（植物学专业论文）水稻染色体内同源重组系统的研究.pdf

华南师范大学博上论文 目录 d o c t o r a ld i s s e r t a t i o n s o u t hc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y s t u d yo nt h ei n t r a c h r o m o s o m a l h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o ni nr i c e ( o r y z a s a t i v al ) d o c t o r a lc a n d i d a t e ：z h u a n y i n gy a n g s u p e r v i s o r ：h o n g q i n g l i m a j o r ：b o t a n y c o l l e g eo f l i f es c i e n c e s s o u t hc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y , g u a n g z h o u d e c e m b e r , 2 0 0 9 摘要 摘要 水稻染色体内同源重组系统的研究 专业：植物学 i y i i i i l l l l l l l l i i l 8 1 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1 1 1 5 i i i l l l l l l l l l l 2 1 1 1 i l l 3 l i i i i “y 18 5 5 12 3 植物在生长过程中，多种外界因素和内部因素能引起细胞内d n a 的损 伤。这些损伤能否被修复以及所采用的修复方式将决定细胞的存亡与变异。 此外，d n a 损伤能作为一种信号影响植物的生长发育。因此，建立一套直观、 高效的d n a 损伤检测系统，有利于研究环境对d n a 的损伤诱变作用、信号转 导途径、相关修复蛋白的功能鉴定和植物的进化与适应等问题。 本文利用已获得的转重组载体株系，研究了水稻基因组d n a 损伤后通过同 源重组( h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n , h r ) 修复的特点、影响水稻d n a 同源重组 效率的因素如转基因拷贝数、插入位点数、关键h i 澎复蛋白基因的表达模式、 蛆损伤胁迫条件、植物生长调节剂和异源r e e q r a d 5 4 基因的表达等。具体 结果如下：一。 1 、系统研究了水稻染色体内同源重组发生的特点。发现水稻各组织中都有 同源重组发生，且同源重组发生的频率具有组织特异性，在水稻中愈伤、根和 叶( 三叶期) 的h r 发生频率高低顺序为：愈伤组织 根 叶。其中，愈伤组织 的h r 频率是根的1 7 1 9 6 倍( 株系间差异) ，是叶的2 2 2 5 0 0 3 倍( 株系间 差异) ，这些差异反映了它们的基因组稳定性不同。组织切片观察发现胚性愈 ： 伤和非胚性愈伤中都有重组发生，但胚性细胞的重组率较高，约为7 0 ；根中的 重组主要集中在皮层和内皮层，占8 0 以上，很少发生在维管束。d a b 染色和 t u n e l 检测发现代谢活性高和d s b 发生较频繁的细胞与较高的重组频率相关。 2 、重组载体整合进水稻基因组的拷贝数( 位点数) 、插入位点的周边序列 特点及甲基化修饰均会影响h r 频率。在愈伤、根和叶( 三叶期) 中发现插入拷 摘要 贝数( 位点数) 越多，h r 频率越高。通过分析获得的2 1 个株系插入位置的侧 翼序列，发现仅8 个株系的插入位置在基因内部，多数插入位置的序列为基因的 间隔区。发现这些整合位点两侧序列特点与h r 频率存在密切关系，该侧翼序列 在基因组内部含重复区域即可促进h r 频率，且重复区域越长，h r 频率相对就 越高；整合位点甲基化还会导致h r 频率降低。 3 、通过生物信息学分析发现水稻基因组中含8 个r a d 5 1 类蛋白家族成员( h r 修复关键酶) ，包括2 个d m ci ( d m cia 和d m cib ) 、2 + r a d 5 1 ( 5 1 a 和r a d 5 1 b ) 、r a d 5 1 b 、r a d 5 1 c 、r a d 5 1 d 和x r c c 3 ；2 个k u 7 0 蛋白( n h e j 修复关键酶) ，1 个为完整蛋白，另1 个是n 端片段。与拟南芥相比，对应蛋白成 员之间具有较高的同源性。通过r t - p c r 方法分析r a d 5 1 类和砌加蛋白基因的时 空表达模式，发现2 个基因表达模式比较接近，在dmci各个组织中均有表达， 且都在颖壳和花药中表达量最高，而在愈伤、根和旗叶中的表达较低，在幼叶中 的表达最低。两个r a d 5 1 基因表达模式不同，r a d 5 1 a 在愈伤、旗叶和花药中的 表达较高，根和颖壳较弱，在幼叶中表达最弱；而r a d 5 1 b 在愈伤中表达最强， 在花药和根中有表达，但较弱。r a d 5 1 b 和r a d 5 1 c 表达模式相似，除在愈伤中 的表达偏低外，在其它各组织中表达差异不大。x r c c 3 的表达模式比较特殊，除 在根中表达量较高以外，在别的组织中表达都很低。