（微生物学专业论文）海洋粘细菌细胞行为及其分子机制研究.pdf

山东大学博士学位论文 摘要 粘细菌曾被普遍认为是典型的土壤细菌类群，主要是由于早先绝大部分粘细 菌是从土壤生境中分离的，并且它们的多细胞行为和完整生活史也都是在固体介 质表面上完成的。虽然，粘细菌在液体培养基中可以生长，但却一直未能证明水 环境中有休眠细胞的发育。因此，尽管在水环镜中也偶有粘细菌分离的报道，但 r e i c h e n b a c h 和d a w i d 认为，粘细菌是陆生的细菌类群，水环境中分离的粘细菌 其实是从土壤中冲入水中，并以休眠状态存活的子实体中粘孢子的萌发物。 1 9 9 8 年l i z u k a 等根据1 6 sr d n a 序列与粘细菌中小囊菌属( n a n n o c y s t i s ) 有 8 9 3 和8 3 2 的同源性，认为从海洋中分离的两株嗜盐细菌为海洋粘细菌。1 9 9 9 年r a v e n s c h l a g 等在构建海底沉积物细菌1 6 sr d n a 文库的基础上，通过特异性 探针杂交方法证明在其分析的样品中可能存在粘细菌的类群。我们通过特殊的分 离方法也在海洋样品中分离并纯化得到了耐盐生长的多株粘细菌。由于海水条件 下并不能提供粘细菌分化发育形成子实体的自然环境，也不能保证粘孢子的高密 度从而丌始一个新的生命周期。这些“海洋”粘细菌在海水环境里是如何存活并 定殖的? 这成为了一个令人感兴趣并且富有挑战性的课题。 本文在充分研究了分离得到的海洋耐盐粘细菌的分类特征的基础之上，将其 同一株嗜盐海洋粘细菌( h a l i a n g i u mo c h r a c e u ms m p 2 ) 进行了微生物学性质的 比较分析，包括在海水和淡水的固体及液体培养基中生长和发育相关特征，生长 后期的球形细胞的抗逆性质和细胞密度依赖性差异等方面。在国际上首次报道 了这一类群粘细菌的在海洋和陆地生境中可能具备的不同的生活方式和分化发 育周期，提出了粘细菌在海洋生境存活并定殖的可能模式，为揭示粘细菌的起源 进化提供了线索。 酬 i i ：粘球菌h w - 1 、1 2 8 7 、1 2 5 1 和1 2 5 1 0 1 均分离自海洋样品，其中h w - i 和1 2 5 - 1 0 - 1 可以耐受全海水生长。依据粘细菌的经典形态学分类方法，对其进 行初步分类鉴定。详细研究了这几株耐盐粘细菌的细胞形态学特征，包括营养细 胞的形状和大小、粘孢子的形态和大小、子实体的形态、菌落的形态、色素等。 在测定g + cm 0 1 时，对化学水解( 高氯酸法和甲酸法) 和生物酶水解( 磷酸二 酯酶i 和牛肠粘膜碱性磷酸酶) d n a 的水解条件和产物进行了分析改善了分 山东大学博士学位论文 析的重复性问题，排除了主要的误差来源。利用反相h p l c 技术，精确测定了这 几株耐盐粘细菌的g + cm 0 1 。同时，对菌侏进i f - j 1 6 sr d n a 序列测定和同源 性分析。在g e n b a n k 中的登录序列号为：h 、1 la f 3 3 6 8 0 1 ) ，1 2 5 1 0 1 ( a y 0 7 2 7 4 0 ) ， 1 2 8 7 ( a y c l 3 2 8 7 9 ) ，1 2 5 1 ( a f 4 6 6 1 9 1 ) 。综合伯杰氏细菌鉴定手册第九版 及原核生物的形态学分类特征，g + cm 0 1 以及1 6 sr d n a 系统分类的结果 的综合，这四株粘细菌被鉴定为：粘球菌目m y x o c o c c a l e s - - 孢囊杆菌亚目 c y s t o b a c t e r i n e a e - - 粘球菌科m y x o c o c c a c e a e - - 粘球菌属m y x o c o c c u s - - 橙色粘球 菌膨r y o c o c c u s f u l v u sh w - 1 ，1 2 8 7 和1 2 5 一l ：大孢粘球菌m y x o c o c c u sm a c r o s p o r u s 1 2 5 1 0 1 。 以嗜盐粘细菌h a l i a n g i u mo c h r a c e u ms m p 2 为对照，考察了四株耐盐粘球菌 在不同海水及n a c i 浓度平板上的生长发育状况，进一步以m f u l v u sh w - 1 为代 表，与嗜盐粘细菌进行对比研究，考察它们在固体液体和含有不同盐浓度条件下 的培养性质，生长后期形成的球形孢子的抗逆性以及生长过程中的细胞密度依赖 性。结果表明： h w - i 可以在o - 1 0 0 ( 盐浓度为3 6 7 ) 海水浓度的培养基中生长，最适生 长条件为0 - 8 0 ( 盐浓度2 9 ) 海水浓度。可以耐受3 o 的n a c i 浓度生长， 最适生长n a c i 浓度为o 1 5 。在淡水或低能浓度v y 2 培养基中，固体平板上 的菌落和液体菌团呈明黄色，液体培养时呈紧密团状生长；当海水浓度高于7 0 后，固体平板上的菌落和液体菌团颜色转为淡褐色，液体培养时较为均匀生长。 作为对照的s m p 2 是绝对嗜盐菌，在不含有n a c l 的培养基中不能生长可以在 0 2 5 的n a c i 浓度范围内生长，最适生长n a c i 浓度l 3 ，在所有的盐浓 度的液体培养基中，均抱团生长。固体平扳上和液体培养基中，耐盐粘球菌的细 胞长度随着不同生长时期而变化，随着时间推移，均由细长杆状转变为圆形或卵 圆形，与子实体中的粘孢子大小相仿，直径约1 2 1 8h m 。同时，耐盐粘球菌在 同一生长时期中的细胞长度也随着盐浓度的升高而变短。s m p - 2 在固体平板培 养后期在菌落中间也形成少量类似子实体结构，液体培养后期菌体也变为卵圆 形，但菌体长度并不随培养基中的盐浓度不同而改变。 