（水生生物学专业论文）海带“单倍体十号”cdna文库构建及est序列分析.pdf

海带“单倍体十号 c d n a 文库构建及e s t 序列分析 摘要 海带是一种重要的大型经济海藻，我国海带养殖面积、养殖产量均居世界首 位。海带可作为食品、化工原料、心血管药物等，在国民经济和人民生活中发挥 着不可替代的作用。海带生物量巨大，是太平洋和大西洋暖温带海域潮下带的重 要初级生产力，其与生活的海洋环境形成了具有高生物多样性和高生产力的生态 系统。海带生活史中典型的异型世代交替现象以及孤雌生殖和无配生殖现象，也 使之成为藻类学和遗传学研究的良好模型生物。 海带富含多糖和酚类物质、染色体数目众多( 2 n = 4 4 ) 、且基因组巨大 ( 4 3 4 m 7 2 0 m b ) ，为海带的分子遗传学研究带来了诸多的难题。迄今为止，海 带基因及新型分子标记研究工作进展极为缓慢。目前，已公布的e s t ( e x p r e s s e d s e q u e n c et a g s ) 数量仅为3 4 9 6 条，可以直接应用于遗传性状研究的s s r 标记尚 未见报道。 本研究以海带“单倍体十号 ( 雌性配子体克隆) 为实验材料，构建了其 e d n a 文库，并对文库进行了e s t 测序和生物信息学分析。得到主要实验结果 如下： ( 1 ) 对分别采用改良的异硫氰酸胍法、t r i z o l 法以及t o t a lr n a 提取试剂盒 法三种方法提取的总r n a ，进行紫外吸收检测和电泳检测。结果表明三种方法 均可获得完整的海带配子体克隆总r n a ，尤以改良的异硫氢酸胍法提取的总 r n a 质量最好。 ( 2 ) 通过磁珠法从总r n a 中分离得到m r n a ，使用e d n as y n t h e s i sk i t ( s t r a t a g e n e ) 经过一系列反应合成双链e d n a ，通过q i a q u i c kg e le x t r a c t i o nk i t ( q i a g e n ) 胶回收大于5 0 0 b p 的片段，连接到载体p b l u e s e r i p ti is k ( + ) ，转染 宿主菌d h l 0 be c o l i ，构建了c d n a 文库，获得了1 3 1 x 1 0 6 个原始克隆，重组 率为8 7 。 ( 3 ) 以e d n a 文库为基础，进行随机测序，得到1 4 7 8 个e s t s 。去除载体 序列、低质量序列后剩余大于l o o b p 的有效序列为8 0 5 个。这些e s t s 拼接出的 叠联群( c o n t i g s ) 有7 6 个，单拷贝e s t ( s i n g l e t s ) 有3 2 1 个，做b l a s t x 和n c b i 非冗余蛋白库比对，叠联群和单拷贝e s t 共有1 1 9 个比对上，占3 0 。做b l a s m 和n c b i 非冗余核酸库比对，叠联群和单拷贝e s t 共有5 2 个比对上，占1 3 1 。 在两个数据库中同时能检索到的序列有4 2 个。与d b e s t 中的海带属( l a m i n a r i a ) e s t s 比对，共有5 8 个叠联群和单拷贝e s t 比对上，占1 4 6 。对与非冗余蛋白 库比对上的1 1 9 个c o n t i g s 和s i n g l e t s 做g o 分类( g e n eo n t o l o g y ) ，1 0 9 个可以 在细胞组分( c e l l u l a rc o m p o n e n t ) 、分子功能( m o l e c u l a rf u n c t i o n ) 和生物学过 程( b i o l o g i c a lp r o c e s s s ) - - - 个大类中得到分类，而其余1 0 个c o n t i g s 和s i n g l e t s 则为 未能分类的序列。 本实验所获取的e s t 序列，为海带基因组学研究提供了最为直接的基础信 息，同时也为海带遗传学研究和应用实践奠定了良好的基础。 关键词：海带；单倍体十号；e d n a 文库；e s t c o n s t r u c tio no fc d n al ib r a r ya n da n aiy siso fe x pre s s e d s e q u e n c et a ginh a p10id10o fl a m i n a ri aj a p o n c a a b s t r a c t l a m i n a r i ai so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te c o n o m i cm a r i n em a c r o a l g a , b o t h f a r m i n ga r e aa n dp r o d u c t i o no fl a m i n a r i ao fc h i n ar a n kf i r s ti nt h ew o r l d l a m i n a r i a c a nb eu s e da l sf o o