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黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 摘要摘要 本文对兰科植物菌根的研究历史，兰科菌根的形态特点、功能、生态学方面 做了简单的综述，并介绍了国内天麻和杓兰属植物菌根的研究进展；对黄花杓兰 的生境特点和根、芽的生长发育过程也做了调查研究。在此基础上，进行黄花杓 兰的菌根研究工作，包括菌根真菌的分离、培养、鉴定和切片显微观察，探讨了 黄花杓兰与菌根真菌的共生关系。 香格里拉的黄花杓兰生长在高山环境下，生长季节很短（4 月10 月） 。对 其根部进行真菌分离，得到 23 株真菌，但真菌的继代培养出现衰退现象，多株 死亡，最后只有 10 株存活。由于大多数没有孢子且未见子实体，所以鉴定困难。 只有菌株 h-4 在8 培养基上产生子囊和子囊孢子，经鉴定为金黄色毛壳菌。推 测金黄色毛壳菌与菌床团丝核菌互为有性世代和无性世代。 对黄花杓兰植株的根进行了一个生长周期的采集和切片观察， 发现黄花杓兰 具有相应的菌根结构，菌丝的存在状态在各物候期有所不同，可分为五个时期： (1) 4 月份联通菌丝时期； (2) 5 月份菌丝团时期； (3) 6、 7 月份无菌丝团时期； (4) 8、9 月份菌丝团时期；(5) 10 月份无菌丝团时期。可以看出，在植株生 长期，根细胞内出现菌丝团；在植株完成正常的生命过程中，真菌营养是光合营 养的补充； 真菌菌丝团也作为植物营养的转化器， 菌丝团消解释放营养供给植株。 在此基础上探讨了菌根真菌与黄花杓兰的共生关系的一个方面： 植株通过联通菌 丝沟通各个细胞的物质交换，菌根真菌利用植株体内物质完成生命活动，菌丝团 消解，使真菌所储藏的营养物转化，为植株所利用。 关键词：黄花杓兰；菌根真菌；共生关系；菌丝团；转化器关键词：黄花杓兰；菌根真菌；共生关系；菌丝团；转化器 notes on symbiotic relationship between cypripedium flavum and its mycorrhizal fungi abstract in this paper, the following research on orchid mycorrhiza are reviewed: history, morphological characters and，its function both to orchid and fungi, ecology specialties. reserches on gastrodia elata bl. in china and on cypripedium flavum in this field have been summarized. the trait of the habitat of c. flavum has been observed, both with the devolpment of its buds and roots. then, the work has been carried out by mycorrhizal fungi cultivation 、identification , and observation the microstructure of mycorrhiza of c. flavum. so the author got the inference of symbiotic relationship between c. flavum and mycorrhizal fungi. the c. flavum population studied in this paper occurs in alpine areas of shanggerila county, its growing season is very short (from april to october ). the author got 23 strains, but most can not been well pureculture and subculture. the strains cant been easily identified because most cant produce spores or sporocarp except h-4. we identified h-4 as chaetomium aureum chivers from its ascus and ascospores. bubils of the genus papulaspora (anamorph) are seem as produced by apothecial fungus as chaetomium (teleomorph). the roots of c. flavum had been sampled each month during growing season and