r a d 5 1 d 在愈伤、旗叶和花 药中表达较高，而在幼叶和根中表达较低。k u 7 0 在个组织中都有表达，只是在 花药和颖壳中表达较弱。 4 、用不同d n a 损伤胁迫( c 0 6 0 吖射线、重金属和干旱) 处理同源重组株 系发现这些处理都能不同程度地提高h r 频率，说明该系统可以实时检测外界环 境对植物d n a 损伤及同源重组的影响。 5 、外源激素( g a 3 、6 - b a 和2 ，4 d ) 处理对同源重组频率有明显的促进影 响，尤其g a 3 作用最明显。g a 3 可分别提高根和叶中同源重组率约5 倍，而6 - b a 只提高了约2 7 倍。同源r t p c r 分析g a 3 对修复关键酶的影响，发现d m ci 和r , 4 d 5 1 d 基因表达模式变化不大，说明不受g a 3 影响；r a d 5 1 a 、r a d 5 1 b 、 r a d 5 1 b 、r a d 5 1 c 、x r c c 3 和k u 7 0 的表达在不同程度上受g a 3 的诱导，尤其对 根部r a d 5 1 c 表达有明显的促进作用；r a d 5 1 a 比r a d 5 1 b 受g a 3 的调控更明显， 在根中随着g a 3 浓度的增加r a d 5 1 a 表达量明显增加；在根和叶中r a d 5 1 b 随 i i 摘要 着g a 3 浓度的增加出现先升后降的趋势。此外还发现如果缩短g a 3 处理的时间 ( 2 4 h ) ，h r 频率仍会增加。 6 、为了检测异源蛋白对水稻h r 的影响，本文通过田间杂交获得了同源重组 株系和酵母r a d 5 4 和大肠杆菌r e c q 超表达转基因株系的杂交后代，发现表达异 源重组酶对水稻h r 频率有促进作用。在对杂交后代进行分子检测时，发现后代 与亲本之间存在较大的差异，有的母本的条带消失，有的父本的条带增大，说明 在杂交过程或后代生长期基因组内有重组现象发生，这将为深入研究水稻同源重 组机理提供较好的材料。 关键词：d n 诹链断裂；同源重组修复；非同源末端连接；水稻；插入位点； 侧翼序列；胁迫；修复关键酶基因 i i i a b s t r a c t s t u d yo nt h e in t r a c h r o m o s o m aih o m oio g o u sr e c o m b in a tio n a b s t r a c t i nr i c e ( o r y z as a t i v a 厶) m a j o r ：b o t a n y aw i d ev a r i e t yo ff a c t o r sf r o mb o t he n v i r o n m e n t a la n de n d o g e n o u so r i g i n sc o u l d c a u s ed n ad a m a g e so fp l a n t sd u r i n gt h e i rl i f e t i m e d n ad a m a g e sc a ni n d u c ec e l l d e a t hi fl e f tu n r e p a i r e d ，o ri n d u c em u t a t i o n si fi n a p p r o p r i a t e l yr e p a i r e d i na d d i t i o n , d n ad a m a g ec a ni n f l u e n c ep l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n tt h r o u g ht h ed a m a g e s i g n a l i n gp a t h w a y t h u s ，s e t t i n gu pa v i s u a la n de f f i c i e n ts y s t e mo fm o n i t o r i n gd n a d a m a g e sw i l lc o n t r i b u t et os t u d y i n go nt h eg e n o t o x i cs t r e s sf r o me n v i r o n m e n t ，t h e s i g n a lt r a n s d u c t i o no fd n ad a m a g ea n dt h ef u n c t i o n o ft h ec o r r e s p o n d i n gp r o t e i n s ，嬲 w e l la st h ea d a p t a t i o no f p l a n tt oe n v i r o n m e n ta n dp l a n tg e n o m ee v o l u t i o n i nt h i st h e s i s ，w es t u d i e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ( h r ) a b s t r a c t e m b r y o g e n i cc e l l sw i t hd e n s ec y t o p l a s m h re v e n t si nr o o t sm