（微生物学专业论文）苯丙氨酸生物合成的5个关键酶基因的串联表达.pdf

苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第1 页共2 7 页 摘要 、 、f 在大肠杆菌中，p p s a 和p c k a 基因分别编码糖代谢中心途径的磷酸烯醇丙酮 酸合成酶( p p s a ) 和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶( p e k a ) ，对苯丙氨酸合成的重要前体 物质磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 的积累起关键侈用。a r o g 、p h e a 和眇b 基 因分别编码苯丙氨酸生物合成途径中的关键酶彩 本研究工作从大肠杆菌k 1 2 诱变菌株基因组中用p c r 方法扩增得到了p p s a 和p c k a 基因，并人工合成了黄色短杆菌p b f 启动子。在已经构建的含有a r o g 、 却8 a 和o b 基因的穿梭质粒p j n 3 的基础上，将p p s a 、p c k a 基因和p b f 启动予 以p s f - p p s a - p c k a 的顺序克隆到质粒p j n 3 上，构建成5 串联基因穿梭质粒p j n 5 ， 然后用电转化方法导入黄色短杆菌中进行酶活性检测和产酸发酵研究。结果表 明，p p s a 和p c k a 基因的串联表达有利于苯丙氨酸生物合成途径下游产物的生成。 转化了p j n 5 质粒的菌株，其苯丙氨酸产量提高到了出发菌株的3 4 倍，比携带 p j n 3 质粒的菌株提高了1 3 。 关键词苯丙氨酸 黄色短杆菌 大肠杆菌 复旦丈学撰写科学报告和学位论文专用纸 一 一一一 矿 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第2 页共2 7 页 a b s t r a c t p h o s p h o e n o l p y r u v a t es y n t h a s e ( p p s a ) a n dp h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y k i n a s e ( p c k a ) a r ek e ye n z y m e st op r o d u c ep h o s p h o e n o l p y r u v a t e ( p e p ) ，al i m i t i n gp r e c u r s o r o fl p h e n y l a l a n i n e o nt h ep a t h w a yo f c a r b o nc e n t e rm e t a b o l i s m i ne s c h e r i c h i ac o l i t h e ya l ee n c o d e db yp p s aa n dp c k ag e n e sr e s p e c t i v e l y t h e3g e n e s ，a r o g ，p h e aa n d t y r b ，e n c o d ek e ye n z y m e so nt h ep a t h w a yo f p h e n y l a l a n i n eb i o s y n t h e s i s i nt h i sw o r k ，p p s aa n dp c k ag e n e sw e r ea m p l i f i e df r o mg e n o m eo fe s c h e r i c h i a c o l ik 1 2m u t a n ts t r a i nb yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，w h i l et h ep r o m o t e rp b fo f b r e v i b a c t e r i u mf l a v u mw a sa r t i f i c i a l l ys y n t h e s i z e d b a s e do nt h es h u t t l ev e c t o rp j n 3 c o n t a i n i n ga r o g ，p h e aa n dt y r bg e n e s ，t h ep r o m o t e rp b f ，p p s aa n dp c k ag e n e sw e r e c l o n e di n t op j n 3i nt u r nt oc o n s t r u c tt h es h u t t l ev e c t o rp j n 5 t h e nt h ec o n s t r u c t e d v e c t o rp j n 5c o n t a i n i n g5g e n e sw a si n t r o d u c e di n t ob r e v i b a c t e r i u mf l a v u mb y e l e c t r o n i ct r a n s f o r mf o re x p r e