carried out to observe endomycorrhizal formation and variation the result shows that c. flavum often associated with orchid mycorrhizal fungi， which developmental varieties occur in different phenology phasesthe following five periods can be divided：(1) community hyphae phase in april；(2) hyphal coils phaseappears in may； (3) non- hyphal coils phasein june to july；(4) hyphal coils phaseappears in august and september； (5) non-hyphal coils phaseoccurs in octoberit can be perceived from above that hyphal coils had arisen in root-cells when plant life transits and mycotrophy is a necessary supplement of phototrophyconcerning the c. flavum and its hyphal coils may be seem as the transformer of nutrient stored in rootstock and /or produced by photosynthesisthe nutrient is transformed by fungi and transported to plant when hyphal coils have been diggestedthe author glad to explain partly the relationship between c. flavum and mycorrhizal fungi at this state：mycorrhizal fungi utilise the nutrient in plant cells to accomplish their life cycle； commnunity hyphae bring about a transmition of nutrients among root-cells, plant utilize the nutrient from diggested hyphal coils key words: cypripedium flavum; mycorrhizal fungi; symbiotic relationship; hyphal coils; transformer 引言 1 引引 言言 云南省素有“植物王国”的美誉，植物的种类和数量都居我国之冠。多样的 气候条件，复杂的地貌，独特的人文，孕育众多娇艳绮丽的名贵花卉。这是云南 花卉业发展的巨大的优势。开发自己的特色花卉，打出自己的花卉名牌，是云南 花卉发展的一重要方向。结合我省特点，越来越多的人把眼光集中在高山花卉的 开发。高山奇特的地理气候条件条件，使高山花卉更加奇异艳丽，具有极大的观 赏价值和经济开发潜力。杓兰属就是这样一类生长在高山上的特色花卉。 杓兰属(cypripedium l.)与兜兰属(pephiopedilum l.)的植物，在园艺学上有拖 鞋兰的称谓，在分类学上总称为杓兰亚科(cypripediludeae)。大家对兜兰属的一 些名品比较熟悉，如杏黄兜兰（paphiopedilum armeniacum s.c.chen et f.y.liu） ， 麻栗坡兜兰(p .malopoense s.c.chen etz.h.tsi )， 硬叶兜兰(p .micarnthum t.tang et f.t.wang)，带叶兜兰(p . hirsutissimum (lindl. ex hook) stein)等等已经开发很成 功了。杓兰属植物与兜兰属植物的花型相似，都有一“兜” （唇瓣） ，状如拖鞋， 加之花色艳丽，故为名曰拖鞋兰（laddy slipper） 。两者分属依据见如下检索表。 1、叶在幼小时的卷迭式为席卷，着生在茎上；花被在果期也不脱落；生长 在温带杓兰属 2、叶在幼小时的卷迭式为二重的，着生在根上；花被在果期已脱落；生长 在亚热带地区兜兰属 杓兰属植物约有 47 种，主产于东亚、北美、欧洲等温带地区和亚热带山地， 向南可以到达喜马拉雅地区和中美洲的危地马拉（cribb，1997） 。我国有 32 种， 广布于自东北到西南山地和台湾高山。其中 18 种是我国特有种（中国植物志 vol.17） 。 云南省有 17 种主要分布于滇西北高海拔的山坡上。 