（微生物学专业论文）紫球藻藻红蛋白β亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达.pdf

摘要 摘要 藻红蛋白潜在的生物活性引起了广泛的重视，如体外的抗氧化活性以及作为光敏剂用 于光治疗。藻类养殖及藻红蛋白纯化的高成本已成为藻红蛋白在医药和工业领域广泛应用 的重要制约因素。本论文从紫球藻( p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ) 基因组d n a 不同提取方法筛 选，藻红蛋白p 亚基基因的克隆，该亚基基因在巴斯德毕赤酵母中进行胞内和分泌表达等 方面开展研究。主要实验结果如下： 采用酚仿法、蛋白酶k 法、盐析法、c t a b 法和改良s d s 法五种方法分别对紫球藻基 因组d n a 提取，结果显示提取的基因组d n a 大小均约2 3k b ，五种方法所提的d n a 纯度 及产率有差别，蛋白酶k 法提取的d n a 得率最大，达3 3 l l x g t t l ，c t a b 方法次之，但 蛋白酶k 法提取的d n a 含有一些蛋白及r n a 等杂质，改良c t a b 法提取的d n a 样品 完整性相对较好，a 2 6 0 a 2 3 0 和a 2 6 0 a 2 8 0 分别为2 0 9 和1 8 5 。综合d n a 提取纯度、得率、 p c r 扩增和酶切效果，c t a b 法是五种方法中最适合紫球藻基因组d n a 提取的方法。 分别提取紫球藻( p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ) 基因组d n a 和总r n a ，根据藻红蛋白保守 序列设计简并引物，采用p c r 、r t p c r 获得紫球藻藻红蛋白d 亚基、间隔序列及c c 亚基 编码区近5 端c d n a 和基因组d n a 序列。e d n a 序列长9 8 7 个碱基，包括b 亚基起始密 码子上游的1 0 个碱基，p 亚基编码区的5 3 4 个碱基( 编码1 7 7 个氨基酸) ，1 0 5 个碱基的间 隔区以及a 亚基编码区近5 端的3 3 8 个碱基( 编码1 6 4 个氨基酸) 。c d n a 序列排布顺序为 5 u t r - r p e b - 间隔区- r p e a ：对其基因组结构分析表明，藻红蛋白( p h y e o e r y t h r i n ，p e ) 亚基基 因编码区无内含子序列。 获得紫球藻藻红蛋白b 亚基e d n a 片段，插入至巴斯德毕赤酵母表达系统胞内表达载 体p p i c 3 5 k 及分泌表达载体p p i c 9 k 中，电转化整合至感受态毕赤酵母g s l15 中，用m d 和m m 培养基，筛选重组子，g 4 1 8 筛选出高拷贝整合菌株，甲醇诱导培养9 6 小时后， s d s p a g e 分析表明，p p i c 3 5 k - p e p g s l l 5 重组酵母在胞内表达了分子量大小约1 9 k d 的重组蛋白，与紫球藻藻红蛋白p 亚基分子量大小一致。 关键词紫球藻，藻红蛋白1 3 亚基，基因克隆，基因表达 中文文摘 中文文摘 紫球藻( p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ) 是一种红藻门单细胞藻。在生长过程中，能合成大量 的藻红蛋白和胞外多糖等有效活性物质。随着藻红蛋白( ( p h y e o e r y t h r i n ，p e ) 在医药和工 业领域的需求增大，高额的海藻养殖成本以及藻红蛋白纯化费用已成为藻红蛋白广泛应用 的一个重要制约因素。加强藻红蛋白基因结构、基因功能的研究，对阐明光合作用分子机 制、质体起源与进化等重大的理论以及与提高光合效率进而提高作物产量等实际问题都具 有重要的理论和实践意义。另外利用发酵生产藻红蛋白，提供食用和饲料蛋白，及利用藻 胆蛋白基因对大型经济海藻蛋白质性状进行基因工程改良，都需要藻胆蛋白基因结构和功 能研究的进展和突破。 紫球藻细胞富含多糖和藻红蛋白等次生代谢产物，因而紫球藻基因组d n a 提取的关键 步骤之一就是这些物质与基因组d n a 的分离，使其d n a 释放到抽提缓冲液中，此外还 要考虑次级代谢产物及其相关酶类等杂质的影响。本研究根据所选材料的特点，选取广泛 应用于植物及真菌d n a 提取的五种方法进行比较。结果显示提取的基因组d n a 大小均约 2 3k b ，五种方法所提的d n a 纯度及产率有差别，蛋白酶k 法提取的d n a 褥率最大达 3 3 l l a g i - t l ，c t a b 方法次之，但蛋白酶k 法提取的d n a 含有一些蛋白及r n a 等杂质， 改良c t a b 法提取的d n a 样品完整性相对较好，a 2 6 0 a 2 3 0 和a 2 6 0 a 2 8 0 分别为2 0 9 和1 8 5 。 综合d n a 提取纯度、得率、p c r 扩增和酶切效果，c t a b 法是五种方法中最适合紫球藻 基因组d n a 提取的方法。 近十几年来，藻红蛋白分子生物学的研究进展较快，到目前为止，已对十几种藻的藻 红蛋白基因进行了克隆和序列分析，其中主要是来自红藻和蓝藻。