生歧化反应，生成一个 l a p 和一个脱氢l a p ，这一过程大致与l 抗坏血酸相同，如图1 2 。 福建师范大学张杰平硕士学位论文 hhhh l li r + 一c - c c h e = hhhh liii l m 一c = c c = c o i i l 一 a p c h 歧化i - 卜c h l - a p脱氢m 图1 2l 一抗坏血酸棕榈酸酯与自由基作用机理 o f i g1 - 2t h em e c h a n i s mo fl - a s c o r b y lp a l m i m t ea n df r e er a d i c a l 1 1 2 2 与0 2 的反应 l a p 的抗氧化活性，也表现在与氧气的反应上【3 6 ，37 1 。在金属离子c a 2 + 、f e 3 + 等存在下，l a p 与氧气反应，首先生成过氧化氢和脱氢l a p ，然后过氧化氢与l a p 继续反应，生成脱氢l a p ，直至把l 。a p 消耗完，l a p 才会失去抗氧化性，如图 1 3 所示。 0 + h 2 0 2 一邺_ 较咖。 k h 食0 + h 2 0 2 _ k 禽0 + h 2 0 图1 3l 抗坏血酸棕榈酸酯与0 2 作用机理 f i gl 一3t h em e c h a n i s mo fl - a s c o r b y lp a l m i t a t ea n d0 2 1 1 2 3 与生育酚( v e ) 的增效作用 l a p 和生育酚结合使用，可以表现出更强的氧化性，即增效作用。在它与生育 4 一禽一禽 肛锻 傩亍。一禽 o _ 嘣l | 记 ok ， 艮一h 一 h 一望 吼_ 铡 h o i | 瑟 。- 删啡 h 强b 第1 章绪论 酚配合使用时，生育酚首先与自由基发生反应生成生育酚自由基，在l - a p 的存在 下生育酚能够再生出来，同时生成l a p 自由基，直到l a p 完全耗尽，抗氧化活 性才消失，如图1 4 所示。 v 图1 4l - 抗坏血酸棕榈酸酯与v e 增效作用 f i gl - 4t h ee n h a n c em e c h a n i s mo fl a s c o r b y lp a l m i t a t ea n dv e 1 2l 抗坏血酸棕榈酸酯的合成研究 l - 抗坏血酸棕榈酸酯的广泛应用促使国内外科研工作者对其的特性和合成进行 了深入的研究。目前，l 一抗坏血酸棕榈酸酯的合成主要有两种方法：化学合成法， 酶催化合成法。反应机理如图1 5 ： o i i h oo h ( r = h ，c h 3 或c 2 h 3 ) o r o h h oo h 图1 5l - a p 的酯化 f i gi - 5t h ee s t e r i f i c a t i o no fl - a p 1 2 1 化学合成法 化学合成法是在浓h 2 s 0 4 、h f 等作为溶剂和催化剂下，l 抗坏血酸与棕榈酸( 酯) 发生酯化或酯交换反应，生成l 抗坏血酸棕榈酸酯。依据材料的不同，可归类为直 接酯化法、酯交换法和棕榈酰氯法。 1 2 1 1 直接酯化法 直接酯化法是以浓硫酸或无水氟化氢为催化剂及溶剂，促使l 抗坏血酸与棕榈 酸直接脱水缩合成l 抗坏血酸棕榈酸酯。据s e i b 报道，棕搁酸过量有利于平衡向生 成物方向进行，一般棕搁酸与l 抗坏血酸的摩尔比在1 3 6 左右，浓硫酸浓度为9 8 - 福建师范大学张杰平硕士学位论文 9 9 时，催化合成l 抗坏血酸棕榈酸酯的得率最高。提高反应温度更有利于产物的 合成，但抗坏血酸的耐热性较差，酯化反应必需控制在低温下进行。蔡力创【3 8 1 等研 究发现，棕榈酸与抗坏血酸的最适物料比为1 3 5 ，在2 5 下反应2 4h ，酯化反应收 率可达8 0 以上。 传统的直接酯化法虽具有生产工艺简单，反应条件温和，收率高等特点，但过 量的棕榈酸易造成乳化现象，在分离、提纯酯时，试剂用量较大，步骤烦琐，加大 生产成本。与浓硫酸相比，在无水氟化氢中的反应缺点是氟化氢使用量大，毒性大， 价格昂贵，对设备的抗腐蚀要求更高；优点是副反应少，产品纯度较高。 1 2 1 2 酯交换法 由于直接酯化中棕榈酸过量带来乳化等问题，试用棕榈酸甲、乙酯代替棕榈酸， 通过酯交换合成l 抗坏血酸棕榈酸酯。龚大春【”】等研究发现，在室温环境中，利用 9 9 的浓h 2 s 0 4 催化酯交换反应，只需1 0h ，l a p 的收率就可以得到8 4 。 该法解决了直接酯化中棕榈酸过量带来的乳化问题，同时缩短了反应时间，且 在反应过程中没有水的生成，这样保证了浓硫酸的纯度，可以使浓硫酸重复利用， 降低反应成本。