黄花杓兰（cypripedium flavum pf hunt et summerh）是杓兰属植物中比较有代表性的一种，株型优 美，花色鲜艳，花期长，极具观赏价值，深受兰花爱好者的喜爱。尤其在国外有 许多人有收集奇特兰花的爱癖， 黄花杓兰自然是上上之选。 所以对于杓兰属植物， 特别是黄花杓兰等有很大的观赏价值的特色高山花卉的开发具有很大的意义和 巨大的市场潜力及经济效益。 对于高山杓兰属特色花卉的开发，是我们研究课题组工作的一个重点。我们 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 2 现在利用无菌萌发的方法得到了包括黄花杓兰，紫点杓兰，云南杓兰等数个品种 的试管苗，并在香格里拉等地的高山上建立基地和观测试验区，对一些特色杓兰 进行生理生态学研究实验。 我们发现研究工作不能缺少的一部分是杓兰的菌根研 究工作。首先，兰科植物全部具有菌根，菌根与兰科植物的一生的生长发育活动 密不可分，所以研究杓兰属的植物不可能避开菌根问题。其次，高山植物的生长 环境恶劣。以黄花杓兰为例，它主要分布于云南西北部、西藏东南部、四川、甘 肃南部和湖北西部（房县） ，海拔在 18003450 的亚高山和高山上，生长季节只 有 410 月。黄花杓兰在恶劣的环境中短时间内以并不高的光合速率（约 6 molm -2s-1） 进行大生产量的生命活动， 这其中菌根真菌对它生长的促进作用和 增加它对恶劣环境的适应能力方面的贡献是巨大的。 在我们的实验工作中也遇到 了一些相应的困难：杓兰植物引种移栽到昆明时出现退化现象，植株营养状况不 佳，株型叶型发生变化，花型变小，花色变淡，几年后开花率降低甚至引种后第 二年就不开花，植株逐渐衰败；试管苗在昆明和原生地移栽成活率相当低，成长 速度极慢。虽然是多种因素起作用，但菌根菌能否成功侵染，显然十分重要。所 以只有将其菌根问题研究清楚，并用于实际应用，结合栽培种植的生理生态方面 的工作，才可以使这些特色花卉的开发成功。 菌根，英文名 mycorrhiza ，来自希腊语的 mykos（真菌）和 rhiza（根系） ， 是对根系和真菌组成的共生体的特定的称谓， 是自然界普遍存在的一种植物与真 菌的共生关系。几乎所有的植物都存在菌根，所以从某种意义上说，自然界绝大 多数的植物不存在真正的根系，只有菌根。 在研究的早期，人们将菌根分为内生菌根，外生菌根和内外生菌根三大类。 但随着研究的深入，人们发现只有这三种划分类别，还远远不够。为此，hasley （1989）根据参与共生的真菌和植物的种类及其形成菌根复合体的特点，重新将 菌 根 划 分 成 7 种 类 型 ， 即 ： 内 外 菌 根 (ectendomycorrhizae) ， 外 生 菌 根 (ectomycorrhizae)，丛枝菌根(vesicular-arbuscular mycorrhizae)，浆果鹃类菌根 (arbutoid mycorrhizae)，水晶兰科菌根(monotropoid mycorrhizae)，欧石楠科菌根 (ericoid mycorrhizae)和兰科菌根(orchid mycorrhizae)。 关于杓兰的菌根工作，国内外鲜有报道。所以选择高山黄花杓兰的菌根研究 作为我的研究选题，是希望通过一系列探索性的工作，判断黄花杓兰植物是否存 引言 3 在菌根，菌根是什么类型，真菌在植物体细胞中的存在形式是什么，在植株的不 同生长物候时期，真菌的存在状态是否存在变化，初步判断黄花杓兰与真菌共生 关系。 这样在理论角度对杓兰的菌根有所阐述， 并希望为杓兰菌根工作打下基础， 为以后的杓兰这种美丽的植物的引种开发乃至实现产业化提供借鉴。 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 4 第一部分：综述：兰科植物菌根的研究进展第一部分：综述：兰科植物菌根的研究进展 概述概述 兰花是一个大家族，总称兰科植物。全世界兰科植物约有 700 属，近 2 万种 以及大量的变种和品种等，主产热带地区。我国大约有 173 属 1200 种和大量的 变种和品种，主要产于云南、四川、台湾、海南、广西、广东等省区，其次是贵 州、湖南、福建、江西、浙江、湖北、安徽、江苏以及甘肃、陕西河南三省的南 部的亚热带地区。到了北方温带地区和西部高原和干旱地区就只有很少的种类 了。兰科植物有很多著名的观赏植物，还有一些是名贵的药材。 人们将兰科观赏花卉大致分为国兰和洋兰两大类。国兰主要指兰属 (cymbidium)的植物和其它国产观赏植物，重要的观赏类群主要包括春兰 cymbidium goeringii (rchb.f.) rchb.f.、蕙兰（cymbidium faberi rolfe） 、建兰 cymbidium ensifolium (l.) sw.、墨兰cymbidium sinense (jackson ex andx.)wild 和寒兰（cymbidium kanran makino）,和杓兰属（cypripedium） 、兜兰属 （paphiopedilum） 、 虾脊兰属 （calanthe） 、 鹤顶兰属 （phaius） 、 独蒜兰属(pleione)、 石斛属（dendrobium） 、指甲兰属（aerides） 、槽舌兰属（holcoglossum） 、和万 代兰属（vanda） 。