s s i o na n df e r m e n t a t i o n o v e r e x p r e s s i o no fp p s aa n d p c k ag e n e sc a u s e de n h a n c e m e n t i ni n t e r m e d i a t e so fp h e n y l a l a n i n eb i o s y n t h e s i s t h e r e s e tf r o mf e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a tt h ey i e l do f p h e n y l a l a n i n eb yt h ec e l l sh a r b o r i n g p j n 5i n c r e a s e d3 4 f o l dr e l a t i v et ot h a tb yt h eh o s tc e l l sa n dh a d1 3 m o r et h a nt h a t b yt h ec e i l sh a r b o r i n gp j n 3 k e yw o r d sp h e n y l a l a n i n ep p s ap c k a a r o g p h e at y r b e s c h e r i c h i ac o l ib r e v i b a c t e r i u m f l a v u m 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第3 页共2 7 页 日u舌 l 一苯丙氨酸( l p h e n y l a l a n i n e ) 是人体的必需氨基酸之一，在食品、饲料、医药 和化妆品等领域都有着广泛的应用。尤其近年来随着低热量、高甜度的二肽甜味 剂阿斯巴甜( a s p a r t a m e ) 应用的日益广泛，作为甜味剂两种原料之一的苯丙氨 酸的市场需求量也迅速增加。另外，苯丙氨酸等芳香族氨基酸及其衍生物是氨基 酸输液制剂和一些抗肿瘤药物的必需原料。因此，对l 苯丙氨酸生物合成途径 的研究和对其工业化生产的研究越来越受到人们的重视。 一，苯丙氨酸的工业生产 l 一苯丙氨酸的生产方法主要有水解抽提法、化学合成法、酶法和微生物发酵 法等4 种。 1 ，水解抽提法 水解天然蛋白质，从中提取氨基酸。但是由于苯丙氨酸在天然蛋白质中含量 较低，一般很少用这种方法来进行生产。 2 ，化学合成法 直接化学合成的苯丙氨酸是d l 型消旋体，必须进行拆分才能得到l 苯丙氨 酸，工艺复杂，成本较高，目前基本上已被酶法和发酵法所取代。 3 ，酶法 利用酶将化学合成的类氨基酸前体高效专一地催化反应成l 苯丙氨酸。酶 法的生产工艺简单，产物能高浓度地蓄积，回收简便而且收率较高。目前工业生 产经常用到的酶有l 苯丙氨酸脱氢酶、l 苯丙氨酸解氨酶、l 苯丙氨酸转氨酶等。 4 ，微生物发酵法 自从1 9 5 7 年利用微生物直接发酵糖获得谷氨酸以来，微生物发酵法正越来 越多地被用于氨基酸的生产。微生物发酵法可分为两类，即前体物发酵法和直接 发酵法。 ( 1 ) 前体物发酵法 它是利用氨基酸生物合成代谢途径中的某些中间体( 即前体物) 作为原料，通 过微生物发酵生产氨基酸的一种方法。其优点是可以避开最终产物对合成途径中 一些关键酶的反馈抑制作用，因此可以用来生产那些难以用酶法或直接发酵法生 产的氨基酸，如l 一色氨酸、l 丝氨酸和l 苯丙氨酸等；而其缺点是成本较高。 ( 2 ) 直接发酵法 这种方法利用合适的生产菌株，用葡萄糖、铵盐等碳源、氮源来直接生产氨 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第4 页共2 7 页 基酸。其优点是原料廉价，反应在常温常压下进行，可以利用现有发酵生产设备， 从而大大节省了生产成本。但是由于l 苯丙氨酸等最终产物对野生菌株体内的 芳香氨基酸合成代谢途径上的关键酶有着强烈的反馈抑制作用，使其细胞不能大 量蓄积苯丙氨酸，因此若要进行实际发酵生产，就必须改造野生菌株，解除其代 谢调控，使得代谢终产物能过量蓄积。一旦获得高产菌株，则直接发酵法的低生 产成本的优势便充分显现出来了。所以，构建高产酸的工程菌是目前研究苯丙氨 酸生产的主要方向。 二，苯丙氨酸的生物合成途径及其代谢调控 l 一苯丙氨酸等芳香族氨基酸只能由植物和微生物合成。在大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i ac o l d 中，以葡萄糖为底物产生苯丙氨酸的全过程如图l 所示。苯 丙氨酸的合成起始物是磷酸烯醇式丙酮酸( p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ，p e p ) 和赤藓 糖4 磷酸( e r y t h r o s e4 - p h o s p h a t e ，e 4 p ) 。其中，磷酸烯醇式丙酮酸是糖酵解途径 ( e m p ) 的中间产物，赤藓糖4 磷酸是磷酸己糖支路( h m p ) 的中间产物。