但棕榈酸甲、乙酯的合成步骤复杂，分离也较烦琐，且l 抗坏血酸 棕榈酸酯的总收率不及直接酯化的总收率，不易于工业化生产。 1 2 1 3 棕榈酰氯法 先将制备好的棕榈酰氯加入二甲基乙酰胺和二氯甲烷混合溶剂中，在一定温度 下通入h c i 气体，加入一定量的l 抗坏血酸即可合成l a p 。蔡立创【3 8 】等人研究了 各影响因素，得出抗坏血酸与棕榈酰氯的最佳配比为1 3 5 ：1 ，最适温度为0 ，并 得出催化剂与抗坏血酸的摩尔比为1 ：1 ，反应1 8h 以上时，收率可高达8 5 以上。 该方法的优点是用到两性的二甲基乙酰胺溶剂，增大了底物溶解度，反应温度 低，副产物少，纯度高：缺点是棕榈酰氯活性较强，有毒，价格贵，0 的条件难 以达到，条件苛刻，不易于工业生产。 1 2 2 酶催化合成法 由于化学合成法成本高、污染大、操作繁琐等缺点，且随着非水相酶学的快速 发展，可以采用酶催化合成法对l 抗坏血酸棕榈酸酯的合成进行探索。酶催化合成 法的突出优点是，在有机体系中，利用温柔的催化剂脂肪酶催化l 抗坏血酸与棕 榈酸或其衍生物发生酯化或酯交换反应，生成l 抗坏血酸棕榈酸酯f 4 0 4 2 1 。由于生物 酶催化法具有化学法无法相比的优势( 见表1 1 ) ，反应的条件温和，选择性高，副 第1 章绪论 反应少，产物分离相对简单，成为非水相酶学研究较热门的一个分支【4 3 】。 表1 1l 抗坏血酸棕榈酸酯合成法的比较 t a b l e1 1c o m p a r i s o no f d i f i e r e n tm e t h o d sf o rt h es y n t h e s i so f l a s c o r b y lp a l m i t a t e t _ 一一 因素化学合成法酶促合成法 l 抗坏血酸棕榈酸酯的合成受到脂肪酶的种类、溶剂的极性、底物的类型及含 量、含水量、温度等一系列相关因素的影响，很多学者从不同侧重面对这些参数作 了初步研究，具体内容见表1 2 。 目前，酶催化合成l - 抗坏血酸棕榈酸酯的研究常用到的脂肪酶是n o v 0 4 3 5 旨肪 酶，叔戊醇和叔丁醇是利用较多的反应介质。使用不同的脂肪酶，反应的转化率是 不一样的，如在c a n d i d aa n t a r t i c ab 脂肪酶的催化下，l a p 的转化率高达9 1 ：而在 黑曲霉脂肪酶酶粉为催化剂时，l a p 的转化率仅为2 3 。此外，即使是同样的 n o v 0 4 3 5 脂肪酶作为催化剂，由于反应底物、反应介质及其它一些因素的差异，使 l a p 的转化率有所不同，转化率最高的达至s j 8 6 ，最低的为2 5 。 表i 2 酶法合成l 抗坏血酸棕榈酸酯的研究 ! 垒! 堕! ：；星翌型翌堑! i z 里! ! 呈i ! 12 1 生：垒! 里2 1 堕! 仑垒! 翌! ! 呈生 催化剂反应底物反应介质l a p 转化率参考文献 福建师范大学张杰平硕士学位论文 1 3 脂肪酶的研究进展 1 3 1 脂肪酶的特性 1 3 1 1 脂肪酶概述 脂肪酶【”】( e c3 1 1 3 ) 是一类甘油酯水解酶，被广泛用于三脂酰甘油酯及一些 疏水性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应【5 4 】。此外脂肪酶还 具有多种催化功能，可表现出磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰胺水解酶等一 些酶的活性【5 5 57 1 。 脂肪酶是最早研究的酶类之一，从1 8 3 4 年首次发现的脂肪酶到现在已有一百多 年的历史。它的来源甚广，普遍存在于动物、植物和微生物中。植物油料作物的种 子内富含有较多的脂肪酶；动物体中，特别是高等动物体内的胰脏和脂肪组织中富 含脂肪酶，其次在胃液和肠液中含有少量的脂肪酶。而微生物脂肪酶的发现较晚， 但微生物种类多、繁殖快，及更易获得纯的脂肪酶应用于工业化生产1 5 8 - 6 0 】，同时微 生物脂肪酶【6 i 】具有更广泛的作用p h 、作用温度范围及底物特一性强等优点，因此近 年来微生物脂肪酶的理论研究和工业化应用发展迅速，引起人类的极大关注【6 2 1 。 据报道，目前大约有2 的微生物产脂肪酶，至少有6 5 个属，其中细菌2 8 个 属，放线菌4 个属，酵母菌1 0 个属，其它真菌2 3 个属。经研究发现生产脂肪酶的 微生物主要有：假丝酵母【6 3 】、圆酵母、毛霉、根霉、青霉、曲霉、地霉、镰刀霉、 白腐核菌、无色杆菌例、假单孢菌【6 5 1 及葡萄球菌等。 