（植物学专业论文）寒兰试管成花过程中的生理生化变化.pdf

ab s t r a c t abs tract i n t h i s p a p e r , t h e t e s t - t u b e s e e d l i n g s o f c y m b id i u m k a n r a n ma k i n o w e r e u s e d a s e x p e r i m e n t a l ma t e r i a l t o s t u d y t h e d y n a m i c s c h a n g e s o f c a r b o h y d r a t e , p r o t e i n , i s o e n z y me a n d n u c l e ic a c i d c o n t e n t s i n t h e c o u r s e o f i n v i t r o fl o w e r i n g . t h e r e s u l t s w e r e a s f o l l o w i n g s . t h e r e a r e c l o s e l y r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e c a r b o h y d r a t e c o n t e n t a n d i n v i t r o fl o w e r i n g . t h e fl o w e r i n g w a s p r o m o t e d b y t h e a c c u m u l a t i o n o f n u t r i t i v e ma t e r ia l . t h e c o n t e n t s o f s o l u b l e t o t a l s a c c h a r i n e , s u c r o s e a n d f r u c t o s e i n c r e a s e d f r o m o d t o 4 0 d . t h e y r e a c h e d th e ir p e a k v a l u e a t 4 0 d , 2 1 .4 g g / g .f w , 2 .9 0 g g / g .f w a n d 5 . l g g / g . f w re s p e c t i v e l y , w h i l e d e c l i n e d a ft e r 4 0 d . me t a b o l i s m a n d t r a n s p o rt o f s t a r c h h a s re l a t i o n s h i p w i t h fl o w e r i n g t o o . s t a r c h c o n t e n t g r a d u a l l y i n c r e a s e d f r o m o d t o 2 0 d w i t h r e a c h i n g t h e h i g h e s t v a l u e o f 7 . l g g / g . f w, w h i l e d e c re a s e d t o t h e l o w e s t v a l u e o f 2 . l g g / g . f w f r o m 2 0 d t o 5 0 d , r o s e t o 4 .印g / g . f w f r o m 5 0 d t o 8 0 d . p r o t e i n me t a b o l i s m w a s r e l a t e d t o t h e p r o c e s s o f fl o w e r f o r m a t i o n . t h e c o n t e n t o f s o l u b l e p r o te in d e c lin e d f r o m o d to 2 0 d , b u t ra p id ly ro s e to its p e a k v a lu e o f 2 .9 0 m g / g .f w fr o m 2 0 d t o 5 0 d , t h e n d r o p a ft e r t h a t . i n s o l u b l e p r o t e i n i n c r e a s e d t o t h e h i g h e s t v a l u e o f 1 .7 8 m g / g .f w fr o m o d to 3 0 d . t h e c o n te n t o f to ta l p r o t e in h a d n o o b v io u s c h a n g e fr o m o d t o 2 0 d , b u t i n c rea s e d t o i t s p e a k p o i n t o f 4 .6 m g / g . f w f r o m 2 0 d t o 5 0 d , r a p i d l y