这 2 种物质缩合成3 脱氧一a 一阿拉伯庚酮糖酸7 磷酸( 3 - d e o x y a k e t o d a r a b i n o h e p m l o s o n a t e 一7 一p h o s p h a t e ，d a h p ) ，然后经莽草酸( s h i k i m a t e ) 途 径形成分枝酸( c h o r i s m a t e ) 。分枝酸是芳香族氨基酸合成途径的分枝点。在分枝 酸以后即分为两条途径。其中一条是在分枝酸变位酶( c h o r i s m a t em u t a s e ，c m ) 和预苯酸脱水酶( p r e p h e n a t ed e h y d r a t a s e ，p d ) 的作用下形成苯丙酮酸，最终在 转氨酶( a r o m a t i c a m i n o a c i dt r a n s a m i n a s e ，a t ) 的作用下形成苯丙氨酸。 芳香族氨基酸生物合成的调节是通过最终产物对合成途径的逐步反馈抑制 ( s t e p f e e d b a c k i n h i b i t i o n ) 来实现的。如图1 虚线部分所示，在大肠杆菌中，芳 香族氨基酸对其合成途径上游的糖代谢中心途径中的酶没有反馈抑制作用，代谢 调控主要针对催化共同途径第一步反应的d a h p 合成酶( d a h ps y n t h e t a s e ，d s ) 和分枝点上的分枝酸变位酶、氨基苯甲酸合酶( a n t h r a n i l a t es y n t h a s e ，a s ) 等。 在黄色短杆菌( b r e v i b a c t e r i u m f l a v u m ) 中，d a h p 合成酶的活性只受苯丙氨酸 和酪氨酸协同抑制，不受色氨酸影响；j 。如果只积累苯丙氨酸或酪氨酸中的一 种，则抑制作用比较轻微：但是在这两种氨基酸同时存在时，浓度达到2 m g l 就能抑制d a h p 合成酶5 0 的活性【2 】。对于分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶，苯丙 氨酸和酪氨酸的积累也会对它们产生协同抑制作用【3 】。而色氨酸的积累则一方面 能反馈抑制氨基苯甲酸合酶，阻止色氨酸继续合成；另一方面却能竞争性地解除 苯丙氨酸和酪氨酸对分枝酸变位酶的抑制【3 j 。因此，能否解除产物对这些酶的反 馈抑制作用，是发酵菌株能否大量累积苯丙氨酸的关键之一。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氮酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第5 页共2 7 页 三，苯丙氨酸生物合成中的关键酶 在苯丙氨酸生物合成途径中，起关键作用的酶往往是：1 ) 在代谢分支点上 能使反应向合成苯丙氨酸方向进行的酶；2 ) 能使前体物质，尤其是竞争激烈( 代 谢去路多) 的前体物质有效积累的酶。 l ，p e p 合成酶( p h o s p h o e n o l p y r u v a t es y n t h a s e ，p p s a ) p e p 合成酶是糖代谢中心途径上的关键酶。在大肠杆菌中，p p s a 由p p s a 基 因编码，由7 9 2 个氨基酸残基组成，以丙酮酸为底物催化生成p e p ”1 。p p s a 同 时能够催化逆向反应，但这时的k i n 值只及正向反应的1 4 0 0 5 1 。 p e p 是影响苯丙氨酸产量的关键因素之一。p e p 在羧化酶( p p c ) 的催化下 形成草酰乙酸，在丙酮酸激酶( p y k ) 催化下形成丙酮酸，而且它还是磷酸转移 体系中的磷酸供体，这些反应都与苯丙氨酸生物合成竞争p e p 。g e e r s e 掣6 】发现 提高p p s a 的活性，有利于苯丙氨酸的大量合成。p a t n a i k 等【7 境隆了大肠杆菌p p s a 基因，使它过量表达，发现能使下游产物d a h p 增加约1 9 倍。 2 ，p e p 羧激酶( p h o s p h o e n o i p y r u v a t ec a r b o x y k i n a s e p e r a ) p e p 羧激酶是糖异生途径中的关键酶，将革酰乙酸催化成p e p 。p c k a 在其 活性中心附近有一对巯基，f e 2 + 、m g ”等二价金属离子可以插入活性中心形成复 合物，从而克服无机磷酸的抑制作用，激活酶的活性【8 】。 在大肠杆菌中，p c k a 基因编码p c k a 蛋白，其过量表达也能造成p e p 在细 胞中的积累，促进下游产物的合成。p c k a 基因与p p s a 基因串联表达能使d a h p 增加2 1 倍【9 1 01 9 9 9 年，c h a o 等【1 0 1 报道，利用酶法生产苯丙氨酸时，同时向大 肠杆菌导入表达p c k a 基因和眇b 基因的质粒可以使摩尔转化率达到7 5 ，比只 导入咿b 基因的高2 0 。 3 ，与产生e 4 p 有关的酶 大肠杆菌的t e t a 基因和t a a 基因分别编码磷酸己糖支路上的转酮酶 ( t r a n s k e t o l a s e ，t k t a ) 和转醛酶( t r a n s a l d o l a s e ，t a l a ) ，催化5 磷酸核糖和5 磷 酸木酮糖到e 4 p 的反应。