（动物学专业论文）鳞翅目昆虫细胞系的dna指纹图谱法鉴定及对sfamnpv敏感性的测定.pdf

博士学位论文 d o ( d r a ld i s s e r r i o n 摘要 细胞系的生物学特性研究对于细胞库的建立和生物制药是非常重要的，细胞 系特性提供了细胞系家系的特点，形态特征，生化特征，遗传稳定性以及细胞系 交叉污染的相关信息。细胞系的鉴定方法包括细胞特异性指标的分析。昆虫细胞 系广泛应用于昆虫病毒培养和重组蛋白生产的科学研究以及工业生产，与哺乳动 物细胞系相比，昆虫细胞系被报道交叉污染和错误标记的例子更多。本论文作者 主要通过d n a 指纹图谱技术鉴定1 7 种鳞翅目昆虫细胞系并检测这些细胞系对芹 菜夜蛾核型多角体病毒的敏感性。d n a 指纹图谱是通过使用随机引物进行d n a 扩增技术获得的，指纹图形是细胞系的一个稳定性参数。根据醛缩酶 ( a l d o l a s e ) ，催乳素受体( p r o l a c t i nr e c e p t o r ) 和白细胞介素一1 b ( i n t e r l u k i n l i d 三 个不同基因，设计三组不同的引物，从细胞中提取d n a ，分别以每一种细胞系 d n a 为模板，p c r 扩增，p c r 产物琼脂塘凝胶电泳检测，从而获得完整的d n a 指纹图谱。实验结果显示，除棉铃虫建立的b c i r l h a - a m i 产生了和甜菜夜蛾 ( l e h 玎小，7 ) 一样的d n a 指纹图形外，所有的细胞系都产生不同的d n a 指纹 图谱，它们可以彼此区分。b c i r l h a a m i 和l e h h n u 7 的一致性图谱，可能是 标记错误或交叉污染造成的；对b t 晶体毒素敏感的粉纹夜蛾b t i t n 5 8 1 - 4 ( t i m 5 一s ) 细胞和t n h5 r 抗性细胞系的d n a 指纹图谱是有差异的。本文作者使用 t c l d 5 0 法测定了六种细胞系对芹菜夜蛾核型多角体病毒的敏感性。用梯度稀释的 病毒悬浮液( s f a m n p v ) 接种培养于9 6 孔细胞培养板中的粉纹也蛾b t i t n 5 8 1 - 4 ( t n h5 一s ) ，草地夜蛾s f 9 ，斜纹夜蛾( s l z s u 1 ) ，小菜蛾b c i r l p x 2 h n u 3 ，舞毒蛾i p l b l d 6 5 2 和美洲棉铃虫( b c i r l h z a m i ) 细胞，2 7 孵育， 逐日记录阳性感染数。数据用按r e e d - - m u e n c h 法分析，得到了不同细胞感染的病 毒滴度。病毒感染s t 9 细胞得到的病毒滴度是5 x 1 0 7t c i d 5 删，b t i t n 5 8 1 - 4 ( t r l h5 s ) 细胞病毒滴度是3 2 x 1 0 7 t c i d 5 0 r r d 。在s l z s u 1 ，b c i r l h z a m i ， i p l b l d 6 5 2 和b c i r l p x 2 一h n u 3 细胞中没有被检测除病毒粒子或病毒多角包涵体 关键词：鉴定d n a 扩增指纹，细胞系，p c r , s f a m n p v ，d n a a b s t r a c t c o m p l e t ec h a r a c t e r i z a t i o no fc e l ll i n e si se s s e n t i a lf o rt h ec e l lb a n k sa n df o rt h e r e g u l a t o r yr e q u i r e m e n t si nb i o p h a r m a c e u t i c a lp r o d u c t i o n c h a r a c t e r i z a t i o no fac e l ll i n e p r o v i d e si n f o r m a t i o nr e g a r d i n gt h el i n e a g eo rs p e c i a t i o no f t h ec e l ll i n e ，g e n e t i cs t a b i l i t y o fc e l l s ，a n dc r o s s c o n t a m i n a t i o no fc e l ll i n e s c e l ll i n ec h a r a c t e r i z a t i o np r o c e d u r e s c l a s s i c a l l yi n c l u d ea n a l y s i so fd i s t i n g u i s h i n gm a r k e r so ft h ec e l l s i n s e c tc e l ll i n e sa r e b e i n gw i d e l yu s e di nr e s e a r c ha n di n d u s t r y f o rc u l t i v a t i o no fi n s e c tv i r u s e sa n d p r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i n s c o m p a r e dt ot h em a m m a l i a nc e l ll i n e s ，t h ee x t e n to f c r o s s c o n t a m i n a t i o na n dm i s l a b e l i n gi sr e p o r t e dh i g h e ri nc a s e so fi n s e c tc e l ll i n e s t h e o v e r a l lg o a lo ft h i sw o r kw a st h ei d e n t i f i c a t i o no f17l e p i d o p t e r a ni n s e c tc e l ll i n e sb y d n a a m p l i f i c a t i o nf i n g e r p r i n t i n ga n dt e s ts n s c e p t i b i l i t yo fi n s e c tc e l ll i n e st oi n f e c t i o n b ys y n g r a p h af a t c i f e i l lm u l t i p l e n u c l e a r p o l y h e d r o s i sv i r u s e s ( s f a m n p v ) d n a a m p l i f i c a t i o nf m g e r p r i n t i n g ( d a f ) 、析t l la r b i t r a r i l ys e l e c t e dp r i m e r sw a su s e dt oo b t a i n d n a f i n g e r p r i n tp r o f i l e st od i s t i n g u i s ha m o n g17l e p i d o p t e r a ni n s e c tc e l ll i n e s t h e f m g e r p r i n t i n gp a t t e r ni