（微生物学专业论文）山东链霉菌诱变育种及发酵条件优化的研究.pdf

原刨性声明 本人郑重声明；所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体。均已在文中以明确方式标明本声明的法律责任由本人 承担 论文作者签名，：裂：茎日期： 诹。s 弋譬 关于学位论文使用授权的声明 ，f_ “ 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：叠，虹导师签名：衄日期：堕墨罗 山东大学硕士学位论文 摘要 本实验室通过对一株产生抗真菌活性物质的链霉菌2 4 # 抗菌谱的测定，发 现其对3 0 余种植物病原真菌有显著拮抗作用，其次生代谢产物对病菌菌丝有 断裂、溶壁、缢缩等致畸效应根据1 6 sr d n a 序列分析和菌株形态特征、培 养特征、细胞壁化学组分及生理生化特性等实验结果，将该菌株定名为：山东 链霉菌( s 抛p t o m y c e st h e r m o c a r b o n x y d u sv a ts h a n d a e n s i s ) 为了选育山东链霉菌高产抗真菌活性物质的菌株，利用各种理化诱变因子 改变原种自身遗传物质通过紫外线加氯化锂( u v + l i c l ) 复合诱交得到高 产菌株u v - - 1 8 、u v 1 9 ，u v - - 2 0 ，其中菌株u v - - 1 9 的发酵上清液抑菌圈 直径是原种的1 8 7 5 倍；通过e o c o 诱变得到高产菌株c o - - 2 2 、c o - - 3 6 、c o 一 3 8 ，其中菌株c o - - 3 8 的发酵上清液抑菌圈直径是原种的1 6 8 倍；通过硫酸二 乙酝诱变得到高产菌株d e s 一2 l 、d e s 一3 i 、d e s 一3 7 ，其中菌株d e s 一2 l 的发酵上清液是原种的1 5 2 倍。通过对以上三种理化诱变剂的诱变效果评价可 知，u v + l i c l 复合诱变是三者中最好的诱变方法 在通过理化因子诱变选育得到优良菌株的基础上，利用原生质体融合技术 融合来源于不同诱变方法得到的优良菌株从丽进一步获得高产菌株：p 4 2 、 p 4 3 、p 4 4 、p 4 5 、p 4 4 0 。通过最小抑菌浓度( m i c ) 的实验发现以上 菌株的抑菌活性物质产量约为原种的8 倍 在改变菌株自身遗传因子的基础上，本实验还利用改变环境因子，来提高 农用抗生素产生菌的产素水平首先通过对比实验找到了该菌的最适碳源和氮 源，即：玉米粉和麸皮，然后利用正交实验优化了培养基主要成分的配比，即： 玉米粉1 0 ，麸皮8 、n a c l 0 0 5 、k 2 h p 0 4 0 1 、m g s 0 4 0 1 5 或0 2 最后利用一组对比实验优化了其他培养条件，结果为：最适发酵周期为7 天， 最适培养温度是3 0 ，最适起始p h 6 5 - - 8 0 之间，最适发酵装量是5 0 0 m l 的 三角瓶装1 2 0 m l ，最适摇床转速1 5 0 r r a i n ，最适接种量是1 0 关键词：山东链霉菌，菌种鉴定，紫外线诱变。萦外线+ l i e l 复合诱变， c o 诱交硫酸二乙酯，原生质体融合，培养条件优化 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t s t r e p t o m y c e ss t r a i n2 4 # w a si s o l a t e df r o mo u rl a bt op r o d u c es e c o n d a r y m e t a b o l i t e sw h i c hc o u l ds t r o n g l ya n t i b i o t i ct o3 0p l a n tp a t h o g e n i cf u n g i ，s u c ha s h e l m i n t h o s p o r i u m $ o r o k i n u m , f u s a r i u mg r a m i n e a r u m 瓤v a l s am a l l , e t c t h es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sp r o d u c e db yt h es t r a i nh a dm a l f o r m a t i o ne f f e c to l lt h e s e p l a n tp a t h o g e n i cf u n g i t h e1 6 sr d n a q l 蛇n c ea n a l y s i sa n dt h et r a d i t i o n a l i d e n t i f i c a t i o nm e t h o d sw 鹊u s e dt oi d 础黟t h e 蛐嘶nb a s e d0 1 1t e s tr e s u l t s , t h i s s t r a i nw a si d e n t i f i