将海水中主要盐离子n a c i 、m g c l 2 和c a c l 2 以不同的组合添加入v y 2 培 养基中测试它们对耐盐粘球菌生长及发育的影响。表明m g c l 2 对h w - 1 生长和 山东大学博士学位论文 发育有促进作用，而高浓度的n a c l 和c a c l 2 则是抑制作用，随着n a c l 浓度升 高代时延长，生孢率降低。对孢子抗逆性分析表明，h w - i 在高盐浓度液体培 养条件后期形成的球形细胞和固体平板上形成的子实体中的粘孢子一样，可以耐 受6 0 0 ，5 分钟的处理而存活，并在干燥的滤纸片上保存五年后仍能萌发。含海 水的固体或液体培养基培养后期球形孢子耐热性均高于淡水v y 2 平板上形成的 子实体中的粘孢子。来自于淡水或低盐浓度v y 2 液体后期的球形孢子不能耐受 4 5 ，5 分钟的处理，而并且干燥保存超过一个月就不能萌发。s m p 2 在固体琼 脂上仅能形成少量的子实体结构，其中的球形细胞可以耐受5 5 6 0 ，5 分钟的 处理。液体培养条件下，后期s m p 2 营养细胞也发生由杆状转变成球形的形态 变化，这些球形细胞也可以耐受5 5 6 0 。c 的处理，可以认为子实体中及液体后期 的球形孢予均为粘孢子。 由于粘细菌是具有社会性行为的细菌，粘细菌必须提高它们的细胞浓度，富 集胞外酶米降解非可溶性营养源，它们在以完整的酵母细胞为碳氮源的v y 佗培 养基上，单个细胞是不能形成菌落的。在海洋环境中，粘细菌不能形成子实体， 营养菌体不经子实体的形态分化直接形成粘孢子，h w - i 如何保证足够的细胞密 度丌始新的生命周期呢? 一个细胞在海洋条件下就可以形成一个菌落吗? 我们 考察了不同盐浓度培养条件下海洋粘细菌生长的细胞密度依赖性。接种2 x 1 0 3 个来自于淡水或1 0 海水v y 2 液体培养基中的h w - 1 营养菌体在平板上或 液体摇瓶中不能生长。而1 0c e l l s m l 的来自于高盐浓度液体培养基( 2 0 海水 浓度) 的菌体细胞，取0 2m l 涂布平板或接种液体摇瓶时均可以生长。h w - 1 的细胞具有在不同盐浓度下生长的能力和能感应不同海水浓度的变换的细胞群 体感应系统。 嗜盐菌s m p 2 在不同海水浓度培养条件下，1 0 6 个细胞不能在平 板上形成菌落。这说明，s m p 一2 的生长具有极强的细胞密度依赖性。 综合以上结果可以得出这样的结论，h w - 1 在海水液体环境下可以不经过子 实体的形态分化直接形成抗逆性的粘孢子，而淡水液体后期的球形细胞仅仅是退 化的营养细胞。在固体介质上的陆地环境中，h w - 1 则可形成子实体的休眠形态。 由于耐盐粘细菌在类似陆地和海洋培养条件下不同的微生物学性质，我们认为它 们存在两种不同的存活方式：一种是简单的即直接从营养细胞形成粘孢子，生 长没有细胞密度依赖性：另一种是复杂的形成多细胞的子实体结构，生长依靠 山东大学博士学位论文 高的细胞密度，而子实体的形成正好保证了在陆地环境中起始一个新的生命周期 的高细胞浓度。耐献牯细菌对海洋的适应可以看怍是一个退化过程，当它们转换 到不同的生活环境中时，可猷变挠不同的生活馕式，嗜盐粘纲菌如s m p 2 ，尾另 一类的海洋粘细菌类群，运用另一种生活方式。它在各种盐浓度培养条件下均形 成紧密的菌体团块，生长具有细胞密度依赖陛。在固体平板上形成子实体结构， 液体环境中营养菌体直接发育形成粘孢子。直到现在，所有分离的嗜盐粘细菌均 归属于新的属，如h a l i a n g i u mo c h r a c e u m ，p l e s i o c y s t i sp a c i f i c a 和e n h y g r o m y x a s a l i n a ，它们与陆地粘细菌的同源性相对较远，形成了定殖于海洋中的一个独特 的进化类群。 由于t n 5 衍生质粒的应用，使转座诱变成为对m y x o c o c c u sx a n t h u s 诱变的主 要方法，为了揭示耐盐粘球菌m y x o c o c c u s f u l v u sh w - 1 的特殊微生物学性质尤其 是耐赫特性的分子机理，我们利用p i ：t n 5 a c 噬菌体对h w - i 进行转导，将转 座子t n 5 a c 转入细胞内，插入染色体，构建丁一个约含有2 0 0 多株转导子的随 机突变子库。以海洋粘细菌的耐盐性状为切入口，首先从突变体库中筛选到四株 耐盐敏感突变株。对这四株耐盐敏感突变子的t n 5l a c 插入从以下几个方面进行 验证：以t n 5 a c 为探针，进行s o u t h e r n 杂交分析，得到一条约1 6k b 的杂交阳 性信号，验证了插入突变：这四株转导突变子具有很强的卡那霉素抗性( k m 妻 2 0 0i _ t g m l 的平板上仍然可以生长) ，在x g a l i p t g 平扳上t n 5 a c 突变体菌株明 显变蓝，得到了一系列突变体基因表达时间谱：以t n 5 a c 序列设计引物，对突 变菌株的染色体d n a 进行p c r 扩增，以野生菌株h w - 1 为对照。突变菌株染色 体的p c r 结果为阳性，而野生菌株h w - i 的结果为阴性。测序结果进行b l a s t 和c l u s t a lx i 8 l 同源性比对分析，是卡那霉素抗性基因( t n 5 中的a p h 基因) 和 1 3 g a a c t o s i d a s e 酶( 1 a c z ) 基因，由以上结果可以判定筛选得到的突变菌株为转 导子。 对突变子进行了突变表型分析，考察t n 5k t c 插入对生长、发育或运动等细 胞行为的影响，由于筛选得到的这几株转导子均为盐敏感突变型，相应考察耐盐 性丧失的程度及t n 5l a c 插入基因的表达时i n j 。