本研究是通过从n c b i 基因库中查阅到有关红藻门藻红蛋白基因序列，用c l u s t a l x l 8 3 软件对所查找的序列进行 比对，得到紫球藻藻红蛋白p 亚基基因两侧保守序列。利用生物软件p r i m e rp r e m i e r5 0 和 o l i g o6 0 对该序列设计引物，再经过p c r 、r t - p c r 等技术，首次完成了紫球藻藻红蛋白 b 亚基、间隔序列及q 亚基编码区近5 端c d n a 序列和基因组d n a 序列的克隆及序列测 定。其中1 3 亚基e d n a 全长由5 3 4 个碱基组成；c d n a 序列排布顺序为5 u t r - r p e b 间隔 区r p e a ；对紫球藻藻红蛋白p 亚基基因组结构分析表明，其基因编码区无内含子序列，由 紫球藻藻红蛋白p 亚基c d n a 序列推导出的氨基酸序列共由1 7 7 个氨基酸组成。含有红藻 藻红蛋白 b亚基与色基结合部位极为保守氨基酸序列 ( n a s c w g m i c e n m a a c l r g d c s ) ，半胱氨酸( c ) 是其色基的结合位点，推测该e d n a 序列即为紫球藻藻红蛋白p 亚基基因。 中文文摘 利用e x p a s y 的p r o t p a r a m 在线软件进行该亚基理化表征分析得到，该蛋白含1 7 7 个氨 基酸，2 5 9 1 个原子，分子量为1 8 5 2 2 1 ，等电点为5 4 3 ，分子式为c 7 9 9 h 1 2 9 9 n 2 2 5 0 2 5 7 s l l 。采 用b i o e d i t o r 软件，根据k y t e d o o l i t t l e 算法对紫球藻藻红蛋白p 亚基氨基酸序列进行疏水 性分析发现其氨基酸全长由3 个明显疏水区。利用e x p a s y 的在线软件s o p m a 预测该亚基 的二级结构可知该亚基的二级结构含有6 8 9 3 a 螺旋和2 0 9 无规则卷曲结构。 将克隆到p m d l 9 t s i m p l e 载体上的紫球藻藻红蛋白p 亚基基因片段，用限制性内切酶 e c o ri 、b a m hi 双酶切后回收酶切产物，把回收的该片段插入至同样用e c o ri 、b a m hi 双酶切的毕赤酵母胞内表达载体p p i c 3 。5 k 中，成功构建重组质粒p p i c 3 5 k - p e p 。用限制 性内切酶e c o ri 、n o ti 双酶切隆在p m d l 9 ts i m p l e 载体上的紫球藻藻红蛋白p 亚基基因 片段后回收酶切产物，把回收片段插入至同样用e c o ri 、n o ti 双酶切的毕赤酵母分泌表 达载体p p i c 9 k 中，成功构建分泌型重组质粒p p i c 9 k - p e l 3 。两重组质粒分别转至感受态大 肠杆菌中进行克隆。通过蓝白斑筛选阳性克隆子，菌落p c r 验证后，提取重组质粒。用 s a li 酶切，使所提取的p p i c 3 5 k - p e p 及p p i c 9 k - p e l 3 重组质粒线性化，通过电转化方法 将该重组质粒转化至毕赤酵母g s1 1 5 中，用m d 培养基，筛选重组子，g 4 1 8 筛选出高拷 贝整合菌株，甲醇诱导培养9 6 小时后，s d s p a g e 分析表明，p p i c 3 5 k f e d g s l l 5 重组 酵母在胞内表达了分子量大小约1 9 k d 的重组蛋白，与紫球藻藻红蛋白p 亚基分子量大小 一致。而阴性对照则无该蛋白表达，说明紫球藻藻红蛋白p 亚基基因在毕赤酵母g s l l 5 中 得到了正确表达和修饰。 v a b s t r a c t a b s t r a c t p o t e n t i a lb i o l o g i c a la c t i v i t i e so fp h y c o e r y t h r i ns u c ha sa n t i o x i d a n ta c t i v i t yi nv i t r oa n da s p h o t o s e n s i t i s e rf o rp h o t o d y n a m i ct h e r a p y ( p d t ) h a dg a i n e dw i d e l yc o n c e r n i n g t h e c o s to f m a s s p r o d u c t i o no fa l g aa n dp u r i f i c a t i o no fp h y c o e r y t h r i nw i l ls e r i o u s l yc o n s t r a i nt h ew i d er a n g e d e m a n d so fb - p h y c o e r y t h r i na p p l i c a t i o n si nb i o m e d i c a la n df o o di n d u s t r i e s i nt h i sp a p e r , w e i n v e s t i g a t e dd i f f e r e n tw a