（微生物学专业论文）利用啤酒废酵母制备多肽的研究.pdf

贵州大学硕士论文 中文摘要 啤酒废酵母多肽是利用啤酒废酵母中所含的丰富蛋白质，经过自溶、酶解精 制以后得到的一类多肽。本试验研究了自溶法、酶水解法( 木瓜蛋白酶、菠萝蛋 白酶) 制备啤酒废酵母多肽的工艺及啤酒废酵母多肽的分离纯化和其生物活性的 测定。 通过正交实验得到最佳的自溶条件为：p h 值6 0 ，温度为4 5 1 2 ，n a c l 用量 为4 o ，在此条件下测得多肽得率为4 9 8 7 同时利用响应面法分析了酶解温 度，p h ，酶用量对木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解的影响，井锝到了酶水解啤酒废 酵母蛋白的最佳工艺木瓜蛋白酶水解的工艺参数为：酶解温度为5 8 ，p h 为 7 0 5 ，酶用量为3 0 3 ，在此条件下测得多肽得率为5 2 1 3 。菠萝蛋白酶的工 艺参数为：酶解温度为4 l ，p h 为6 5 8 ，酶用量为2 6 2 ，在此条件下水解测 得多肽得率为5 0 9 7 利用等电点法去除啤酒废酵母多肽液中的核酸。采用颗粒活性炭对啤酒废酵 母多肽液进行脱色，经过实验确定最佳的脱色条件：活性炭用量为3 ，脱色温 度4 5 c ，吸附时间3 h ，p f l 3 0 。在此条件下脱色，脱色率较高为8 0 左右，而 肽损失率相对较低为6 左右 ， 对所缛到的多肽采用凝胶层析分离，得到1 4 种不同的肽产品，并检测了它 们的总抗氧化活性，其中组分e ，f ，m ，d ，6 的抗氧化活性较强利用氨基酸自 动分析仪测定了啤酒废酵母多肽液的氨基酸组成及其含量 研究了真空干燥、真空冷冻干燥对多肽的干燥效果发现真空干燥所得产品 颜色色泽深，并且干燥温度较高，可能会对多肽的活性有所影响，而真空冷冻干 燥能形成均匀细微的粉末，并且能在低温下将产品冻干，能极大程度地保护多肽 的活性。因此选择真空冷冻干燥对多肽进行干燥 关键词：啤酒废酵母多肽：木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶：分离纯化 贵州大学硕士论文 a b s t r a c t t h ew a s t eb e e ry e a s tp o l y p e p t i d e sa r e ag r o u po fa c t i v ep e p t i d e sm a k e n f r o mw a s t eb e e rp r o t e i nb ya u t o l y z i n go rh y d r o l y s i s 。t h e yw e r es t u d i e di nt h i s p a p e rt h a tt h ep r e p a r a t i o nt e c h n i q u e so fp o l y p e p t i d e sm a k e nb ya u t o l y z i n g a n dh y d r o l y z i n gw i t hp a p a i no rb r o m e l a i nt o g e t h e rw i t ht h ei s o l a t i o nm e t h o d s a n dt h em e a s u r a t i o no fb i o l o g ya c t i v i t i e so fp o l y p e p t i d e s t h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h eo p t i m u ma u t o l y z i n gc o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w s ：p h 6 0 ，t e m p e r a t u r e4 5 ，c o n c e n t r a t i o no fn a c i4 1 1 1 ey i e l d so f p e p t i d e sw e r e4 9 8 7 u n d e rt h i s c o n d i t i o n t h eh y d r o l y s i s t e c h n i q u e p a r a m e t e r ss u c ha st e m p e r a t u r e 。