（微生物学专业论文）果胶酶产生菌hdym02的诱变育种.pdf

中文摘要 中文摘要 果胶酶是l 类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛一 分布于高等植物和微生物中，在某些原生动物和昆虫中也有发现。在微生物中，细 菌、放线菌、酵母和霉菌都能代谢合成果胶酶。果胶酶在工业生产领域中是一种 重要的新兴酶类。据统计，目前果胶酶在全世界食品酶的销售额中占2 5 。 本文以黑龙江巴彦亚麻有限公司沤麻池中分离筛选出的h d y m 0 2 为出发菌 株，先用紫外线进行诱变，从大量突变株中进行筛选，选育出4 株产果胶酶性质 稳定且酶活明显提高的突变株：u 6 ，u 1 2 ，u 2 7 ，u 3 6 ，其中的u 1 2 在6 h 时的酶 活为出发菌株的1 4 4 倍。将u 1 2 作为亚硝基胍诱变出发菌株，经过4 轮诱变，筛 选出突变株4 株：n 4 ， n 1 5 ，n 3 3 ，n 5 2 。其中n 3 3 在2 4 h 时的酶活为8 5 3 9 唧oi m l 。将n 3 3 进行紫外和亚硝基胍复合诱变，得到突变株4 株：f 6 ，f 1 8 ，f 2 2 ， f 3 5 其中f 2 2 在2 4 h 时的酶活达到9 8 3 3 u m oi m l 。最后将f 2 2 进行紫外和硫酸二乙 酯符合诱变，得到本研究的最终突变株f 1 4 ，其在2 4 h 时的酶活为1 11 2 7 u m o l m l ， 是出发菌株产量( 3 4 3 9 啪o i m l ) 的3 2 倍 将最终突变株f 1 4 转接1 0 代，用d n s 法测其发酵液的吸光值，测定结果显 示u n 3 7 发酵液的吸光值比较稳定，说明果胶酶产量稳定没有出现回复突变，并 且较出发菌株的吸光值有很大提高。 关键词：果胶酶；紫外：育种 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t p e c t i n a s ei sak i n do fd e c o m p o s i t i o no ft h ep e c t i nc o l l e c t i v e l y ，c o n t a i nav a r i e t yo f c o m p o n e n t so ft h ec o m p o s i t ee n z y m e p e c t i n a s ew i d e l yd i s t r i b u t e do v e rh i g h e rp l a n t s a n dm i c r o o 唱a n i s m s ，i nc e n a i np r o t o z o aa n di n s e c t sa r ea l s of o u n d i nm i c r o o 唱a n i s m s ? b a c t e a ，a c t i n o m y c e t e s ，y e a s ta n dm o l dc a nt om e t a b o l i z ea n ds y n t h e s i z et h ep e c t i n a s e p e c t i n a s ei sa ni m p o r t a n te m e 唱i n ge n z y m e si nt h ea r e ao fi n d u s t r i a lp r o d u c t i o n a c c o r d i n gt os t a t i s t i c s ，a tp r e s e n t ，p e c t i n a s ea c c o u n t e df o r2 5p e rc e n ti nt h ew o r l do f f o o de n z y m es a l e s i nt h i sp a p e r ，w ei m p o s eh d y m - 0 2w h i c hw a si s o l a t e df r o mr e t t i n gp o n d si n h e i l o n 百i a n gb a y a nn a xl t d a st h es t a r t i n gs t m i 凡、v ep r o c e s sm u t a t i o nt o u s e u l t r a v i o l e t1 i 曲t ，a n df r o mal a r g en u m b e ro fm u t a t i o n st ot h es c r e e n i n g ，、es e l e c tf o u r m u t a n ts t m i n s 、v h i c hp r o d u c ep e c t i n a s ea n dp r o p e r t yi ss t a b l ea n d s i g n i f i c a n t l y e n h a n c et h ee n z y m a t i ca c t i v i t y ：u 6 ，u 1 2 ，u 2 7 ，u 3 6 ，o n eo fu 1 2w h e ni n6ht h e e n z y m a t i ca c t i v i t ) ，a st h es