y sf o rd n ae x t r a c t i o n ，c l o n e do fp e1 3 s u b u n i tg e n ea n dt h e ne x p r e s s e d i np i c h i ap a s t o r i s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) d n aw a se x t r a c t e df r o mp o r p h y r i d i u mc r u e n t u mb yp h e n o l c h l o r o f o r mm e t h o d ， c t a b ( c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ) m e t h o d ，p r o t e i n a s ekm e t h o d ，i m p r o v e ds d s m e t h o da n ds a l t i n go u tm e t h o dr e s p e c t i v e l y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ea r es o m ed i f f e r e n c e si n p u r i t ya n dy i e l da m o n g t h o s ef i v em e t h o d s t h es i z eo f p o r p h y r i d i u mc r u e n t u mg e n o m i cd n ai s a b o u t2 3 k b j p r o t e i n a s ekm e t h o dh a v eb e r e ty i e l du pt o3 3lp g p l ，w h i l ec t a bf o l l o w s b u t d n ae x t r a c t e db yp r o t e i n a s ekm e t h o dc o n t a i n sp r o t e i na n ds u c hi m p u r i t i e sa sr n a t h ep u r i t y o ft h ed n a b yc t a bm e t h o di sb e t t e rt h a nt h a to fo t h e r s a 2 6 0 a 2 3 0a n da 2 6 0 a 2 s oo fd n ab y c t a bm e t h o dw e r e2 0 9a n d1 8 5 ，a sf a ra st h ep u r i s t 、y i e l d 、e f f i c i e n to f p c ra m p l i f i c a t i o na n d r e s t r i c t i o nd i g e s tc o n c e r n e d ，c t a bm e t h o di sm o s ts u i t a b l ef o re x t r a c t i n gg e n o m i cd n af r o m p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ( 2 ) t h eg e n o m i cd n aa n dt o t a lr n ao fp o r p h y r i d i u mc r u e n t u mw e r ee x t r a c t e d r e s p e c t i v e l y d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nt h ec o n s e r v e dp eg e n es e q u e n c e s t h e d n aa n de d n ao f1 3 s u b u n i t 、5 t e r m i n a lo fa s u b u n i ta n di n t e r g e n i cs e q u e n c eo fp ew a s a m p l i f i e du s i n gt h et e c h n i q u e so fp c r a n dr t - p c r t h i ss e q u e n c ec o n t a i n9 8 7 b p ，c o n s i s t i n go f 10n u c l e o t i d e st h a tl o c a t ei nt h eu p s t r e a mo ft h ei n i t i a t i o nc o d o no f1 3 s u b u n i t ，5 3 4n u c l e o t i d e s c o d i n gf o rps u b u n i t ( c o d i n g1 7 7a m i n oa c i d s ) ，1 0 5n u c l e o t i d e sf o ri n t e r