sas t a b l ec h a r a c t e r i s t i co ft h ec e l ll i n eb e c a u s eh i g ha n dl o w p a s s a g e sg e n e r a t e dt h es a m ep r o f i l e t h ed n a f r o me a c hc e l ll i n ew a sa m p l i f i e d ，a n d p c rp r o d u c t sw e r ea n a l y z e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s a l lc e l ll i n e sc o u l db e d i s t i n g u i s h e df r o me a c ho t h e rw i t hf o l l o w i n ge x c e p t i o n ：b c i r l - h a - a m le s t a b l i s h e d f r o mh e l i o t h i sa r m i g e r a p r o d u c e dt h es a m ep r o f i l ea sl a p h y g m ae x i g u a ( l e - h - h n u 7 ) t h i sc a s eo fi d e n t i c a lp a t t e r n si sb e l i e v e dt ob ed u et oc r o s sc o n t a m i n a t i o no fc u l t u r e s o ft h et o t a l17c e l ll i n e s ，s i xc e l ll i n e sh a sb e e nt e s t e df o rs u s c e p t i b i l i t yt o s y n g r a p h af a t c i f e r am u l t i p l en u c l e o c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ( s f a m n p v ) i n f e c t i o n b yu s eo fat y p i c a le n d p o i n ta s s a yp r o c e d u r e c e l ll i n e sf r o mt r i c h o p l u s i an ib t i t n 5 b1 - 4 ( t n h5 一s ) ，s p o d o p t e r af r u g i p e r d a ( s f 9b c i r lc l o n e ) ，s p o d o p t e r al i t u r a ( s l - z s u 一1 ) ，p l u t e l l ax y l o s t e l l ab c i r l p x 2 一h n u 3 ，l y m a n t r i ad i s p a ri p l b - l d 6 5 2 ，a n d h e l i c o v e r p az e a ( b c i r l r l z - a m1 ) i n9 6 - w e l lt i s s u ec u l t u r ep l a t e sw e r ei n f e c t e d 、析m d i l u t i o n so fv i r u ss u s p e n s i o n s ( s f a m n p v ) e a c hc e l v v i r u sc o m b i n a t i o nw a si n c u b a t e da t t e m p e r a t u r e s2 7o ca n dc e l l sw e r ee x a m i n e df o rc y t o p a t h i ce f f e c t ( t h ep r e s e n c eo f o c c l u s i o nb o d i e si nt h en u c l e i ) f r o m2t o4d a y si n t e r v a l su pt oo n ew e e kp o s ti n f e c t i o n t h er e s u l t i n gd a t aw e r ea n a l y z e db yr e e da n dm u e n c hm e t h o d ，p r o v i d i n gv i r u st i t e r sf o r i i 博士学位论文 d o c t o r a ld i s s e r i a t l o n e a c hc o m b i n a t i o no fv i r a li n f e c t i o nc e l ll i n e t h er e s u l t sw e r ec a t e g o r i z e db ya c c u r a c y a n db yr a p i d i t yo fm a x i m u mt i t e r v i r u st i t e ro fs f 9b c i r lc l o n ew a sh i g h e rt h a no t h e r e e l l l i n e s5x10 t c i d s 0 m l ，3 5x10 p f u m lt h el o w e s tl e v e ld e t e c t e di ni n f e c t e dc e l l s w a si nb t i - t n 5 8 1 4 ( t n h5 一s ) c e l l s3 2 x 1 0 7t c i d s d m l ，2 2 x 1 0 7p f u m 1 n ov i r i o n so r p o l y h e d r a li n c l u s i o nb o d i e sw e r ed e t e c t e di ns l z s u 一1 ，b c i i i 工一h z a m l ，i p l b l d 6 5 2 a n db c i ri ，p x 2 h m 3c e l l s k e y w o r d s ：d n aa m p l i f i c a t i o nf i n g e r p r i n t ，i n s e c tc e l ll i n e s ，p c r , ( s f a m n p v ) i i i 博士学位论文 d o c t o r a ld i s s e 联i o n 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：。少丁 日期z 4 1 年朋歹1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同 意华中师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分 内容。 作者签名：? 少丁 日期：2 0 1 年箩月31 日 狮挑槲 呐：冲“巾 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人 的学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程” 中的规定享受相关权益。