t a r t i n gs t r a i no f1 4 4t i m e s u12w i u b e2 l sn t gm u t a t i o no f s t a n i n gs t r a i n ja r e rf o u rc y c l eo fm u t a t i o n ，w es c r e e n e df i v em u t a n ts t r a i n s ：n 4 ，n 15 ， n 3 3 ，n 5 2 t h ee n z y m a t i ca c t i v i t yo f n 3 3i st h e2 2b t i m e so f u l 2w h e ni n1 2 h f i n a l l y ， m a k i n gt h en 3 3 t ou va n dn t g c o m p o s i t em u t a t i o n ，w eo b t a i nt h es e v e nm u t a n t s ：f 6 ， fl8 ，f 2 2 ，f 3 5 ，w h i c ht h ee n z y 瑚a t i ca c t i v i t yo ff 2 2a t2 4ha c h i e v et o9 8 3 3u m o l m l f i n a l l v w em a k em u t a t i o no ft h ef 2 2w i t hu va n dd i e t h y ls u i f a t e ，o b t a i nf i n a l m u t a n tf l4o f t h i sr e s e a r c h ，i t se n z y m a t i ca c t i v i t ) ，i sl l1 2 7 啪o l m li nt h e2 4h ，i ti s 3 2t i m e so fs t a n i n gp r o d u c t i o ns t r a i n s ( 3 4 3 9u m o l m l ) w es w i t c ht h ee v e n t u a l l ym u t a n tf l4t ot e ng e n e r a t i o n ，a n dd e t e c t i n g t h e e x t i n c t i o nv a i u eo ff ? l4 b r o t hw i t ht h ed n sa p p r o a c h ，i ts h o 、v e dt h a tt h ee x t i n c t i o n v a i u eo ff l4b r o t hi sr e l a t i v e l ys t a b l e ，i ti l l u s t r a t et h a to u t p u to fp e c t i n a s ei ss t a b l ea n d n o ta p p e a rb a c km u t a t i o n ，a n di tc o m p a r et os t a n i n gs t r a i nt h ee x t i n c t i o nv a l u eh a v e g r e a t lyi n l p r o v e d i ( e y w o r d s ：p e c t i n a s e ；m u t a g e n e s i s ；s e l e c t i o n 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。捌我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中小包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也小包含为获得墨蕉堑塞堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：1 豉志 签字f i 期：0 2 一扩年爹月7 幻r 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉堑丕堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨垄迤盔堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：赫爵b 导师签名： 签字日期：左嘲年z 月f 文日 签字日期：年 月 同 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章绪论 第l 章绪论 2 0 世纪7 0 年代微生物果胶酶在研究果蔬腐坏病过程中被发现。随着对果胶 酶来源及性质研究的不断深入，果胶酶在食品加上和棉麻脱胶等加工工艺中的利 用己获得了巨大的成就。对产果胶酶菌种的选育，产酶动力学，酶学研究及分子 生物学研究一直在进行中，并不断深入，果胶酶的应用也越来越广泛。 1 1 果胶概述 1 1 1 果胶物质的定义 1 9 2 5 年法国人j b r a c c n o t 首先发现果胶并将其命名为p e c t i n ，p e c t i n 是由希 腊文“p e k t o s ”而来口j ，意思是容易成胶的物质。