e 4 p 是苯丙氨酸合成的另一个起始物，对下游途径也有 很大影响。有人报道，t k t a 基因的过量表达会导致d a h p2 倍的增加【1 l j ；而t a l a 基因也能够使d a h p 产量增加【1 2 1 。2 0 0 1 年，t a t a r k o 等【1 3 】研究发现向工程菌株导 入t k t a 基因能使最终苯丙氨酸的产量增加到1 4 倍。 4 ，d a i - i p 合成酶( d s ) d a h p 合成酶催化p e p 和e 4 p 缩合形成d a h p ，是催化芳香族氨基酸合成 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯雨巍酸生耪合成的5 个关键酶基霞懿串联表达第6 贾共2 7 交 共同途经第一步反应的酶。农大肠抒菌中，d s 有3 个周功酶，分别由a r o f 、a r o g 葶a r o h 基因编鹦，其中a r o g 的活性受苯丙氨酸反馈抑制。通过定点突变技术， 发现a r o g 第1 8 0 位的丝氨酸残基是反馈抑镱4 的关键结食位点【1 4 1 。把第1 8 0 位的 丝氨酸突变为苯丙氨酸并把第8 位的亮氨酸突变为异亮氨酸，可以鳃除反馈抑制 9 0 以上【1 5 】。江培捌等【1 6 ，1 7 l 通过随机诱变把第2 0 9 位的苯丙氨酸突变为丝氨酸， 也使反馈抑制解除9 0 ，将其导入工程菌后取得了良好的产酸结果。 s ，分枝酸变位酶( c m ) 和预苯酸脱水酶( p d ) c m 和p d 魑由间一个綦因p h e a 编码的双功能酶。大肠杆菌p h e a 编码的p 蛋白由3 8 7 个氨基酸残基组成【l “，共分3 个结构域。其中靠近n 末端的结构域 表现出c m 的活性；中间第1 0 1 至2 8 5 氨基羧残基所构成的区域则表现出p d 的 活性9 l ；靠近c 末端的结构域是调节区域，将这一部分缺失后，p 蛋自仍傈持 c m 和p d 的活性，但不受苯丙氮酸反馈抑帝6 的影响l 。 过羹的p 蛋白裔利予苯丙氨酸的合成。i k e d a 等f 2 l l 将大肠秆菌p h e a 基西通 过多拷贝质粒载体学入谷氨酸棒杆菌串，锭苯藤氨酸产量提高了3 5 ，达蜀 2 3 9 ：l ，蜜现了利用舜源的酶在檫状秆菌中生产苯丙氮酸。 6 ，芳香族氮基馥转氨酶( a t ) 大肠杆蘧t y r b 基因编礴芳番族氨基酸转氨酶，催钝产雯苯褥氨羧懿最甓一 步反瘟。舂人报道，在酶法生产串，往大骚楞蓥工稳菌中导入尧隆蠢t y r b 基因 匏爨粒，能缓生成苯嚣氨酸豹露尔转化率达到5 s 【l 。】。 7 ，编码其蚀摆关酶豹蒸因期调控黟列 除了以上几个关键酶及其基因钋，姿翦人们还缀关没a t o p 、c s r a 、t y r r 等的 职究。a t o p 基因编鹦透性酶( a r o m a t i ca r a i n oa c i d sp e r m e a s e ) ，负责燎苯雨氨酸 肉臌步 运输，减少苯丙氨酸在胞内的积累。 c s r a ( c a r b o ns t o r a g er e g u l a t o r ) 基因编码一种r n a 结合蛋白，对糖酵解途 径起正调控作用，阻止糖的异生，从而减少p e p 的供成【1 3 , 2 2 】。有报道表明，将 发酵菌株的c s r a 基因敲除，可使苯阉氨酸产量增加2 倍【i ”。 t y r r 基因编码t y r r 调节蛋白，通过与a r o f 、a r o g 、t y r p 、t y r b 、a t o p 等基 因上游的d n a 调控序列结含，抑制这些基因的转录 2 3 , 2 4 i 。通过定点突变t y r r 基 因，可以解除这种阻遏作用t 2 5 , 2 6 。 四，构建苯丙氨酸高产工程茵的策略 复鼠大学攘写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第7 页共2 7 页 以廉价糖为原料的直接发酵是生产苯丙氨酸的必然发展方向。而实际利用直 接发酵法的关键是选育高产苯丙氨酸的工程菌株。 1 ，宿主菌的选择 目前在芳香族氨基酸发酵生产中研究应用较多的宿主菌有棒状杆菌和大肠 杆菌。大肠杆菌具有生长快速，遗传学、生理学背景清楚，易于进行基因工程改 造等优点。而棒状杆菌是一类不产芽孢、无鞭毛、短杆状的革兰氏阳性菌的总称。 与大肠杆菌相比，棒状杆菌具有对人畜无害、不产生内毒素和胞外蛋白酶、产物 不易降解而且有利于纯化等优点【2 ”，其中，谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u m ) 、乳酸短杆菌( b r e v i b a c t e r i u ml a c t o f e r m e n t u m ) 和黄色短杆菌等都是 目前氨基酸的主要生产菌株。本文研究工作中所用的产酸宿主菌就是一株经过诱 变的黄色短杆菌。 但是由于棒状杆菌的遗传背景还不清楚，较难直接进行基因工程操作。因此， 需要穿梭质粒载体，先在大肠杆菌中进行基因操作，然后导入棒状杆菌中进行表 达。本文研究工作中采用的穿梭载体是由陆军等【28 】人构建的p j 系列质粒，包含 棒状杆菌质粒p x z l 0 1 4 2 和大肠杆菌质粒p k l 8 ：m o b 的复制起始区。 