突变子2 t d 9 6 和2 t d l 0 8 只能在 海水浓度低于7 0 和n a c i 浓度低于2 o 的条件下生长，且丧失了形成子实体的 能力，说明t n 5 a c 的插入不仅对细胞耐盐性有影响还相应的影响其分化发育。 由莰犬孝溥学篷论冀 2 t d 8 7 和2 t d l 2 0 只能谯海水浓度低予8 0 和n a c i 浓度低于2 0 的条件下生长， 部分丧失了予实俸形藏麓力。t n 5l a c 插入豹谴黉：鞫方蠢静苓阏镬褥瓣釜毪及予 实体形成能力下降也不同，对2 t d 9 6 、2 t d l 0 8 的影响最大。定量分析测定b g a a c t o s i d a s e 酶比活，确定t n 5 如c 撬入染色体启动予的不慝袭达时闻及强弱。 在2 t d 9 6 、2 t d l 0 8 翁篷长袭( 对数期，稳定期) ，l a c z 基因并不表达，壹秘发 育期才开始袭达，并且液达程度越来越高，酶比活呈上升趋势，说明t n 5 a c 的 疆久盘点为发育鞠表这靛鞠关基医，撬示参与发瓷甥表达驰懿莱些基霞是与瓣薤 性状相关的。 在x - g a l 平板上2 t d 9 6 及2 t d l 0 8 两株转导子明显变蓝t 说明t n 5l a c 以正 确羲方离搔入到h w - 1 染色薅囊韵予靛下游，我稍翻爱t a i l - p c r 法分离了这诱 株转导子+ r n 5 a c 插入凝固，得到大小分别为1 5k b 和1 8k b 的片段产物经过 测廖分柝，l ，5k b 片段一端带有t n 5 的特异性序捌。对分离到的这一段t n 5 矗站 插入稻邻垮列进行生物倍惠学分辑，提示箕功麓可髓是与信号转导有关的激酶系 统，为从分子水平上揭示耐盐粘细黼的耐毹机理打下了基础。 关键词：耐箍粘细菌分化发育转导耐盐机制生存定髓模式 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t t h em y x o b a c t e r i aa r ec o n s i d e r e dt ob et h et y p i c a ls o i lm i c r o o r g a n i s m sa n dv e r y c o m m o ni nm a n yt e r r e s t r i a le n v i r o n m e n t s m ) o b a c t e r i a lc e i l sm o v eb yg l i d i n gi n s w a m i so ns o l i ds u r f a c e s f e e db yc o o p e r a t i v e l yd i g e s t i n gm a c r o m o l e c u l e sa sw e l la s w h o l em i c r o o r g a n i s m s ，a n df o r mm u l t i c e l l u l a rf r u i t i n gb o d i e so ns o l i ds u r f a c e s t h e r e s t i n gc e l l s ，o rm y x o s p o r e s ，d e v e l o pw i t h i nf r u i t i n gb o d i e s f r u i t i n gb o d i e so n l y d e v e l o po ns o l i ds u r f a c e sa n dt e r r e s t r i a lm y x o b a c t e r i ad on o tu s u a l l yt o l e r a t eg r e a t e r t h a n1 n a c l a l t h o u g hm y x o b a c t e r i ac o u l dg r o wi nl i q u i db r o t h b u ti tn e v e rb e v e r i f i e dt h a tr e s tf o r m so fm y x o b a c t e r i ac o u l dd e x ，e l o pi nw a t e r s i n c em y x o b a c t e r i a w e r eo c c a s i o n a l l yi s o l a t e df r o ma q u e o u se l i x ，i r o n m e n t s ，r e i c h e n b a c ha n dd a w i d c o n s i d e r e dt h em y x o b a c t e r i ai s o l a t e sf r o mw a t e rw e r et h er e s tf o r m s m y x o s p o r e si n f r u i t i n gb o d i e sw h i c hw e r ef l u s h e di n t ot h ew a t e ra n dg e r m i n a t e d o nt h eo t h e rh a n d ，m y x o b a c t e r i ac o u l db ei s o l a t e df r o mm a r i n es a m p l e s ，a sp r o v e n b yt h e 16 sr d n af r a g m e n t sa m p l i f i e df r o mm a r