果胶的分子量由于来源的不同而 不同1 ”。果胶物质可分为原果胶、果胶、果胶酸，它们的定义不同。例如原果胶是 填充于植物组织中的果胶物质；果胶是指含有中性糖侧链且部分被甲酯化的果胶 酸；果胶酸即为聚半乳糖醛酸。1 4 j 1 1 2 果胶物质的存在及化学组成 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以q 一1 ，4 糖苷键聚合而成的多糖链， 一般带有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、海藻糖、芹菜糖、乳糖等组成的侧链，游离 的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物f l 结合在一起它存在于 所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞问层，在初生壁中与不同含量的纤 维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白( e x t e n s i n ) 川相互交联，使 各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态果胶分子的结构因植物的种类、组 织部位、生长条件等的不同而不同。 黑龙江大学硕士学位论文 ，乳6 “ h 拉i c ， f 。 ) 疑一肯一宁到d ， 斥毫囊 p i 平羹木m h 一 木x v i “- 甲茸m c 岫l l t 圣 c | ， 图卜l 果胶的结构简图i j l f i g u r e1 1d i a g r a mo f t h es t n j c t u r eo fp e c t i n 图卜l 是果胶的结构简图，总体可分为光滑区( s m o o t hr e g jo n ) 和须状区( h a ir y r e g i o n ) 两部分，主要由h g a 、r g 一1 和r g 一】1 三个结构区域构成，其中r g 一】常以二 聚体的形式存在同其它植物多糖一样，果胶也是多分子的、多分散的、多结构 的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分布。 在植物的根、茎、叶、果实等器官中，以果实中果胶的含量最高。比如草莓、 山楂、苹果、柑橘等的果实中含量颇丰。此外，胡萝卜的肉质根、向日葵的花盘 等也富含果胶。目前真正具有工业生产价值的果胶来源首推柑橘果皮和苹果榨汁 废渣滓。部分水果和蔬菜中的果胶含量如表1 1 所示。 表1 1 部分水果和蔬菜的果胶含量i ：| c 】 t a b l el lt h ep a no rf i i t sa n dv e g e t a b i e sp e c t i nc o n t e n t 第1 章绪论 1 2 果胶酶概述 1 2 1 果胶酶的定义及分类 1 2 1 1 果胶酶的定义 果胶酶是类复杂的酶，通常将能够催化果胶酸或果胶分子降解的酶类统称 为果胶酶。 1 2 1 2 果胶酶的分类 从广义上来讲果胶酶可以被分为3 种类犁r j ：( 1 ) 原果胶酶：它能把不溶于水 的原果胶分解为可溶于水的高聚合体的果胶：( 2 ) 果胶酯酶：它能够促使果胶的脱 甲酯作用，脱去果胶中的甲氧基基团；( 3 ) 解聚酶：它能够促使果胶中d 半乳糖醛 酸的q 1 ，4 糖苷键的裂解。最近几年人们对果胶酶的研究更加深入，所以又提出 了一种比较详细的分类方法。 ( 1 ) 原果胶酶( p r o t o p e c t i n a s e s ) 能够促使原果胶溶解的酶为原果胶酶。根据原果胶酶的作用机理把它分为两 种类型：a 型原果胶酶与b 型原果胶酶。a 型原果胶酶主要来源于酵母及酵母状 真菌的发酵液中。 ( 2 ) 聚半乳糖醛酸酶( p o l y g a l a c t l l r o n a s e sp g ) 聚半乳糖醛酸酶是在有水参加反应的情况下促进聚半乳糖醛酸链水解的一种 果胶酶。根据水解作用机理的不同，聚半乳糖醛酸酶可以被分为内切聚半乳糖醛酸 酶( e n d o p g ) 和外切聚半乳糖醛酸酶( e x o p g ) 。外切酶又可以划分为两种类型：一种 是真菌外切聚半乳糖醛酸酶；另一种是细菌外切聚半乳糖醛酸酶。其中内切聚半 乳糖醛酸酶分布于真菌和细菌中，在一些高等植物和寄生于植物的线虫中也有发 现。有关研究报道，现在已经在许多微生物的菌体中发现了这种内切酶。 ( 3 ) 裂解酶( p e c t i nl y a s e s ，p l ) 裂解酶又叫反式消去酶，是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶。 根据其作用机理以及作用底物的不同，可以划分为：( a ) 内切聚半乳糖醛酸裂解酶 ( e n d o p g l ，e c 4 2 2 2 ) ；( b ) 外切聚半乳糖醛酸裂解酶( e x o p g l ，e c 4 2 2 9 ) ；( c ) 内 1 黑龙江大学硕士学位论文 切聚甲基半乳糖醉酸裂斛酶( e n d o p m gl - e c 4 2 2 1 0 ) ：( d ) 外切聚甲基半乳糖醛 酸裂解酶( e x o p m g l ) 。裂斛嗍町以多种细菌和一些致病性的真菌产生内切裂解 酶比外切裂解酶要f 富。