回童途塞握变压溢卮；旦坐生；旦二生；旦三生筮i 鱼! 作者签名：? ，t 日期：2 一c 年歹月罗1 日 导师签 日期： 日 c h a p t e r1 ：l i t e r a t u r er e v i e w 1 1h i s t o r i c a lb a c k g r o u n d c o n t r a r yt ot h eg e n e r a lv i e w , t h ec u l t u r eo fi n v e r t e b r a t ec e l l si nv i t r oi sn o tr e c e n ti t b e g a n i n1915w h e nt h eg e r m a ne n t o m o l o g i s tr i c h a r db g o l d s c h m i d tw o r k e dw i t ht h e s i l km o t h ( g o l d s c h m i d t , 1 9 15 ) h en o t i c e di nv i t r os p e r m a t o g e n e s i sa n dm a i n t a i n e dc e l l s a l i v ei nh e m o l y m p hf r o mh o m o l o g o u si n s e c ta sc u l t u r em e d i u m b e t w e e n1917a n d19 2 2 ， s t a n l e yg l a s e rm a d ee f f o r t st od e v e l o pi n s e c tt i s s u ec u l t u r e i n19 3 5 ，w i l l i a mt r a g e r a c h i e v e dt h ef i r s tl o n gt e r mc u l t i v a t i o no fi n s e c tc e l l s ( ac u l t u r eo fs i l k w o r mo v a r yc e l l s m a i n t a i n e df o r3w e e k si nm e d i u mc o n s i s t i n go fh e m o l y m p h , i n o r g a n i cs a l t s ，m a l t o s e a n d d i g e s t e de g ga l b u m i n ) i n19 5 6 ，g e r a dr w y a t ti s o l a t e df r o ms i l k w o r mb o m b y xm o r ia n da n a l y z e dt h e a m i n oa c i d s ，o r g a n i ca c i d s ，o r g a n i cs a l t sa n ds u g a r sp r e s e n ti nt h eh e m o l y m p h h e m a i n t a i n e do v a r i a nc e l l sa l i v ef o r2w e e k s ( m a r a m o r o s c h ，19 9 9 ) i n19 6 2 ，t h o m a sg r a c e i s o l a t e dt h ef i r s tf o u rl e p i d o p t e r a ni n s e c tc e l ll i n e sa n dd e v e l o p e dt h ef i r s ts y n t h e t i c g r o w t hm e d i u m ，a l r e a d yi nu s et o d a y ，f o rt h ec u l t i v a t i o no fi n s e c tc e l l s t h i sm e d i u m r e q u i r e ds e r u ma d d i t i v e o nt h es a m ey e a r , t h e f i r s ti n t e r n a t i o n a lc o l l o q u i u mo n i n v e r t e b r a t et i s s u ec u l t u r ew a so r g a n i z e do nm o n t p e l l i e ri nf r a n c e t w oy e a r sl a t e r , g r a c ee s t a b l i s h e dt h ef i r s tm o s q u i t oc e l ll i n e ( m a r a m o r o s c h , 19 9 9 ) i nt h el a t e r6 0 s ， o t h e rc e l ll i n ew e r ea l s od e v e l o p e d ，m o s to ft h el e p i d o p t e r a n i nt h es a m ep e r i o d ，w i l d t y p eb a c u l o v i r u s e si n f e c t i n gi nv i v ol e p i d o p t e r a nl a r v a e c o m eu n d e ri n t e n s i v es t u d y o r i g i n a l l yp r o p a g a t e di nl a r v a e ，t h e yw e r ea p p l i e dt ot h ei n v i t r op r o d u c t i o no fb i o i n s e c t i c i d e a l t h o u g h ，i nf a c t ，t h ef i r s tb a c u l o v i r u sa p p l i c a t i o ni n a g r i c u l t u r ea sab i o i n s e c t i c i d ew a si n 18 9 2 ，t h ef i r s te x t e n s i v et r i a l so fb a c u l o v i r u s e f f i c a c ya n ds a f e t yw e r ec a r r i e do u ti n19 7 5b yt h eu se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y ( e p a ) ( m a e d a , 19 9 5 ) i nt h e7 0 sa n d8 0 s ，t h en u m b e ro f a c t o r sw o r k i n gi ni n s e c tc e l l c u l t i v a t i o ni n c r e a s e da n dt h ei n t e r e s to fi n v e r t e b r a t ei n s e c tc u l t i v a t i o ns u r p a s s e dt h a to f c l a s s i c a le n t