e da ss t r e p t o m y c e st h e r m o c a r b o n x y d u sv a ts h a n d a e n s i s t oc u l t u r ea n t i b i o t i co v e r p r o d u c i n g 剐r a j h s t h es t u d yi n c l u d eu s i n gd i f f e r e n t p h y s i c a la n dc h e m i c a lf a v o r s t oi n d u c e s l r e p t o m y c e st h e r m o c a r b o n x y d u sv a t s h a n d a e n s i st om m a t i o n a f t e ro r i g i n a ls t r a i nw e r em u t a g e n s i s e db yu vc o m b i n e d l i c l 、c o c o 、d e s ，9h i g h - y i e l ds w a i n sw c r co b t a i n e d u s i n go x f o r dp l a t ea s s a y m e t h o d , t h ea n t i b i o t i ce f f e c tm e a s u r e db yt h ed i a m e t e ro fa n t i b i o t i cc i r c l eo f m u t a t i o n a ls t r a i n si n c l u d i n g u v - - 1 9 、c 0 - - 3 8 、d e s - - 2 1w e r er e s p e c t i v e l y1 8 7 5 、 1 6 8 、1 5 2t i m e st h a nt h eo r i g i n a ls t r a i n b y 锄a l y z i n ga n do o m p a r i i l gm u t a t i v e e f f e c t so f d i f f e r e n tm u t a t i v ef a c t o r s 。i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h em u t a t i v ee f f e c t so f u v c o m b i n e dl i c i 憾b e t t e rt h a no t h e rf a c l o r sw h i c ht h es t u d yu s e d t h em u t a g e n i ce x p e r i m e n t sd e f m e df o u rm u t a n t sa sp a r e n ts t r a i n s ，t h e nb yt h e m e a n so fp m t o p l a s tf u s i o nt e c h n i q u e ，t h ef u s i o ne x p e r i m e n t so b t a i n e dh i g h - y i e l d s t r a i l l s ：p 4 - 2 、p 4 - 3 、p 4 - 4 、p 4 - 5 、p 4 - 4 0 b ym i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n e x p e r i m e n t , i tf o u n dt h a tt h ea n t i b i o t i cp r o d u c t i o no ft h e s eh i g h - y i e l ds w a i n sw c r c a b o u t8t i m e st h a nt h eo r i g i n a ls t r a i n a f t e re x c e r p t e dt h e o p t i m af o r m u l ao ff e r m e n t a t i o nm e d i u m , t h eo p t i m a l m e d i u ma n dc u l t u r a lc o n d i t i o n sw 讹a s c e r t a i n e d t h e o p t i m a lm e d i u mw a s c o m p o s e do fm a i z ep o w d e r l o o 6 、w h e a tb r a nb r o t h8 、n a c l0 0 5 ，k 2 h p 0 4 0 1 、m g s 0 4 0 1 5 o t 0 2 a n dt h eo p t i m a lc u l t u r a lc o n d i t i o n si n v o l v e d ：t h e o p t i m u