- 可以从腐烂食物中的细菌和真菌中分离到。 ( 4 ) 果胶酉旨酶( p e c tin e s te r ；1 s o p i ：) 果胶酯酶( 阼，e c ：3 1 1 j 1 ) 是一种羧酸酯酶，属于水解酶。它能促进脱酯化 作用，从果胶的半乳糖酵酸聚糖卜链上脱去甲基，从而释放出酸性果胶和甲醇。 果胶酯酶的活动贯穿怕：细胞新陈代谢的全过程，包括细胞的生长、果实的成熟、 衰老、脱落。在纺织 ：业生产中，果胶酯酶用于改善纺织品的质地：在果蔬加工 中能使产品稳定以及用一j 二果汁提取和澄清。从植物的致病菌以及真菌中发现有果 胶酯酶。 1 2 2 果胶酶的性质和作用方式 聚半乳糖醛酸酶( p g ) 是发现最早的果胶酶，它可以水解d 半乳糖醛酸的q 1 ，4 糖苷键，其作用方式见图卜2 。 旧蝠 o i 、，l m i 旧蚓念 v n 确 帅恐 o i 一，、 卜 l 图卜2 聚t 乳糖醉酸酶作用模型 f i g u r e1 2p o l y g a l a c t u r o n a s er o l em o d e l 内切聚半乳糖醛酸酶( e n d o p g ) 作用于聚半乳糖醛酸时，使溶液粘度下降。因 而e n d o p g 在果汁澄清中起重要作用。其最适p h 、温度和反应初速度等随酶来源 厶飞崤 第1 章绪论 不同而异，比如柬源于脆壁兜鲁氏酵母的e n d o p g 最适p | 为f 1 ，1 ，黑曲霉产生的 e n d o p ( ；最适d h 为4 0 4 2 。 外切聚半乳糖醛酸酶( e x o p g ) 以切断底物非还原性术端a 一1 4 糖苻键的方式 水解聚半乳糖醛酸，与e n d o p g 的作用结果不同的是其溶液粘度下降小明显。 e x o p g 在植物，霉菌和细菌中均有发现。最终产物多为单半乳糖醉酸，反应p l 值 为4 5 ，欧式植物杆菌的最终产物为二半乳糖醛酸，反应p 1 值为7 5 。 聚半乳糖醛酸裂解酶( p g l ，) 通过反式消去作用切断果胶酸分子q 1 4 糖苷键， 生成具有不饱和键的半乳糖醛酸酯。e n d o p g l 以随机方式裂解，e x o p g l 由非还 原性木端释放不饱和二聚体。p g l 最佳底物是低酯化果胶，e x o p g l 最佳底物则 是果胶酸。p g l 大多由细菌产生，少数e n d o p g l 由真菌产生。州样通过反式消 去作用切断a l ，4 糖苷键的还有聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( p m g l ) ，其作用方式 如图卜3 l 所示。目前研究较多的是内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( e n d o p m g l ) ， e n d o p m g l 多由真菌产生，高等植物中尚未发现，细菌中也很少见。 上山 h o 图1 3 果胶裂解酶作川模型 f i g u r e1 3p e c t i nl y a s er o l em o d e l 果胶酯酶( p e ) 的作用方式如图卜4 所示。果胶酯酶具有专一性强，对聚半 乳糖醛酸中的甲酯有高度特异性等特点。通过研究可知在细菌、真菌和植物中， 多种果胶酶组成一个活跃的果胶体系，p e 与p g 和p m g l 共存。由此可知p e 对其 它果胶质解聚酶是必不可少的。 黑龙江大学硕士学位论文 、k o 0 巡曳l 、 h ( 心心n t 。一 已 h 厶 ! 。蹬惑 io k 抵一 ( j l - 3 。一一一( ) 、 ，弋心 + 五c 。h h 6 h 氧 h c 卜、 v： h( ) 图l 一l 果胶酯酶f 1 一j j 模i u f i g u r el 一4p e c t i n e s t e r a s er o l em o d e l 果胶酶的性质和作用底物及束源密切相关，一般表现为最适p h 值和温度的差异l 2 j 1 1 j 1 4 i o 1 3 果胶酶的应用 1 3 1 在食品行业的应用 1 3 1 1 果汁制造和果酒酿造 其应用主要集中在如下几个方面：( 1 ) 提高果汁出汁率，加速果汁澄清1 1 5 l ；( 2 ) 制备混浊果蔬汁1 1 6 1 ；( 3 ) 单细胞食品的制备，原果胶酶能作用于植物组织产生松 散的单细胞。酶处理的果蔬组织所获得的单细胞，细胞完整，各种营养成分保存 完好，表面及内部的张力较小而易与牛奶、酸奶、冰淇淋、混合，且易被胃蛋白 酶以及胰凝乳蛋白酶消化，适宜用作老人、婴儿以及病人的食品；( 4 ) 果酒酿造时 果汁的预处理l i 。 1 3 1 2 作为天然的防腐剂 果胶酶降解果胶而得到的果胶分解物对食品有很强的抗菌作用，特别是对大肠 杆菌有显著的抑制增殖作用i f 刖。2 0 世纪9 0 年代中期，果胶分解物作为天然防腐剂 开发成功。目前，国外以果胶分解物为主要成分，配合其它天然防腐剂，已广泛 应用于酸菜、成鱼、牛肉饼等食品的防腐。 第1 章绪论 1 3 1 3 果实的脱皮 将含有纤维素酶和半纤维素酶的粗果胶酶制剂作用于果实皮层，能使皮层 细胞分离，结构破坏而脱落。如柑桔囊衣、一莲子的肉衣和人蒜的膜层经过粗 果胶酶处理后，可以很快地脱落 二“；。 1 3 1 4 榨油 果胶酶是一种细胞壁降解酶，它可以用于植物油的榨取过程：_ 。