p h a n dc o n c e n t r a t i o no fe n z y m ew e r e o p t i m i z e dw i t hr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y t h eo p t i m u mh y d r o l y s i s c o n d i t i o n so fp a p a i nw e r ea sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e 5 8 c ，p h 7 0 5 ，c o n c e n t r a t i o n o fe n z y m e 3 0 3 w i t ht h ey i e l d so fp e p t i d e s5 2 1 3 w h e n 托c o m e st ot h e b r o m e l a i n t h ey i e l d so fp e p t i d e sw e r e5 0 9 7 w i t ht h eo p t i m u mh y d r o l y s i s c o n d i t i o n s ：t e m p e r a t u r e4 1 ，p h 6 5 8 ，c o n c e n t r a t i o no f e n z y m e 2 6 2 b yi s o e l e c t d cp o i n tm e t h o dt h en u c l e i ca c i dw a sr e m o v e di nt h es o l u t i o n o fw a s t eb e e ry e a s tp o l y p e p t i d e s 1 1 1 ea c t i v a t e dc a r b o nw a su s e dt od e c o l o u r t h el i q u i do fw a s t eb e e ry e a s tp o l y p e p t i d e sa n dt h eb e s tc o n t i t i o n sc a nb el i s t a sf o t i o w s ：q u a n t i t yo fa c t i v a t e dc a r b o n3 s o l u t i o np h 3 0 t e m p e r a t u r e4 5 c a n da d s o r p t i o nt i m e3 h u n d e rt h i sc o n d i t i o n 。t h ed e c o l o d n gr a t ew a sa r o u n d8 w h i l et h el o s sr a t eo fp e p u d e sw a s6 a p p r o x i m a t e l y 1 4k i n d so fp o l y p e p t i d e sw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e db yg e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p ha n dt h et o t a la n t i o x i d a t i o nw a sm e a s u r e dw h i c hi n d i c a t e dt h a t t h et o t a la n t i o x i d a t i o no fe f 。m ，d 。gc o m p o n e n t sw a sh i g h e rt h a no t h e r s t h ec o n t e n to fa m i n oa c i dw a st e s t e db ya u t o m a t i ca m i n oa c i da n a l y z e r d e s i c c a t i o n so fp o l y p e p t i d e sw e r em a k e nb yv a c u u md r y i n ga n dv a c u u m f r e e z e - d r y i n g t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em o t h o do fv a c u u mf r e e z e - o r y i n g w a sb e t t e rt h a nv a c u u md r y i n gb e c a u s et h ef o r m e rc a np r o t e c tt h ea c t i v i t i e so f 砬 贵州大学硕士论文 p o l y p e p t i d e sc o m p e l e t l yf o rn sl o w e rt e m p e r a t u r e k e yw o r d s ：w a s t eb e e ry e a s tp o l y p e p t i d e s ；p a p a i n ；b r o m e l a i n ；i s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o n 利用啤酒废酵母制备多肽的研究 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 ，苦文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究曾做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：蕉亟堑日期：! ! 12 生旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：煎垂益导师签名：滞逾血 剥用啤冠废酵母制备多肚的研究 1 1 生物活性肽概述 第一章文献综述 肽的分子量一般在1 8 0 5 0 0 0 之间分子量在1 0 0 0 5 0 0 0 之间的称为大肽。 分子量在1 8 0 1 0 0 0 之间的称为小肽、寡肽、低聚肽，也称为小分子活性多肽。 生物学家将肽称为“氨基酸链”，将小分子活性多肽统称为“生物活性肽”。生 物活性肽是具有氨基酸顺序的多肽，通过体内消化释放，并在动物的肠道消化过 程中，充当新陈代谢的潜在生理效应物【l 】科学家们研究发现，食物蛋白并非需 要在肠道中彻底分解为游离氨基酸后才能被机体吸收和利用。许多蛋白质分子隐 含着某些活性片断，它在消化过程中释放出大量短链多肤物质，对人体具有多种 生理调节作用，这些活性肽进入人体后，可产生类似激素的作用某些食物蛋白 质( 如酪蛋白、卵蛋白、胶原蛋白、鱼肉蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白等) 能 通过酶解释放出一些生物活性肽。这些活性肽容易被人吸收，同时还有去除自由 基、抗衰老、增强免疫、降血压、降血脂、降血糖、减肥、抗动脉粥样硬化、抗 氧化、防治心脏病、调节胃肠功能、促进钙及微量元素吸收等多种生理功能调节 作用，这些功能都是原蛋白质及组成的氨基酸所不具备的 生物活性肽具有某些生理活性作用，包括免疫调节作用、抗菌作用、抗肿瘤 作用及其提高机体免疫力等人们研究发现，人类摄入的蛋白质经消化酶作用后， 不是象以前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽的形式吸收 聊3 1 1 4 以游离氨基酸形式吸收的比例很小，且肽比游离氨基酸消化更快、吸收 更多这表明肽的生物效价和营养价值比游离氪基酸更高。自此，肽被吸收的观 点引起人们的重视，其生理功能研究也变得活跃起来。 目前，生物活性肽引起食品学术界的广泛重视，而对蛋白质营养价值的评价 也从蛋白质的消化性、氮基酸组成及含量发展到蛋白质序列中某些特定小肽的生 理保健功能上来，实现了蛋白质生物化学、生理学与营养学的一大飞跃1 9 8 6 年的诺贝尔生理学奖颁给了第一位发现多肽生长因子的科学家，以表彰他为基础 科学研究开辟了一个具有广泛重要性的新领域【卯 利用啤酒废酵母制各多肚的研究 1 1 1 生物活性肽的性质及其生理功能 无论是从结构还是从功能来说，生物活性肽都是自然界中存在种类最多，功 能最复杂的一类化合物。这些活性肽包括从简单的二肽到复杂的线性、环形多肽， 有的多肽其氨基酸残基还进一步被糖苷化、磷酸化，以不同的形式参与生物体的 生命活动。结构的多样性和复杂性正反映了活性肽在细胞生理与调节代谢功能等 方面的重要性，大量的研究证实了活性肽有促进免疫功能、提高激素活性、抑制 酶活、抗菌、抗病毒、降血脂、降血压等作用。 随着对活性肽功能研究的不断深入，人们发现当人体缺乏某些调节人体生理 机能多肽时会导致人体机能的失调，因此，在以营养为基础的食物能满足人体必 需氨基酸的需要后，适当补充某些活性肽则可提高体质、增强防病抗病的能力， 从而改善人们的生活质量。现代人体缺乏的肽主要是：调节免疫功能的活性肽， 促进能量代谢的活性肽，阻止胆固醇吸收并排出体外的活性肽，激活胰岛分泌、 调节血禧的活性肽，调节人体内分泌的活性肽，调节人体胃肠功能紊乱的活性肽， 能抗病毒的活性肽，降血压的活性肽等等表卜1 是几种生物活性多肽的种类及 其功能。 