mp e r i o dw a s7 d , t h eo p t i m u mt e m p e r a t u mw a s3 0 c ，t h ei n i t i a lp ho ft h e m e d i u mw a s6 5 8 0 a n dt h es h a k i n g - n a s ke x p e r i m e n t sw e 他d o n ei n5 0 0 m l , 山东大学硕士学位论文 f l a s k sc o n t a i n i n 9 1 2 0 m lm e d i u mw i t h l o i n o c u l a t i o nq u a n t i t yo r b i t a ls h a k i n ga t 1 5 0 r r a i n k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e st h e r m o c a r b o n x y d u s c a rs h a n d a e n s i s , s t r a i n i d e n t i f i c a t i o n , u v , i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n , a g r i c u l t u r ea n t i b i o t i c s p r o t o p l a s t f u s i o n 和对人类健康的潜在危害，而且还带来了对非靶标生物的影响及植物病原菌抗 性的发展等问题。使得化学农药的发展受到了来自各方面的限制寻找广谱、 高效、低毒的生物农药已成为科研人员及农药使用者的共识其中农用抗生 素是研究的热点之一农用抗生素是由微生物产生的次级代谢产物，因其具有 低毒、高效、选择性强、残留时间短、无三致和无公害等特点，正日益受到世 界各国的重视，如农用链霉素、井冈霉素、春日霉素等在植物病虫害防治上已 广泛应用并做出了突出贡献 农用抗生素的研究始于2 0 世纪5 0 年代，是随医用抗生素之后发展起来的 早期日本美国、英国等先后把链霉素、土霉素、灰黄霉素等医用抗生素用来 防治植物病害，d e k k e r ( 1 9 7 1 ) 等人相继报道了一批如放线菌酮( a c t i d i o n e ) ，抗 霉素a ( a c t i m y c ma ) 以及一些多烯类农用抗生素。1 9 5 8 年日本成功研制出杀 稻瘟菌素一s ( b 触m s ) ，并于1 9 6 1 年大面积应用于稻瘟病的防治，基本上 取代了有机汞制剂在防治稻瘟病上的应用杀稻瘟菌素的发现和工业化，使农 抗的开发研究进入了新时期此后不久h a m a o ( 1 9 6 5 ) ，s u z u r i ( 1 9 6 5 ) 等又开发了 象春日霉素0 k a s u g a m y c i n ) 、多氧霉素( p o l y o x i n ) 、有效霉素( v a l i d a m y c i n ) 那样 的高效低毒无公害的新农抗同时，我国科研人员也研制开发了一些抗真菌农 用抗生素，如井冈霉素、春雷霉素、农抗1 2 0 等，这些农用抗生素已在全国大 面积推广使用最近，由于一些新技术尤其生物技术在农用抗生素研制中的利 用，新的研究成果不断涌现 2 抗真菌农用抗生素产生菌的开发动向 发展农用抗生素是可持续发展的需要，进入二十一世纪全球环境意识 增强，其 限制化学 展历程， 实现产品 年代，防治稻瘟病的农用抗生素灭瘟素、春雷霉素替代了化学农药一有机汞制 剂，8 0 年代，化学农药一三环唑又替代了灭瘟素和春雷霉素，这一现象表明： 农用抗生素除了发挥自身特点外，还必须降低成本，提高防效，才能在农业生 产中发挥更大的作用。 因此选育高产菌株是农用抗生素向工业化生产方向发展中有待解决的关 键问题自从5 0 年代开始我国农用抗生索菌种超过1 0 0 多种，其中完成室内 测定和田问小区试验的品种也有5 0 多种，但真正在农业生产上发挥作用的品 种并不多，其中直接原因就是抗生素产生菌效价较低、成本高，难于生产推广 应用井冈霉素是国内为数不多的能在农业生产上获得长期、大面积推广应用 的农用抗生素品种之一自7 0 年代至今，2 0 多年问井冈霉素一直是防治水稻 纹枯病的主要农药品种沈寅初( 1 9 9 8 ) ；林德沂0 9 9 6 ) 报道，目前在全国已有 专业化生产厂3 0 多家，年产含量5 的井冈霉素达3 ，5 0 0 - 4 , 0 0 0 吨，占据了9 0 以上防治稻纹枯病用药的市场其成功的主要原因在于通过菌种选育，大幅度 提高了产生菌的效价，从野生菌种最初的几十单位，提高到2 0 ，0 0 0 - 3 0 ，0 0 0 单 位，大大降低生产成本，实现了产品工业化生产，达到大面积推广应用 农用抗生素研究中的优良菌种选育一直是国家攻关项目的重要内容，目 前以阿维菌素为代表的农用抗生素研究已被许多国家列为生物农药发展中的 重点、优先开发的项目筛选新菌种，提高产生菌效价和筛选新农抗是国家。七 五”、。八五”和。九五”科技攻关中农用抗生素关键技术研究的重要内容，因 此，采用传统育种技术与现代生物技术相结合的方法，提高农用抗生素的效价， 是解决其继续发展的重要课题。 