2 ，传统的微生物育种方法 ( 1 1 分离筛选野生菌 直接分离筛选野生菌以获得高产酸的优良菌株是最常规的选育工程菌的手 段之一。但是野生菌株细胞内的芳香氨基酸合成途径中存在着强烈的反馈抑制， 要在自然界中发现解除反馈抑制的菌株的可能性微乎其微。 ( 2 1 营养缺陷型突变株 筛选某种氨基酸缺陷型的突变株，往往有利于其他氨基酸的积累。比如，酪 氨酸缺陷型菌株一方面可以有效减小苯丙氨酸和酪氨酸对芳香族氨基酸合成途 径的协同抑制，另一方面可以开源节流使中间代谢流更多地用于苯丙氨酸的合 成，因此大肠杆菌和棒状杆菌的酪氨酸缺陷型菌株都可能分泌苯丙氨酸。 ( 3 ) 抗氨基酸结构类似物的突变株 抗氨基酸结构类似物的机理是因为菌株产生了突变，解除了该类似物对合成 途径的反馈抑制，从而使这种突变菌株有可能积累相应的氨基酸。选育苯丙氨酸 工程茵时，常用的类似物有b 2 - 噻吩丙氨酸、邻氟苯丙氨酸( o f p ) 、间氟苯丙 氨酸( m f p ) 、对氟苯丙氨酸( p f p ) 和对氨基苯丙氨酸等。本文研究中所用的出 发菌株( 黄色短杆菌和大肠杆菌) 就是m f p 和p f p 的抗性突变株。 3 ，计算机辅助代谢流分析 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第8 页共2 7 页 传统诱变育种盲目性大、工作繁重，而且又为突变菌株引入不可预知的缺陷。 随着代谢途径研究的日益深入，已经可以利用计算机对代谢流向、中间产物等进 行分析，可以避免传统育种的盲目性。以化学计量学为基础的m p s ( m e t a b o l i c p a t h w a ys y n t h e s i s ) 和以动力学为基础的b s t ( b i o c h e m i c a ls y s t e mt h e o r y ) 等理 论为计算机软件分析提供了算法支持【2 9 , 3 0 】。利用计算机分析可以迅速定位代谢的 关键步骤，确定研究重点，大大提高了效率。例如，通过对苯丙氨酸代谢网络的 分析可以发现磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 的积累有利于苯丙氨酸的产生【3 l 】，从而 使生成p e p 有关的酶成为研究热点。目前互联网上免费的代谢模拟分析软件有 j a r n a c ( h t t p ：w w w c d s c a l t e c h e d u - e h s a u r o j a r n a c h t m ) 等。 4 ，利用基因工程构建高产菌株 尽管计算机分析的好处为人们越来越多地认识，但它毕竟是一个辅助手段， 无法代替实际育种。当前，育种主要是运用基因工程技术，改造关键酶基因，使 更多的前体物质能得到积累。然后构建这些基因的高效表达载体，导入工程菌， 期待产生更高产的工程菌。 1 9 8 5 年，o z a k i 等【3 2 】将抗苯丙氨酸类似物的谷氨酸棒杆菌上编码c m 和p d 的基因克隆进了p c e 5 3 质粒，再将重组质粒导回亲株，发现苯丙氨酸产量比原 始菌株提高5 0 ，达到1 9 e d l 。 2 0 0 0 年，曾小冰等f 3 3 】将大肠杆菌a r o g 、p h e a 和缈b 等3 个基因串联克隆 进穿梭质粒，然后导入黄色短杆菌中表达，发现苯丙氨酸产量提高到2 3 5 倍， 达到2 7 7 9 l 。 基因技术除了用于增加前体物质之外，还有诸多方面的应用，如利用自杀型 载体构建营养缺陷型菌株，引入新的酶来构建代谢旁路以减少有害物质积累等 【3 2 】。因此，基因工程技术已经成为现在获取苯丙氨酸高产工程菌的主要手段。 在本研究工作中，我们用聚合酶链式反应从大肠杆菌总d n a 中扩增得到 p p s a 和p c k a 基因。检测了相关酶的活性后，结合曾小冰等【1 7 】人在a r o g 、p h e a 和o r b 等3 个基因串联表达方面的工作，将这5 个基因以串联的形式克隆到穿 梭质粒上，然后电转化导入黄色短杆菌中，以实现构建高产苯丙氨酸的工程菌株 的目的。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 至塑璺塑生塑宣堕盟! 尘差壁堕苎里墼皇璧垂堡篁! 夏基! ! 夏 g l u c o s e ，。j 厂一 一一一- - t ) - c h o r i s t o a t e a s c n 、 ： 一一一一j a n t h r a n i l a t ep r e p h o n a t e t r y p t o p h a nt y r o s i n e p h e n y l p y r u v a t e l a n i n e 图1大肠杆菌苯丙氨酸生物合成途径及其调控 图中实线部分表示合成途径，虚线部分表示反馈抑制 p e p ：p h o s p h o e n o l p y m v a t e ；e 4 p ：e r y t h r o s e4 - p h o s p h a t e ；d a h p ：3 - d e o x y - a - k e t o d a r a b i n o h c p t u l o s o n a t c - 7 - p h o s p h a t e ；r u 5 p ：r i b u l