a i n l ya p p e a r e di n c o r t e xa n de n d o d e r m d a bs t a i n i n ga n dt u n e la s s a yo ft h ep l a n tt i s s u er e v e a l e d t h a tc e l l sw i t hh i g hr e c o m b i n a t i o nr a t ea r eo f v i g o r o u sm e t a b o l i s ma n dm o r ed s b s 2 h rr a t e sw e r ei n f l u e n c e db yt h et r a n s g e n ec o p i e si n t e g r a t e di nr i c eg e n o m e a n d t h el o c a t i o n so ft h et r a n s g e n e si nc h r o m o s o m ea l s oi n f l e n c e dt h eh rr a t e s m o r e i n s e r t i o nc o p i e si nc a l l u s ，r o o t sa n dl e a v e s g e n e r a l l y r e s u l t e dh i g h e rh rr a t e s d i f f e r e n tl i n e sw i t hs a m ei n s e r t i o nl o c ia l s os h o w e dd i f f e r e n th rr a t e s t h ea n a l y s i s o ff l a n k i n gs e q u e n c e so f21l i n e ss h o w e dt h a t8l i n e sw i t ht r a n s g e n ei n t e g r a t e di n g e n ec o d i n gr e g i o n a n a l y s i so ft h ec o m p o s i t i o no ff l a n k i n gs e q u e n c er e v e a l e dt h a t h rr a t e sa r ec o r r e l a t e dw i t ht h er e p e a t s e q u e n c e s m e a n w h i l e ，m e t h y l a t i o na t i n t e g r a t i o ns i t e sl e dt ol o w e rh r r a t e s 3 a n a l y s i so fd s br e p a i re n z y m eg e n e ss h o w e dt h a tr i c eg e n o m ec o n t a i n se i g h t r a d 51h o m o l o g s ，w h i c hi n c l u d e st w od m c1 ( d m claa n dd m cib ) ，t w or a d 51 ( r a d 5 1 aa n d 5 lb ) ，砒m 5 1 b ，凡5 1 c ，砒5 1 da n dx r c c 3 mr i c e g e n o m ea l s oh a st w ok u 7 0p r o t e i n sw h i c hi si m p o r t a n tf o rn o n - h o m o l o g o u se n d j o i n i n g ( n h e j ) t h e s ep r o t e i n ss h o w e dh i g hh o m o g yw i t h t h e i ra r a b i d o p s i s c o u n t e r p a r t s r t - p c rr e v e a l e dt h a tt w od m c 1ig e n ee x p r e s s e di na l lt i s s u e s ，w i t h t h eh i g h e s tl e v e li ng h m e sa n da n t h e r s ，f o l l o w e db yc a l l u s ，r o o t s ，f l a gl e a v e sa n d y o u n gl e a v e s r a d 5 1 ae x p r e s s e dh i g h l yi nc a l l u s ，f l a gl e a v e sa n da n t h e r s ，w h i l e r a d 5 1 bh a so n l ys t r o n ge x p r e s s i o ni nc a l l u s r a d 5 1 ba n dr a d 5 i cs h o w e ds i m i l a r e x p r e s s i o np a t t e r n si nd i f f e r e n tt i s s u e ，w i t hr e l a t i v e l