g e n i cr e g i o na n d3 3 8 n u c l e o t i d e st h a td r a wn e a rt h e 5 t e r m i n a lo fas u b u n i t ( c o d i n g11 2a m i n oa c i d s ) t h es t r u c t u r eo f t h i se d n ai s5 u t r - r p e b - i n t e r g e n i cs e q u e n c e - r p e a ；t h ea n a l y s i so fg e n o m i cs e q u e n c es h o w e d t h a tp o r p h y r i d i u mc r u e n t u mg e n eo fp s u b u n i to fp eh a sn oi n t r o n s ( 3 ) g e n eo f1 3 s u b u n i to fp ew e r ei n s e r t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 3 5 ka n d p p i c 9 k , t op r o d u c e ar e c o m b i n a n tp l a s m i d ，w h i c hw e r en a m e dp p i c 3 5 k - p e j 3a n dp p i c 9 k p e 3 r e s p e c t i v e l y a f t e rl i n e a r l yc l e a v a g e ，t h ep p i c 3 5 k - p e j 3a n dp p i c 9 k - p e j 3p l a s m i dw e r eu s e dt o t r a n s f o r mg s115y e a s tb yl i g h t n i n gs t r o k e , t h e nu s e dm da n dm mm e d i u m st os c r e e nt h e r e c o m b i n a n t s ，f u r t h e ri d e n t i f i c a t i o nw a sd o n eb yc l o n ep c r , a p p l i e dg 4 18a n t i b i o t i ct oc o p y n u m b e rs c r e e n i n g ，a f t e rp p i c 3 5 k - p e 0 一g s1 1 5a n dp p i c 9 k - p e b g s1 1 5y e a s t sw e r ei n d u c e d t t a b s t r a c t b ym e t h a n o lf o r9 6h ，s d s p a g ea s s a y sh a v ep r o v e dt h er e c o m b i n a n ty e a s tp p i c 3 5 i ( - p e 3 一g s 1 15h a v eb e e ni n d u c e dt o e x p r e s s t h ep r o t e i n ，w h o s em o l e c u l a r w e i g h tw a sc l o s et o 19 k d a , w h i c hi si na c c o r d a n c ew i t hm o l e c u l a rw e i g h to f 3 s u b u n i to fp h y c o e r y t h r i n k e y w o r d s e x p r e s s i o n p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ，ps u b u n i to fp h y c o e r y t h r i n ，g e n ec l o n i n g , g e n e i i i 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)星坚b学号兰：丝! z 墨竺专业 热! 叁! 拖豆 所呈交的论文( 论文题目：紫球藻 藻红蛋白d 亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达) 是我个人在导师指导 下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。