d ，c h e m i c a lm a t e r i a la n dc a r d i o v a s c u l a rd r u g s ，s oi t p l a y sa n i r r e p l a c e a b l er o l ei n t h en a t i o n a le c o n o m ya n dp e o p l e sl i v e s l a m i n a r i a ，w i t h t r e m e n d o u sb i o m a s s ，c o n t r i b u t e sg r e a t l yi nt h ep r i m a r yp r o d u c t i v i t yo ft h es u b t i d a l a r e ai nw a r n lt e m p e r a t ez o n eo ft h eb a c i f i ca n da t l a n t i co c e a n ，a n dc o n s t r u c t sh i g h b i o - d i v e r s i t ya n dp r o d u c t i v i t ye c o s y s t e mw i t hi t s l i v i n g m a r i n ee n v i r o n m e n t h e t e r o g e n e s i s ，p a r t h e n o g e n e s i sa n da p o g a m yo fl a m i n a r i am a k ei tab e t t e rm o d e l o r g a n i s mf o ra l g o l o g ya n dg e n e t i c sr e s e a r c h e s r i c hp o l y s a c c h a r i d e sa n dp h e n o l i cc o m p o u n d s ，n u m e r o u sc h r o m o s o m e s ( 2 n = 4 4 ) ， a n dah u g eg e n o m e ( 4 3 4 m b 7 2 0 m b ) o fl a m i n a r i a ，b r i n gm a n yp r o b l e m sf o rt h e s t u d yo fm o l e c u l a rg e n e t i c so fl a m i n a r i a r e s e a r c h e sf o rl a m i n a r i ag e n ea n dn e w m o l e c u l a rm a r k e ra r e e x t r e m e l ys l o w ；a so ft o d a y , t h eq u a n t i t yo fl a m i n a r i a e x p r e s s e ds e q u e n c et a g sp u b l i s h e di so n l y3 4 9 6 a n dt h e r ea r en or e p o r t sa b o u ts s r m a r k e r st h a tc a nb ed i r e c t l ya p p l i e dt ot h eg e n e t i cc h a r a c t e r i s t i c ss t u d y t h i se x p e r i m e n th a sc o n s t r u c t e dt h ee d n a l i b r a r yf o rh a p l o i d10o fl a m i n a r i a j a p o n i c a ，a n dt h e nc a r r yo u te s ts e q u e n c i n ga n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s t h er e s u l t s a r el i s t e dh e r e ： ( 1 ) e x t r a c tt o t a lr n ar e s p e c t i v e l yb yg u a n i d i n ei s o t h i o c y a n a t e ，t r i z o la n dt o t a l r n ae x t r a c t i o nk i t s ，t h e nc a r r yo u tu vd e t e c t i o na n dg e le l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l t s s h o wt h a ta l lo ft h et h r e em e t h o d sc o u l dg e ti n t e g r a t e da n dh i 曲一q u a l i t yt o t a lr n ao f l a m i n a r i aj a p o n i c