洋兰准确的称呼应为世界热带兰，它包括我国产的几种热带品 属（兜兰属，蝴蝶兰属，万代兰属，石斛属等） ，其它一些重要的观赏属包括柏 拉兰属（brassavola），卡特兰属（cattleya） ，围柱兰属（encyclia） ，树兰属 （epidendrum） ， 蕾丽兰属 （laelia） ， 薄叶兰属 （lycaste） ， 尾萼兰属 （masdevallia） 等属。 由于兰科植物具有巨大的观赏价值和经济价值， 所以一直被世界园艺学家和 植物学家关注。人们在开发研究过程中，发现兰科植物的菌根问题是不可以忽视 的。 兰科植物的种子细小如尘埃（arditti ，1992） ，最大的种子平均千粒重不足 10 毫克。成熟的种子不具胚乳结构，仅具一简单未分化的胚：由含有脂肪粒和 蛋白体的薄壁细胞组成。所以在自然条件下，兰科植物不可以萌发，只有感染了 合适的真菌才可以开始正常的生命活动。 因此兰科植物的菌根比起其它植物来即 具有一定的特殊性，又有相当的重要性。 第一部分 综述：兰科植物菌根的研究进展 5 表 1 几种主要菌根类型的特征 table1 the feature of several main mycorrhiza 菌根类型 菌套 哈蒂氏带 菌丝隔膜 胞内菌丝 外生菌 + + + _ va 菌根 _ _ _ 泡囊丛枝 杜鹃花科菌根 _ _ + 圈状 兰科菌根 _ _ + peloton 1. 兰科植物菌根的结构特点 兰科植物菌根的结构特点 自然界普遍存在着植物与真菌的共生现象，从解剖学和生理学的角度看，这 种由真菌和植物根系形成的共生体已经不是真正意义上的根系了 （李晓林， 冯固， 2001） ，故称菌根（mycorrhiza 或 mycorrhizae） 。至今还没有发现有菌根结构的 植物仅有 3，自然界的菌根真菌对植物的侵染是相当普遍的（刘润进 fargus, 1971; 宇田川俊一，椿启介等，1978 )。据臧穆先生观察， 黄花杓兰的根际和根皮层细胞内的团丝核菌属，从菌丝和小型菌核纽结形态看， 近似于菌床团丝核菌 cf. papulaspora byssina hotson。由此分析 h-4 很可能是黄 花杓兰的菌根菌。我们可以这样假设该菌株的生活史：金黄色毛壳菌在黄花杓兰 的根际土壤中完成有性阶段的生长，菌丝侵入植株根部，形成菌根结构，与植株 共生。菌丝在寄主细胞内进行无性生长阶段，利用植株细胞内的营养物质，形成 菌丝团，最终被植株消解，继而又有菌丝侵入，又形成菌丝团、消解。由此周而 复始，即完成了该菌一完整生活史，又完成植株与真菌的共生关系。 但我们这一假说对其它分离得到的菌株是否为菌根菌没有否定作用。 因为兰 科植物的菌根真菌与植株之间没有严格的专一性，也就是说，黄花杓兰很可能具 有多种菌根真菌，我们分离得到的内生真菌可能有几种都为其菌根真菌。 第二章 黄花杓兰根部内生真菌的分离、培养、鉴定 31 5 6 7 8 10 11 9 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 32 12 图 5-8. 金黄毛壳菌：5. 子囊壳；6. 子囊和子囊孢子；7. 子囊孢子；8. 分生孢 子。 （hkas 3428）9-11. cf. 菌床团丝核菌小团核的不同时期。 （hkas 3429） 12. h-4 菌株在 v8 培养基上的菌落 fig.5-8. chaetomium aureum chivers：5. perithecium；6. asci and ascospores；7. ascospores；8. conidiospores.（hkas 3428）9-11. cf. papulaspora byssina hotson： showing different stages of bulbils.（hkas 3429）12. the colony of h-4 on medium v8 1.5 内生真菌的接种试验 内生真菌的接种试验 一株真菌为菌根真菌，必须满足下列条件： 1）菌株可以侵入植株的根部，并形成相应的菌根结构 2）该菌对于植株的生长必须有促进作用 3）在合适的培养基上，被侵染的无菌苗在相同的分离条件下，还可分离得 到该菌株 第二章 黄花杓兰根部内生真菌的分离、培养、鉴定 33 必须确定分离得到的真菌是否是菌根真菌， 才可以把它们应用到黄花杓兰的 开发上去。所以在 2003 年 5 月份进行了真菌接种工作。 1.5.1 真菌菌株 真菌菌株 h-2，h-3，h-4，h-7，h-8，h-9（此时只分离出 9 株菌，有 3 株转接不活） 1.5.2 黄花杓兰无菌苗 黄花杓兰无菌苗 由黄家林提供 1.5.3 接种用真菌培养 接种用真菌培养 将真菌接入 pp 液体培养基，25摇瓶培养 7d 1.5.4 土壤 土壤 用黄花杓兰原生土 ：草霉土 2 ：1 的比例进行配土，一半经 121灭菌 4h，另一半不灭菌，分装在直径 10cm，高 8cm 的塑料盆中。 