而目前国家级正式农药登记防治植物真菌病害的药剂9 9 以上为化学农 药，登记的生物农药不足1 ，获得临时登记的防治真菌病害的抗生素类农药 不过十种，因此，急需开发出具有低毒、高效、选择性强、残留时间短、无三 致和无公害等特点的新型农用抗生素。具体而言农用抗生素的研制所面临的主 5 要挑战是： 1 利用诱交育种、原生质体融合或分了生物学技术，将不同菌株进行基因 诱变、重组来改良和培养新菌株，特别是种问的基因重组，获得效价更高、抑 菌谱更广的菌株 2 农用抗生素作为一种生物制剂，其产业化最关键的因素是获得高效高产 菌株后，其发酵条件的优化任何工业发酵过程的研究，都要进行实验室规模 最佳培养基和培养条件的筛选，而后要进入中试及大规模生产 3 为加大中国农药在世界市场上的份额，开发出具有自主知识产权、高效 低毒、无污染、无残留的农用抗生素，并实现产业化，其前提就是要获得纯品 农用抗生素并确定其化学结构，这对农用抗生素进行工业化合成、分子结构的 改造、研制出新农药，建立新化合物文库具有不可估量的作用。 4 开展农用抗生素的作用机理研究，明确其作用方式及作用位点，这对于 克服耐药性，提高筛选效率和靶目标的针对性，延长农用抗生素的使用寿命， 进行有效成分的检测等提供必不可少的先决条件 3 抗生素产生菌的诱变育种的研究概况 微生物的诱变育种约始于1 9 3 9 年2 0 世纪4 0 年代初，b e a d 和t a t u m 采 用x 射线和紫外线等辐射因子来诱交红色面包霉等，获得了各种代谢障碍的突 变株。阐述基因与酶功能的关系，使遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进 了工业微生物育种技术的发展随后b a c k u s 等系统地总结了在青霉素产生菌 中的w i s c o n s i n 育种系谱，为世界许多国家提供了青霉素高产变种。7 0 、8 0 年 代，在抗生素产生菌诱变育种中有关诱变的方法以及突变体的筛选方法等有了 很大发展，同时分子遗传学和分子生物学技术的广泛应用也为诱变育种注入了 新的活力，特别是9 0 年代分子标记方法的运用以及人们对诱变规律和微生物 遗传学知识的进一步了解，使得定向诱变有了可能 在我国，抗生素工业起步于5 0 年代，抗生素产生菌的诱交育种也起始于 那个时间7 0 年代后期8 0 年代以来才真正进入快速发展阶段，特别是在新诱 变因子的开发上，我国的科研工作者作出了巨大贡献进入9 0 年代，诱变机 理研究进一步深入，育成的菌种的数量及质量也大大提高，但和世界发达国家 山东大学硕士学位论文 水平相比我国的抗生素产生菌的诱交育种无论是在基础理论研究上还是在生 产实践上都还有较大差距尽管随着现代生物技术的发展，将目的基因导入宿 主菌进行克隆和表达，从而构建基因工程菌的报道己有不少。但基因工程菌 用于大规模工业生产的还为数不多，经典的诱变育种仍是目前最重要的遗传育 种手段，特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少目前， 国内微生物育种界主要采用的仍是常规的理化因子等诱交方法 3 1 抗生素产生菌诱变育种的目的 3 1 1 提高生产能力 从自然界分离到的抗生素产生菌的野生型菌株，生产能力通常很低。不能 作为生产菌种。但野生型菌种经过诱变选育后，生产能力往往可提高几十至几 百倍例如：经过一系列的物化诱变处理，同时结合培养条件的优化，在4 0 多年内，青霉素产生菌的生产能力提高了3 0 0 多倍，达到了目前的 6 0 0 0 0 - 8 9 0 0 0 u r o l 。同时，在其他抗生素( 如：链霉素、金霉素，地霉素等) 产生 菌的选育中也取得了巨大成绩。 3 1 2 改善抗生素的品质 抗生素产生菌产生的抗生素，往往不是单一的，而是多组分的混合物。通 过诱变育种可将其中有毒的或活性弱的组分除去，同时也可增加有效组分或添 加新组分柱晶白霉素产生菌的野生型菌株的菌丝有一定的毒性，四川抗菌素 工业研究所的孙益0 9 9 4 ) 等，利用常规理化因子对其进行诱变处理结果不但 改造了菌株菌丝有毒性的不良性状，而且还使得发酵产品中主组分a 5 的含量 显著提高小诺霉素是一种抗菌作用强，毒性低的广谱抗生素，但在刚投产时 由于副组分含量较高，该抗生素的品质受到了非常大的影响后来经过多年的 诱变育种及发酵工艺调控，小诺霉素主组分的含量才逐步上升 3 1 3 合成新的抗生素产品 7 诱变某些抗生素产生菌，去掉或改变抗生素母核上的某一功能团，可以得 山东大学硕士学位论文 到疗效更好的新品种，称之为突变生物合成( m u t a t i o n a l 毋r n t h e s i s ) 。如用亚硝 基诱变红霉素产生菌波赛链霉菌( r 绎幻 妒甜p e u c e t i c u s ) 后获得一青色突变株 能产生新品种阿霉素阿霉素是红霉素母核上1 4 位置的h 为羟基所取代，即 1 4 _ 羟基红霉素红霉素仅对白血病有效，而阿霉素对人类急性白血病及多种 实体瘤均有疗效通过诱变筛选还可以得到原抗生素母核上较复杂基团发生改 变的新抗生素产生菌。