微生物脂肪酶【6 6 7 0 1 以其优越的特性成为工业需求脂肪酶的重要来源【7 1 扔】，被广 泛应用于食品保护剂、医药和化妆品的安全伴侣、洗涤剂中绿色剂、皮革中的脱脂 剂、手性化合物拆分【7 4 】的高效选择剂、造纸工业的除脂剂等行业。这主要是由于脂 肪酶的反应条件温和、能耗低、原料要求低等优点，备受各行业的关注，随着生物 技术的快速发展，微生物脂肪酶的应用会有巨大的商业前景【7 5 1 。近年来，随着非水 相酶催化领域的研究，酶催化生物反应器的系统研究，固定化技术的发展及新开发 第1 章绪论 的酶品种等的应用，逐步拓宽了脂肪酶的应用领域。目前，脂肪酶已广泛应用于酯 类合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、 具有特定功能的多肽和糖类的合成与转化等方面，应用前景广阔。 1 - 3 1 2 脂肪酶的分子结构 天然存在的大多数酶的本质是蛋白质。脂肪酶是一种糖蛋白，其糖基部分约占 分子量的2 1 5 ，以甘露糖为主，整个分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心 靠近分子疏水端【7 引。研究表明，来源不同的脂肪酶，其氨基酸组成不同，分子量大 小就会有差异。但由于生物的同源性和进化过程的保守性，其催化的活性中心具有 相同或相似的特征区：h i s xyg l y - z - s e r w g l y 或y - g l y h i s s e r w g l y ( w 、x 、y 、 z 指非特异性氨基酸) 结构，如图1 6 所示【77 1 。绝大多数脂肪酶的活性中心几乎都由 s e r 平l ：l h i s 参与组成，h i s 、s e r 与另一种氨基酸残基( 如c c l 和g c l 的g l u 、r m l 和h p l 的a s p 等) 一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组件。 图1 6 脂肪酶二级结构的一股形式 f i g1 - 6l i p a s es e c o n d a r ys t r u c t u r ei nt h ef o r mo fg e n e r a 经研究证实，脂肪酶是一种“丝氨酸水解酶”。脂肪酶活性中心三元组结构如图 1 7 所荆7 “7 1 ，丝氨酸残基与组氨酸通过氢键相连，另外的一种氨基酸( 谷氨酸或天 冬氨酸) 与组氨酸通过羧基形成的氢键相连。这三者连同底物构成四面中间体复合 物进行催化反应。从脂肪酶分子空间结构来看，丝氨酸残基被c 【螺旋和1 3 折叠片段 围绕形成氧负离子空洞，a 螺旋类似亲水性“盖子”，对三元组件的构象起一定保护 作用。当脂肪酶与界面相接触时，a 螺旋“盖子”打开，酶的活性中心暴露出来，酶 与底物结合发生催化反应。脂肪酶的这种结构有利于催化过程中底物对活性中心亲 和力的提高，以及活性中间体的稳定。所以界面激活现象通常与“仅螺旋盖”的重新 定向排列有关。脂肪酶的化学修饰和固定化对脂肪酶催化活性的改变，与“c 【螺旋盖” 福建师范大学张杰平硕士学位论文 的重新定向排列不无关系。 一阶吐 厂、g 小 。飞 图l 7 脂肪酶催化甘油三酯水解过程中形成的四面体中间态 f i gl - 7t h et e t r a h e d r a li n t e r m e d i a t es t a t eo f t r i g l y c e r i d eh y d r o l y s i sc a t a l y z e dl i p a s e 1 3 1 3 脂肪酶的底物特异性 脂肪酶的底物特异性取决于酶分子催化活性中心的结构。由于酶的来源不同， 酶的结构也随着发生变化，这使得酶对不同底物的特异性也不同。脂肪酶的底物特 异性可分为脂肪酸特异性、位置特异性和立体特异性。 一 脂肪酸特异性是指酶对不同碳链长度和饱和度的脂肪酸表现出特殊反应性，不 同来源脂肪酶水解不同甘油酯所表现出脂肪酸特异性差别很大，见表1 3 。 表1 3 几种不同来源的脂肪酶的脂肪酸特异性 t a b l e1 3p a r t i c u l a rc h a i nl e n g t hs p e c i f i c i t yo fs e v e r a ld i f f e r e n tl i p a s e s 脂肪酶来源最适脂肪酸 p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m a s p e i g i l l u sn i g e r r h i z o p u sd e l e m a r g e o t r i c h u mc a n d i “，竹 a c h r o m o b a t e r i u ml i p o l y t i c u m s t a p h y l o c o c c u sa s r e u s2 2 6 短链( c 8 以下) 脂肪酸 中等链长( c 。