d e c re a s e d t o t h e l o w e s t p o i n t o f 4 .o m g / g . f w a t 7 0 d . n u c l e i c a c i d m e t a b o l i s m p re p a re d fo r in v itr o fl o w e r in g . t h e c o n t e n t o f d n a in c r e as e d b y 8 % fr o m 2 0 d t o 3 0 d , w h i l e t h e c o n t e n t o f r n a a n d t h e r a t i o o f r n a / d n a r e a c h e d t o i t s p e a k p o i n t o f 6 . 5 6 mg / g . f w a n d 1 5 . 3 f r o m o d t o 4 0 d , w h i c h w e re 1 0 d e a r l i e r t h a n t h a t o f s o l u b l e p r o t e i n , d r o p t a ft e r 4 0 d . t w o n e w s o l u b l e p r o t e i n b a n d s , 16k) a t 2 0 d a n d 6 5 k d a t 4 0 d , w e r e d e te c te d in s d s - p a g e p a tt e rn . t h e y w e re s p e c ia l p r o te in s in th e c o u r s e o f fl o w e r in g b u d in d u c tio n . p o d a n d e s t h a d r e l a tio n s h ip w ith t h e p r o c e s s o f fl o w e r i n g b u d f o r m i n g . p o d s a n d p o d 4 o n l y a p p e a r e d f r o m 2 0 d t o 5 0 d , p o d 6 d i s a p p e a r e d f r o m 6 0 d t o 8 0 d , e s t 4 w e a k e n e d a t 8 0 d , a n d e s t 5 w e a k e n e d fr o m 6 0 d t o 8 0 d . t h e re l a t i o n s h i p b e t w e e n c a t a n d md h a n d i n v i t r o fl o w e r i n g w a s n o t a b s tr a c t o b v i o us . k e y w o r d s : c y m b i d i u m i s o z y m e ; n u c l e i c a c i d ma k i n o ;i n v i t r o fl o w e r i n g ; c a r b o h y d r a t e ; p r o t e i n ; i i i 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含 其 他 人已 经发 表 或 撰写 过的 研究 成 果， 也 不包 含为 通 过 获 得 一 鱼a 一 jk 同查 或 其他教育机构的 学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的 同志对本研究所 做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文者签一舟争 一卿 2a-fl 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了 解南昌大管有关保留、 使 用学位论文的 规定， 有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅 和借阅。 本人授权南昌大学可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索， 可以 采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作“ 名 (手 褚 畔 导师签名 ( 手写) : 签 字 日 期 :卿年 子 月 ;r 日 签字 日期 :卿 年 子月 4日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址 : 电话: 邮编 第1 章 引言 第 1 章 引言 寒兰 ( c y m b i d i u m k a n r a n m a k i n o ) ，兰科兰属中的地生兰，生长在 海拔 4 0 0 m - 2 4 0 0 m之间，主要分 布在江西、台湾、 福建、 浙江、 湖南、广东、 广西 和四 川 等地，也 见于日 本和朝鲜半岛 南 端i l l . 