目前，在氨基环酵类抗生素，如新霉素，庆大霉素和巴 龙霉素生产菌的选育中，正试图用所谓突变生物合成方法来达到这一目的诱 变筛选不能合成抗生素某一组分的突变株，这类突变株只有在添加了它不能合 成的组分时才能合成原抗生素由于次生代谢产物生物合成过程中，某些酶专 一性不强，所以若添加的不是合成原抗生素所需要的组分，而是其结构类似物， 那么就有可能得到组入原抗生素不同类似物的多种新抗生素例如，诱变新霉 素产生菌，得到一株不能合成新霉素的一个组分2 - - 脱氧链霉胺的突变株，在 它的培养液中加入不同的类似物作为前体，如链霉胺时，即可获得组入这些前 体的新抗生素 3 l4 改善抗生素产生菌的性状 通过诱变选育还可改善抗生素产生菌的某些特性，以适应生产上的设备和 条件，并可简化工艺条件，缩短发酵周期。增加设备以及原料的利用率如土 霉素生产中选得了减少泡沫的变异菌株，从而提高了发酵罐的利用率：又如青 霉素发酵液中需要添加昂贵的苯乙酸或苯氧乙酸为前体，才能有效地合成青霉 素g ，诱变筛选氧化苯乙酸能力低，结合前体进入青霉素分子能力强的突变株， 可大大提高前体的利用率 3 1 5 用于研究推测抗生素的生物合成途径 在研究抗生素生物合成过程和抗生素形成的遗传机制方面，抗生素产生菌 的诱变也是一种非常有效的手段在研究抗生素的生物合成途径时，人们利用 一些常规的人工诱变方法，使抗生素产生菌失去产抗生素或其中问体的能力， 就可分离得到抗生素生物合成的各种不同障碍型突变株这些突变株能够积累 某种中问代谢产物或支路代谢产物，从分析产生菌和突变株的代谢产物的化学 山东大学硬士学位论文 结构上的差异，找出这些代谢产物在合成过程中的相互关系，即可推断其生物 合成的反应步骤，再分离其反应中的特殊酶类，可判断其生化反应的特性在 这些突变株中，抗生素阻断型突变株( 亦被称为抗生素零突变株) 便是常用的一 种，它是指目标抗生素分泌为零的突变株，历来都是判明抗生素生物合成途径 有关基础理论研究的好材料例如顶头孢霉( c e p h a l o s p o r i u ma c r e m o n i u m ) 的头 孢菌素c ( c p c ) 生物合成途径的阐述就是采用了若干这样的突变株同时，零 突变株如发生回复突变往往能筛选到产抗生素能力大幅度提高的突变株，这种 迂回跃进战略在抗生素高产菌株的选育方面也是非常有效的途径通过诱变育 种便能得到这种突变体廖爱芳( 1 9 9 6 ) 等对话索米星原生菌株t - 1 2 5 进行紫外 线诱变后获得阻断型体绿色菌株7 2 5 ，利用7 - 2 5 ，也对西索米星的生物合成途 径进行了合理的推测 3 1 6 与其他育种方法相结合 诱变育种与其他方法相结合起来，往往会使得育种效率大大提高如：杂 交育种是将两个亲本的有利性状组合在一起而获得良种的育种方法在杂交前 先分别诱变两个亲本，获得有利的突变型，然后再经杂交将有利的基因组合起 来，比起单纯地将原始亲本杂交更能得到理想的效果除此之外，诱变还可获 得各种类型的突变株，除了可直接提高产量外，有的是遗传研究工作中不可缺 少的标记菌株，可应用于转化、转导，融合重组等；同时，这些突变菌株也拓 宽了微生物的遗传种质资源，丰富了基因库的内容 3 2 抗生素产生菌诱交育种的技术研究进展 诱变育种技术是最早在农用抗生素上应用的一种育种技术它是通过物 理、化学因素作用于抗生菌，人为的使其遗传物质发生变异，从中选育高产菌 株由于它操作简便，速度快、收效大而且诱变手段多样，所以是实验室及生 产上最为常用的高产菌株的育种方式当前，在农用抗生素生产上常用的诱变 剂主要包括以紫外线州) 、x 射线( x - m y ) 、y 射线( y - m y ) ，快中子( f n ) 、h i c o 、 激光等作为诱变介质的物理诱交剂和以碱基类似物( 5 b u 、2 - a p 等) 、烷化荆 ( e m s 、d e s 等) 和吖啶类移码突变剂为主的化学诱变剂另外近几年在微生物 9 山东大学硕士学位论文 诱变育种领域中新近发展的离子束注入诱变技术在农用抗生素育种上的应用 也逐渐增多由于诱变育种操作简便、快捷，早期农用抗生素育种中主要采用 此种方式，在很长一段时间内为农用抗生素生产作出了很大的贡献。但长期使 用诱变劫处理同一菌种，由于突变的不定向性及突变的累积使得在获得高产的 同时菌株在生活能力、产孢量等方面会明显减弱农用抗生素基因重组育种技 术的发展使这一问题得以解决基因重组育种技术自1 9 4 6 年的大肠杆菌k - 1 2 杂交试验成功以来，利用杂交、转化和转导等遗传方法，经过基因重组获得具 有多组合优良性状或多倍体的微生物菌种的技术，在微生物育种技术中一直占 有相当重要的地位经过近5 0 多年的发展，该技术已日趋成熟，发展为常规 杂交育种和原生质体融合两种技术，在生产上已经广泛的应用于细菌、放线菌 及霉菌等的菌种选育。 3 2 1 紫外线诱变 紫外线不能引起电离它的作用是使物质分子或原子中的轨道电子从基态 跃迁到激发态，紫外光子本身作为能量被物质吸收由于其穿透性很弱，所以 广泛地用作微生物诱变剂紫外辐射诱变的作用机制有很多解释，但较为确定 的是紫外辐射使d n a 分予形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，并可能引起 突变或死亡另外嘧啶二聚体的形成，还会妨碍双链的解开，因而影响d n a 的复制和转录。