o s e5 p ；r 5 p ：r i b o s c5 p ；x 5 p x y l u l o s e5 p ；g i y 3 p ：g l y c e r a l d e h y d e3 p ；s 7 p ：s e d o h e p t u l o s e7 p ；o a a ：o x a l o a c e t a t e ； p p s a ：p h o s p h o e n o l p y r u v a t es y n t h a s e ；p c k a ：p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y k i n a s e ；p y k ： p y r u v a t ek i n a s c ；p p c ：p h o s p h o e n o l p y r u v a t cc a r b o x y l a s e ；t k t a ：t r a n s k e t o l a s e ；t a i a ： t r a n s a l d o l a s e ；d s ：d a h ps y n t h c t a s e ；c m ：c h o r i s m a t em u t a s e ；p d ：p r e d h e n a t e d e h y d r a t a s e ；a t ：a r o m a t i c a m i n o - a c i dt r a n s a m i n a s e ；a s ：a n t h r a n i l a t es y n t h a s e ；a t o p a r o m a t i ca m i n oa c i d sp e r m e a s e 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第1 0 页共2 7 页 一，材料 1 ，菌株 材料与方法 表1本项研究所用菌株 名称抗性及特点用途来源 ec o l ik 1 2 诱n t g 诱变，抗p f p 、m f p p p s a 、庐t a 基因 变菌株p 4 1来源菌株 ec o l it o p l ot c 质粒转化受体菌 株 ec o i l p 2 3 9 2 pk p r 质粒表达 菌株 复旦大学微生物 实验室保存 复旦大学分子生 物学实验室保存 复旦大学分子生 物学实验室保存 b r e v i b a c t e r i u m n x r ( 荣丁酮酸抗性) ，抗穿梭质粒表达菌复旦大学微生物 型! 翌王猩堕足壁：塑婴：蟹险医塑塑剑蕉：蕉醛重楚塞堕童堡壹 2 ，质粒 表2本项研究所用质粒 名称抗性标记用途来源 p b l u e s c r i p ts k - a m p r 基因克隆载体 复旦大学分子生物 学实验室保存 pk p ra m p r ec o l i 表达载体复旦大学分子生物 学实验室保存 p j n 3 k m 穿梭质粒载体，携带a r o g 、复旦大学微生物实 醴丛：女! 墅宝壁垄固墅童堡壹 3 ，培养基 ( 1 ) 菌体生长培养基 大肠杆菌使用l b 培养基：短杆菌使用l b 添加1 牛肉膏的培养基。必要 时在培养基中添加各种相应的抗生素。 ( 2 ) 短杆菌发酵培养基 葡萄糖1 0 ，n i - 1 4 c i2 ，尿素1 ，k h 2 p 0 4o 1 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 00 3 ， m g s 0 4 7 h 2 00 0 4 ，酵母粉o 5 ，蛋白胨o 5 ，c a c l 22 5 9 ，l ，m n s 0 4 h 2 0 10 m g l ，f e s 0 4 - 7 h 2 05 0 m g l ，z n s 0 4 7 i - 1 2 03 m g l ，a i c l 3 6 h 2 05 m g l ， n a 2 m 0 0 4 2 h 2 03 m g l ，h 3 8 0 30 5 m g l ，p h7 4 ( 以氨水调节) 。以0 6k g c m 2 灭 菌2 0 r a i n 。 4 ，酶和试剂 限制性内切酶、t a q 酶、碱性磷酸酯酶、t 4 磷酸激酶、连接酶购自t a k a r a 公司( 日本) 。测定酶活性所用试剂购自s i g m a 公司。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达 第1 i 页共2 7 页 人工合成 d n a 片段 p c r p b f ( o 1 k b ) 一 圆馋。 p s k 如p p “p c “w ；f p j ” u 。：7 、；：= ：= ：! ! ；! ：、“p n 、t ：! ! ：，盏。8 “” 图2 5 串联苎曼耋梭质粒p j n 5。b p j n 5 呻轧 的构建 i 蠢b k 姥e 洲一 。o 。r i 。v ，c 。：。如o r 。i g 。i n 。o h f 。v e 。g ：e t a 。b l v eere：p。l，ic；。o；n。in。：!：!：；：!：=：!：!二二p孑。