本人了 解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交的 学位论文并允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容； 学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名鍪兰i 签名日期兰翌：墨 指导教师签名望够 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题背景 紫球藻( p o r p h y r i d i u m ) 是一种单细胞藻类，属于红藻门( r h o d o p h y t a ) ，红藻纲 ( r h o d o p h y c e a e ) ，红毛菜亚纲( b a n g i o p h y c i d a e ) ，紫球藻目( p o r p h y r i d i a l e s ) ，紫球藻 科( p o r p h y r i d i a c e a e ) ，紫球藻属( p o r p h y r i d i u ms p p ) ，它的生长周期短，实验室培养方 法成熟，广泛分布于海水、淡水、咸水及潮湿的土地中。其细胞呈球形，胞外包围着一 层粘质鞘，粘质鞘的相互粘连而使多个细胞不规则地聚生成一团，粘质鞘是细胞通过高尔 基复合体合成并分泌到细胞外的水溶性紫球藻多糖。许多研究表明紫球藻细胞膜外部缺少 支承性的纤维成份，认为它无细胞壁。藻胆体附着于叶绿体的类囊体膜表面，细胞中存在 线粒体、内质网和高尔基体等细胞器【1 , 2 】。紫球藻细胞内有一个大而呈星状的色素体，内含 丰富的藻红蛋白和藻蓝蛋白，其中以b p e 含量最多。藻胆蛋白含量可达到细胞总蛋白的 5 0 ，是b p e 的一个重要来源，具有很高的经济开发价值【3 1 。通过多年的研究，人们总结 了紫球藻中三种藻胆蛋白的亚单位和色基组成以及光谱性质如表1 1 ： 表1 1 紫球藻藻胆蛋白组成和基本性质 t a b l e1 - 1c o m p o s i t i o na n db a s i cc h a r a c t e ro f p h y c o b i l i s o m e so f p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m 分子量色基种类和数目 hh 藻胆蛋白蛋白质组成 堕璺堡巨 塑旦婴婴 b p e ( a p ) “ 2 4 02 p e b4 p e b 2 p e b ，2 p u b 4 05 4 55 7 5 b - p e ( 口d ) 。 1 1 0 ，5 52 p e b4 p e b 一 3 65 4 55 7 0 r p c( n b ) 31 0 31 p c b1 p c b ，1 p e b 95 5 5 ，6 1 76 3 6 藻胆蛋白作为捕光色素蛋白存在于红藻( r h o d o p h y t a ) 、蓝藻( c y a n o p h y t a ) 、隐藻 ( c r y p t o p h y t a ) 署f l 少数甲藻( p y r r o p h y c e a e ) r 扣，包括藻蓝蛋i 刍( p h y c o c y a n i n ，p c ，l r n a x = 6 1 0 6 2 0 n m ) 、别藻蓝蛋 刍( a l l o p h y c o c y a n i n ，a p c ，k m a x = 6 5 0 6 5 51 1 1 t i ) 、藻红蛋i 刍( p h y c o e r y t h r i n ， p e ，九r n a x = 5 4 0 5 7 0n m ) 和藻红蓝蛋( p h y c o c r y t h r o c y a n i n ，p e c ，l r n a x = 5 7 0 n m ) 4 种【4 捌。藻 胆蛋白是一类水溶性蛋白，常作为储藏蛋白，使藻类在氮源缺乏的季节得以生存【6 1 。 1 9 2 8 年l e m b e r g 首次证明藻胆蛋白是由脱辅基蛋白和四吡咯结构的色基所组成。藻胆 蛋白的提取材料多取之于红藻与蓝藻，藻种的不同所含藻胆蛋白的种类和含量也不同。藻 胆蛋白是一类寡聚体蛋白，基本构建单位是a 和p 亚基，少数藻胆蛋白还含有丫亚基。藻 胆蛋白有多种生物活性，在医学领域中有着广泛的用途，研究发现藻胆蛋白不仅可作为荧 光探针用于免疫检测，作为光敏剂用于光动力治疗癌症等方面，还具有提高机体免疫力、 促进细胞增殖，防治肿瘤等多种生理活性【7 ，引。p i n e r oe s t r a d a 等研究证实藻胆蛋白具有抗 稿矬帅范人学吴义诚硕士学位论文 氧化活性，在体内和体外都呵以防止脂质体过氧化的作用【9 】。 藻红蛋白( p e ) ，藻蓝蛋白( p c ) ，异藻蓝蛋白( a p c ) 在藻体类囊体膜上顺序排列，与 连接蛋白构成藻胆体，光能在藻胆体中按一定的顺序传递：p e ( 或p e c ) _ p c _ a p c 叶p s i i 1 1 0 。藻胆蛋白亚基结合的胆色素发色基团在较宽的光谱范围内有较高的吸收系数：藻红蛋 白的光吸收区位于蓝绿光区，弥补了藻类叶绿素a 在海中光能吸收不足，使海藻更能适应 生存环境。藻红蛋白是前级捕光色素，位于光能传递链的第一环，对藻红蛋白的研究深入 有助于阐明藻类光合作用的机制，近年来研究发现藻红蛋白在医药和食品领域有着广泛的 应用前景，因而备受人们的关注，也取得了一些重要的成果。以下就藻红蛋白的研究概况 和应用前景做一综述。 