利用紫外诱变的方法选育出大量产量高、活性强的优良微生物 菌种周建琴等用康乐霉素( k c ) 产生菌的自然突变株s t 9 1 为出发菌株，采用 u v 诱变和自然选育的方法，筛选出的突变株u 1 0s4 ，发酵效价比出发菌株提 高4 6 0 多倍随着原生质体技术的发展，利用紫外线对原生质体直接诱变处理， 能在较短时间较大幅度地提高菌种的变异率将红霉素产生菌红色链霉菌的原 生质体用紫外线照射一定的时间后，筛选得到比对照菌株效价提高2 2 5 8 的 高产菌株h p 3 紫外诱变技术是诱变和筛选优良菌株的常规育种方法由于其 设备简单、诱变效率高、操作安全简便等特点而被广泛应用此外，紫外诱变 在核酸中往往造成比较单一的损伤，所以在d n a 的损伤与修复研究中也有一 定的意义 i o 山东大学硕士学位论文 3 2 2 电离辐射诱变 具有贯穿性能的电离辐射对细胞的作用是十分广泛和深刻的。辐射能量的 吸收和传递使细胞中精密组织的生物大分子产生激发和电离状态，特殊的生物 结构使电子转移和自由基链式反应得以进行，导致原初生化损伤亚细胞结构 损伤引起酶的释放，代谢方向性和协调性的破坏促使原初损伤进一步扩展。以 下举两种电离辐射作具体说明 3 2 2 1 y 射线 y 射线与x 射线由光子组成，是间接电离辐射一般具有较高的能量，能 产生高速运动的次级电子，因而直接或问接地改变d n a 结构廖爱芳用青霉 素、超声波对庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌2 3 1 8 的孢子进行预处理，再用”c o 进行辐射诱变，筛选出的高产菌株7 9 、1 6 7 ，摇瓶发酵效价比亲株2 3 1 8 提高 2 0 ，发酵周期缩短i o 小时，且生产能力稳定魏奏金等采用不同剂量的“o 射线。对南昌霉素产生菌南昌链霉菌菌株的孢予进行处理，结果表明，3 万伦琴的诱变剂董具有较好的诱变效应，连续四批摇瓶发酵试验突变株平均产 量比出发菌株提高5 0 以上快中子也是间接电离粒子，快中子在组织内能量 损失主要是通过与h 原子核等的弹性碰撞而产生的反冲质子使组织中的原子 激发和电离，引起生物分子中化学键的断裂周延等利用紫外线、快中子、快 中子和磁场复合、y 射线、y 射线和磁场复合诱变，以酶活为筛予对产脂肪酶 的菌株进行诱变育种，认为在产脂肪酶菌株的诱变中快中子诱变更为有效 3 2 2 2 离子束 重离子属带电粒子，能直接引起电离重离子束与其它辐射( 如中子、电 子、x 射线、y 射线) 相比，在与生物材科相互作用中具有很好的诱变效应 例如：应用低能矿离子对柔红霉素产生菌进行离子辐照选育，获得了柔红霉 素产抗生素能力提高1 5 倍的高产突变体，刘连碧等根据突变株在平板培养时 所合成的红色葸环类物质扩散广的现象初步推断：可能是由于突变株细胞壁或 细胞膜的通透性增强，引起柔红霉素及其合成途径中的葸环类中间体大量泄漏 山东大学硕士学位论文 到培养基中，从而降低了它们在细胞中的累积，减弱了对菌体生长的抑制作用， 同时。也可能部分解除了其整个生物合成代谢途径的反馈抑制，最终导致柔红 霉素合成水平的提高颉红梅等用瓤k 离子辐照庆大霉素产生菌绛f l z d , 单孢 菌，所得突变株的正变率为6 9 1 除此之外，糖化酶生产菌、不饱和脂肪酸 生产菌、维生素生产菌的离子束诱交效果也得到充分肯定 3 2 3 化学试剂诱变 化学诱变剂种类繁多，大致可以分三类一类是在d n a 复制过程中能取 代正常的碱基；一类是改变静止中的d n a 碱基；一类是移码d n a 碱基 第一类，碱基类似物如：5 - - 溴尿嘧啶、a 一氨基嘌呤( 2 一氨基嘌呤，5 一氨基嘌呤) 它们能在d n a 复制过程中渗入d n a 而不损坏它的复制能力， 但是它们的氢原子的分布与正常碱基不同，比正常的具有更大的不正确的配对 倾向，因此引起误义突变。5 - - 溴尿嘧啶是一种非天然的碱基类似物。它渗入 到d n a 分子中，必须有两个条件：一是天然碱基贫乏，二是在d n a 复制需 要吸收外源碱基以合成新的d n a 分子这两个条件缺一不可因此，此类诱 变荆必须在创造天然碱基贫乏的环境和菌体正处于生长繁殖过程时使用 脱氨基诱变剂为第二类有：亚硝酸( h n 0 2 ) 羟胺( n h 2 0 h ) 等亚硝酸 能直接与碱基起氧化脱氨基作用，因而，腺嘌呤脱氨基后成为次黄嘌呤，后者 能与胞嘧啶配对而取代与腺嘌呤正常配对的胸腺嘧啶胞嘧啶脱氨基后成为尿 嘧啶，它能与腺嘌呤配对，而取代与胞嘧啶正常配对的鸟嘌呤鸟嘧啶脱氨基 后成为黄嘌呤，它能与胞嘧啶配对，而取代与鸟嘌呤正常配对的胞嘧啶因为 胸腺嘧啶( 以及r n a 中的尿嘧啶) 没有氨基，所以用亚硝酸处理时保持不变 羟胺只与胞嘧啶起反应，使它只能与腺嘌呤配对，而不能与鸟嘌呤配对 第三类大多数为烷化剂包括：氮芥( m m ) 、乙烯亚胺( e i ) 、硫酸二乙酯 ( d e s ) 、甲基磺酸乙醋( e m s ) 、亚硝基弧( n r g ) 、亚硝基甲基尿( n m u ) 其主要生物效应：( 1 ) d n