寒兰的 营养繁殖为 分株繁殖， 是 传统繁殖方式，然而其繁殖系数极低;通过种子萌发来繁殖为有性繁殖，但是 寒兰种子极小，没有胚乳，只有一个发育不完全的胚，种皮致密有蜡质，并且 可能含有抑制物，因此，自 然条件下极难萌发。 自 从1 9 6 0 年法国g m o r e l 开创了 兰花茎尖组织培养法以来，全世界己 有 7 0 多属、 数百种和更多品种的兰花通过组织培养获得成功. 绝大多数具有 观赏 价值和商业价值的洋兰相继走上了工厂化生产。国兰中的墨兰、建兰、 春兰、 蕙兰、寒兰也都建立了相应的无性快速繁殖体系。 第一次关于试管开花的报道是 1 9 4 6年我国学者罗士韦在培养冤丝子茎尖 时发现有花的形成，从而导致了人们利用组织培养技术诱导花芽形成的研究。 目 前己 有叶子花、青篙、矮牵牛、烟草、石竹、印度蓝茉莉、何氏凤仙及竹子 等植物诱导试管内成花获得成功，有的还获得了有效的试管种子，并正在对一 些引起植物试管成花的因子及开花模式进行深入研究。近年来，有关兰花试管 成花的研究己有不少的报道，并且在建兰、 春兰、石解兰、文心兰和蝴蝶兰中 获得成功。目 前试管成花研究中还存在不少问题，比如由于开花过程本身以 及 花分化启动、花原基与花器官原基形成过程中影响因子的复杂性，很难对开花 过程进行全面监控，而只能以某一阶段的试验结果作为衡量标准，这就为 探讨 开花机理增加了难度。 植物开花是一个高度复杂而且复合的、在一定遗传背景控制下的生理生 化 及形态发生过程，表现为植物接受环境条件诱导，经过一系列信号传导过 程， 启动开花决定过程中的控制基因，并在诸多关键基因的相互作用以及诸多 代谢 途径的相互制约下，引起花芽分化， 进而导致器官发生。但究竟这些基因的表 达调控如何进行还是一个未知的领域。 通过拟南芥和金鱼草突变体的研究， 人 们对花的顶端及花的形态建成有了相当的认识，但对植物由 营养分生组织转向 生殖分生组织的机理认识还是很少。在顶端分生组织接受开花诱导机理方面也 第 1 章 引言 还是一个黑匣子。 研究表明，植物离体成花规律与整体成花规律是基本相似的，而组织培养 具有研究材 料来源单一， 无 性系 ( 克隆) 遗传背 景一致: 经济方便，效 率高; 条件可控，误差小:生长快，周期短;可进行周年试验或生产等优点，因此被 大量用于成花研究。组织培养和细胞培养体系己成为研究植物形态变化、生理 生化反应和进行遗传改良的良好载体，并且将越来越成为一个不可缺少的研究 手段，因此，利用一个已 经建立的稳定的高效的离体培养系统和诱导试管成花 的程序，来研究其成花过程中生理生化及其形态建成，探讨试管成花的机理， 是十分有效的方法。 本研究以寒兰试管苗为实验材料， 研究其成花过程中碳水化合物、 蛋白 质、 同工酶以 及核酸的动态变化， 探讨这些生理生化变化与试管成花的关系，为离 体成花机理研究提供基础资料。 第2 章 文献综述 第2 章 文献综述 兰科植物约有8 0 0 属， 2 .5 万一3 .0 万种d 1 。 兰花是 整个兰科植物的 总 称， 根据原产地可分为国兰和洋兰，国 兰一般是指兰科兰属 ( c y m b i d i u m ) 中的 地生 兰， 常见的 种 有: 春兰 ( c . g o g e r i n g i i ) , 蕙兰 ( c . f a b e r i ) 、 建兰 ( c . e n s if o l i u m ) , 寒兰( c k a n r a n ) , 墨 兰( c . s i n e n s e ) 、 莲 瓣兰( c l i a n p a n ) 、 春剑 ( c . g o e r i n g i i v a r . l o n g i b r a c t e a t u m ) 等。 洋兰 一般是附生兰， 大多 是 杂交种， 花大色艳， 具有 极高的观赏价值和经济价值， 但无香味， 常见的有: 卡特兰属( c a t t l e y a ) 、 兜兰 ( p a p h i o p e d i l u m ) 、 石解属 田e n d r o b i u m ) , 蝴蝶兰属 ( p h a l a e a n o p s i s ) 、 文 心 兰属 ( o n c i d i u m ) 、 万代 兰属( v a n d a ) 等。 试管成花是指用组织培养的方法，使植物的成花过程在培养容器中完成。 最早研究兰花试管成花的是法国的j u l i e n c o s t a n t i n ，他在研究中发现兰花在缺少 菌根时可以 促进成花:随后，美国康奈尔大学植物生理专家l e w i s k n u d s o n 研究 了 l a e l io c a t t l e y a( 卡特兰属c a t t l e y a x 蕾丽兰属 l a e l i a ) 的试管成花， 是首次报 道的兰花试管成花植物。到目 前为止，能够诱导试管成花的兰科植物有:建 兰( c . e n s if o l i u m ) 12 - 8 1 、 春 兰( c . g o e r in g it) 19 3 ; 2 )d o r ie ll a 变 种( 五 唇 兰 属 d o r i t i s 和克 格 兰 属 k i n g ie ll a 的 人 工 杂 交 种 ) 1 0 11 1 1 1 ; 文 心 兰 属( o . v a r io s u m ) 2 3 . 