ag a m e t o p h y t e ，a n dg u a n i d i n ei s o t h i o c y a n a t em e t h o di st h eb e s t o n e ( 2 ) i s o l a t em r n af r o mt o t a lr n au s i n gm a g n e t i cp a r t i c l e s ，a n ds y n t h e s i z e d o u b l e s t r a n d e de d n aw i t he d n a s y n t h e s i sk i t ( s t r a t a g e n e ) ，t h e nc o l l e c ts e g m e n t s o v e r5 0 0 b pw i t hq i a q u i c kg e le x t r a c t i o nk i t ( q i a g e n ) ，f o l l o w e db yc o n n e c t i n gt o c a r r i e rp b l u e s c r i p ti is k ( + ) a n dt r a n s f e c t i n gd h10 be c o l i f i n a l l yt h ee d n a l i b r a r y i sc o n s t r u c t e d ，w i t h1 31xl0 6c l o n e sa n d8 7 r e c o m b i n a t i o nr a t e ( 3 ) b a s e do ne d n al i b r a r y , l a r g e s c a l es e q u e n c i n gp u t so u t14 7 8e s t s ，8 0 5 v a l i ds e q u e n c e so fm o r et h a n10 0 b pa f t e r w i p i n go f f e a r r i e ra n dl o w q u a l i t y s e q u e n c e sa r eg o t t h e s ee s t ss t i t c ht o7 6c o n t i g sa n d3 21s i n g l e t s 119o ft h ec o n t i g s a n d s i n g l e t s m a t c ha f t e rb l a s t xa n dn c b in o n r e d u n d a n t p r o t e i n d a t a b a s e c o m p a r a t i o n , w h i c ha c c o u tf o r3 0 o fa l l ；5 2o ft h ec o n t i g sa n ds i n g l e t sm a t c ha f t e r b l a s ma n dn c b in o n - r e d u n d a n tn u c l e i ca c i dd a t a b a s ec o m p a r a t i o n , w h i c hi s13 1 4 2s e q u e n c e sc a nb es e a r c h e df r o mb o t ho ft h e s et w od a t a b a s e s 5 8o ft h ec o n t i g sa n d s i n g l e t sm a t c hw h e nc o m p a r e d 谢廿ld b e s to fl a m i n a r i a , w h i c hi s 14 6 o e n e o n t o l o g yo ft h e119c o n t i g sa n ds i n g l e t ss h o wt h a t10 9a t t r i b u t et oc e l l u l a rc o m p o n e n t ， m o l e c u l a rf u n c t i o n , b i o l o g i c a l p r o c e s s sc a t e g o r i e s ，w h i l et h e f u n c t i o no ft h e r e m a i n i n g10c o n t i g sa n ds i n g l e t sa r eu n k o w n t h ee s t sg a i n e dh e r eo f f e rd i r e c ti n f o r m a t i o nf o rl a m i n a r i ag e n o m i c s ，a n dl a y g o o df o u n d a t i o nf o rl a m i n a r i ab i o l o g i c a lr e s e a r c ha n da p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：l a m i n a r i a j a p o n i c a ；h a p l o i d10 ；e d n al i b r a r y ；e s t 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼；翅瀣查甚丝益要赞别直明的：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：加孵年 导师签字 签字日期肿多月明 ，富 盔r 日 巯 肿 海带“单倍体十号”c d n a 文库构建及e s t 序列分析 0 引言 海带是冷水性的大型经济海藻，主要分布在北太平洋与大西洋沿海地区。