，如在橄榄油榨 制时加入果胶酶可破坏起乳化作用的果胶提高油的收率，而且榨出的油贮存时也 非常稳定，多酚类物质和维生素含量也有所增加。 1 3 2 在纺织和造纸工业中的应用 1 3 2 1 纺织产品的脱胶 果胶酶脱胶有许多优点1 2 1 l ：不破坏植物纤维，不污染环境，节约能源。麻类 纤维是非常优良的纺织品原料，但是这些纤维中除了含有纤维素外还含有的果胶 质i 二l 。脱胶就是从植物纤维中除去有粘性的非纤维物质。传统的脱胶工艺是把麻 浸泡在强碱溶液中并于沸水中煮，再漂洗，中和，清洗，烘干后还得用柔软剂处 理以防止纤维脆弱。这种方法能耗高，排放大量的有毒物质，严重的污染了环境， 而且还损害部分纤维对其质量造成一定的影响1 2 制。用微生物和酶脱胶可以克服以 上缺点，所得纤维完全符合质量标准1 2 川。 1 3 2 2 造纸业的生物制浆 造纸工业中的生物制浆与纺织品的生物脱胶类似，都是通过果胶酶等酶处理 降解植物纤维原料中的果胶、半纤维素及木质素，使其分散成满足造纸工业不同 要求的束纤维或单纤维，以生产柔软、均一、有弹性的高品质材料忙o l 。由于纸浆 中高分子果胶带负电荷，经酶降解至六糖以下即可将其除去，避免了成品纸的静 电现象吲。 1 3 3 在生物技术领域中的应用 1 3 3 1 纯化植物病毒 黑龙江大学硕士学位论文 病毒被束缚订：植物组织的韧皮部时，一r 通过j j 【l 入一一些果胶酶和纤维素酶把 病毒从这吵鬯植物组织! l 分离出来。这对研究纯的植物病毒以：其物理、化学及生物 学特性提供了帮助。 1 3 3 2 d n 的提取 在某些植物中d 、a 和一些多聚糖黏| ；f j 力，。起，j 1 传统的提取方法所提取的d a 纯度不高，这时若在提取过程中加入定硅果胶酶，叮以把这些杂质降解为小的 分子片断从而与d 、a 分离，d l a 的纯度可得剑了显著提高_ 。 1 3 3 3 制备植物细胞原生质体 真菌和细菌果胶酶都可以用来从植物纤【织巾分离植物细胞原生质体，尤其适 合于未木质化的植物组织细胞原生质体的制备。 1 3 4 在医药行业中的应用 1 3 4 1 植物药的提取 果胶酶用在植物药材提取过程中叮起到浸提辅助剂的作用1 2 ，破坏植物细胞 壁的果胶结构，提高药材有效成分的提取率；也可作为植物药提取液的澄清剂， 加快滤过过程，提高沉淀速度，改善澄清度；还能作为中药材提取后药渣处理再 利用的催化剂1 3 1 ) j 。 1 3 4 2 治疗胃结石 山楂、柿子等食物中含有大量的鞣酸、果胶和树胶。鞣酸具有较强的收敛作 用，在胃酸的作用下可与食物中的蛋白质结合形成不溶于水的鞣酸蛋白沉淀于胃 内。果胶和树胶遇酸即形成凝胶，可将鞣酸蛋门粘合成块，也可与食物残渣聚集 形成巨大的块即胃结石。果胶酶能降解果胶物质，使果胶失去粘性，不能与鞣酸 蛋白粘合，从而使胃结石快速解聚而排出胃腔卜。 1 3 5 其他领域的应用 1 3 5 1 木材防腐 在木材工业中，为延长木材的储藏时间往往需要涂布防腐剂。利用果胶酶制 剂或能产生果胶酶的特异性细菌处理木材，能够破坏木材中含有果胶的纹孔塞和 - 8 第1 罩绪论 具缘纹孔膜，可使其通透性大大增加，增强了防腐剂的防腐效果。“。 1 3 5 2 提高洗涤剂的去污能力 t j 水果和或蔬菜汁形成的污渍特别难以除去，加入果胶酶果胶裂解酶和或果 胶水解酶的沈涤剂，对这些污渍具有良好的去污性能l 、i i 卜引。 1 3 5 3 作为饲料添加剂 动物饲料中含有大量不会被动物吸收消耗的非淀粉多糖、果胶、单宁等物质， 这些物质溶于水就会成胶体状念，将会增大肠道粘度，阻碍营养物质的扩散和吸 收! ；“。果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶等配合，可降解植物细胞壁中果胶和纤 维，促使淀粉、脂类、维生素和蛋白质等释放出来，从而提高了饲料的营养价值i + 。 1 3 5 4 诱导植物抗病 2 0 世纪9 0 年代以来的研究表明，果胶酶及其降解产物果胶寡糖片段具有激 发植物防御反应的能力1 w l ，其中包括诱导植保素的产生、对蛋白酶抑制子的诱导、 乙烯的生成以及对某些防御相关酶的诱导等，从而增强了植物自身的抗病能力卜引。 用果胶酶作为新型生防农药具有对人畜无害，不污染环境，不伤害天敌，病原物 不会产生抗药性，用量低等优点。 1 4 微生物发酵法生产果胶酶的研究 由于动、植物天然来源的果胶酶产量低且提取困难，不能满足生产的需要， 所以果胶酶的工业化生产均采用微生物发酵方法进行。 1 4 1 产果胶酶的微生物 1 4 1 1 真菌果胶酶产生菌 真菌中的果胶酶产生菌有很多，主要包括曲霉属( 彳印p 脚，s ) 、青霉属 ( 胁，cj | ，j “砌、镰孢属( 助s a ，蚴) 、克鲁维氏酵母( 朋叫y p 聊y d p o ，其中曲 霉1 醺：黑柱霉s p e r g ih u sn i g e 卉、米啦霉s p e r g j1 】u so r y z a 亩黄盥霉 ( 、a s p e r g j j 】u sf i a v u s 、) 、b 本盥霉( 、a s p e r g i l l u sj a p o n i c a 由、崔毛海谨a 霉 ( 彳印p 馏j j ，u ss 咖p ) 。其它菌属有：灰霉菌( 肋f 叫f j sc 拍盯p a ) 镰孢菌 黑龙江大学硕士掌位论文 ( 、 ：u s a r j u ms p 凶宣薅。