哆手，0玎、hmd 心 c o m y n e f o mb a c t e r i a ：o r i v e ：o r i g i n ) ：! ! ：苎，：歹 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氮酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第1 2 页共2 7 页 图3穿梭质粒p j n 2 和p j n o 的构建 表3本项研究所用p c r 引物和人工基因列表 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达 第1 3 页共2 7 页 二，方法 1 ，大肠杆菌p p s a 、p c k a 基因的克隆 根据h i r s h 等【4 】报道的p p s a 基因d n a 序列和h u g h s 等 3 5 1 报道的p c k a 基因 d n a 序列，设计了p c r 扩增的引物( 见表3 ) 。通过p c r 方法从e c o l ik 1 2 诱 变菌株染色体d n a 中分别扩增得到p p s a 和p c k a 基因。 2 ，大肠杆菌表达载体的构建 参照文献 9 】所述过程构建成表达质粒p p r p p s a 、p p r p c k a 和2 串联表 达质粒p p r - p p s a p c k a ，用限制性内切酶酶切分析和测序鉴定它们的正确性。 用氯化钙法转化到ec o l ip 2 3 9 2 中后，参照方法6 ( 1 ) 、( 2 ) 、( 3 ) 、( 7 ) 等步骤，检 测p p s a 和p c k a 的酶活性。 3 ，5 串联基因穿梭质粒及相关质粒的构建 根据陆军【2 8 】报道的棒状杆菌启动子序列，设计了3 段人工基因( 见表3 ) 用 以拼成b r e v i b a c t e r i u m f l a v u m 启动子p b f ，并通过p b f 的p c r 引物( 见表3 ) ，分 别引入h i n d l l i 和e c o r i 酶切位点。按图2 、图3 所示过程，将启动子p b f 串联在 p p s a - p c k a 基因前，构建成含有2 个反向表达操纵子的5 串联基因质粒p j n 5 以 及质粒p j n 2 、p j n 0 ，用p c r 和限制性内切酶酶切分析鉴定它们的正确性。 4 ，穿梭质粒导入b r e v i b a c t e r i u m f l a v u m 采用电转化方法f 3 6 】，将5 0 u l 菌液和1 0 u l 质粒混和于0 4c m 电击杯中， 以2 4k v 电击4m s 。然后把菌液移入2m l 短杆菌生长培养基中，3 l 1 0 0r p m 培养l h r 。5 0 0 0r p m 离心5 m i n 后，将菌体沉淀涂布在含2 0 ug m l 卡那霉素和 1 0pg m l 萘丁酮酸的生长培养基上。 5 ，短杆菌中质粒的抽提 1 0 m l 菌液离心后取沉淀，加入1 0 0 u l 溶液i 、5 0m g m l 溶菌酶1 0 u l 和 8u n i t 变溶菌酶，振荡均匀后于3 t c 放置2 h r ，以后的操作同大肠杆菌质粒的抽 提。 6 ，酶活性检测 ( 1 ) 酶的粗提纯 按5 的接种量将菌体接种于2 0 m l 生长培养基中，3 1 培养4 8 h r ，于4 c 4 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，收集菌体，用1 0m m o l l i r i s h c i 缓冲液( p h7 4 ) 洗涤， 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第1 4 页共2 7 页 离心后菌体重新悬浮于1 0 m l i r i s h c i 缓冲液中。菌液用超声波破碎处理1 0m i n 8 0 0 0r p m 离心2 0 m i n 。取上清，用硫酸铵进行分级沉淀。先以2 5 的饱和度沉淀 8 0 0 0r p m 离心后取上清，加入硫酸铵至7 0 饱和度，以8 0 0 0r p m 离心2 0 m i n 。 沉淀溶于2 m lt r i s h c i 缓冲液中，于4 。c 透祈4 次，每次2 h r ，得到酶粗提物。 ( 2 ) p e p 合成酶( p p s a ) 酶活检测 参照文献 3 7 】，酶反应体系中含：丙酮酸钠i 5um o l l ，a t p1 0ur n o l l ， m g c l 21 0 um o l l ，t r i s h c l ( p h8 o ) 1 0 0 1 tm o l l ，酶粗提物2 0 0ul 。3 0 。c 保 温3 0 m i n 后加入1 0 - - 氯乙酸3 0 0 ul 终止反应，高速离心后取4 0 u l 上清液， 加3 6 0 t tl 水和0 1 2 , 4 一二硝基苯肼1 0 0ul ，2 5 保温5 m i n 后加入2 5m o l l n a o h5 0 01 2l ，用5 2 0n l n 波长测定光吸收。通过丙酮酸钠标准曲线算出丙酮酸 钠被消耗的量。 ( 3 ) p e p 羧化激酶( p c k a ) 酶活检测 参照文献 3 8 1 ，l m l 酶反应体系中包括p e p1 0 “m o l l ，n a h c 0 35 0 “m o l l ， a d p4um o l l ，m g c l z8 0um o l l ，t r i s h c l ( p h7 5 ) 1 0 0um o l l ，酶粗提物1 0 0 “l 。