海 带不仅是一种营养成分丰富的海洋食蔬，同时其富含的褐藻胶、甘露醇、碘、海 藻多糖等经济成分也是医药保健、海藻化工和农业肥料等行业的重要原料；海带 是海洋初级生产者，在提供海洋动物饵料和生活场所的同时，在海洋生态系统中 起着固定光能、吸收二氧化碳、合成有机物质、释放氧气、净化水质、维持生态 平衡等重要作用【1 】。而海带属藻类生活史中特征性的世代交替现象以及孤雌生殖 和无配生殖现象，使之成为了藻类遗传学研究的模型生物。 二十世纪中期我国科技工作者先后攻克了“夏苗培育”、“筏式养殖”、“施肥 养殖”、“南移养殖”等技术难关，实现了海带全人工养殖，并迅速的实现了北起 辽宁、南至广东的大面积养殖，形成了海水养殖的“第一次浪潮”；二十世纪七 十年代末期以来，海带品种培育工作的深入开展，进一步提高了养殖效益，并有 十余个品种实现了大规模养殖生产，海带养殖成为我国海水养殖业的主要支柱产 业之一，海带年产量占我国藻类养殖总产量的6 4 6 5 2 1 。但是由于研究手段以 及研究方式的限制，海带研究工作一直缺乏较为全面的遗传背景信息，无法深入 地阐明某些重要的生物学现象。国内外遗传育种界对分子遗传学的研究也十分有 限，分子育种、数量性状基因定位与杂种优势预测等现代生物技术育种理论与技 术体系尚不完善。开展海带基因研究，进行表达序列标签大规模分析，不仅能够 深层次地探索海带遗传机制与机理，支撑我国海带遗传育种理论，还有助于培育 出优质、高产、抗逆的养殖新品种，从根本上解决我国海带产业“质”、“量 和 “病的问题。 出于解译基因的起源、进化、遗传编码对生命活动表达调控等方面的需求， 基因组研究已进入了一个内涵更丰富、更深刻的阶段。国际上对基因资源研究的 热点逐渐已由阐述基因结构的基因组学转移到功能基因组学研究领域。自e s t 首先被应用于人类基因组作图以来，在新基因克隆、功能分析等方面得到了广泛 的应用，大量研究实例证明，e s t 是了解基因组结构、收集基因组信息和发现新 基因的有效且经济的途径。重要经济和模式生物在完成基因组计划的基础上有机 地再进行e s t 分析和延伸，以及不同组织和不同时期基因表达时空分析，使得 e s t 数据呈指数增长，加强了基因研究的深度与广度。 海带“单倍体十号”c d n a 文库构建及e s t 序列分析 海带属藻类基因组在4 3 4 m b - - 7 2 0 m b 之间，与水稻基因组大小相似，由于基 因组容量大，遗传物质提取纯化困难( 藻体富含多糖) 等原因，国内外对于海带 表达序列标记的研究比较少，目前获得e s t 序列仅有3 4 9 6 条 ( h t t p ：t w w w n c b i n l m n i h g o v ，2 0 0 8 年4 月) ，并且主要集中在对掌状海带 ( l a m i n a r i ad i g i t a t a ) 的研究。因此，可以说海带属藻类的新基因与功能基因研 究的潜力巨大，其基因研究存在着很大的真空。本项研究将以“单倍体十号”为 实验材料建立e d n a 文库，并对测序得到e s t s 序列加以分析，为今后海带功能 基因组学研究、比较基因组学研究和重要性状功能基因的分离、克隆以及用基因 工程方法对海带进行遗传改良打下基础。 海带“单倍体十号”e d n a 文库构建及e s t 序列分析 1 文献综述 1 1 海带生物学特征及概述 1 1 1 海带分类及自然分布 海带在分类学上属于褐藻门( p h a e o p h y t a ) 、褐子纲( p h a e o s p o r e a e ) 、海带 目( l a m i n a r i a l e s ) 、海带科( l a m i n a r i a c e a e ) 、海带属( l a m i n a r i a ) 【3 】。海带属藻 类主要分布在北太平洋与大西洋潮下带海域【4 】。全球( 主要是中国、日本、韩国) 养殖种类主要有真海带( l a m i n a r i aj a p o n i c a ，我国一般称为海带) 、长叶海带 ( l a m i n a r i al o g i s s i m a ) 和利尻海带( l a m i n a r i ao c h t a n s i s ) 等少数几个物种。目 前，我国海带养殖种类主要是真海带( l a m i n a r i aj a p o n i c a ) 及其与糖海带 ( l a m i n a r i as a c c h a r i n a ) 和长叶海带( l a m i n a r i al o g i s s i m a ) 的杂交种。 