a 交联( 2 ) 碱基缺失( 3 ) 引起染色体畸变( 4 ) 造 成碱基对的转换或颠换硫酸二乙酯( d e s ) 的作用机制主要是使d n a 的磷 酸及碱基部分发生烷基化作用，这样d n a 在复制时就产生错误，尤其是嘌呤 类更容易发生烷化作用鸟嘌呤由于烷化作用，而使其与糖的结合键发生水解 ， 山东大学硕士学位论文 而解离，使嘌呤从d n a 中脱落下来，造成d n a 的缺损，进一步发生d n a 在 复制的紊乱 化学诱变育种的特点：与物理诱变相比，很多化学诱变剂产生了高比例的 点突变，低比例的d n a 畸变，而物理诱交由于以丫射线和x 射线为代表的电 离辐射，其穿透力较强，易被d n a 吸收，对d n a 结构具有很大的破坏性 化学诱变育种具体有以下特点：( 1 ) 诱变突变率较高，具有位点特异性：( 2 ) d n a 畸变的比例相对较少，很少有致死型发生，对处理材料损伤轻；( 3 ) 化学诱变荆 有迟效作用，即诱变能引起生物学损伤和染色体断裂，但并不立即表现和断开； ( 4 ) 存在残留药物的后效作用，反应后对生物损伤大；( 5 ) 由于引起的突变范围 广，后代选择需要足够大的群体；( 6 ) 价格便宜，操作简单。不需要特殊设备 3 2 4 诱变剂量的选择 在对各种诱变剂有效性( 诱交剂测定剂量对菌株的敏感性) 的评价中，诱 变率( 常用致死率作微生物对诱变剂敏感性的生物参数) 是最重要的在诱变 育种工作中，用诱变剂的绝对剂量( 物理诱变剂的辐射量，化学诱变剂的浓度) 来评价有效剂量不能直观反映诱变效果，因此常采用相对剂量例如：致死率、 形态突变率、营养缺陷型出现率等来评价任何诱变剡都有杀菌和诱变两方面 作用，在一般情况下诱交处理后的细胞死亡率越高，活下来的细胞突变率也 越高，故可用致死率作为相对剂量过去常用致死率为9 9 9 9 * , 的剂量而近 年来多采用致死率为7 0 - - 7 5 ，甚至更低的剂量。原因主要是：诱变剂的作用 目的是通过提高变异率和变异幅度，从而提高生产水平因此，凡在高诱交率 的基础上，既能扩大变异幅度又能促进使变异向正变范围移动的剂量，就是合 适荆量在一定范围内，诱变率往往随剂量增高而提高，但达到一定剂量后， 再提高剂量反而会使诱变率下降，许多实验表明，紫外线、x 射线和乙烯亚胺 等因素的诱变效应。正变较多的出现在偏低的剂量中，而负变则较多的出现于 偏高的剂量中在经多次诱变的菌株中，更容易出现负变因此。现在普遍倾 向于采用较低剂量来进行诱变育种。 技术出现并被首先应用于动植物细胞，并很快发展到微生物领域，先后在真菌、 细菌和放线苗中得以应用它的发展使得微生物育种中不能充分利用遗传重组 的状况得到了很大的改观。 3 2 s 1 技术原理 原生质体融合技术是生物工程中细胞工程的一个重要的方面。它是用酶将 两杂交亲本的细胞壁酶解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹 的原生质体然后将两处理的原生质体在高渗环境中混合使之在助融剂 p 颇聚乙二醇) 的作用下融合的过程 n 。 3 2 5 2 在农用抗生素育种中的应用与发展 原生质体融合技术在微生物育种中的应用为农用抗生素高产良种培育开万 拓了较为广阕的前景首先原生质体融合可以实现遗传物质的充分重组，加大 了融合子成为高产、并具有优良性状的组合体的可能性其次原生质体融合常 引起细胞质粒的消除，消除频率往往可达1 3 8 5 这常常导致细胞染色体 的改变，或是次级代谢途径的变化，从而增加高产菌株出现的几率而且研究 发现原生质种内或种问融合很可能导致抗生素合成限速酶的修饰及某些有利 于增产的“沉默基因”的表达，从而提高抗生素产量原生质体融合技术是农 用抗生素育种领域中除诱变育种之外应用最为广泛的育种技术尤其近几年随 着原生质体技术的不断完善和发展，许多农用抗生素产素水平的提高都或多或 少的得益于原生质体融合郑幼霞等1 9 8 5 年曾报道了利用庆丰霉素a s 2 0 1 和 吸水链霉菌井冈变种v a 4 t x - t i s j 菌株的原生质体种间融合重组获得了l 株产素水 平明显提高、其他性状良好的菌株曾洪梅等也以五夷霉素产生菌不吸水链霉 菌五夷变种c o - n - 3 1 诱变突变株m 3 5 潍孢子颜色灰色) 和m 4 6 ( s e r - 孢子颜色 嚣 象 山东大学硕士学位论文 灰白色) 为直接亲本，通过种内原生质体融合获得了l 株较原株效价提高8 2 的高产菌株1 ：3 1 - 2 4 目前，原生质体融合技术已形成原生质体融合、原生质体 诱变、原生质体转化等一系列技术。在融合方法上，最近又发展了电诱导原生 质体融合技术和脂质体介导的原生质体融合技术，而且正逐渐被应用在农用抗 生素高产菌株的育种工作中当然，这一技术本身仍存在一些理论问题如； 杂交育种中所共同存在的正突变累积及遗传标记问题；以及在原生质体融合过 程中同源细胞之间的重组问题：还有在种间及种内原生质体融合过程中的原生 质体灭活技术问题。近年来对这些问题的解决使原生质体融合技术更加成熟完 善，同时加快这一技术在农用抗生素育种领域中的应用例如姚曙光等( 2 0 0 3 ) 将林可霉素产生菌n 6 5 2 # 、$ 7 8 1 # 的原生质体分别热灭活和紫外灭活，并将灭 活原生质体用p e g 融合，从中获得9 2 2 0 1 # 融合株，其摇瓶效价分别较n 6 5 2 # 、 $ 7 8 1 # 提高1 7 5 2 。