蝴 蝶 兰属( p h a la e n o p s is ) 杂 交 种 10 ,1 1 ,13 1 : 石 解 属( d e n d r o b iu m ) 中 d . s o n i a 114 1 , d . t h o n g -i n 115 1 , d . c a n d id u m 116 11171 , d . m a d a m e n o n g -i n 118 1 ; ) c . n iv e o - m a r g in a t u m 1 19 1 ; 大 根 兰( c . n ip p o n i c u m ) 12 0 3 ; 扇 叶 兰 属( p s y g o n o r c h is p u s i l la ) 12 11 0 成花是一个高度复杂的综合的生物学过程，需要一定的遗传背景，一定的 生理生化状态，在受内外环境因子的诱导下，经过信号传导，启动成花过程中 的诱导基因及相关结构基因，引起花芽分化，进而产生花器宫。通过研究各种 因子对试管成花过程的影响，从而阐明其调控机理。这些影响因子主要有:光 周期、温度、植物生长调节剂、营养条件及开花相关基因等。本文主要就这些 领域的研究进展加以综述。 2 . 1 兰花试管成花研究进展 第 2 章 文献综述 2 . 1 . 1光周期 d i c h e n s 等 2 2 1和a l ta m u r a 等 2 3 1认 为日 长( 适 宜 的 光 周 期 ) 影 响 许 多 种 植 物 的 试管成花。 a r d i t i 2 4 认为一 些兰花具有光周期， 适宜的 光周期会诱 导 这些植物 成花。光周期对兰花试管成花的影响还因其光周期反应类型而不同，长1 1 照兰 花对日 长要求有一最低极限日 照， 低于这个极限日 照则不能开花。 贾勇 炯等门 报道将彩心建 兰 ( c . e n s if o l i u m ) 花枝 茎节 接种在同 一 培养 基 上分别置于 连续光 照和黑暗条件培养，待3周后，外植体开始膨大，不同的是，在连续光照下的 颜色呈浅绿色，而黑暗条件下处理的颜色要淡些，呈浅白色;培养 6周后，在 连续照明下的陆续开始启动， 花茎节上开始长出小突起， 逐渐长成新芽 ， 若是花 芽，伸长迅速，一周左右可形成花蕾，并很快开花.相反短日 照兰花要求有一 个最高的极限日 照， 它 们不能 在高于这个日 照时间 下开 花。 a n a p a u l a a . v a z 等2 1 1 证实p . p u s i l l a 花原基形成的数量与光照时间成正关系， 即光照时间 长， 形成的 花芽的数目则多，然而当光照时间超过 2 0 h ，成花和花的发育则会受到抑制。 朱国 兵 等(2 5 1发 现 寒 兰( c k a n r a n ) 在 光 照时间 从8 h增 加到1 6 h时， 8 h的 花芽 诱导率最高，达4 1 .6 7 %, 随着光照时间的增长，花芽诱导率先是降低而后又升 高，其中 1 4 h处理诱导率最低，仅为 1 2 . 9 0 %;当光照时间为 1 6 h时，花芽诱 导率有所升高， 达2 8 .2 6 %，但所有花蕾都不开花。 a r d i t i j . 2 4 14r道， 在很多 试管成 花的属， 种间、 种内 杂交种里， 如石解属 ( d e ndr o b i u m ) , l a e l i o c a t t l e y a( 卡特兰属c a t t l e y a x蕾丽兰属l a e l i a ) , 蝴蝶兰 属 ( p h a la e n o p s i s ) 具有光周期 现象， 它们无论是实生苗 还是组培苗， 在不同的 条件下，都有试管成花的现象，这表明它们对光周期无特定要求:此外， a r d i t i 7 . 等 2 6 1 认为全球范围内， 数以 百万计的实生苗和组培苗 生长 在不同的光照和光 周期环境下，如果适宜的光周期可以 诱导成花，依次可推得，很多实生苗和组 培苗将会在试管成花。但这只是一种假设，目前对兰花光周期的研究资料还很 少，还不足以说明光周期不是花芽诱导的主要因子，即使有些兰花对光周期不 敏感，也可能它们是属于日中性植物。 2 . 1 . 2温度 温度是调控植物由营养生长向生殖生长转变的主要因子之一。大量事实表 明，不同植物的成花各自有其一定温度范围的要求。通常温度过低或过高都会 第2 章 文献综述 抑制花的分化与发育。但有些植物则需要在一定时期内接受某种程度的低温或 高 温诱 导才能 成花， 由 此看来 温度对 成花的 影响是非常复杂 的。 a r d i t i 12 7 112 8 1报道 同 一种的 c a t t l e y a杂种兰花， 诱导其成花的光周期反应会因 温度变化的影响而 表现不同。 低温对兰 花 试管成花的 影响因种的 不同 而表现不同。 陈发兴等【2 9 1 报 道短日 照和低 温可刺 激 卡 特兰等开 花; 蝴蝶兰 ( p h a l . s p . ) 在温度低于2 3 1c ， 其 花芽分化才能启动， 高于2 3 时， 花芽分化便被抑制; 石解兰 ( d e n d ro b i u m ) 在 温度低于1 3 时， 可受到刺激而启动生殖生长， 高于1 3 时则维持营养生长， 同时生殖生长被抑制。