1 1 2 海带的外部形态 海带( l a m i n a r i aj a p o n i c a ) 孢子体为棕褐色带状，藻体分为固着器，柄和叶 片三部分。固着器位于柄的基部，由许多自柄部分生出的多次分枝的圆柱形假根 组成，假根末端生有吸盘，柄呈圆形或扁圆形。海带为居间生长，生长点位于叶 片靠近柄的基部【5 1 。海带( l a m i n a r i a ，a p o n i c a ) 叶片为带状，可根据纵沟、中带 部、叶缘部、基部等特征以及叶长、叶宽、叶厚、中带部宽度、藻体色泽等指标 进行海带不同养殖品种的区分和鉴定。 1 1 3 海带的繁殖习性及生活史 海带属( l a m i n a r i a ) 藻类为异型世代( 不等世代) 交替，其生活史由大型 的叶状孢子体世代和微小的配子体世代构成。自然界中的海带寿命为跨3 个年度 的两年生活，第一年夏季叶片大部分腐烂脱落，仅残留固着器、柄部和少量的叶 片基部( 生长点部位) ；待秋季水温下降后，基部细胞不断分裂，重新生长出叶 片，至第二年秋季叶片死亡。每年秋季叶片表皮细胞可分化形成孢子囊，并放散 孢子。在人工养殖情况下，海带生命周期仅为跨2 个年度的1 年生活，在夏季水 温达到1 6 左右即可大量收获，水温在1 8 2 0 之间时开始产生孢子囊。当藻 体生长部位产生孢子囊群后，长度生长停止；孢子囊成熟后，大量放散出游孢子； 之后藻体衰老死亡。初期放散出来的游孢子在水中作迅速的波浪式运动，经过一 海带“单倍体十号”c d n a 文库构建及e s t 序列分析 段时间，游孢子附着到基质上，并逐渐萌发成配子体。 配子体形成后便结束了无性世代，配子体向雌雄两个方向分化。海带雌配子 体多数为一个细胞的藻体，为梨形或球形，直径一般为1 1g t m 2 2 9 m ，最初几天， 色素较淡以后逐渐加深，变为棕褐色；雄配子体一般由多个细胞组成，细胞较雌 配子体的小，直径多为5 p m 8 9 i n ，色素较雌配子体的浅。雌、雄配子形成后， 分别排卵、排精，卵子受精形成合子，合子继而萌发形成孢子体。 图1 1 海带的生活史 f i g 1 1l i f ec y c l eo fl a m i n a r i a 1 2 海带配子体克隆技术及其应用 在2 0 世纪7 0 年代之前，许多藻类学家和藻类遗传学家都认为海带不是进行 科学研究的理想材料。海带的孢子体世代特别是成熟的孢子体长度可达几米，很 难在实验室内养殖。而配子体世代是短暂的，在适宜的条件下，两周就能成熟， 不能长期保存1 6 j 。海带以配子体形式存在时间短，在很大程度上限制了对于海带 的科学研究。海带配子体克隆的建立为海带的深入研究提供了可能和支撑。 1 2 1 海带配子体克隆的建立 2 0 世纪7 0 年代方宗熙先生等采用细胞单独分离培养技术，在连续光照，较 高温度( 1 8 。c - 2 2 。c ) 以及维生素c 的条件下成功地培育出海带配子体无性繁殖 系( 即海带配子体克隆) f7 1 。海带配子体克隆是从单个雌配子体或单个雄配子体 海带“单倍体十号”c d n a 文库构建及e s t 序列分析 分别长成的多细胞的复杂的分枝体或簇状体。由于配子体克隆具有发育的全能 性，因而，在正常的培养条件下，无法实现克隆的长期保存。崔竞进、欧毓麟等 通过低温( 4 ) 和弱光 1 2e 斗m o l ( m 2 s ) 3 来抑制海带配子体克隆细胞的生长和 发育，使其进行缓慢的有丝分裂，实现了种质资源的长期保存嘲，这就把短命的 海带配子体转化成长寿的配子体。吴超元等的研究证明打碎接种和通气悬浮培养 可以扩培海带配子体克隆一j 。海带配子体的单细胞分离技术、低温弱光保存技术 和扩增培养技术的应用为海带种质资源的保存提供了切实的技术保证，使利用配 子体进行的科学研究摆脱了季节性的限制。 中国海洋大学在二十世纪八十年代初，率先建立了海带配子体克隆种质资源 库，到目前为止，已保存了海带属8 个种，近2 0 0 个品系的克隆，其中“单倍体 十号等部分克隆的保存时间已近3 0 年，仍保持着良好的生长发育能力【l o l 。 1 2 2 海带配子体克隆的应用 对于自然界生物来说，保护天然群体的基因库，维持生物多样性是种质资源 开发和保护的主题之一【1 l 】。海带配子体克隆长期保存技术的建立，为海带种质库 的建设提供了切实的技术保证，这种能够长期保存并保留着其遗传特性及发育全 能性的特点，对种质资源的保护、遗传多样性的研究及育种工作具有重要的意义。 1 2 2 1 海带配子体克隆在生理、生化和遗传学研究中的应用 由于海带孢子体组织培养技术尚不完善，且海带孢子体细胞富含多糖等物 质，在核酸提取、纯化方面也有难度，而利用配子体克隆提取核酸，用分子标记 技术，获得种( 品) 系的特征图谱，用以研究海带遗传多样性和辅助育种，是一 项可靠有效的方法【1 2 】。另外，海带配子体克隆也是进行原生质体培养研究的方 便材料，秦松等( 1 9 9 5 ) 用酶法从海带雌配子体单性生殖系分离出了雌性单倍体 原生质体【1 3 1 。 1 2 2 2 海带配子体克隆在育种中的应用 1 2 2 2 1 单倍体育种 海带配子体克隆在生殖隔离的条件下，可进行单性生殖，发育成孢子体。海 带单性生殖的特点类似于高等植物的花粉及胚珠培养，都是在雌雄隔离的条件 下，调控其环境及营养条件，使其进行发育，培育成正常植株。 