邀矗( 、p e n j c j 1i u ma x i l jj c tj 商u 津0 甄电 毯_ ( 、s a c c h a r o m y c e s f 甜d ，s 砌0 。 i 前研究最多的是黑f | i i 霉，吲内外多川j 作为果胶酶的来源，最适 p i l 值般在酸性范围川f j ；二。 1 4 1 2 细菌果胶酶产生菌 也有许多果胶酶产尘菌是细菌，它们一般属。j 假单孢菌属( 尽p “面砒啪5 ) 黄 单孢菌属( 肋，7z 厅伽，7 a 曲、欧文氏菌属( 正厂砌，国、芽他杆菌属( 毖c ，_ ，_ p 梭 菌属( 口d s f 厂，斫砌等。其中菌利一包括节杆菌( l ，r 力朋铂cr 刚芽孢杆菌( 毖c ，j _ ，“s 曼力短小芽孢杆菌( 矗p 删j ，_ 7 砌等。近年来，一些来源于细菌杆菌属的碱性果胶 酶只益受到重视如浸麻芽孢杆菌( ，肋f 7 h s 所“c p 厂“门5 夕，助c ，_ ，“s 跟刷，9 、 b a c i l l u ss p n t 一3 1 、b a c i l 】u s 、o ，p q 一、：“、8 a c i l lu ss p ，m g c p j 誉丁、等。 目前放线菌产果胶酶的研究报道很少，国内有关报道仅限吴琼等人。 1 4 2 果胶酶的发酵生产 微生物果胶酶的合成需要在果胶质的诱导下产生，因此在果胶酶生产培养基 中一定要添加果胶质；早期研究表明卜”| 叫“，不论是哪种产果胶酶微生物，在培养 基中添加果胶或果胶酶都是提高产酶水平的有效办法。然而，对于工业生产来说， 添加果胶制剂生产果胶酶是不经济的，寻找廉价的果胶替代物能有效的降低果胶 酶生产成本。比如在某些植物组织中含有丰富的果胶，因此可以以富含果胶的废 弃物作为果胶酶合成的诱导物。 果胶酶的发酵生产工艺有固态发酵( s s f ) f 1 1 和液态发酵( s m f ) 删两种类型。 通过比较黑曲霉的两种培养条件得出f 叫：液态发酵所采用的果胶质底物大都是不 同来源的果胶产品；而固态发酵可以采用农业废弃物或农产品加工副产品来作碳 源和果胶酶诱导物。中科院生态环境研究中心生物技术室用甜菜粕作碳源，接种 草酸青霉进行固态发酵，生产酸性和碱性果胶酶及微生物蛋白饲料已取得了成功f 圳。 5 果胶酶高产菌株的选育 产果胶酶的菌种一般可以从腐烂的果蔬以及果园泥土中的微生物中利用果胶 第1 章绪论 为唯一碳源的分离培养基筛选出来。野生菌株的酶活力往往很低，必须对其进行 诱变育种，以期得到酶活较高的菌株。国内外学者在菌种选育方面做了大量工作。 我国学者对果胶酶菌种选育的研究始于上世纪8 0 年代，杨天波r 叫等以碳黑曲霉 ( a c a r b o n a r i u s ) a s p 3 3 9 6 为出发菌株，对孢二f 悬液进行紫外线和高能电了辐射复 合处理，获得产酶能力提高的白色抱子突变株。崔福绵f 6 i 等以亚硝基胍处理黑曲 霉( a n i g e r ) c p 一8 31 ，获得高产果胶酶突变株c p 8 5 2 1 l 。此菌株在无锡酶制剂厂通过 了中试，作为生产菌株进行批量生产。 张应玖等r ；对黑曲霉( a n i g e r ) a s 3 8 8 3 的亚硝基胍诱变，获得j b 5 1 3 变异株， 产酶能力提高近一倍。刘海森等对碳黑曲霉( a c a r b o n a r i u s ) a s p 3 3 9 6 经亚硝基胍 和c 0 6 0 射线获得果胶酶高产突变株。韩北忠将黑曲霉( a n i g e r ) 经紫外线和亚硝 酸诱变，获得2 株果胶酶高产突变株。朱宝成等p 叫采用原生质体诱变方法更加简 洁有效，将制备的碳黑曲霉( a c a r b o n a r i u s ) a s p 3 3 9 6 原生质体装于安培管，以5x 1 0 ”r a d 高能电子辐射，从再生菌株中获得果胶酶酶活提高一倍的变异株。谢必峰 等j 对黑曲霉( a n 追e r ) a s h 1 0 4 经半导体激光辐照获得b 1 菌株，固体发酵酶活可 达2 8 0 0 0 u 儋干曲。张宁欣等l ( j 从土壤分离到具有较强果胶酶分解能力的野生菌株 一3 2 8 ，鉴定为宇佐美曲霉( a u s 锄i i ) ，经紫外线、c 0 6 0 射线和d e s 连续诱变获得 酶活力为出发株1 0 倍且性能稳定的突变株。 进入2 1 世纪以来产果胶酶菌种的选育得到了更大的发展。郭爱莲等2 j 人对野 生菌株z h l 应用紫外线、硫酸二乙酯、亚硝基胍和紫外线复合诱变及氦氖激光等多 次反复诱变，诱变后菌株酶活比原始菌株提高了近3 1 倍。h a d j t a i e bn o o e n ，e t a 产“采用亚硝酸对胁，c ，- ，j 删d c c jr 硼，进行诱变，得到1 株组成突变型菌株 c t l ，该菌株产酶活力远远高于原始菌株，并且不需果胶或其类似物的诱导，降低 了生产成本。朱宏莉i i _ j 等利用氦氖激光诱变原生质体筛选到了一株产果胶酶性能 稳定且酶活明显提高的突变株z h 一2 。其酶作用最适条件为：p h 6 5 ，5 0 ，酶的热 稳定性实验显示，50 保温6 0 m i n 后，酶活力基本不变。张浩森等从富含果胶 质的果园的土壤中筛选出一株高产菌株，产酶最高可达到1 3 9 6 8 u m l 。 