3 1 保温2 0 m i n 后加入0 7 5 m l 无水乙醇和2 0 “l 新制的2 0 m g m l f a s t v i o l e tbs a l t ，于2 5 保温1 0m i n ，然后加入lm o l lh c io 2 5m l ，测定5 2 0r i m 的光吸收。 ( 4 ) p d c m 酶活检测 曲分枝酸变位酶p d 酶活测定：将在3 t c 温育的酶粗提物0 2m l 和0 0 0 2 m o l l 分枝酸钡溶液( 以0 1m o l l 的p h7 8t r i s h c l 配制) 0 2 m l 混和，3 7 放 置2 0r a i n 后加入1 m o l lh c io 4 m l ，继续在3 7 放置1 0 m i n 后加入l m 0 1 l n a o h 3 2m l ，测定3 2 0 n m 的光吸收。 b ) 预苯酸脱水酶c m 酶活测定：将在3 7 温育的酶粗提物o 4 m l 和 o 0 0 5 m o l l 预苯酸溶液( 以0 0 2 5m o l lp h8 2 t r i s - h c l 配制) 0 6m l 混和，3 7 。c 放置3 0m i n 后加入1m o l ln a o h3 m l ，测定其在3 2 0 n m 处的光吸收。 ( 5 ) 转氨酶( a t ) 酶活检测 参照文献 3 9 】，底物溶液( 苯丙酮酸钠2 0m g m l ，l 一天冬氨酸5 0m g m l ， 十六烷基三甲基溴化铵0 0 8 3 ，5 - 磷酸吡哆醛o 1 6 7 m m o l l ，p h7 0 ) o 8 m l 和 酶粗提物0 2m l 混和，于3 0 。c 恒温反应6 0 r a i n 。反应结束后离心，取上清做纸 层析，按方法7 的步骤测定l 一苯丙氨酸浓度。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达第1 5 页共2 7 页 ( 6 ) d a h p 合成酶( d s ) 酶活检测 参照文献 3 9 1 ，酶反应体系中包括p h6 4t r i s h c il m l ，5 m o l l 赤藓糖4 一 磷酸1 0 0ul ，1 0m m o l l 磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 5 0ul ，0 1m o f l c o c l 2lul ， 酶粗提物2 0 0 ul 。3 7 保温3 0 r a i n 后加入1 0 0w l 三氯乙酸0 4m l 。离心后取 上清o 2 5m l 和o 0 2 5m o l l 高碘酸o 2 5m l 混和，室温放置4 5 r a i n 。再加入2 0 l 亚砷酸钠0 5m l ，室温放置2 m i n 后加入3g l 硫巴比妥酸2 m l ，沸水浴处理 5 m i n 后，测定5 4 9 n m 的光吸收。 ( 7 ) 总蛋白质质量的测定 参照文献 4 0 ，取1ul 酶粗提物加入l m l0 0 1 考马斯亮蓝g - 2 5 0 中，混 匀2m i n 后，测定5 9 5 n m 的光吸收。通过牛血清蛋白标准曲线换算成浓度。 7 ，短杆菌发酵产酸及苯丙氨酸浓度检测 采用摇瓶发酵，活化后的种子液以1 0 的接种量转接至2 0m l 发酵培养基 ( 含2 0 ug m l 卡那霉素和1 0 ug m l 萘丁酮酸) 中，3 1 2 5 0r p m 培养7 2 h r 。 取发酵液上清2 ul 点样于滤纸上，以标准浓度的苯丙氨酸作对照，置于层析液 ( 正丁醇：冰乙酸：水= 4 ：1 ：1 ) 中单向上行展层4 h r 。烘干后以喷涂茚三酮显 色，剪下着色斑点，置于6 0 的乙醇溶液中脱色2 h r ，测定5 7 0a m 的光吸收。 通过苯丙氨酸标准曲线换算成浓度。 8 ，生长曲线的测定 将带有穿梭质粒的b r e v i b a c t e r i u m 伽v “聊单菌落接种在含2 0ug m l 卡那霉 素和l o ug m l 萘丁酮酸的生长培养液中，以3 1 2 5 0r p m 振荡培养4 8 h r ，再 按1 0 接种量转接摇瓶培养。每隔2 h r 取样测定6 0 0 n m 的光吸收。 9 ，d n a 测序 委托上海博亚生物技术有限公司进行。 复旦丈学撰写科学报告和学位论文专用纸 苯丙氨酸生物合成的5 个关键酶基因的串联表达 第1 6 页共2 7 页 结果 1 ，p p s a 和p c k a 基因的p c r 扩增以及相关重组质粒的构建 按方法i 和2 ，进行p c r 扩增p p s a 、p c k a 基因，扩增得到的片断进行了限 制性内切酶酶切鉴定和序列测定，确认为p p s a ( 2 3 7 6b p ) 、p c k a ( 1 3 9 2b p ) 基因； 对构建的相关质粒进行限制性内切酶酶切鉴定和p c r 鉴定，证明了所构建质粒 的正确性。 p p s a 基因d n a 测序结果与文献【4 报道的基因序列相比较显示，第1 4 8 位 的碱基由g 变为a ，密码子由g c c 变为a c c ，相应的氨基酸由a l a 变为t