i n es a m p l e sa n dp e r m a n e n t l yc o l d m a r i n es e d i m e n t s i n19 9 8i i z u k ae ta li s o l a t e dt w oh a l o p h i l i cm a r i n em y x o b a c t e r i a t h e16 sr d n as e q u e n c es t u d i e si n d i c a t e dt h a tt h et w oi s o l a t e sw e r er e l a t e dt ot h e g e n u sn a n n o c ) s t i s t h ec l o s e s tr e l a t i v ef o rs t r a i ns h i 一1 w a sn e x e d e n s ( 1 e v e lo f s i m i l a r i t x8 9 j ) ，a n dt h o s ef o rs t r a i ns m p 一2w e r en e x e d e n s ( 1 e x 7 e lo fs i m i l a r i t y 8 3 2 ) b a s e do nt h ep h y l o g e n e t i cd i s t a n c e sb e t w e e nb r a n c h e s ，t h ei s o l a t e sw e r e a s s i g n e dt ot 、on e wm y x o b a c t e r i a lg e n e r a w i t has p e c i a lm e t h o d ，w ea l s oi s o l a t e d s o m eh a l o t o l e r a n tm ) x o b a c t e r i as t r a i n sf r o mm a r i n es a m p l e s i n c eh a l o p h i l i ca n d h a l o t o l e r a n tm j x o b a c t e r i ah a v eb e e ni s o l a t e df r o mv a r i o u sm a r i n es a m p l e s ，p g s e a w a t e r m a r i n es a n d s ，m u d ，o rs e d i m e n t so nm a r i n ea n i m a l sa n dp l a n t s ，w h i c h s u g g e s t st h a tm y x o b a c t e r i am i g h tb ei n d i g e n o u st ot h eo c e a n h o w e v e r , t h en a t u r a l m a r i n ee m i r o n m e n t sd on o tf a v o rt h em o r p h o g e n e s i so ft h ef r u i t i n gb o d ys t r u c t u r e ， w h i c hn o to n l ) p r o t e c t sm y x o s p o r e sb u te n s u r e st h ec e l ld e n s i t yf o ran e wl i f ec y c l e s o h o wc o t f l dt h e s em a r i n em y x o b a c t e r i a li s o l a t e sl i x ，ei nt h eo c e a n ? i nt i f f sp a p e r w er e p o s e dt h ed i f f e r e n tc h a r a c t e r i s t i c so fh a l o t o l e r a n tm y x o b a c t e r i a i nt e r r e s t r i a lv e r s u sm a r i n ec o n d i t i o n s ah a l o t o l e r a n tm y x o b a c t e r i a ls t r a i n 均吖n c o c c i i s u h z i sh w - 1 ( a t c cb a a 一8 5 5 ) a n dah a l o p h i l i cm y x o b a c t e r i a ls t r a i n h a l i a n g i u mf ，( 。i n a c e u ms m p 一2w e r ee m p l 0 3 ，e da sm o a c i st os t u d yt h eg r o w t ha n d d e x ，e l o p m c n tc h a r a c t e r i s t i c si ns e a w a t e ro ri nf l e s h 、v a t e r c e l l u l a rd e n s i t y d e p e n d e n t 山东大学博士学位论文 g r o w t ha n dt h es p h e r i c a lc e l l sc h a r a c t e r i s t i c so ft h em a r i n em y x o b a c t e r i a f r o mt h e r e s u l t