yl o wl e v e li nc a l l u s t h ex r c c 3 w a sd e t e c t e dw i t hs t r o n ge x p r e s s i o ni nr o o t sw h i l el o wl e v e l si no t h e rt i s s u e s c a l l u s ， f l a gl e a v e sa n da n t h e r sd i s p l a y e dh i g hc o n c e n t r a t i o no fr a d 5 1 dw h i l ey o u n gl e a v e s a n dr o o t sl o w n ek u7 0t r a n s c r i p t ss h o w e dal o w e rl e v e li na n t h e r sa n dg h m e s 4 t r e a t m e n to ft h et r a n s g e n i cp l a n t sw i t hd n a d a m a g ea g e n tc 0 6 0 _ yr a y , h e a v ym e t a l o rd e h y d r a t i o ne n h a n c e dh rr a t e s ，w h i c hi n d i c a t e sb o t hd n ad a m a g ea n d e n v i r o n m e n t a ls t r e s s e sc a ns t i m u l a t eh ri nr i c e v a b s t r a c t 5 t r e a t m e n to ft h et r a n s g e n i cp l a n t sw i t hp l a n tg r o w t hr e g u l a t o r sg a 3 ，6 - b aa n d 2 ，4 一dc a ni n c r e a s eh rr a t e s ，e s p e c i a l l yi nt h ec a s eo fg a 3 g a 3c a ni n c r e a s eh rr a t e s 5 - f o l d ，w h i l e6 - b ai n c r e a s e da b o u t2 7 一f o l d r t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt r e a t m e n t o ft h ep l a n tw i t hg a 3i n d u c e dt h ee x p r e s s i o no fr a d 5 d l a , r a d 5 1 b , r a d 5 1 b , r a d 5 1 cx r c c 3a n dk u 7 0t od i f f e r e n tl e v e l s t h er a d 5 1 ce x p r e s s i o ni nr o o t sw a s s t r o n g l yi n d u c e db yg a 3 t h er a d 5 1 dt r a n s c r i p t si n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo f g a 3 c o n c e n t r a t i o ni nr o o t s r a d 5 1 be x p r e s s i o nc a nb ei n d u c e db yg a 3 ，w h i l ei t s e x p r e s s i o nl e v e ld e c r e a s e sw i t ht h ei n c r e a s eo fg a 3c o n c e n t r a t i o n t r e a t m e n to fs e e d s - i nt h eg e r m i n a t i o ns t a g ea l s oi n c r e a s e dh rr a t e s 6 t oi n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c eo fr a d 5 4a n dr e c qo nr i c eh r t r a n s g e n i cr a d 5 4a n d r e c qr i c ep l a n t sw e r ec r o s s e dw i t ht h ep l a n t sc o n t a i n i n gt h er e c o m b i n a t i o nc o n s t r u c t o u rd a t as h o w e db o t hp r o t e i n sc a l ls t i m u l a t eh ri nr i c e s o t h e mb l o ta n a l y s i s i n d i c a t e ds o m ef 1p l a n t sh a v ed i f f e r e n tp a a e r n sf r o mt h e i rp a r e n tl