且色素分泌少，传代稳定性强。 3 3 抗生素产生菌诱变育种的筛选方法 通过诱变处理，在微生物群体中会出现各种突变型的个体，但其中多数是 负变株，正变株所占比例极小，为在短时间内获得好的效果，必须设计和采用 效率较高的筛选方案及筛选方法目前常用的筛选方法有随机筛选( r a n d o m s e l e c t i o n ) 和推理选育( r a t i o n a ls e l e c t i o n ) 两种 3 3 1 随机筛选法 随机筛选是抗生素产生菌的诱变育种中一直采用的方法，它是将菌种诱变 处理后，不加选择地随机挑选菌落，从中选出产量最高者进一步复试这种筛 选方法较为可靠，但随机性大，需要进行大量筛选如果突变机率很小，为了 能够挑选到优良菌株，就必须花费巨大的人力和时间，这就大大限制了筛选量， 影响高产菌株的筛出率它主要包括以下几种 3 3 1 1 表面培养筛选 这种筛选是以在固体培养基上生长的菌落进行的，基本可分两种方法：一 种是检测单个菌落的代谢产物分泌于培养基中形成的于中菌圈，或用一种能与菌 山东大学硕士学位论文 落代谢产物起颜色反应的化合物喷射鉴别形成的显色圈。根据抑菌圈或显色圈 的大小，可以初步判定筛选对象活性的高低，是一种初筛的方法。日本人八木 t y a k 9 ) 在春雷霉素产生菌诱变处理后的筛选工作中采用了一种称之为琼脂块 培养法的方法，使得筛选的效率大为提高高卫胜等利用此法选育林可霉素菌 种亦取得了很好的效果另一种是把单个菌落分泌于培养基中的代谢产物洗脱 到溶液中，然后进行抗菌活力的测定。它比第一种费力，但准确性高在生产 实践中，这两种方法常常结合在一起使用 3 3 1 2 液体培养筛选 这是生产上一直使用的方法它主要指将菌种诱变处理后挑选出的菌落接 入摇瓶进行发酵实验这一方法筛选效果优于表面培养筛选，它可以设计各种 更接近于生产条件的工艺例如，种子与发酵阶段的温度，通气、搅拌、补料譬 和发酵培养过程的测定等等均可仿效生产工艺同时，它的实际分辨力也高于 固体表面筛选缺点是，它不能象固体表面筛选那样对大量诱变分离株进行检 ，莹 t ，穷 测，而且操作起来工作量大，时间长过程复杂。不过，近年来由于筛选工具 的微型化以及筛选过程的自动化。使该方法的筛选效率得到了极大地提高。 一一彗 3 3 1 3 多级筛选 在抗生素产生菌的诱变育种中，群体中的突变率较低，其中正突变率更少， 加上操作和测试误差又较高，所以要设计多级筛选来寻找稳定高产变异株的最 高机率多级筛选原理是分离株反复通过多次筛选，确定每一级分离株高单位 的最高比率，例如第一级( 或称初筛) 选出2 0 高单位菌株；第二级( 复筛) 选出 l o ：第三级选出l o 每一级的每一株菌株使用摇瓶数分别是一只、三只和 五只测试提高精确度仅为重演度的平方根，因此，一个多级筛选的早期阶段 ( 初筛) 要测定大量单菌落，虽然分辨力低。但可排除大量低产株在筛选后期， 分离的复试株较少，重演性逐渐提高，最后确定的高产突变株最好包括小型发 酵罐试验。 山东大学硕士学位论文 3 3 1 4 迅速循环再筛选 以重演性稳定的优良高产菌株为出发菌株进行诱变选育，周而复始的迅速 再循环。可提高筛选效率因为抗生素效价的高低是由多基因控制的，每个提 高效价基因突变的效果是累加的，所以经多代诱变选育，最终可筛选出比原始 出发菌株有较大幅度增产的突变株同时，建立几条线再循环伺时进行选育的 优点在于，每条线可以采用不同条件( 例如，多出发菌株，不同诱变剂，各种 筛选培养基等等) 以最大限度表达和选得各种优良突变型菌株而且它还建 立了从不同选育线中的最优良菌株之间进行遗传重组，更有希望获得有益基因 丛的连锁或产生带有新基因型的重组体菌株这样的重组体如果再以多条线进 行突变选育高产突变型是很有效的因此，迅速循环再筛选对于抗生素产生菌 的菌种改良具有重要的价值 3 3 2 推理选育 由于遗传物质变异的不定向性和抗生素生物合成受多基因控制的复杂性， 要从大量的变异菌株中获取所需要的突变株就需要应用有关抗生素生物合成 的调控机制来设立定性的或是半定性的筛选模型推理选育正是在此基础上发 展来的推理选育起始于2 0 世纪6 0 年代，7 0 年代由e l 删i c r 正式提出它是 指诱发突变与理性化筛选方法相结合的一种育种方法，即利用抗生素的生物合 成途径和代谢调控的原理来指导和设计育种方案。随着对抗生素生物合成途径 的深入研究，推理选育技术迅速发展起来，内容极为丰富，筛选方法多种多样 8 0 年代、v 蛐m k i s 和e l a n d e r 对推理选育方法作了很好的总结，他们提出推 理选育的范围包括前体和结构类似物的抗性突变方法，营养缺陷型的回复突 变，多拷贝质粒的抗生素产生菌筛选，多倍体菌株的诱导或自发分离等目前 推理选育最常用的方法有耐前体及其结构类似物突变株的筛选，耐自身产物及 其类似物突变株的筛选，耐分解阻遏物突变株的筛选，代谢途径障碍突变株的 筛选等 1 7 山东大学硕士学位论文 4 抗生素产生菌发酵条件优化的研究 优良