so b t a i n e d ，w es u g g e s tt h ep o s s i b l el i v i n gp a t t e r n so fm y x o b a c t e r i ai nt h eo c e a n f o rt h ef i r s tt i m ew h i c hc o u l dp r o v i d eac l u ef o rt h ei l l u m i n a t i o no ft h em y x o b a c t e r i a s e v o l u t i o n h a l o t o l e m n tm y x o c o c c u ss t r a i n sh w - 1 、1 2 8 7 、1 2 5 - 1a n d1 2 5 1 0 1w e r ea l l i s o l a t e df r o mm a r i n es a m p l e s ，a m o n gt h e mh w - 1a n d1 2 5 - 1 0 1c o u l dg r o wb e a t i n g t h es a l i n i t yi ns e a w a t e r ( 3 6 ) t op e r f o r mt h ec l a s s i cm o r p h o l o g i c a lc l a s s i f i c a t i o n w eo b s e r v e dt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s ef o u rs t r a i n s ，i n c l u d i n gt h e s h a p ea n ds i z e o fv e g e t a t i v e c e l l m y x o s p o r e sa n df r u i t i n g b o d i e sa n dt h e c o n f i g u r a t i o no fs w a r m sa n dp i g m e n t se t c 1 od e t e r m i n et h e ( h ct 0 0 1 w ea n a l y z e d t h ec o n d i t i o n sa n dp r o d u c t sb yc h e m i c a ld e g r a d a t i o n ( p e r c h l o r i ca c i da n df o r m i ca c i d ) a n de n z y m a t i cd e g r a d a t i o n ( p h a s p h o d i e s t e r a s eia n db o v i n ei n t e s t i n a lm u c o s aa l k a l i n e p h o p h a t a s e ) o fb a c t e r i a lg e n o m ed n a w i t hr p - 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1g r e wi nt h em e d i u mr a n g i n gf r o m0 ( d v y ) t o 13 0 s e a w a t e r ( t h es a l i n i t yw a sa s s a y e dt ob e4 7 ) t h eo p t i m a lg r o w t hc o n d i t i o n s w e r ea t0 - 8 0 s e a w a t e r ( d v ya n d1 0 - 8 0 h v y t h es a l i n i t yi n8 0 h v yi s2 9 、 i nd v yo rl o w - s e a w a t e rh v yt h es w a m i so na g a ro rc e l lc l u m p si nl i q u i dw e r e b r i g h ty e l l o w i ft h ec o n c e n t r a t i o no fs e a w a t e rw a sm o r et h a n7 0 ，t h ec o l o ro f s w a r m so rc l u m p sc h a n g e dt ol i g h tt a n t om a k eac o m p a r i s o n ，h w - 1a n ds m p 2 山东大学博士学位论文 w e r eb o t hi n o c u l a t e do n t ov y 2a g a rs u p p l e m e n t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f s o d i u mc h l o r i d e 州a c l ) j u s ta si i z u k ad e s c r i b e d ，h a l i a n g i u mo c h r a c e u ms t l 面n s m p - 2i sa no b l i g a t eh a l o p h i l e t h es t r a i nw a su n a b l et og r o ww i t h o u tn a c i t h e n a c lc o n c e n t r a t i o nr e q u i r e df o rg r o w t hr a n g e df