- 4 2 1 2 ) 脂肪酸 中等链长( c r c l 2 ) 脂肪酸 c r i 9 c i s i 酸和c r i - 9 - c 1 8 2 、c r i 1 2 c 1 8 ：2 不饱和脂肪酸 饱和脂肪酸 不饱和脂肪酸 位置特异性是指脂肪酶对底物甘油三酯中s n 1 ( 或s n 3 ) 和s n 2 位酯键识别和 水解能力的差异。m a t o r i t 7 8 1 等人对3 4 种脂肪酶的位置选择性作了比较，发现几乎所 有的脂肪酶都有水解s n 1 和s n 3 酯键的特殊性。目前，发现能催化水解甘油酯s n 2 酯键的脂肪酶很少，据报道，主要有c a n d i d a a n t a r c t i c al i p a s ea 、g e o t r i c h u ms p l i p a s e 和p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m 等。 第1 章绪论 立体特异性是指脂肪酶作用的底物应具有特定的立体结构才能被识别催化。这 种异构性包括光学异构性和几何异构性。比如，来自风e “如m 彻甜。7 f 7 “o 旭j c g 凇的脂肪 酶能识另i j s n 1 位和s n 3 位二酰基甘油，其在水解s n 2 ，s n 3 位二酰基甘油比水解它的 对映体速度快得多。在非水相酶促合成和酯交换时，酶对底物的不同立体结构表现 出不同的特异性。 正是由于脂肪酶的底物特异性，使得它可以完成化学法难以实现的消旋化合物 分离和不对称合成。随着酶在非水相中研究的深入，脂肪酶的特性研究的应用成为 当今生物科学及相关学科研究的热点。 1 3 1 4 脂肪酶在非水相酶学研究中的应用 上世纪八十年代，随着k l i b a n o va m t 7 9 j 等科学家研究发现，酶在微量水或几乎 无水的有机溶剂中可表现出一定的催化活性，从此，酶在非水相介质中的应用受到 了极大的关注。之后的二三十年内，随着生物技术水平的突飞进步，酶在非水体系 中催化的应用也有了突破性的进展，为制药、精细化工、食品和香料等行业带来新 的曙光。微生物脂肪酶以其特有的反应条件温和、成本价格低、底物特异性强【8 0 ，8 1 】 等优点，成为工业应用酶中较重要资源，为相关行业开辟了新的路线1 8 2 4 1 。 脂肪酶在完全无水的条件下是没有催化活性的，因为水分子可以通过氢键、疏 水作用、范德华力等作用力维持酶分子的催化活性构型，只有与酶分子紧密结合的 单分子水化层( 即必需水) 起至关重要的作用。在有机溶剂中，只要这层必需水不 受破坏，其它的水环境被有机溶剂取代都不会对酶的结构产生较大影响，反而有机 溶剂体系能成为脂肪酶发挥催化功效的宝库【8 5 ，8 6 】。国内外的许多研究者对酶活性部 位的结构在有机溶剂中有没有发生变化( 与酶在水环境中的结构相比) 很感兴趣， 为此，他们应用各种高新的生物检测手段，如x 射线衍射技术、核磁共振技术( e p r ) 、 傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 、环境扫描电镜( e s e m ) 等对酶的结构进行分析， 结果发现酶分子的结构中心基本没有发生太大的变化，可见，有机溶剂可作为酶催 化反应的体系。另外，脂肪酶在非水相介质中的催化反应有以下优点： i 非极性底物的溶解度增加： i i 酶的热力学稳定性提高； i i i 几乎没有副反应，酶与产物易于分离及酶可多次回收利用： i v 温和的酯化反应对多肽和酯类化合物的合成起到巨大作用； v 可减少产物对酶的抑制作用。 福建师范大学张杰平硕士学位论文 脂肪酶催化的非水相介质包括：水有机溶剂两相体系( 液液两相体系) ； 水不互溶有机溶剂单相体系( 液固两相体系) ；水互溶有机溶剂单相体系；反 像胶束体系；超临界流体体系【8 7 8 8 1 。此外，固定化还可以对酶进行共价修饰和磁 化，提高酶在有机溶剂中的稳定性和活性，带有磁性的脂肪酶可利用磁场回收，酶 基本不失活。 在近2 0 年内，脂肪酶在非水相介质中的应用已取得了巨大成绩，尤其是在水相 中无