o m o l o g i c a ls t u d i e s t h eh i g hc o n t r i b u t i o no fk a r lm a r a m o r s c hw a st h a th e a d a p t e di n s e c tc e l lc u l t i v a t i o nt oal a r g es c a l e ，t h i n k st o t h ed e v e l o p m e n to fu n i v e r s a l 博士学位论文 d o c t o r a ld i s s e r t a t i o n i n s e c tc e l lm e d i ab o t h 诵t l l ( m e d i u mm m ，m i t s u h a s h ia n dm a r a m o r o s c h19 6 4 ) a n d w i t h o u ts e r u m ( m m s f ，m i t s u h a s h i19 8 2 ) i nt h eb e g i n n i n go ft h e8 0 s ，s e v e r a ls c i e n t i s t s ( w i l k i ee ta 1 ，19 8 0 ；w e i s se ta l ， 19 81 ) d e v e l o p e dt h ef i r s ts e r u m - f l e em e d i as u p p o r t i n g l a r g e s c a l ec u l t i v a t i o n b y r e p l a c i n gs e r u mb ys t e r o la n dl i p i d s t h e i rm a i nm o t i v a t i o n sw e r et or e d u c et h ec o s ta n d t h el o t t o l o tv a r i a t i o n , w h i l et o d a y ，t h eu s eo fs e r u m f r e em e d i ai se s s e n t i a l l yd i c t a t e db y s a f e t yc o n s i d e r a t i o n ( g a l b r a i t h ，2 0 0 2 ) i n1 9 8 3 ，s m i t he ta 1 ( 1 9 8 3 ) c o n s t r u c t e dt h ef i r s tr e c o m b i n a n tb a c u l o v i r u st o p r o d u c er e c o m b i n a n th u m a ni n t e r f e r o n t h eu s eo ft h i sb a c u l o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o r s y s t e m ( b e v s ) 谢t l lc o c u l t i v a t e di n s e c tc e l l s ( i c ) o p e n e daw h o l en e wf i e l do fa c t i v i t y i nt h ea r e ao f p r o t e i ne x p r e s s i o n ，a n dt h ei n i t i a li n t e r e s to nb i o p e c t i c i d e su s i n gw i l d - t y p e v i r u sw a se x p a n d e db ym o d i f y i n gt h eb a c u l o v i r u sg e n o m e i n19 8 8 ，t h ef i r s tr e c o m b i n a n t b a c u l o v i r u se x p r e s s i n ga n i n s e c t s p e c i f i cn e u r o t o x i nw a sd e v e l o p e dt oi n c r e a s ei t s b i o p e s t i c i d ea c t i o n ( c a r b o n e l le ta 1 ，1 9 8 8 ) i n1 9 9 1 ，h i n ke ta 1 t e s t e d3d i f f e r e n t r e c o m b i n a n tb a c u l o v i r u s e sf o rp r o t e i ne x p r e s s i o ni n2 3i n s e c tc e l ll i n e s ( h i n ke ta 1 ， 19 9 1 ) s i n c et h e n , t h eg e n o m eo fa u t o g r a p h ac a l i f o r n i c a ( a c m n p v ) ，t h em o s tw i d e l y u s e db a c u l o v i r u s ，h a sb e e nc o m p l e t e l ys e q u e n c e d ( a y r e se ta 1 ，19 9 4 ) a sw ee n t e rt h e2 1 吼c e n t u r y ，n e wf i e l d so fb a c u l o v i r u s e sa p p l i c a t i o n sa r eo p e n i n g u p ，s u c ha sb a c u l o v i r u s e sd i s p l a y ( o j a l ae ta 1 ，2 0 01 ) a n dt h eu s eo fb a c u l o v i r u s e sa s v e c t o r sf o r g e n ed e l i v e r y ( c o n d r e a ya n dk o s t ，2 0 0 3 ；k o s te ta 1 ，2 0 0 5 ) t o d a y ， b a c u l o v i r u s e sa sb i o i n s e c t i c i d e sa r ei na i le f f i c i e n t , c o s t e f f e c t i v es u b s t i t u t et oc h e m i c a l p e s t i c i d e s ( h e n m a n d e z c r e s p o e ta 1 ，2 0 01 ) g e n e t i c a l l ym o d i f i e db a c u l o v i r u s e s c o n s t i t u t eap o w e r f u lt o o lf o rt h ee x p r e s s i o no fg l y c o s y l a t e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n s ( r - 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