表卜1 几种主要的生物活性肽 t a b l e1 - 1 s e v e r a lm a i nb i o l o g i c a la c t i v ep o l y p e p t i d e s 种类生理功能 营养肽 免疫肽 促生长肽 抗高血压肤 抗菌肽 以提供肽类营养或提高营养物质的吸收、转化和利用率为主的 一些活性肽类，主要包括三种：易消化吸收肽、消化吸收调节 肽、矿物元素吸收促进肽 通过直接或问接途径促进或调节特异性免疫和非特异性免疫 功能的活性肽类，具有巨噬细胞的吞噬能力和抑制肿瘤细胞的 生长包括阿片肽、囊素三肽、胸腺肽、脾脏活性肽、谷胱甘肽 能促进细胞的生长分化能刺激对人体有益菌乳酸菌族的生长 能抑制血管紧张素i 转化酶( a c e ) 的活性来体现降血压功能 具有抗菌作用 2 利用啤酒废酵母制各多肚的研究 1 1 2 生物活性肽的制备 人类获得活性肽的方法主要有三种：提取存在于生物体中的各类天然活性 肽( 激素类、酶抑制剂等) ；分离消化过程中产生的或体外酶解蛋白质产生的肽； 通过化学法( 液相或固相) 、酶法或重组d n a 技术合成的肽。合成法虽可按人们 的意愿合成任意活性肽，但目前大都因成本高、副反应物多以及残留化合物等问 题而受到制约，其中，重组d n a 技术如果成功，将会有广阔前景，但其安全性还 需要进行研究【q 目前生物活性肽的生产主要采用酶水解法。酶法水解可以在不降低营养价值 的前提下改善蛋白质的理化和功能性质，扩展在食品加工中的应用范围。而且酶 解法生产活性肽安全性极高、价格低廉、易于推广有关酶法有限水解制得肽类 的研究在近十多年内受到广泛重视【刀过去对利用贮藏蛋白如大豆、玉米、小麦 等种子蛋白和动物营养蛋白及乳蛋白水解制备生物活性肽一直未给予应有的注 意，但是现在，人们逐渐注意到在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区， 选择适当的蛋白酶水解这些多肽，有可能将其释放出来，从而制备各种各样的生 物活性肽。较之酸水解和碱水解，酶法水解蛋白质具有多种优点：蛋白质的酶水 解是一种不完全、不彻底的水解。其产物主要是肽而不是氨基酸：反应条件温和， 反应时间短，效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸：产品纯度高，产物易 分离，成本低廉等【盯 1 1 3 生物活性肽的研究现状 活性肽是一类多功能因子，它涉及了一系列身体代谢和生理调节功能自从 生物化学家用人工方法合成多肽4 0 多年以来，伴随着分子生物学、生物化学技术 的飞速发展，人们已发现数万种多肽。肽能促进食品微生物的生长和代谢，有报 道表明大豆肽具有促进食品微生物( 如乳酸菌) 生长发育和活跃代谢的作用，相 同氨基酸组成的大豆蛋白质和氨基酸混合物无此效梨，】日本木本夫报道，大豆 多肽可以促进乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌和霉菌的增殖，并能促进面包酵母的产 气作用。寡肽能促进瘤胃常驻菌群的繁殖，有研究表明肽对瘤胃微生物生长的主 要效应是加速微生物繁殖速度，缩短细胞分裂周期。某些肽具有一定的免疫功能， 3 利用啤酒废酵母制各多肽的研究 g a t t e g n o 等 1 0 】从人酪蛋白水解产物中分离出具有免疫刺激功能的活性肽代建 哥】对仔猪的实验表明，注射猪胰多肽粗制品可以提高仔猪血清球蛋白水平， 增强仔猪的免疫功能。肌肽能够抑制幼鼠的过敏反应，但增强老龄鼠的免疫反应， 并且通过活化t 、b 淋巴细胞而发挥免疫调节作用【i ”肽对组织的生长也有一定 的影响。近年来的研究表明，血液循环中的寡肽能直接参与组织蛋白质的合成。 肽具有抗氧化和生物防御作用这早已被证实了，7 0 年代末k i s s o n r h e e 发现大豆 粉、大豆浓缩蛋白和分离蛋白含许多水溶性和醇溶性的抗氧化物质。c h e n 1 3 】从 大豆蛋白b - c o n g l y c i n i n 的水解物中分离出6 种抗氧化活性多肽。k u n i o s u e t s u n a 掣1 4 】用胃蛋白酶降解牛乳酪蛋白，并从酶的降解产物中分离纯化得到了具有清 除自由基活性的六肽：t y r p h e _ t y r p r o - 6 l u l e u 其清除羟基和a p p h 基的活性 比谷胱甘肽和肌肽都高张日俊等【l 习从豆粕、牛奶和鱿鱼废弃蛋白中均降解出 谷胱甘肽( 6 s h ) 寡肽在动物中的应用也很广泛，如可提高动物生产性能，对 反刍动物的吸收代谢有重要的作用，还可以减少仔猪的腹泻及促进一些动物的骨 骼生长、提高蛋壳品质旄用晖等【嘲研究表明，在蛋鸡日稂中添加小肽制品后 血浆中铁、锌的含量显著高于对照组，蛋壳强度提高。 近年来在日本和中国己开始使用糖肽辅助治疗肿瘤，其作用机理就是使淋巴 系统活化生物活性肽也己成为食品学界研究最为热门的课题之一。日本以活性 肽为功能因子开发出了低抗原食品、婴儿食品、流动食品、运动食品、促钙吸收 食品、降压食品、醒酒食品等一系列的产品【1 7 】，取得了良好的社会效益和经济 效益在我国，肥胖、心脑血管疾病等。