1 2 藻红蛋白的研究背景与现状 1 2 1 藻红蛋白的分类 最初依据藻红蛋白的来源不同，藻红蛋白( p e ) 主要分为红毛菜纲( b a n g i p h y c e a e ) 来 源的藻红蛋白b p e 、红藻纲( r h o d o p h y c e a e ) 来源的藻红蛋白r p e 及来自蓝藻纲 ( c y a n o p h y c e a e ) 的藻红蛋白c - p e 三种。随着研究的深入，发现在不同类型的藻中发现光谱 特性一致的藻红蛋白，如在红藻中也存在着c p e ，故现在这些名称已不再有分类学上的 意义，仅表示其不同的特征吸收光谱【l 。 p e 中以r - p e 最具代表性。根据藻红蛋白光谱特性的不同，r 藻红蛋白可分为为“三 峰i 型”、“三峰i i 型”和“两峰一肩吸收型”。“两峰一肩吸收型r 藻红蛋白其特征是在可 见光谱区的4 9 8 和5 6 5 n m 有吸收峰、在5 4 0 n m 有吸收肩，“三峰吸收型”其特征是在4 9 8 、 5 4 0 、5 6 5 n m 分别产生三个吸收峰。三峰i 型r - p e ( 有三个完全的吸收峰，分别位于4 9 8n l t l 、 5 3 5l l m 和5 6 5n l l l ，而且4 9 8n l - n 的吸收峰低于5 3 5 砌和5 6 5 姗的吸收峰) 和三峰i i 型r - p e ( 与i 型r - p e 类似，也有三个完全的吸收峰，但4 9 8n l n 的吸收峰高于其它两 个吸收峰) 【1 2 】。通常把两峰一肩吸收型”称为i 型r - 藻红蛋白，把“三峰型，称为i i 型r 藻 红蛋白。 1 2 2 藻红蛋白结构 r - p e 是大分子量、多亚基蛋白色素复合物。据报道分子量从2 2 0 k d a 至3 0 0k d a 不等， 因种属来源而异【l3 1 。r - p e 由脱辅基寡聚蛋白与开链的四毗咯发色团共价结合而成，组成 寡聚蛋白的亚基有a 、p 、丫等。几种亚基在藻体中的数目是不同的，即p e 以不同的聚集 状态存在于不同藻类中【1 4 】，有( 0 【p ) 6 丫、( a p ) 3 丫等形式，而且外界环境条件的变化，尤其 是光质的变化能改变这一聚集形式 1 5 】。一般来说，藻红蛋白的a 亚基与1 3 亚基先形成稳定 的单体( a i d ，再由单体聚合为多聚体( a 1 3 ) n 。红藻中的r - p e 通常以( c t l 3 ) 6 形式存在，极少种 类的r - p e 由多个不同亚基组成【1 6 】， g r a c i l a r i a ll o n g a 的r p e 由0 【、1 3 、丫、y 四种亚基组 2 第l 章绪论 成【1 7 】。不同的红藻藻红蛋白其丫亚基的数量有所差异，c a l l i t h a m n i o nb y s s o i d e s ，cr o s e u m ， a u d o u i n e l l as a v i a n a ，g c o u l t e r i ，及a n e g l e c t u m 含有两个t 亚基，但p o r p h y r i d i u m p u r p u r e u m 含有三个丫亚基，r h o d e l l av i o l a c e a e 只含有一个丫亚基【1 8 ，1 9 】。 研究人员先后在藻胆蛋白中发现四种同分异构体色基，分别是藻尿胆素 ( p h y c o u r o b i l i n ，p u b ) ，藻蓝胆素( p h y c o c y a n o b i l i n ，p c b ) ，藻紫胆素( p h y c o b i l i v i o l i n ，p x b ) 和藻红胆素( p h y c o e r y t h r o b i l i n ，p e b ) ，它们的差异仅仅表现在双键位置的不同【2 0 1 。藻红蛋 白亚基的半胱氨酸残基通过二硫键与色素分子结合，结合在藻红蛋白亚基上的色素分子有 吸收带在5 3 0 5 7 0n i l l 的藻红胆素( p h y c o e r y t h r o b i l i n , p e b ) 和吸收带在4 9 0 5 0 0n t 1 1 的藻尿 胆素( p h y c o u r o b i l i n , p u b ) 及在奥杜藻( a u d o u i n e l l a ) 等极少红藻中出现的藻蓝胆素 ( p h y c o c y a n o b i l i n ，p c b ) 2 1 1 。 1 2 3 藻红蛋白的脱辅基蛋白基因结构 藻红蛋白的分子生物学研究主要集中于原核蓝绿藻c y a n o b a c t e r i a l 藻红蛋白亚基操纵 子的基因结构与功能的探索。针对真核红藻r p e 的分子生物学研究主要集中在0 【、b 亚基 作为藻类光合进化标记，比较不同藻种的a 、b 亚基的基因序列、氨基酸序列从而探讨它 们的亲源关系及伍、p 亚基操纵子转录水平的调节等【2 2 1 。 p e 的组装和表达是一个核质基因协同作用的过程，其中a 、p 亚基由质体基因组编码， 常形成从d 到0 【排列的1 个操纵子 2 3 】。a 、p 亚基分子量接近，a 亚基基因全长约为4 9 0 b p ， 编码约1 6 0 个氨基酸，其分子量为1 6 2 0 k d 2 4 , 2 5 ，2 6 1 。