温度对实生苗和组培苗试管成花的作用也是不一样的， y a n e t i l3 o 1 和a s h m o re 3 11 认 为即 使春化 诱 导a r e t h u s a和布 袋 兰( c a ly p s o b u t b o s a ) 的实生苗成花，但是低温诱导其组培苗试管成花的可能性很小。另外，并不是 所有能 试管成花的 兰 花， 都要经过 一 个低温作用， d u a n l3 2 报道， 在已 经成功诱 导 试管成 花的 许多 属 ( a r e t h u s a . c a ly p s o . c y m b i d i u r n . d e n d r o b i u m . o n c i d i u m . p h a l a e n o p s i s 和s a r c o c h i l u s ) 具有 温周期的种中， 它们通常 持续培养 在高 温条件 下，即无低温的诱导作用。 2 . 1 .3植物生长调节剂 影响植物开花的主要环境因子如光周期，温度和水的供给等，很大程度均 是通过影响植物的内源激素及同化产物的合成和流向而发生作用.在研究试管 成花过程中，植物生长调节剂起着至关重要的作用。 2 . 1 .3 . 1 细胞分裂素 王 光 远 等 11 7 1在 对 铁 皮 石 解( d . c a n d id u m ) ， 王 熊 13 1在 对 秋 兰( c . e n s if o l i u m ) 研究中 发 现， 当培 养基中 添加 b a时， 可诱导植株成花. 朱国 兵等 12 5 1 在对寒 兰 ( c . k a n r a n ) 的试管成花研究中发 现随着 6 - b a浓度的 提高其花芽的诱导率 呈抛物 线 状变化， 当6 - b a浓度超过2 . o m g / l 时， 花芽的 诱导 率达 最高。 d u a n 和 y a z a w a ll o l 研究d o r i e lla 7 -r n y( 伍 唇兰属d o r i t is p u lc h e r r i m a x k i n g t e l l a p h i l ip p in e n s is ) 的 试管 成 花时， 发 现在 在 无糖的、 a c in 另外把经过 6 - b a诱导带花芽的植株 继代培 养在含6 - b a的v a c i n 在寒兰的 试管成 花诱导中， t d z的 诱导花芽 形成的效果上要比6 - b a 好，但正常的开花率低于6 - b a. 2 . 1 .3 .2生长素、赤霉素 生长素 n a a本身不诱导成花，单独使用不能促使花芽的形成，然而通过 与细胞分裂素 6 - b a的配合使用，则可以 促进花芽的形成2 5 。 王熊3 1将经诱导 的建 兰( c . e n s if o i u m ) 小苗再转入含浓度为2 .5 m 创l的n a a的培 养基中 生 长 ， 出 现 畸 形 花 或 花 芽 枯 萎 死 亡 。 k o s t e n y u k 3 3 1在c . n iv e o - m a r g in a t u m试管 成 花研究中也发现， n a a本身不诱导成花， 而生长素抑制剂2 , 3 , 5 一 三碘苯甲酸抑 制成花， 高浓度的。 a 3 延缓成花， 多效哇 ( 抗g a 。 剂) 完全抑制细胞分裂素或 根修剪对诱导成花的作用。 2 . 1 . 3 . 3 ab a、乙烯 兰花在离体条件下， a b a对花芽诱导有明显影响， 经过适当的浓度及合适 的时间预处理， 再转入含有 6 - b a的培养基上， 对花芽诱导有促进作用;同时 研究发 现， 如果 先将铁皮石解原 球茎在加有0 .51 . 5 m 留l a b a的 培养 基上培 养1 5 - 2 0 d ， 再转到含6 - b a的m s培养基上， 可以得到很高的成花率， 平均达 8 2 .8 %，说明 a b a的增加在成花诱导的早期阶段中 可能起重要的作用1 1 7 1 。 用 a b a和乙 烯处理石解 属 ( d e n d r o b i u m ) 和文心兰属 ( o n c i d i u 间， 加速了 营养生 长向生殖生长的转变， 可在培养实生苗的容器中， 测得乙烯含量的增加。 因此， 在某些情况下，可能是乙烯诱导植株试管成花。 第2 章 文献综述 2 . 1 . 4营养水平 糖诱导开花具有普遍性， 糖源及糖浓度的不同其诱导效果不同。在对秋兰 ( c . e n s 如l o i u m ) 的 研究中发现，改变搪源， 提高激素浓度能使根状茎上的营养 芽变成花芽 ;在铁 皮 石 解 ( d . c a n d i d u m ) 离体成 花研究中 发 现， 培养基中加入 葡萄 糖， 可 使花芽 形 成 的时间 提 早， 成 花率 增 加 1 1 6 11 1 7 ) . d u , , 和y a z a w a l o l研究 d o r i e l l a t i n y时， 在不 含6 - b a培养基中加入2 5 留l 的 蔗糖， 不能诱导 花芽 形 成: 在含6 - b a的 培养 基中，当 搪浓度为1 卿l 或8 叼l 时， 大多 植株仍无花 芽形成， 表明6 - b a诱导花芽形成时，糖浓度的大小是重要影响因子。