雄配子体克隆在长时间培养下，多细胞分枝顶端细胞可经无配生殖，直接形 海带“单倍体十号”e d n a 文库构建及e s t 序列分析 成雄性孢子体，但其染色体为单倍数，经海上养殖，发现不能形成孢子囊1 4 , 1 5 】。 雌配子体产生的卵子未经受精可直接发育成孢子体( 即孤雌生殖) 。有关海 带孤雌生殖的研究开展较早，海带雌配子体克隆在6 1 6 c ，2 0 0e 1 t m o l ( m z s ) 和 9 1 0 h 的光照下，能够进行孤雌生殖，发育成为孢子体，但通常染色体为单倍数； 部分个体经自然加倍，染色体为二倍数，能够长成正常、成熟的孢子体，且形成 的孢子全部发育为雌配子体，由此完成了海带雌性生活史【1 6 ，1 1 ，18 ，1 9 ，2 0 】。利用克隆 进行孤雌生殖，可形成纯系的雌性孢子体【2 1 】。 “单海一号”是用海带单倍体做材料经过与一棵杂种海带杂交和连续五代的 自交而于1 9 8 3 年选育出来的一个海带新品种，是单倍体育种在海藻中首次获得 的成功。该品种具有叶片较厚、厚成较好、叶柄扁圆、叶片基部圆形，中带部较 宽，藻体韧性大、后期脱落较轻、抗烂能力强，成熟较早、孢子囊面积大等特点。 “单海一号”的亲本是纯系雌性孢子体，此纯系起源于一个雌性配子体克隆f 2 2 1 。 1 2 2 2 2 杂种优势育种及杂交育种 杂种优势育种是利用不同品系的雌雄配子体克隆杂交，进行有性生殖培育海 带品种的技术。该技术既能解决连续自交造成海带遗传基因( 数量性状) 因纯一 造成的性状退化，有效的进行了海带品系间的基因重组，有利于基因间的修饰和 互补，对于培育高产海带品种有重要的意义1 2 3 】。 “单杂十号”是首次培育出的具有明显杂种优势的子一代。在1 9 8 2 年1 9 8 3 年由两个纯系杂交所产生的一个杂交种，因此孢子体群体的形态非常一致，这是 一般海带品种达不到的，同时其产量比推广的优良品种增产6 0 以上【2 4 】。“单杂 十号”的母本是“单倍体十号 ( f h l 0 ) ，父本是m h j 。f h l 0 是中国海洋大学海 洋生物遗传育种研究室培养的第1 0 号雌配子体克隆，m h j 是1 9 8 1 年从日本北 海道引进的雄配子体克隆。本实验所用实验材料即f h i o 。 “荣福”海带是1 9 9 7 年利用海带福建种( l a m i n a r i aj a p o n i c a ) 雌配子体克 隆和“远杂1 0 号”海带雄配子体克隆进行杂交，获得杂种f 1 ，经过6 年的选择 育种，于2 0 0 3 年育成耐高温、高产品种。藻体浓褐色、根系发达、柄扁平、基 部圆平、藻体较宽、中带部明显。 “9 0 1 ”海带是日本长叶海带( l a m i n a r i al o g i s s i m a ) 雌配子体克隆和海带 ( l a m i n a r i a j a p o n i c a ) 早厚成品种雄配子体克隆杂交，经连续五年的自交选育获 6 海带“单倍体十号”c d n a 文库构建及e s t 序列分析 得的生长速度较快的品种。藻体色泽浓褐、个体宽大、纵沟较明显、基部终身楔 形，近基部l m 处呈微弧形。 “东方二号 海带是2 0 0 1 年利用长叶海带( l a m i n a r i al o g i s s i m a ) 雄配子体 克隆和海带( l a m i n a r i a j a p o n i c a ) 杂雌配子体克隆交育成的海带品种。藻体深褐 色、假根发达、柄部粗扁、基部近圆形、纵沟明显、叶片无斑点。 1 2 2 2 3 远缘杂交育种 远缘杂交是利用地域分布隔离的不同品种海带克服远缘不育杂交技术。利用 太平洋物种海带( l a m i n a r i aj a p o n i c a ) 雌配子体克隆与大西洋物种糖海带 ( l a m i n a r i as a c c h a r i n a ) 雄配子体杂交，再经自交选育出远缘新品种“远杂1o 号”， 远缘杂交技术扩大了海带种之间的基因交流与重组，用于海带品种选育，达到世 界先进水平。远缘杂交培育的品种比生产品种每亩增产5 0 0 公斤以上，增幅3 0 左右，并具有藻体较厚、厚成期早的特点 2 5 1 。 1 3 基因文库 基因文库是指采用体外克隆技术得到的一个重组d n a 分子群体。群体中的 每个重组分子独立寄存在适当的宿主细胞中，通过这些宿主细胞繁殖，不仅能使 文库中的各种d n a 分子得到维持和拷贝数扩增，而且还可以通过对这些宿主细 胞的基因型或者表达产物的检测分析，从文库中分离出人们感兴趣的目的基因， 开展进一步的理论和开发研究。 由于基因文库在生物学研究领域的广泛应用，围绕最大限度发挥基因文库应 用价值的目标，目前已发展出许多专门的综合技术。概括起来可分为两大部分： 一项是基因文库的构建技术；另一项是目的基因分离技术，即如何快捷高效地从 文库中获得有关目的基因的序列及功能方面的信息。 按组成基因文库的重组d n a 片断的供体来源，基因文库可分为基因组文库 和e d n a 文库两大类。 1 3 1 基因组文库和c d n a 文库 在基因组文库中，重组的d n a 片断来源于某种特定生物个体的基因组 d n a 。