1.5.5 接种方法 接种方法 用注射器吸 2ml 的菌液注到无菌苔藓上，包住小苗的根部，植于土壤中，对 照为不接真菌的，用无菌 pp 液体培养基 2ml。 1.5.6 培养方法 培养方法 室外，有遮荫遮雨棚，一周内覆膜。 1.5.7 结果 结果 最终小苗在一个月后大部分死亡，分析原因，主要有以下几点： 1）小苗为 2002 年底成苗，由于摆放时间过长，所以生长状况不佳 2）小苗的根不发达 3）接连阴雨天气，由于在室外遮雨不够，造成雨水的侵入 4）昆明 5 月份的温度过高，影响到小苗的生长 所以小苗的接种试验没有成功， 在以后由于时间的关系和小苗出瓶的时间与 工作安排有冲突，所以没有接着进行真菌的侵染工作。 1.6 小结 小结 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 34 我们对黄花杓兰根部进行四次内生真菌的分离工作，得到了 23 株菌，这些真 菌绝大多数不产生孢子，且在继代培养中频频出现衰退现象，许多株转接不活， 表现了黄花杓兰对寄主有相当的依赖性； 我们把除 h-4 外的其它真菌暂时划为无 孢群。 h-4 经鉴定为经黄色毛壳菌，推测与植株根部的菌根真菌可能为一种真菌的 有性世代和无性世代，在根际土壤中进行有性繁殖，侵入植株根部进行细胞内无 性生活史。 进行真菌对无菌苗的侵染工作，没有成功。 第三章 黄花杓兰根部的切片研究 35 第二部分：实验部分第二部分：实验部分 第三章 黄花杓兰根部切片研究第三章 黄花杓兰根部切片研究 关于杓兰属植物的菌根工作，国外已经陆续有些报道，但所报道的都是一些 国外特有的杓兰品种，关于黄花杓兰是否具有菌根结构，菌根的类型，真菌在根 部的分布以及存在状态等许多方面的研究内容，都未见相关报道。可以说，黄花 杓兰的菌根工作是一个陌生的领域，需要先进行一些摸索性、尝试性的工作。 我们的工作从黄花杓兰的根部切片入手，判断其是否具有菌根及菌根类型。 在黄花杓兰的生长季（4 月至 10 月）每月 10 号左右在香格里拉仙人洞（东经 99 39, 北纬 2746，海拔 3400m）采集黄花杓兰自然居群的成年植株的根， 用清水洗净，faa 固定。 1. 石腊固定切片石腊固定切片 1.1 切片制作切片制作： 按照李正理（1996）的方法进行。 1.2 结果与讨论结果与讨论 黄花杓兰的根的横断面是圆形，根直径约 23mm，由表皮层、皮层、内皮 层、中柱鞘和中柱组成。表皮外具有表皮毛（表皮毛状突起物或假根毛） 。表皮 层的表皮细胞具有两层，两层细胞大小和形状区别不大。皮层细胞有 67 层， 呈圆形，细胞大，细胞核明显，具有大量内含物，储存营养丰富。内皮层细胞仅 有一层。中柱鞘多列。 在黄花杓兰的石蜡切片上，我们找不到菌丝的存在，这与李柏年等（1993） 所作的大花杓兰的根部扫描电镜研究中的结果相似。 分析原因， 可能有以下两点： 首先是切片过薄，使菌丝在图中只有一些断面，所以菌丝的形态特征不可辨，不 能判断是否具有菌丝；在不同的时期，真菌以不同的形态存在，我所选的根段采 于 6 月份，此时检查不出菌丝团，所以切片中也找不到菌丝的存在。 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 36 图 13 黄花杓兰的根部显微结构 fig.13 the crosso section of c.flavum root 2. 黄花杓兰徒手切片研究黄花杓兰徒手切片研究 2.1 切片制作切片制作 将黄花杓兰的两年根、三年根、四年根分成上中下三段（上段 2cm，下段 2cm，其余为中段） ，用双面刀片进行徒手切片，olympus cx31 型显微镜下观 察，jvc tk-c721eg 照相。 2.2 结果与讨论结果与讨论 第三章 黄花杓兰根部的切片研究 37 我们发现在黄花杓兰的根部存在明显的典型兰科菌根结构：根外无菌套，根 的皮层组织内无哈蒂氏带，皮层细胞内与细胞间都存在相当数量密度的菌丝，内 皮层和中柱鞘及中柱中没有菌丝存在；菌丝有隔，可以形成结状或螺旋状的菌丝 团（见图 17） 。 菌丝存在状态在老根与新根之间没有明显的差别；在根的上部（接地上茎 2cm 左右）的密度比下部要少；根尖没有菌丝侵染。根茎没有真菌存在，这与许 多兰科植物菌根结构相似。 郭秀珍等 （1989） 报道兰科植物的储藏根内含有兰酚， 可以抑制真菌的入侵。 大多数兰科植物的根尖都没有菌丝侵染 （潘超美等， 2002） ， 这可能是根尖旺盛的生长会产生一些物质抑制真菌的生长， 或是根尖细胞的内含 物质不适合真菌生长。 在黄花杓兰的根外有成团的菌丝束包围， 其根际土壤的腐殖层里也有大量的 真菌菌丝。该菌丝可以是周围的腐烂的枝叶分解成兰科植物可以吸收的物质，甚 至通过菌丝将吸收的营养物质转运到植物体内（潘超美，1999） 。所以从生态角 度上讲，根外菌丝，根内菌丝、兰根和土壤基质形成一个大的共生体系，使兰科 植物更加有效地利用土壤中的有机质，完成生长繁殖活动。 