朱国 兵 等2 5 1在寒 兰试管 成 花 研究中发 现，当6 - b a的浓度一定 时， 蔗 糖的 浓度是影响 花芽诱导率和能否正常开花的重要因子， 当蔗糖浓度逐渐升高到4 .5 % 过程中， 花芽诱导率也不断提高，但随着蔗糖浓度的进一步地提高，其花芽诱导率反而 下降，并且难以顺利开花，这很可能是由于蔗糖浓度太大而使得培养基中的渗 透压太高，从而不利于植株的生殖生长发育。 n h 4 / n 0 3 的比 值， 营养成分 的 浓度( 高 盐的m s 与 低盐的v a c i n 而当 b a浓度不变， 而总 氮量降低 至1 / 2 0 , 磷的 含 量增加到 5倍，并进行根修剪共同使用时，成花率可高达 9 7 .5 %;但单独调节 氮，磷的含量，或只进行根修剪，其诱导成花的作用不明显， 这表明植株的营 养条件在很大程度上影响着 6 - b a对成花作用的敏感 性。朱国兵等2 5 1 在研究 6 - b a ， 含氮量和蔗 搪 浓 度对寒兰( c . k a n r a n ) 试管成花的 结果 表明 ， 当6 - b a为 2 .o m g / l . 蔗搪为3 . 5 % . 氮浓度 不变时， 花芽的诱导率最高， 达到7 6 .0 %. 2 . 1 . 5附加物 附加物对兰花的成花作用因成分不同而不同。将椰子汁、 香蕉汁、西红柿 汁等附加成分 ( 可 能 含有生长调 节物质) 分别 加入到培养基中， 小苗试管成 花 均无明 显提高 3 4 1 。 赖氨 酸3 5 1 、 六 氢毗陡梭酸3 6 和高 铁氰 化物3 7 1 等能 促进浮萍 属 ( l e m n a ) 一 些种 成 花 ， 但 这 些 物 质 不 能诱 导c . n i v e a - m a rg i n a t u m 成花 3 3 。 王 光 远 刀 在培养基中 分别加入亚精胺、腐胺和精胺，发现它们对铁皮石解 ( d . 第 2 章 文献综述 离体成花都有促进作用，亚精胺效果最好。 2 . 1 .6根的影响 根对花芽分化有抑制作用。多数试管成花实验中发现，植株根系的发育状 况对花芽的诱导具有影响作用，有根的小植株作为一个完整的植物体，由于其 自 身的调节作用， 对外源激素处理的敏感性显然比原 球茎和无根小苗要低【 ， 刀 。 k o s t e n y u k 1在c . n iv e 。 一 m a r g in a t u m试管 成 花 研 究 中 发 现 ， 当 修 剪 根， 并结 合 调整 6 - b a ,磷和氮的浓度时，在 9 0 d内，几乎 1 0 0 % 的植株成花;不修剪根 时，成花率明显下降:而单独使用根修剪时有诱导成花的作用 ( 尽管诱导率很 低) ， 推测可能是与根部释放的信号物质与抑制成花有关， 或者与改变了 根部合 成细胞分裂素的量有关。 2 . 1 . 7与兰花开花有关的基因 2 . 1 7 . 1 l f y基因 l f y 基因 具 有促进植物提早开花的作用3 8 1 13 9 1 。 邵寒 霜等 4 0 1 采用微弹 轰击法， 用花分生组织决定基因l f y 与单子叶植物的u b i 启动子构建了一个适合在单子 叶植物中 高效 表达的 含有l f y c d n a 的 表达载体 ( p b i l - 1 ) ， 转化文心兰， 获得了 一些卡那霉素抗性克隆，但未见有提早开花的报道。 2 . 1 .7 .2 d o h i 墓因 d o h 1 是 通过控制 s a m ( m u l t i p l e s h o o t a p i c a l m e r s t e m ， 多 枝顶端分生 组织 ) 和茎结构的形成与发育来维持兰花的基本结构。在兰花植物中，d o h 1的过量 表达可完全抑制茎的形成和发育，转基因兰花植物在表达反义d o h i的m r n a 时，会产生大量的茎顶端分生组织，并使开花提前;在花转化时期抑制s ma 中 d o h i的表达是必需的，而且d o h i 可能是 d o m a d s 1 上游的一个调节子14 0 2 . 1 . 7 . 3 d o ma d s i 基因 兰花的 花同 源异型基因d o m a d s 1是在石解兰( d e n d ro b i u m g r e x m a d a m e 第z 章 文献综述 t h o n g - 1 n ) 的 花转型时期仅在 过渡的茎 顶端分生 组织表达的 一个标记基因， 除了 在茎中微弱表达外，在其它营养组织中检侧不到，它在花序分生组织和花原基 中转录， 最后几乎在所有的花器官中表达，它在调节兰花花期中起着重要作用 4 2 1 4 3 1 2 . 1 . 7 .4 o ma d s基因 h s u 和 y a n g 4 4 )从 文 心 兰( o n c id iu m g o w e r r a m s e y ) 中 分 离 得 到了 花 发 育 a b c 模型中的b 族基因o m a d s 3的c d n a 序列，o m a d s 3 的表达在所有的花器 官和营养叶中均能够检测到， 它和a 族基因具有相同的调控花器官形成和花发生 的功能。 