r o m0 2 t o5 w i t ha l lo p t i m a l c o n c e n t r a t i o nb e t w e e n1 a n d3 o nt h eo t h e rh a n d m y x o c o c c u sf u l v u ss t r a i n h w - 1c o u l do n l yt o l e r a t en a c ic o n c e n t r a t i o na sh i 曲a s3 w i t ha l lo p t i m a l c o n c e n t r a t i o na t0 - 1 5 h w - 1c e l l sw e r eg r e a t l yc l u m p e dw h e ng r o w i n gi nl i q u i d d v yo rl o ws e a w a t e rh v yb u tm u c hh o m o g e n i z e da th i 曲s e a w a t e rc o n c e n t r a t i o n i nc o n t r a s t s m p - 2g r e wi nt i g h tc l u m p sa ta l lt e s t e ds a l tc o n c e n t r a t i o n s t h el e n g t ho fh w - ic e l l sc h a n g e di nd i f f e r e n tg r o w t hs t a g e s ，b o t hi nl i q u i da n do n a g a r b e s i d e s i nr e s p o n s et os e a w a t e rc o n c e n t r a t i o n ，t h ec e l l sa l s oc h a n g e dt h e i rs i z e i - l o w e xe r a f t e rg r o u c h ，a l m o s ta l lt h ec e l l s ，w h e t h e ri n i t i a l l yl o n go rs h o r t ，i nl i q u i do r o na g a r s h o r t e n e di n t os p h e r e so ro v o i d s ，s i m i l a ri ns i z e ( 1 2 - 1 8l a mi nd i a m e t e r ) t o t h em ) x o s p o r e sf r o mt h ef r u i t i n gb o d i e s b yc o n t r a s t ，s m p - 2h a de s s e n t i a l l yn o c h a n g eo t i t sc e l ls i z ei nr e s p o n s et od i f f e r e n ts e a w a t e rc o n c e n t r a t i o n s i nt h ef r u i t i n g b o d 3 一l i k e s t r u c t u r eo fs m p - 2o na g a r , o ri na g e dl i q u i dc u l t u r e ，t h ec e l l sw e r c s h o r t e n e di n t oo 、o i d s t h ef m i t i n gb o d yf o r m a t i o no fh a l o t o l e r a n th w - 1o n l yo c c u r r e do ns o l i ds u r f a c e s ， s u c ha sa g a r a n dw a ss t r o n g l ya f f e c t e db yt h es a l i n i t y o nd v y - a g a ro rl e s st h a n6 0 h v y - a g a r t y p i c a lf r u i t i n gb o d i e s ，w h i c h w e r eo r a n g er e da n d1 0 0 - 1 5 0p mi n d i a m e t e r “i t hac u s h i o n l i k ep e d i c e l ja p p e a r e do nt h et h i r dd a ya f t e ri n o c u l a t i o n a s t h es a l i n i t yi n c r e a s e d t h ef r u i t i n gb o d yf o r m a t i o nw a sd e l a y e da n dt h ef i n a ls t r u c t u r e b e c a m em o r er u d i m e n t a r y o nm e d i ac o n t a i n i n g2 9 s a l i n i t y ( 8 0 h v y - 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if r o ma g a ro rl i q u i dc o n t a i n i n gh i g hs e a w a t e rc o u l d s u r v i v eh e a t 。t r e a t m e n ta t6 0o