i n e s , w h i c h p r o b a b l yc a m ef r o mt h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nb e t w e e nt h et r a n s g e n e s k e yw o r d s ：d n ad o u b l e s t r a n d b r e a k s ，h o m o g e n o u s r e c o m b i n a t i o n r e p a i r , n o n - h o m o l o g o u se n dj o i n i n g ，r i c e ，i n s e r t i o ns i t e ，f l a n ks e q u e n c e i e n v k o n m e n t a l s u p p r e s s m n , r e p a t re n z y m eg e n e v i 目录 目录 j 商要i a b s t r a c t 1 1 r 目录v i i 缩写词表x i 第一章文献综述1 1 1 d s b 与修复途径- 2 1 1 1h r 和n h f _ j 修复机制3 1 1 1 1h r 的修复机制3 1 1 1 2 n h f _ j 修复机制3 1 1 2h r 和n h e j 修复特点：4 1 2 参与d s b 修复的主要蛋白5 1 2 1n h e j 相关蛋白5 1 2 2h r 相关蛋白6 1 2 2 1r a d 5l 类蛋白一6 1 2 2 2r a d 5 2 蛋白8 1 2 2 3m r n 复合体9 1 2 2 4r a d 5 4 蛋白9 1 2 2 5 解螺旋酶r e c q 家族一1 0 1 2 2 6 其他蛋白l0 1 2 3 相互作用1 l 1 3 基因打靶与h r 1 2 1 4 h r 与表观遗传学。1 3 1 5 高等植物h r 修复的研究进展1 4 1 5 1 植物中h r 研究历程：- 。1 4 1 5 2 植物中的重组蛋白l6 1 5 3 影响h r 事件发生的因子1 9 1 6 水稻物种特性；：j ：2 0 1 7 本研究的目的和意义2 0 第二章水稻染色体内同源重组系统的研究2 2 2 1 材料与方法2 2 2 1 1 植物材料2 2 2 1 2 仪器、工具酶及试剂2 2 2 1 2 1 仪器及用品：2 2 2 1 2 2 工具酶及试剂2 3 一2 1 3 实验方法2 3 2 1 3 1 基本m s 培养基母液配方2 3 2 1 3 2 材料的培养2 4 2 1 3 3 g u s 组织化学染色检测h r 事件2 4 2 1 3 4 不同材料的重组率的统计2 5 2 1 - 3 5 转基因植株鉴定- 。2 6 2 1 3 6d a b 组织化学染色检测过氧化氢酶活性事件3l 2 1 3 7 植物组织石蜡切片的制作一3 1 i 目录 2 1 3 8t u n e l 3 4 2 1 3 9t a i l p c r 一：3 4 2 1 3 1 0g e n o m i ew a l k i n g 3 5 2 1 3 1 1 琼脂糖凝胶电泳及检测3 6 2 1 3 1 2 甲基化检测3 6 2 2 结果与分析3 7 2 2 1 转基因株系的s o u t h e r n 杂交检测3 7 2 2 1 1 总d n a 提取3 7 2 2 1 2 探针制备3 7 2 2 1 3s o u t h e r n 杂交结果。3 8 2 2 2 水稻中染色体内同源重组的分析4 0 2 2 2 1 水稻各组织染色体内同源重组4 0 2 2 2 2 不同株系间重组的比较4 0 2 2 2 3 水稻愈伤组织中的染色体内同源重组4 2 2 2 2 4h r 发生的随机性二二4 3 2 2 2 5 花药中的同源重组4 4 2 2 3 插入位点对h r 的影响4 5 2 2 4 插入位置对h r 的影响4 6 2 2 4 1 侧翼序列分析4 6 2 2 4 ，2 侧翼序列特点和h r 频率关系5 0 2 2 5 水稻组织的过氧化氢酶活性检测5 l 2 2 6t u n e l 检澳4 5 2 2 2 7d n a 甲基化分析5 3 2 3 讨论! ；2 i 2 , 3 1 水稻染色体内同源重组特点5 4 2 3 2 重组与细胞代谢、分裂活性的关系5 5 2 3 3 插入位置对重组的影响5 6 第三章d s b 修复关键蛋白家族基因表达分析- 5 8 3 1 材料与方法5 8 3 1 1 水稻中d s b 修复蛋白基因的检索与鉴定5 8 3 1 2 染色体分布图5 8 3 1 3 序列分析5 9 3 1 4 基因表达分析5 9 3 1 4 1 材料的准备5 9 3 1 4 2r n a 提取。