h s u 等 4 5 1 在文 心兰中克 隆了 a g l 6 - l i k e 基因 o m a d s i ， 将其在拟南芥中 进行 异位表达后，转基因植物都呈现出植株体积变小、开花显著提早和无限花序失 去等特征。 2 . 1 . 7 . 5 p e ma d s 基因 t s a i 等 4 6 1 从 蝴 蝶 兰( p h a la e n o p s is e q u e s tr is ) 中 分 离 鉴定 得 到 4 个 b 功 能 基 因 ， 包括p c m a d s 2 . p e m a d s 3 , p e m a d s 4和p e m a d s 5 ，它们在植物体内 表达的 部位各不相同。 p e ma d s 2主要在粤片、 花瓣中表达; p e m a d s 3则主要在花瓣、 唇瓣中表达， 但两者在蕊柱中均有少量表达; p e m a d s 4只在唇瓣和蕊柱中表达; p e ma d s 5主要在花瓣中表达， 但在曹片、 唇瓣和蕊柱中也有少量表达。 它们可 能在兰花形态建成中具有不同的作用。 t s a i 等14 6 1 从蝴蝶兰中分离得到p e m a d s 6基因， 它在花曹、 花瓣、 唇瓣和花 柱中表达并且参与它们的发育; 进一步的研究还发现p e ma d s 6不仅仅是花器官 的特异基因，并且在兰花的寿命和子房发育中也起功能作用。 2 . 1 . 7 . 6 p h a l - a c s 基因 b u i 等 4 7 和h o 等 4 s 在 蝴蝶兰中 克隆到了 3 个1 - 氨 环丙基 小羚酸合成酶 基因 ( p h a l - a c s 1 , p h a l - a c s 2 , p h a l - a c s 3 ) ， 这3 种基因主要是在兰花不同的时期调节 乙烯合成，在蝴蝶兰授粉后的子房发育中起着重要的作用，有改变兰花花期的 第2 章 文献综述 潜力。 综上所述， 兰花试管成花的研究还主要集中在光周期、 温度、 植物生长物质 和营养条件等方面，对有关兰花开花基因还知之甚少，随着现代分子生物学技 术的快速发展，将这些开花基因进行克隆，然后转入试管兰花中，建立高效的 转化系统，是以后研究的主要方向，其成果必将大大促 进兰花试管成花的研究 进展。 2 . 2植物成花过程中的生理生化变化 植物从营养生长转变为生殖生长，需要将外界环境刺激转化成植物的生理 生化变化及基因表达的变化。 长期以来， 人们对植物成花过程中的碳水化合物、 蛋白质、同工酶、激素和核酸代谢等方面进行了大量研究。 2 .2 . 1碳水化合物的动态变化 2 0 世纪初就有人提出碳水化合物的分配在控制开花中的作用， 并提出了许 多假说。后来出现了 “ 成花素”等概念，人们认为同化物只是为花的发生提供 能量， 起着辅助的作用。 但后来的研究发现，糖类不仅仅是能量的供应者， 而 且直接参与花发生的调节过程， 高的c i n己被认为是许多植物成花转变过程的 主要决定因素之一。 陈 志 金 15 0 1发 现 可 溶 性 糖总 体 水 平 高 有 利 于 卡 特 兰 成 花 . t z a y - f a 等 15 1 1研 究 发现，春化处理可以使萝卜 的抽墓开花提早，己经完成春化的与未完成春化或 脱春化的萝 卜 植株相比， 其总糖及非还原性糖的含量均比 后两者高，认为春化 植株中的高糖水平导致了 萝卜 植株花芽分化提早。 将拟南芥品种 “ l e t ”顶芽置 于含有蔗搪的 基质中暗培养， 其叶片数与在长日 条件下生 长的相同 15 2 1蔗糖对 l e i d o n和 s t o c k h o l m等需要春化才能开花的拟南芥品种的开花方面有很大的促 进作用。为了明确单独施用蔗糖对开花的促进作用是否存在普遍性，研究者对 迟开花的拟南芥突变体生态型施用蔗糖，以 避免这些生态型由于存在显性等位 基因 通常 所赋 予的 开花抑 制， 结果 蔗糖加速f v e , f p a , f c a , c o和g i 突 变体开 花 ， 但不 能 加 速 夕 和fi v a 突 变 体 开 花 15 2 1 。 这 些 结 果 可 能 意 味 着f v e , f p a , f c a , c o和g i 是在营养茎尖蔗糖可利用性控制点的上游过程或与控制点相分离的过 第2 章 文献综述 程起作用，而f t 和f w a则在控制点下游过程起作用。 研究发现，过量表达蔗糖磷酸合成酶的转基因番茄与非转基因番茄相比， 其蔗 糖 合成能 力提高，开 花提前5 3 1 。 桂 竹香 在春化期间， 顶芽可溶 性糖水平增 加 5 4 1 研究表明碳水化合物的代谢过程与开花相关，但其机理还不是很清楚。拟 南芥 至少 有5 个 ( a 心1 , c a m l .梦 ， p g m和s e x l ) 突变 体在淀粉的 合成、 储存 和代谢方式上存在差异， 它们在一定的条件下都会延迟开花。 c a m l 和g i 突变体 的开花时间不受光周期影响，所以这两个基因都有可能在光周期促进途径中 起 作 用 5 5 1 p g m 和s e x l 突 变 体 在 短日 条 件 下 延 迟 开 花 ， 但 这几 个 突 变 体 经 过 低 温 处理后都可提前开花，故而认为春化并不依赖于正常的淀粉代谢作用” 6 1 l e j e n n e 等 5 7 1研 究 发 现， 在 长日 照 条 件 下， 拟 南 芥 淀 粉合 成 缺陷 型 突 变 体 的 开花时间比在短日 照条件下提前，且从叶片中输出的碳水化合物也比后者高许 多， 输出时间提前，而在短日 照条件下其碳水化合物的输出并不增加，说明 碳 水化合物在花芽形成的过程中有很大作用。 