随着生物技术的发展，利用基因工程技术进行菌种选育，不仅使菌种的产酶 黑龙江大学硕士学位论文 量f r 较人的提高，而n 能够改变酶的性质，从而缩短从探索研究到应用的时间， 克服了传统育种方法的亩i = 。k l u s k e n eld ，e ta r 通过摧w 1 程构建了】株 产果胶酸裂解酶的菌株，所产的鹃最适温度为9 ( ) ，热稳定性很好，表观解链温 度为1 0 2 5 ，是迄今所知最耐热的果胶酶。 1 6 诱变方法研究现状 1 6 1 物理方法 1 6 1 1 紫外诱变 紫外线照射是一种既简单又有效的诱变方法，嘧啶对紫外的敏感性要大于嘌 呤，嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。紫外线的主要作用是使同链d n a 的 相邻嘧啶之间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，二聚体的出现减弱双键问氢键的 作用，并引起扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。 在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会相对较少。但一旦形成，会妨碍双链的解开， 因而影响的复制和转录，并使细胞死亡。紫外线还能引起缺失、重复、和移码突 变。这些突变可能是紫外线的直接作用、间接作用和系统共同作用的结果。 紫外线作为一种方便有效的诱变手段得到了广泛的应用，邱雁临等m 】以绿色 木霉n 。为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍诱变处理，采用刚果红透明圈法，在含 有制霉菌素浓的平板上挑取h c 值大于n 。的菌株分别在不同温度下进行固态发酵 复筛，得到耐高温高酶活菌株。 1 6 1 2 微波诱变 微波在生物学上的应用主要集中于杀菌、刺激植物种子发芽生长，也可用于 微生物诱变育种。此方法所需的设备简单，方法易行，操作安全，诱变效果较好， 因而在工业微生物育种选育中具有较大的推广价值。 微波诱变的原理是电磁波会对生物体产生两种效应，分别是热效应和非热效 应。所谓热效应是指一定频率和功率的电磁辐射照射在生物体上，引起局部温度 上升，从而引起一些生理生化反应，甚至死亡；非热效应是指在电磁波的作用下， 第1 罩绪论 特别是在低强度、长时f h j 的弱电磁场的作用下，生物体不产生明显的温升，或产 0 i 的温丁i 是相：生物体自身温度自然起伏的范围内，可以忽略其变化，但卸叮以产 生强烈的生物响应，使生物体内产生各种，士理、生化功能盼变化，并表现出频率 和功率的选择性。 1 6 1 3 激光诱变 激光辐射对微生物影响的是光、热、压力和电磁场效应的综合应用，能够引 起细胞d a 或r a ，质粒、染色体畸变效应，酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细 胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发射功能作用都可能 导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异，不同种类的激光辐射生物有 机体，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同。激光以其高亮度、高方向性、高 相干性以及单色性，在微生物育种领域已得到广泛应用。而且，不同种类的激光 辐照微生物，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同，这也给微生物的诱变育种 提供了便利条件。 1 6 1 4 离子束诱变 离子注入兴起于2 0 世纪8 0 年代，最初用在农作物诱变育种当中，但后来发 现在改良微生物方面也表现出良好的应用效果，其特点是损伤轻、突变率高、突 变谱广。离子注入除了能像一般辐射一样引起d n a 链断裂外，还能引起生物分子 原子移位、重组和化合。注入离子可精确控制入射深度和部位，经加速后的离子 具有一定的静止质量，注入生物体后可以使质量、能量和电荷共同作用于生物体， 不同的质量数、电荷数和能量又可以根据需要进行组合，因此，离子注入生物体 后质、能、电的联合作用比其它电离辐射对生物体的作用内容更为丰富和复杂， 特别值得指出的是离子注入与生物体相互作用存在峰值，在峰值范围内，注入离 子与生物体的相互作用是局部的、多重的和不易修复的，因此，离子注入用于诱 变育种有可能在损伤轻的情况下获得较高的突变率和较宽的突变谱。宣云等；矿概 述了离子束在小麦遗传改良中所取得的成果，一般都能获得比较好的诱变效果。 黑龙江大学硕士学位论文 1 6 2 化学方法 化学诱变剂是一类能和d 、a 起作用而改变其结构，并f j | 起d a 变片的物质。 其作用机制郁是| jd 、a 起化学作用，从而引起遗传物质的变异，1 月而诱变效应与 t 理化特性宵很人关系。最常用的化学诱变剂常常足烷化剂，如甲基磺酸乙酯 ( e m s ) 、亚硝基胍( t g ) 、等。它们的诱变机理主要是使d a 中的碱基发牛烷化 作用。其中的亚硝基胍是一种诱变作用特别强的诱变剂，常称为超诱变剂，它可 以使一个群体中任何一个基因的突变率高达1 ，此外它还能诱发邻近位置的基因 同时发生突变，既所谓并发突变，而且特别容易诱发复制叉附近的并发突变。