p 亚基基因全长约为5 4 0 b p ，编码约 1 8 0 个氨基酸，其分子量为1 7 2 2k d 。丫亚基基因在核基因组上，基因全长约9 4 0 b p ，编码 约3 1 0 个氨基酸，其分子量约为3 2 k d z 7 1 。对于真核红藻藻红蛋白a 、p 亚基基因序列，现 在已有较多的报道，而对丫亚基基因序列研究，仅见于角甲藻( a g l u o t h u m n i o nn e g l e c t u m ) 及珊瑚藻( c o r a l l i n ao f f i c i n a i i s ) 等藻类。 隐藻( c r y p t o m o n a s )中p e 的眠b 亚基是分别转录的【2 引，而红藻p e 的基因的排布 顺序通常为d 亚基间隔区q 亚基构成一个操纵子【2 2 1 ，如图1 1 。已报道的红藻藻红蛋白基 因除r h o d e l l ar e t i c u l a t a ( r r , a f l l 4 8 2 3 ) 、r h o d e l l av i o l a c e a ( r v ，l 0 2 1 8 8 ) 其p 、a 亚基含有 不同数量和长度的内含子形成编码区不连续的排布方式外，其他红藻的藻红蛋白在基因排 布顺序和编码碱基数目上基本一致，但在间隔区长度上差异较大。如角甲藻( a g l u o t h u m n i o n n e g l e c t u m ) 的藻红蛋白亚基间的间隔区长度为1 0 8 个碱基，不但间隔区长度长，而且间隔 区的碱基组成差异大。珊瑚藻( c o r a l l i n ao f f i c i n a l i s ) 的间隔区有1 0 1 个碱基，亲缘关系较 近的甘紫菜( p o r p h y r at e n e r a ) 、坛紫菜( p o r p h y r ah a i t a n e n s i s ) 、紫红紫菜( p o r p h y r a p u r p u r e a ) 和条斑紫菜( p o r p h y r ay e z o e n s i s ) 的藻红蛋白亚基基因的间隔序列变异不大， 长度均为7 4 个碱基的间隔区，而龙须菜( g r a c i l a r i al e m a n e i f o r m i s ) 和高氏红藻( g r i f f i t h s i a 福建师范大学吴义诚硕士学位论文 m d 以i 凰) 藻红蛋白亚基间的间隔序列长度分别只有5 4 和5 1 个碱基，间隔序列的变异并不影 响功能基因的正常表达。 fy - u p s t r e a m 卜b e t a 矗u b u n i t s p a e e r a l f as u b u n i t 图1 1红溧漂红蛋臼操纵子结构 f i g u r e1 1 s t r u c t u r eo f p h y c o e r y t h r i no p e r o no f r h o d o p h y t a 1 - 2 4 藻红蛋白脱辅基蛋白基因序列特征 r - 藻红蛋白基因序列在真核红藻中的保守性较高，而在真核红藻与原核蓝藻之间有较 大的差异，与其他已知的1 0 种红藻藻红蛋白d n a 序列相比，坛紫菜藻红蛋白d n a 序列( 包 括c c 、p 亚基及二者之间的间隔序列) 与它们的同源性在7 4 1 9 5 4 之间，其中与紫红紫 菜、条斑紫菜的同源性分别高达9 5 1 和9 2 2 。而与蓝藻单歧藻藻红蛋白的d n a 序列 同源性为6 2 2 。坛紫菜0 【亚基与这1 0 种红藻的0 【亚基核苷酸和氨基酸同源性分别为 7 7 6 9 5 8 和8 0 4 一9 9 4 ，与蓝藻单歧藻q 亚基的d n a 序列同源性为6 8 9 ；坛紫菜 藻红蛋白b 亚基与这1 0 种红藻的b 亚基氨基酸和核苷酸同源性分别为：8 3 6 1 0 0 和 7 8 5 9 5 5 ，与蓝藻门单歧藻的1 3 亚基的d n a 序列同源性为6 5 4 。变异大的部位主要 是两个亚基基因间的间隔序列，比较的1 2 个d n a 序列间隔序列的同源性为2 7 o 9 8 6 【2 9 1 。鉴于p e 亚基基因序列的保守性，其序列比对的研究有助于说明含藻胆体生物的亲源 关系，从而为光合进化提供研究资料。 红藻藻红蛋白队1 3 亚基的氨基酸序列的同源性比d n a 序列的同源性更高，坛紫菜d 亚基比a 亚基的氨基酸序列同源性更高，相对更保守，另有报道在螺旋藻( s p i r u l i n a ) t 3 0 】和 龙须菜( g r a c i l a r i al e m a n e i f o r m i ) 3 t 】中l 也存在这种情况。但珊瑚藻( c o r a l l i n ao f f i c i n a l i s ) a 亚基核苷酸和氨基酸序列同源性均高于1 3 亚基1 3 2 1 。在所有已知的藻胆蛋白中三类位点的 氨基酸具有较高的保守性：第一类是负责光能吸收和传递；第二类负责o r , 、1 3 亚基间相互作 用及亚基自身的三级结构，以形成聚合物；第三类只在位、1 3 亚基中保守，负责在藻胆蛋 白聚合体聚合时起稳定作用，或是与连接蛋白作用以维持藻红蛋白稳定的光谱特性【3 3 】。 