将提取出来的染色体基因组d n a 经过机械剪切或适当的限制性内切酶消 化处理，形成一定大小的d n a 片断，将这些d n a 片断克隆到高容量载体上， 7 海带“单倍体十号”e d n a 文库构建及e s t 序列分析 将带有基因组d n a 片断的载体导入适当宿主细胞中，使重组d n a 片断克隆化， 即可获得一个包含该生物个体基因组全部序列信息的基因组文库。基因组文库主 要用于基因组物理图谱的构建、基因组序列分析、基因在染色体上的定位以及基 因组中基因的结构和组织形式分析等方面。此外，基因组文库在克隆、鉴定基因 调控元件上也有特别的用途。 c d n a 文库中重组d n a 片断来源于细胞中表达的m r n a ，将某一特定类型 细胞表达的m r n a 经反转录酶催化形成与之互补的e d n a ，重组克隆后得到的。 e d n a 文库反映的是来源细胞当时基因组表达出的基因序列信息。e d n a 文库在 研究特定类型细胞基因组的表达状态以及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的 优势，尤其在制备e d n a 探针或在细菌中表达高等生物的基因时，e d n a 克隆是 必需的。在真核生物的基因组中含有大量的间隔序列，而原核生物如大肠杆菌尚 未发现有类似的序列存在。因此，大肠杆菌不能够从真核基因的初级转录本上去 除间隔序列，而成熟的m r n a 分子，其间隔序列已在拼接过程中被删除，因此 使用m r n a 为模板反转录的e d n a ，为真核生物基因在原核生物细胞内表达提 供了基础。另外，由于e d n a 文库要比基因组d n a 文库小，因此在基因的克隆 和筛选方面具有很大的优势【2 6 】。 1 3 2e d n a 文库的载体系统【2 6 1 e d n a 文库有多种载体系统，主要包括九噬菌体、质粒、噬菌粒、反转录病 毒等。 以九噬菌体作为文库的载体，插入片段的装载容量大，适合于全长e d n a 的克隆。重组子经专门的体外包装系统包装成有感染能力的噬菌体颗粒，对宿主 菌大肠杆菌的转染效率高，且通过对转染细胞的表型鉴定，如蓝白斑分析，可较 为简单地反映出文库中含有插入片段的实际情况，有较好的质量控制指标。故用 九噬菌体构建的e d n a 文库质量高，代表性好，且文库以噬菌体颗粒的形式存在， 其感染活性在4 c 环境中极其稳定，非常适合文库的长期保存。但九噬菌体文库 的筛选方法有限，文库中许多d n a 片段在宿主细胞中常常无法获得功能性表达， 因此在功能基因组学研究中，其实用价值受到了影响。 与九噬菌体载体系统相比，质粒载体系统的体外操作简便，在其本身的设计 上可塑性大。用质粒载体构建e d n a 文库，能进行e d n a 的功能性筛选，即能 海带“单倍体十号”e d n a 文库构建及e s t 序列分析 够利用基因在体内体现其生物学功能的生化基础，从文库中分离鉴定出目的基 因，也即利用基因编码产物在体内发生的各种蛋白质一蛋白质、蛋白质一核酸等 生物分子间的相互作用，使用一种生物分子作为靶分子，从表达的e d n a 文库 中检测出与靶分子发生相互作用的编码产物，进而分离出目的基因。当然，要实 现e d n a 的功能性筛选，文库中的c d n a 序列必须能在宿主细胞中进行功能性 表达，产生具有天然构象的编码产物，且在检测出目的功能表型的同时，能直接 获得编码基因。尽管质粒载体系统有其优点，但也有缺点，其载体容量较小，也 即插入的片段较小，大片段的重组克隆在文库的群体扩增过程中容易丢失。另外， 质粒构建的c d n a 文库只能通过转化方式导入宿主细胞中，而目前常用的转化 方式效率较低，因而导致文库的库容量相对较小，且质粒文库的保存条件严格， 需要以活转化菌的形式保存和扩增，质粒文库会因部分转化菌死亡而不适宜长期 保存。 噬菌粒载体系统用于利用噬菌体表面展示系统构建和筛选表达的e d n a 文 库，它具有与质粒文库类似的缺点，由m 1 3 噬菌体衍生而来。 以逆转录病毒构建的表达载体，其载荷目的基因的表达效率，取决于载体本 身的结构及寄主细胞的种类。这种类型的表达载体，侵染的细胞谱广，对细胞的 感染率高，且因转染进宿主细胞的重组病毒基因能高频地整合到宿主细胞基因组 中而易构建出宿主细胞稳定表达的c d n a 文库，因而功能基因对宿主细胞产生 的表型影响是长效的，利于表型改变的检测和目的基因的分离。 1 3 3c d n a 文库的类型 从1 9 7 6 年h o f s t e t t e r 成功地构建了第一个e d n a 文库以来，构建 e d n a 文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期c d n a 文库，由于 当时技术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而 y o u n g 和d a v i s 重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来， c d n a 文库构建的新方法层出不穷，但其共同目的是使c d n a 文库更加迅速、高 效地满足研究的需要。 