3 菌根真菌的入侵途径 菌根真菌的入侵途径 关于兰科菌根真菌的入侵途径，一般认为是从外皮层的通道开始的，然后进 入皮层，并进一步向内扩展（esnault et al 1994）或者是破坏根被组织和外皮层 细胞进入皮层（范黎等，1999） ；也有人认为兰科植物依赖假根毛(表皮毛)进入 菌根真菌（rasmussen，1990） 。在我们的切片研究发现，在黄花杓兰的表皮毛中 存在明显的菌丝，且可以看见菌丝的隔。我们也看见菌丝从表皮侵入植株根部， 所以我们认为在黄花杓兰的菌根真菌的侵入时，两种情况都可以发生（图 13 和 图 14） 。 黄花杓兰的根部围绕着许多菌丝，有人认为有些物质可以吸引真菌进入，虽 然这些物质至今还未检验到（williamson hadley，1970） 。数不尽的真菌菌丝 向黄花杓兰的根部入侵，使之可以找到一切可以入侵的部位（表皮通道和表皮 毛） 。这其中可能还包括了黄花杓兰和菌根真菌的相互识别的过程。 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 38 图 14 菌丝与黄花杓兰的表皮毛 图 15 菌丝进入表皮细胞 真菌从土壤中对黄花杓兰的侵入是多途径的。 该侵入在黄花杓兰的表皮没有 第三章 黄花杓兰根部的切片研究 39 得到很好的防御（可能是真菌与黄花杓兰协同进化适应的结果） ，但在皮层胞壁 细胞中就可以有效地防御，将菌丝团消解，防止其进一步侵入内皮层。所以有人 认为这是兰科植物对菌根真菌的欺骗行为。 4 黄花杓兰与菌根真菌的共生关系 黄花杓兰与菌根真菌的共生关系 4.1 菌根真菌存在状态与黄花杓兰物侯的关系 菌根真菌存在状态与黄花杓兰物侯的关系 我们发现，菌根真菌在黄花杓兰的不同物侯期，以不同的形式存在，表现一 定的规律性。 表表 4 生长季中黄花杓兰生长物侯、营养方式和菌丝状态 生长季中黄花杓兰生长物侯、营养方式和菌丝状态 table 4：phenology and nutrition form of cypripedium flavum and state of hyphae during growing season 月份 month 4 月 april 5 月 may 6 月、7 月 june、july 8 月、9 月 august、 september 10 月 october 植物物候 phenology 萌动 germination 展叶，始花 opening leaves，first flower 盛花，幼果 flower，yong capsule 果期，叶片衰老 fruitage，leaves senesced 休眠 dormancy 菌丝状态 state of hyphae 联通菌丝 community hyphae 菌丝团 hyphal coils 无 disappeared 菌丝团 hyphal coils 无 disappeared 营养方式 nutrition form 利用储备物 质 utilize nutrient stored in roots 光合营养 真菌营养 phototrophy mycotrophy 光合营养 phototrophy 光合营养 真菌营养 phototrophy mycotrophy 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 40 16 17 18 19 第三章 黄花杓兰根部的切片研究 41 20 16. 联通菌丝时期（四月份） ，400； 17. 菌丝团时期（五月份） ，400； 18. 菌丝 团消失时期（六、七月份） ，400； 19. 菌丝团时期（八、九月份） ，400；20. 菌丝 团消失时期（十月份） ，400 plate 16. community hyphae phase in april，400； 17. hyphal coils phasein may， 400； 18. non-hyphal coils phasein june and july， 400； 19. hyphal coils phase in august and september， 400； 20. non-hyphal coils phasein october， 400 我们根据菌根真菌的不同存在状态，把菌根分为以下几个时期： (1) 联通菌丝时期： 四月份， 菌丝在各个细胞之间是相互穿联 （图 16 和图 21） 。 细胞中间的原生质有收缩现象出现，从收缩的原生质中伸出数条真菌菌 丝，穿过细胞壁和细胞膜通往四周的细胞，这样使各个细胞之间相互联 通呈网状。 (2) 菌丝团时期：五月份开始在细胞内部出现菌丝团（图 17 和图 22） 。菌 丝团形状呈节状，在不同的细胞中的密度不同，也偶尔又在两个细胞之 间穿连的现象存在。 (3) 无菌丝团时期：六月份，七月份，菌丝团消失，也未见联通菌丝，细 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 42 胞内有大量颗粒物（图 18） 。 (4) 菌丝团时期：八、九月份菌丝团又重新出现（图 19） 。 (5) 无菌丝团时期：十月份又没有菌丝团存在,细胞间储存了大量的颗粒物 （图 20） 。 人们对菌丝团的作用已经达成共识，真菌以形成菌丝团和消解菌丝团，来为 植株提供营养(hadley & willianson，1972)，所以又将这一过程称为真菌营养 （mycotrophy） 。他们认为从菌丝团的形成到消解是一个非常快的过程，大约需 要几个小时到几天的时间，所以在形成菌丝团不久就是消解的过程，然而形成和 消解的过程是动态的，很难用眼睛直接观察出来，所以我们简化试验，将菌丝团 的出现当成真菌营养的标志。 我们发现在植株萌动时期，出现联通菌丝在各个细胞之间穿连，沟通植株各 个细胞。因为在萌动期，植株的外表虽然没有太大的变化，但细胞内部已在进行 一系列的生理生化反应，在此是形成了联通菌丝，从而启动了作为整体的根系活 动。 由于香格里拉四月份较低的气温，此时冻土层中的真菌的活动也处于休眠， 所以该真菌一定来源于细胞内部。是上一年被消解的菌丝团仍有活性（magnus， 1900） ，利用植株细胞内储存的营养物质，形成联通菌丝。该过程可能被兰科植 图21 联通菌丝 fig 21community hyphae 图22 菌丝团 fig 22hyphal coils 第三章 黄花杓兰根部的切片研究 43 物的某种信号分子启动，只是该物质还没有检验出来。 在五月份短短的时间内植株有很大的生长量：幼芽迅速萌发生长，进而长成 1035cm 甚至更大的植株，叶片逐渐展开，而且形成花苞。这一段时间植株需要 很多的营养物质， 来满足生长内所需。 但光合生产能力尚小， 不能满足植株需要。 所以此时真菌营养的出现，起到了补充营养的作用，使植株完成生长过程。 在 6、7 月份植株的光合作用最为旺盛，光合营养完全可以满足植株生长。 此时不需要真菌营养，此时我们也没有发现菌丝团。 8、9 月份是植株的由一个生长的重要时期，因为植株开始逐步衰老，果实 逐渐成熟，叶片慢慢变黄，光合效率开始逐步衰退，而植株仍需要大量营养，以 形成一个蒴果里的数以万计的种子。这时又出现真菌营养，以菌丝团被消解的形 式补充为植株所需营养。 10 月份为倒苗时期，植株已经完成一个生长期的整个生命过程，根部开始 休眠，根部的真菌也没有太大的活动，没有看到有菌丝团。 4.2 光合营养 光合营养(phototrophy)与真菌营养与真菌营养(mycotrophy)的关系的关系 通过上述比较黄花杓兰的物侯期与真菌营养的出现的时间关系，我们不难得 出这样的结论：真菌营养总是出现在植株的生活转变期，植株需要很多的营养来 满足生长需要，而自身光合作用不能完全满足生活所需时才出现其所谓的“欺骗 行为” 。所以我们认为是植株的主要营养方式光合营养不能满足生长需要时，真菌 营养来作为补充。 asmussen(2002)认为兰科植物真菌营养可以作为一部分的能量来 源补充甚至代替光合营养，在黄花杓兰身上体现的是真菌营养时光合营养的有益 补充。 4.3 黄花杓兰成年植株与真菌共生关系分析 黄花杓兰成年植株与真菌共生关系分析 兰科植物的成年植株对菌根真菌的依赖性不如原球茎时期和小苗时期强烈， 这是因为植株有足够的光合能力来满足生长的需要。但是黄花杓兰是一种在短时 间就完成相当大的生长量迅速倒苗的草本植物。观察黄花杓兰一个生长周期的活 动，开始萌发时，就有点异养性质。黄花杓兰总是能在自己需要菌根真菌提供营 养的时候“欺骗”真菌为其提供营养。这是长期系统进化的结果。真菌对黄花杓 兰的生长提供营养，可能是兰科植物对于真菌营养有一种诱导启动作用，估计可 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 44 能以信号分子的形式，可能与引导真菌侵入兰科根部的信号有所不同。 在兰科植物与真菌的关系，许多人认为偏利反寄生关系。那么真菌是完全只 是付出吗？从自然界的定律来看，应该是不可能的。我们在思考一个问题，真菌 在植株细胞内形成许多菌丝团， 营养从何而来？当然是利用细胞内的储存的物质 了。而且在每次真菌出现前，都是植株营养积累的时期，真菌利用植株的储存的 营养来形成庞大的菌丝系统。 倒苗前的物质积累为翌年 5 月份菌丝团的形成提供 营养， 6、7 月份强大的光合作用也积累了许多产物使 8、9 月份可以正常形成 菌丝团。由此可见植株积累的营养物质被真菌利用形成菌丝团，最后又以菌丝团 消解的形式返还供给植株生长。 所以，真菌营养对植株来讲是利用菌丝团将储存物转化为植株更易利用的物 质，将植株的体内的营养物质储藏释放的过程。这与 burgeff（1959）提出的理 念：菌丝团在细胞中的功能是储存器官，在消解之前积累糖原蛋白质和脂肪的理 念有所不同，菌丝团更可能是一种转换器官。因为，该储存期不是原封不动的将 原有形式的营养返还给植株，首先营养在其形成菌丝团到消解过程中已经被转 化，而且由于菌根真菌的生命活动，造成一部分消耗（harley 和smith，1983）。 由此可见，黄花杓兰与菌根真菌是互惠互利的共生关系。一方面，真菌靠植 株内的营养完成自身生长发育过程（形成菌丝团，然后消解） 。