5 9 3 1 4 3 半定量r t - p c r 5 9 3 1 5p c r 结果的相对定量6 l 3 1 6 原位杂交6 l 3 1 6 1 试剂配方6 1 3 1 6 2 操作流程6 3 3 2 结果与分析6 5 3 2 1d s b 修复基因家族的鉴定和在染色体上的位置6 5 3 2 2d s b 修复蛋白家族氨基酸序列比对分析6 7 3 2 3 水稻和拟南芥d s b 家族蛋白基因系统进化分析6 8 v i i i 目录 3 2 4d s b 修复家族基因各成员的表达预测6 9 3 2 4 1n c b i 数据库分析6 9 3 2 4 2 基因芯片分析7 0 3 2 5r a d 5 1 家族蛋白基因表达水平7 0 3 2 5 1r n a 提取7 0 3 2 5 2r t - p c r 扩增7 l 3 2 6 原位杂交7 3 3 2 6 1 探针的标记7 3 3 2 6 2 原位杂交7 4 3 3 讨论7 5 3 3 1 生物信息学分析水稻d s b 修复蛋白k 一7 5 3 3 2 内源修复蛋白的表达模式7 6 第四章d n a 损伤胁迫处理对重组的影响7 9 4 1 材料与方法7 9 4 1 1 材料7 9 4 1 2 方法7 9 4 1 2 1 培养条件7 9 4 1 2 2 重组率的统计7 9 4 1 2 3c 0 6 - 丫处理7 9 4 1 2 4 重金属处理8 0 4 1 2 5 干旱处理8 0 4 2 结果与分析一8 0 4 2 1c o ? o 吖处理8 0 4 2 1 1c 0 6 0 - 1 , 对愈伤中h r 的影响8 0 4 2 1 2c d m i 吖对三叶期小苗h r 的影响一8 1 4 2 2 重金属处理8 2 4 2 2 1c u 2 + 对重组的影响8 2 4 2 2 2z 铲+ 对重组的影响8 4 4 2 2 3c 矿对重组的影喻：o ：_ 8 5 4 2 2 4c r 对重组的影响一8 6 4 2 3 干旱处理对重组的影响8 7 4 3 讨论8 9 第五章外源激素对重组的影响9 1 5 1 材料与方法9 1 5 1 1 植物材料9 l 5 1 2 实验方法9 1 5 1 2 1 激素处理：二：上。9 1 5 1 2 2 短期g a 3 处理。9 1 5 2 结果与分析9 2 5 2 1g a 3 对重组的影响9 2 5 2 2 2 ，4 d 对重组的影响9 4 5 2 36 - b a 对重组的影响：9 6 5 2 4 短期g a 3 处理对h r 的影响。9 8 5 2 5 主要d s b 修复基因对g a 3 的响应10 0 i x 目录 5 3 讨论10 1 第六章异源重组蛋白表达对重组的影响1 0 2 6 1 材料与方法1 0 2 6 1 1 植物材料10 2 6 1 2 载1 本。10 2 6 1 3 实验方法1 0 3 6 1 3 。1 温烫蒸汽杂交法t 0 3 6 1 3 2p c r 扩增1 0 3 6 1 3 3s o u t h e r n 杂交1 0 4 6 2 结果与分析1 0 4 6 2 1 田间杂交方法改进，1 0 4 6 2 2 杂交后代检测。1 0 4 6 2 2 13 5 s ：r a d 5 4 重组株系组合检测1 0 4 6 2 2 2u b i ：r a d 5 4 重组株系组合检测1 0 5 6 2 2 3u b i ：r e e q x 重组株系组合检测1 0 6 6 2 3 杂交后代的重组率1 0 7 6 3 讨论1 0 8 第七章结论。1 1 0 论文创新点1 1l 攻读博士期间发表论文及参与课题1 1 2 参考文献1 13 附j 素l 致谢9 原创性声明错误l 未定义书签。 x 缩写词表 缩写名 2 ，4 一d d d d h 2 0 d m s o g 潞 h h p t h r h y g t - d n a t r i s x g h c 6 b a g a d n t p d s b b p k b c d n a d n a n h e j i 心 r r r p m r n a s e s d s p v p p d e p c 缩写词表 英文名中译名 2 ，4 - d i c h l o r op h c n o x y a c e t i ca c i d2 , 4 二氯苯氧乙酸 d a y 天 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r双蒸水 d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜 1 3 - g h c u r o n i d a s e葡糖醛酸酶基因 h小时 h y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e潮霉素磷酸转移酶 h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n 同源重组 h y g r o m y c i n 潮霉素 t r a n s f e rd n a 转移d n a t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) 三( 羟甲基) 氨基 5 - b r o m o 一4 - c h o l r o - 3 一i n d o l y l d 5 溴一4 氯3 吲哚 g l u c u r o n i d e- - d 葡糖醛酸 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e 6 卞基腺嘌呤 g i b b e r e l l i n 赤霉素 d e o x y c y t i d i n et r i p h o s p h a t e脱氧核糖核苷酸+ d o u b l es t r a n db r e a kd n a 双链断裂 b a s ep a i r碱基对 k i l o b a s e千碱基 c o m p l e m e n t a r yd