a p t 【3 4 】发现角甲藻( a g l u o t h u m n i o nn e g l e c t u m ) 的仅、1 3 亚基c 末端的变异较大，红藻在第 三位密码子有大于8 0 的a 或t 的偏倚性【3 5 1 ，这一偏倚性也体现在其它已知藻红蛋白基 因序列，与高等植物及其他藻类质体基因的情况相似；红藻藻红蛋白基因序列g c 含量偏 低，珊瑚藻a 、1 3 亚基基因序列g + c 含量分别为3 6 9 1 和3 6 4 8 ，条斑紫菜( p o 翟h y r a y e z o e n s i s ) a 、b 亚基基因序列g + c 含量分别为3 9 8 5 和3 8 8 7 。 丫亚基基因的研究目前报道不多，王盛【3 2 】等采用r a c e 方法扩增获得了珊瑚藻 ( c o r a l l i n ao f f i c i n a l i s ) 丫亚基c d n a 序列，全长2 3 0 8 b p ，编码区9 6 0 b p 共编码3 2 0 个氨基 酸，珊瑚藻丫亚基d n aa n dc d n a 序列的比较发现其编码区没有内含子，对丫亚基的同一 4 第1 章绪论 克隆子的不同菌落进行酶切存在不同的条带，将这些克隆子测序发现，他们的序列有所区 别，存在不同的e d n a 末端，这些现象表明丫亚基基因可能有几个拷贝或是经历了不同的 翻译后的修饰。 a p t 【3 6 】采用羟基磷灰石结合离子交换高效液相色谱分离纯化角甲藻( a g l u o t h u m n i o n n e g l e c t u m ) 藻红蛋白，分离到两个分子量分别为3 1 k d 和3 3k d 的y 亚基，命名为丫3 3 和丫3 1 ， 吸收光谱分析结果表明矿3 结合了3p u b 和1 个p e b ，丫3 1 结合2 个p u b 和2 个p e b 。探 针杂交筛选角甲藻( a g l u o t h u m n i o nn e g l e c t u m ) e d n a 文库，获得了一条包含编码7 3 3 开放 阅读框在内的1 3 0 0 b p 片段，y 3 3 开放阅读框全长9 5 4 b p ，编码3 1 7 个氨基酸，其开放阅读 框的第三位密码子存在明显的偏倚性，g c 含量丰富。人们推测藻红蛋白的y 亚基与藻蓝 蛋白的连接多肽具有相似的功能，但在g e n e b a n k 没有搜索到其同源的氨基酸序列。矿3 的 第1 4 3 至1 5 6 位氮基酸序列与藻胆蛋白链接蛋白结构域i 的保守区具有一定的同源性，而 且y 3 3 这一区域包含氨基酸序列在所有连接蛋白保守区存在。丫3 3 在成熟肽前存在一条包含 4 0 个氨基酸前导序列，这段前导序列与t o m a t or u b i s c o 小亚基的转移肽存在相当高的同源 性。前导肽与高等植物的叶绿体的转运肽相似，富含丝氨酸，表明这二者在将蛋白导入质 体时或许使用的是具有相同功能的信号肽。 1 2 5 藻胆蛋白基因工程研究进展 目前，藻胆蛋白的获得主要通过从藻类中提取的途径，藻种选育、培养和采收的高成 本，而导致天然藻胆蛋白市场价格极高。1 9 8 5 年b r y a n t 了7 】等将灰色藻( c y a n o p h o r a p a r a d o x a ) 的别藻蓝蛋白基因和聚球藻s y n e c h o c o c c u sp c c7 0 0 2 的藻蓝蛋白基因在大肠杆 菌中成功表达。大规模生产重组藻胆蛋白的研究主要朝三个方向发展：大规模生产重组 脱辅基藻胆蛋白，保证藻胆蛋白用于药物以及食品生产的来源及质量。在体外和体内研 究藻胆素与重组脱辅基结合，生产有光学活性的藻胆蛋白。高效表达系统的建立以及藻 胆蛋白合成调控的研究。 c a i 等【3 8 】以蓝藻a n a b a e n a s p p c c 7 1 2 0 为宿主，将其藻蓝蛋白a 及p 亚基基因分别克 隆到相应蓝藻载体成功表达了带有组氨酸等标签( t a g ) 的重组藻蓝蛋白亚基，表达的重组亚 基，与其自身相应亚基聚合，形成的重组寡聚藻蓝蛋白具有天然藻蓝蛋白荧光特性，并组 装成该藻的捕光复合物藻胆体。运用该方法可以在蓝藻细胞内产生稳定的带有亲和纯化标 签的寡聚藻胆蛋白，不用化学处理便可用于荧光标记。秦松等【3 9 】利用大肠杆菌表达系统， 成功表达了重组别藻蓝蛋白，命名为镭普克( r a p c ) ，赵方庆等【4 0 】研究了培养基组成、培 养条件以及诱导条件等对该工程菌r a p c 表达量的影响，确立了最优的高密度发酵条件， 采用5 l 自动发酵罐用d o s t a t 补料流加方式发酵1 6 h 后，菌体密度o d 6 0 0 可达1 0 6 ，每 升发酵液中r a p c 含量可达3 5 2 9 ，纯化的r a p c 对小鼠$ 18 0 抑瘤率达4 5 6 4 ，林凡等 福建师范大学吴义诚硕士学位论文 1 4 1 1 实现y ：l 糖诱导重组别藻蓝蛋白表达工程菌的5 l 全自动发酵罐培养。任育红等【4 2 1 将别 藻蓝蛋白基因在毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 中成功表达，重组子经摇瓶培养4 8 h 表达量达 4 4 m l ，远低于e c o l i 的表达量。杨听林【