涂 国全等m 剐采用三种不同剂量的e m s 对菌株的孢子进行诱变处理，筛选得出小诺霉 素菌株4 9 一1 2 一j 3 ，较出发菌株发酵能力提高4 0 以上。其中正突变率达4 0 。 1 6 3 复合因子诱变 普遍认为，复合诱变具有协同效应，如果两种或髓种以上诱变剂合理搭配使 用，复合诱变较单一诱变效果要好。李坏l ( 。) l 等使用紫外线和激光复合d 一苯丙氨酸 产生菌得到稳定高产的突变株，沈卫荣等i _ ”i 以黄曲霉为出发菌株，经3 次紫外线、 1 次6 0 c o 、3 次亚硝基胍多重复合诱变处理，选育获得曲酸生产菌，曲酸产量提高 了6 3 。 1 6 4 基因工程方法 随着生物技术的快速发展，先进的基因工程技术也日渐被应用到诱变育种的 生产研究当中。基因工程是利用重组d n a 技术，对生物的基因进行改造和重新组 合，然后导入受体细胞内进行繁殖，使重组基凶在受体细胞内表达，从而产生出 人类所需的基因产物。利用基因工程技术可以很方便地对目的基因进行有目的的 操纵，将目的基因按照人们的意志进行重新定点诱变筛选和重新组合。这种诱变 法有针对性、技术含量高、诱变方向稳定，甚至将不同物种间的基因进行重新组 合。但是前提条件是必须事先知道具体的目的基因，以及成熟的技术路线和手段， 所以传统的诱变育种方法还是有其存在和应用的价值和意义。 第1 章绪论 1 7 果胶酶的分析方法 进行果胶酶的研究不能没有可靠的酶分析定量方法，常用的果胶酶定性定量 分析办法有以下儿种。 ( 1 ) 透明圈法 根扼果胶降解物在高碘酸中的溶解性有差别来定性判断果胶酶是否存在的一 种方法。由于久分子聚合物不溶于酸，果胶酶降解的小分子溶于酸从而在琼脂 培养摹板上形成透明圈。基本方法是：用果胶酶底物、缓冲液、淀粉和琼脂配 成溶液铺板，然后加入少量的酶液，注入一点，反应一段时间后，加入高碘酸，如果 该酶有活性，注入酶的点将出现透明圈。下一步，可以倾出高碘酸溶液，加入硼1 酸钠 溶液，根据淀粉与碘的颜色反应，更易清楚的判明透明圈的存在。该方法对于果胶 酶产生菌的筛选是方便的，而且可以变换底物及p h 等区别不同种类的果胶酶。本 研究所用的刚果红染色法i 引l 是透明圈法的一种改良方法，主要原理是刚果红染料 可与多糖水解物形成有浓郁色泽的复合物，在果胶为唯一炭源的培养基中如果培 养物具有产果胶的能力，就可以形成明显的绛红色水解圈。这一方法效果良好且 果胶用量很少、成本低，是一种较好的筛选方法。 ( 2 ) 果胶酯酶测定方法 果胶酯酶测定方法是根据果胶酯酶的作用方式和产物设计而成的。方法是 采用滴定羧基来评价酶活；方法是根据甲醇的生成，通过气相色谱或液相色谱 仪定量分析甲醇，根掘甲醇的生成量评价酶活，此方法比较精确。 ( 3 ) 电泳转移胶膜法 果胶酶底物聚半乳糖醛酸盐能被特殊染色剂染色，电泳转移胶膜法正是基于 着这一原理。该法适于对电泳分离后的果胶酶活性评价。此法的优点是能检测微 量的果胶水解酶和裂解酶，也可用来筛选产果胶酶菌株，缺点是操作过程较为烦 琐。 ( 4 ) 苹果汁脱胶分析( a j d aa p p 】ej u i c ed e p e c t i n i z i n ga s s a y ) 此方法是由爱尔兰b i o c o n 有限公司推荐并已成为广泛接受的方法。该法根据 黑龙江大学硕士学位论文 果胶物质在未被酶解之前以及在酶解反应的不同时期能在：异内一皇溶剂中形成大小 1 i 等的胶川而判断酶的活性。此法具有简便，省时，能准确地反映出果胶复合酶中 最之柯工业价值的成分的多少等优点。 ( 5 ) 黏度下降法 果胶物质在酶的作用下大分予降解伴随底物溶液黏度下降，黏度下降法以底 物黏度下降的百分比束评价酶活。同a j d a 方法一样，黏度法所测定的酶活性，主要 是反映内切酶和内切裂解酶活，该法实验操作较a j d a 法复杂。 ( 6 ) 还原糖测定法 由果胶酶的作用机理可知，长链果胶分子的糖苷键断裂结果都产生还原端基 _ ：。这些还原端基的牛成量，可用来表示酶活性。于是各种分析还原糖的方法都可 用来设计分析酶。其中最为常用的为d n s 法卜引。 ( 7 ) 果胶裂解酶活性分析 是根据果胶裂解酶具有的特征反应，生成特异底物b 一4 ，5 一不饱和半乳糖醛 酸基而设计的。该方法比直接测量紫外吸收麻烦，且蛋白质沉淀不完全对测定结果 有影响，在紫外分光仪缺乏的条件下，是一种替代方法i _ i j 。 8 本研究的目的和意义 2 0 0 5 年，全世界的工业酶制剂市场己达到2 0 亿美元的销售额2 4 ，果胶酶的 销售份额也大幅度增加，其产量也己跻身世界四大酶制剂行列。 面对如此巨大的需求，动、植物天然来源的果胶酶产量低且提取困难，根本 不能满足生产和实验的需要。微生物因具有生长速度快、生长条件简单、代谢过 程特殊和分布广等特点而成为果胶酶的重要来源。国内外对果胶酶高产菌株的选 育多集中在真菌中的曲霉属，对其他菌属的果胶酶研究较少。 本研究所用菌种h d y m 0 2 是黑龙江大学微生物重点实验室从沤麻液中分离 选育而来，属于蜡状芽孢杆菌属。虽然h d y m 0 2 的初始活性较低和大部分曲霉属 果胶酶产生菌相比不具备优势，但经实验证明，在沤麻液中添加该菌可缩短沤麻 周期，提高出麻率和亚麻纤维质量，并可节约水资源减少环境污染。而且霉菌是 1 6 第1 章绪论 好气性微生物，在氧4e f 二允足时生长易受影响。在纺织品脱胶应用方面的果胶酶 高产菌株的选育应转