1 3 3 1“经典 c d n a 文库 构建e d n a 文库时以m r n a 为模板，反转录合成e d n a 第一链，而e d n a 第二链的合成可通过自身引导法、置换合成法或引导合成法进行，双链合成后通 9 海带“单倍体十号”e d n a 文库构建及e s t 序列分析 过分级分离去除小分子双链e d n a ，留下分子量较大的双链e d n a 并对其进行修 饰，使末端平滑化，接上接头，克隆到能在细菌中扩增的载体中。由于目前构建 文库多数采用此种方法，因此称其为“经典”e d n a 文库法。随着分子生物学的 发展，“经典 e d n a 文库的构建方法有了很大的改进，但仍存在不足：第一， 低丰度表达序列在文库中出现的几率很低；第二，文库克隆的片断一般较小，单 个克隆上的d n a 片断太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能 覆盖一个完整的全基因e d n a 2 7 2 引。本实验即利用此种方法构建c d n a 文库并对 其进行随机e s t 测序。 1 3 3 2 全长e d n a 文库( f u l ll e n g t he d n a l i b r a r y ) 全长e d n a 文库，是指从生物体内一套完整的m r n a 分子经反转录而得到 的d n a 分子群体，是m r _ n a 分子群的一个完整的拷贝。全长e d n a 文库不仅 能提供完整的m r n a 信息，而且可以通过基因序列比对得到r n r n a 剪接信息， 此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因 的功能等【2 9 】。目前已有多个物种构建了全长e d n a 文库，为新基因功能的研究 奠定了基础。如胡乐琴等( 2 0 0 6 ) 利用s m a r t 技术构建了海带配子体e d n a 全 长文库；王昆等( 2 0 0 6 ) 构建了人参叶的全长e d n a 文库并对部分克隆进行 了分析 3 1 】；董志敏等( 2 0 0 6 ) 构建了大豆叶的全长e d n a 文库并进行了鉴定f 3 2 1 。 1 3 3 3 均一化c d n a 文库( e q u a l i z e de d n al i b r a r yo rn o r m a le d n al i b r a r y ) 均一化e d n a 文库又称为等量化e d n a 文库，是指某一特定组织或细胞的 所有表达基因均包含其中，且在e d n a 文库中表达基因对应的e d n a 的拷贝数 相等或接近。b i s h o p ( 1 9 7 4 ) 基于d n a r n a 杂交的研究就已经将基因的转录 水平分为高中低3 类。随后研究进一步表明，绝大多数基因是处于中等或低等 表达丰度的，在单个细胞中含有近1 1 5 个拷贝，而高丰度表达基因的转录产物 在单个细胞中最高可达5 0 0 0 个左右拷贝，约占总表达量的2 5 3 3 】。这种基因表 达能力上的巨大差异成了获得一个具有完整代表性的e d n a 文库的障碍，其表 达量上的巨大差异更为大规模研究增添了困难。对单一组织的e d n a 文库而言， 高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选、鉴定以及大规模的e s t 测序带来了 不必要的浪费。 均一化e d n a 文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来 1 0 海带“单倍体十号”e d n a 文库构建及e s t 序列分析 的障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。现在，在构建均一化的 c d n a 文库中至少有2 种主要的观点：一种是基于复性动力学的原理，高丰度的 c d n a 在退火条件下复性的速度快，而低丰度的c d n a 复性要很长时间，从而可 以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组d n a 在拷贝数上具有相 对均一化的性质，通过c d n a 与基因组d n a 饱和杂交而降低在文库中高拷贝存 在的e d n a 的丰度 3 4 , 3 5 】。第一种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言 需要多次摸索才能找到最适条件；而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性 动力学的原理也提出了其不利因素，即采用基因组d n a 饱和杂交的方法会因为 低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。目前己报道的均一化e d n a 文库 多是根据第二种原理构建的。 均一化e d n a 文库具有以下四方面的优点：第一，在经济上具有广泛的应用 空间，可以节约大量试验成本；第二，增加克隆低丰度m r n a 的机会，适用于分 析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测；第三，与原始丰度的