另一方面，植株 对于细胞内储存的营养一般不直接利用， 而是在需要时由真菌利用转化后再返还 给植株。虽然在真菌营养整个过程植株的营养总量是损失了一小部分，但真菌将 原储存能量进行代谢，转化，形成一些其他的形式的糖类、氨基酸、激素等，通 过消解返回供给植株生长。所以从这方面讲，菌根真菌还是物质转化器。真菌还 可以以联通菌丝的形式沟通各个根部细胞的物质与能量。 第四章 小结及研究展望 45 第二部分：实验部分第二部分：实验部分 第四章 小结及研究展望第四章 小结及研究展望 一 小结一 小结 黄花杓兰是具有典型兰科菌根的高山特色花卉， 由于内生真菌对于植株有一 定的依赖性所以造成虽然真菌可以分离出来，但是继代生长不佳，很容易衰退死 亡，而且由于大多不产生孢子和子实体，在鉴定方面也出现一定的困难。 对黄花杓兰植株的根进行了一个生长周期的采集和切片观察， 发现黄花杓兰 具有相应的菌根结构，菌丝的存在状态在各物候期有所不同，可分为五个时期： (1) 4 月份联通菌丝时期； (2) 5 月份菌丝团时期； (3) 6、 7 月份无菌丝团时期； (4) 8、9 月份菌丝团时期；(5) 10 月份无菌丝团时期。 可以看出，在植株生活转变期，根细胞内出现菌丝团；在植株完成正常的生 命过程中，真菌营养是光合营养的补充；真菌菌丝团也作为植物营养的器，菌丝 团消解释放营养供给植株。 在此基础上探讨了菌根真菌与黄花杓兰的共生关系的一个方面： 植株通过联 通菌丝沟通各个细胞的物质交换，菌根真菌利用植株体内物质完成生命活动，菌 丝团消解，使真菌所储藏的营养物转化，为植株所利用。 推测菌根真菌侵入的途径是通过表皮毛和表皮通道细胞两个途径进入的。 二 研究展望二 研究展望 黄花杓兰的这一特色花卉的开发具有非常好的市场前景， 目前最有效的开发 模式是培养出试管苗，再将这些小苗繁育成为可以作为商品出售的成品花卉制 品。由于菌根真菌在小苗和成年植株生长中起关键作用，使无菌萌发苗的出瓶、 移栽和栽培时小苗的成活率低和生长状况不佳， 成为黄花杓兰开发中待突破的一 个重要的难关。我们要把菌根技术引入到黄花杓兰的种子萌发和栽培种植中去： 找出有效的菌株，进行黄花杓兰种子的共生萌发，进一步提高萌发率和出瓶苗的 生长状况；将效用菌株制成菌肥制剂，应用于组培苗的大规模的栽培。这样才可 以完全实现黄花杓兰的产业化。 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 46 我们对黄花杓兰进行的菌根工作，只做了一个开始尝试性的工作：确定了黄 花杓兰野生成年植株确实存在菌根结构， 菌根真菌在黄花杓兰的不同生长阶段存 在状态不同； 并在此基础上肯定了菌根存在的意义， 及其黄花杓兰生长中的作用。 在应用方面没有还有进行有效地工作，所以还需要以后付出努力：菌根的作用是 否可以被一些添加的营养物质代替， 菌根真菌对小苗的侵染试验和菌肥制剂的研 制应用、 菌根真菌与植株的相互作用机理和物质能量的流动这些工作不但有 很大的应用上的意义，而且在理论研究上，也可以帮助阐明兰科植物与菌根真菌 的共生关系和协同进化。 参考文献 47 参考文献参考文献 陈瑞蕊，林先贵，施亚琴，2003兰科菌根的研究进展应用与环境生物学报， 2003，9（1） ：97101 陈心启，吉占和，1998中国兰花全书北京：中国林业出版社 弓明钦，1997菌根研究及其应用北京：中国林业出版社 范黎，郭顺星，1998兰科菌根真菌研究进展微生物学通报，25（4） ：227 230 范黎，郭顺星，徐锦堂，1999天麻种子萌发过程中与其共生真菌石斛小菇间的 相互作用菌物系统，18（2） ：219225 范黎，郭顺星，肖培根，1999墨兰菌根的结构和酸性磷酸酶定位研究云南植 物研究，21（2） ：197 范黎，郭顺星，肖培根，2001天麻种子萌发过程与开唇小姑的相互作用菌物 系统，20（4） ：539546 郭秀珍，毕国昌，1989林木菌根造林技术北京：中国林业出版社 郭顺星，徐锦堂，1990真菌在兰科植物种子萌发生长中的作用及相互关系植 物学通报，7（1） ：1317 郭顺星， 徐锦堂， 1990 （a） 白芨种子染菌萌发过程中细胞超微结构变化的研究。 植物学报，32（8） ：594598 郭顺星，徐锦堂，1990(b)天麻消化紫箕小姑及密环菌过程中的细胞超微结构 变化的研究真菌学报，9（3） ：218225 黄家林，2000杓兰属（cypripedium l.）种子无菌萌发及其原球茎生长发育的 研究（硕士论文） 黄家林，胡虹，2001黄花杓兰种子无菌萌发的培养条件研究云南植物研究， 23（1） ：105108 王瑞苓：黄花杓兰与菌根真菌共生关系研究 48 李伯年， 高金城， 1993 大花杓兰根结构的扫描电镜研究 甘肃科学学报 17 （5） ： 2 李晓林，冯固，2001从枝菌根的生理生态北京：华文出版社 李正理，1996植物组织制片学北京：北京大学出版社 刘润进，李晓林，2000从枝菌根及其应用北京：科学出版社 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