在大量工作基础上， 人们提出成花诱导的营养分配学说，该学说认为生殖 器官发育比营养生长需要更多的能量，在成花诱导条件下，不论什么环境因子 ( 如各种激素) 都是 通过改 变植物体内的 “ 源一 库” 关系， 从而使茎尖获得比 非诱导 条件下更有利的同化物供应。这就是说，碳水化合物在成花转变中起着重要的 作用f5 8 1 但是，碳水化合物的变化究竟是成花转变的原因，还是环境改变的结果? 人们试图用拟南芥突变体的研究来解决这个问题。研究发现长日植物拟南芥有 两 种突 变体， p g m t c 7 5是 质体葡萄 糖磷酸变位酶缺陷 型突变体， s o p t c 2 6 t突 变体的 淀粉降解过程有缺陷，它们的生 长和开花时间在 连续光照下与野生型没 有明显差异;但是随着日 长的缩短，与野生型相比，它们的生长变缓，开花延 迟，而这两种突变体之间几乎无区别，这说明生长减缓和延迟开花可能是由于 淀粉不能 动用所致5 9 1 。 从 而认为， 碳水 化合物的变化 很可能是成花转变的原 因， 而不是结果。 蔗搪作为植物中最常见的碳水化合物， 在成花过程中可能不是 ( 或不仅是) 作为能量供应物，而是作为一种信号物质发挥作用的。属于长日照植物的白芥 ( s i n a p i s a l b a ) 经一个短日 照处理后，即使光强提高到正常的2 . 5 倍，植物也不 能开花。 但是， 这一处理导致茎尖分生组织的糖水平和酸性转化酶活性的提高， 第2 章 文献综述 并 发 生类似 于成花转变的 典型超微结 构变化6 0 1 ， 这些 现象被认为是由 于光合 作 用和同化物利用增加的结果。并且，因茎尖蔗糖水平的增加先于细胞分裂活动 的增加，而细胞分裂活动的增加是成花转变的重要事件，所以蔗糖可能是作为 一 种成 花 信号 作 用于 茎 尖的6 11 成花 转变 过程中 茎 尖蔗糖等碳水 化合物的来源也是人们关注的 焦点。 i4 c 仇 标记实验表明，在诱导白芥植物时，最新合成的同化物向顶芽的供应量没有发 生 变化。 玻罗 尼亚属植物b o r o n i a m e g a s t i g m a 转移至低温条件下2 d 内 淀粉浓 度 增加， 并且这种高浓度淀粉可保持 1 0 周， 随后花芽开始发育， 淀粉含量也下降。 金光菊 ( r u d b e c k i a b ic o l o r ) 在经1 - 2 个长日 诱导后顶端游离糖含量增加， 而髓 区的淀粉含量下降。很显然，茎尖早期积累的蔗糖可能是来自 叶或茎中，而不 是 来自 光 合 作 用 15 7 1 2 . 2 .2蛋白质的动态变化 奥岩松等【6 2 1 通过对3 个不同抽墓期 类型大白 菜品种在不同发育时期体内 可 溶性蛋白质种类和水平变化的研究发现，大白菜体内可溶性蛋白质含量在花芽 分化开始时达到最高，在整个花芽分化过程中还出 现了一些新蛋白质，这些特 异蛋白质的出现往往与发育阶段的转变有着直接的关系。 此外， 该研究还发现， 抽蔓性越晚的大白菜品种其可溶性蛋白 质水平越低。植物体内可溶性蛋白质的 种类和水平是基因表达的结果，核酸操纵的功能性蛋白质代谢可反映出其基因 特性。 t a n a k a 等 4 9 1 认为 卡 特兰花诱导前 期蛋白 质积累 和含量高， 伴随花诱导 的 蛋 白 质能够降解可能是成花机制所必需的过程。李秀珍等6 3 1 在研究冬小麦春化过 程中可溶性蛋白质组成的变化与形态发生的关系时发现，未经低温处理的春小 麦幼芽的可溶性蛋白 质含量最高，随后逐步降低，至低温处理2 1 d 基本趋于恒 定，并认为这种现象可能与春小麦对低温的适应过程有关。冬小麦幼芽在低温 的作用下其可溶性蛋白质含量的变化与春小麦不同，处理 1 4 d时含量最高，以 后迅速下降， 2 8 d时接近于未经春化的水平， 3 5 d 时又有所上升。 春化中期可溶 性蛋白质含量的提高，可能是植株生理状态转变的原因之一。用聚丙烯酞胺凝 胶电 泳检验可溶性蛋白质谱带的变化表明， 经低温处 理7 d 的冬小麦幼芽中 有一 新带出现，其分子量为2 1 k d ;低温处理延长至 1 4 d ，出现了另外两条新的蛋白 第z 章 文献综述 质带，其分子量分别为5 l k d和 1 7 k d，其中5 l k d的新蛋白质带相对含量变化 不明显，而两种小分子量的蛋白质随着低温处理时间的延长其相对含量逐渐增 加。 陶月良 等1 6 4 1 在对黄瓜花原基启动时细胞及其组织化学的研究发现， 在花芽 分化过程中r n a和蛋白质的含量明显增加， 说明花原基启动过程中转录和翻译 水平增加。 一般认为， 高的r n a / d n a比值对由营养生长向生殖生长的转变有 重要意义， 其生理意义可能与花原基形成所需要的特异性m r n a大量转录以及 蛋白 质 ( 特别是酶) 的合成有关。类似的 研究也表明，在花芽分化过程中，植 株生 长 点 可溶性蛋白 质的 含量与种类均发生了 变化16 5 - 6