富裕病”及由于人口老龄化而致的各种 “老年病”已成为严重的社会问题【1 盯，急需功能性保健食品进人市场用于食 品的活性肽一般由蛋白质酶解制得，因原料蛋白、所用酶类及分离精制方法的不 同可得到不同的产品，这些具有促进吸收、降血压、调节血清中血脂水平、促进 钙质吸收等功能，除此以外，它们还具有较好的酸、热稳定性和水溶性，以及粘 度随浓度变化不明显等优点，因而易于作为功能添加剂用于各种食品，故乐于被 生产厂家和消费者所接受，极具市场前景。目前已从酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋 白、豌豆蛋自、玉米蛋白、卵自蛋白、丝蛋白、胶原蛋白、水产蛋自等的酶解物 中制得一系列功能各异的生物活性肽 近年来，人们对于大分子蛋白质和氨基酸并不缺乏，而比这些更高级的功能 4 利用啤酒废酵母制备多肚的研究 营养、活性营养即小分子活性肽却很缺乏。因膳食结构的改善和饮食观念有误区。 出现很多“现代病”，如高血压、高血脂、高血糖、动脉粥样硬化、心脏病、癌 症等。大量的科学实验证明肽类物质，具有调控这些疾病的功能。随着生物技术 的进步和生命科学的发展，生物体内活性肽的生理功能受到越来越多的重视。现 代人生活节奏快，压力大加上环境污染，给人体带来前所未有的危害，使人体合 成肽的能力大大减弱或停顿或丧失。因此，也出现了像内分泌失调、神经系统失 调等疾病，出现诸多的“现代怪病”。因此，人类靠自身合成的肽来调节身体的 生理功能已不能满足其需要，必须靠人工体外合成的生物活性肽来弥补体内缺 肽，以促进人体生理功能的发挥。目前世界上有2 0 0 0 多种病毒在向人类进攻，为 了增强人体对外界细菌病毒进攻的抵抗力，用体外合成的肽来补充人体调节人体 的免疫系统，以防御病毒对人体的进攻 我国有丰富的蛋白质资源，但目前我国对蛋白资源资源的利用率并不高，蛋 白质资源大部分还集中于用传统的技术进行生产加工，利用生物技术进行蛋白质 资源的深加工显得薄弱。以此为突破口，加强高新技术对蛋白质资源的研究开发， 将会有广阔的社会前景和良好的经济效益 1 2 啤酒废酵母的概述 啤酒酵母是啤酒生产过程中的重要副产物之一在锥形大罐啤酒发酵中，每 1 0 0 吨啤酒可得含水8 2 的湿酵母泥2 吨或干燥酵母3 9 0 k g ，其中2 3 是主发酵酵 母，其余1 3 是后发酵酵母，这些在啤酒发酵过程中形成的酵母泥除一部分留作 下一批啤酒发酵接种之用外，大部分作为剩余的酵母泥而排放。我国现有啤酒 企业5 0 0 多家，2 0 0 6 年年产啤酒已达到3 5 1 5 万吨，啤酒废酵母存在于酵母泥中， 其产量一般为2 3 ，即每年有6 0 9 0 万吨酵母泥，如果不对这些废弃物进行综 合利用，势必造成资源的浪费和环境的严重污染许多企业将啤酒废酵母泥经过 简单烘干作为饲料，没有进一步深加工，故没有真正形成对副产物的综合利用 研究发现，啤酒酵母不但可用于生产啤酒，而且还因为其蛋白质，核酸，氨基酸 等物质含量高，并且易于提取。在食品工业和医药工业中有广泛应用，如可用于 提取蛋白质维生素，生产食品添加剂及功能食品等【嘲。对啤酒废酵母的回收 利用不仅可以减轻环境的污染，还能给啤酒厂带来一定的经济效益 5 利用啤酒废酵母制各多肚的研究 1 2 1 啤酒废酵母的营养成分 啤酒酵母的营养成分十分丰富，利用价值很高，富含蛋白质、碳水化合物、 脂肪、粗纤维等多种营养成分，其干燥酵母的具体营养成分见表1 - 2 表卜2 啤酒干酵母营养成分鳓 t a b l e1 - 2 n u t r i t i o n a lc o m p o n e n to ft r yb e e ry e a s t 啤酒干酵母中含有丰富的维生素b 。、晚、b 、b ，：及时酸、泛酸等生理活性物 质( 见表t 一3 ) ，其中麦角甾醇在其他食物中含量比较贫乏但又是人体所必需的 麦角甾醇受紫外线照射后会转化为维生素d ，而维生素d 对骨骼的形成极为重要。 表1 - 3 啤酒干酵母中维生素及生理活性物质含量【捌 t a b l e1 - 3 c o n t e n to fv i t a m i n ea n da c t i v es u b s t a n c ei nt h ed r yb e e ry e a s t 啤酒酵母中的蛋白质含量较高，并含有1 8 种氨基酣2 “2 2 1 ，其中人体必需的8 种氨基酸含量均很高，啤酒废酵母中的氨基酸的组成比例接近联合国粮农组织 ( f a o ) 推荐的理想氨基酸组成值，谷物中缺乏的赖氨酸，啤酒酵母中则含量丰 富因此不论作为人类食品或是动物饲料都有很高的营养价值 1 2 2 啤酒废酵母的综合利用现状 1 2 2 1 啤酒废酵母在食品工业中的应用 啤酒酵母由于所含氨基酸、维生素和矿物质等营养成分比较丰富，因而在食 6 利用啤酒废酵母制各多肽的研究 品行业也有广泛的应用前景。目前，主要应用于生产酵母浸青、天然调味品等营 养食品。 酵母浸膏是借酵母菌体的内源酶( 蛋白酶、核酸酶、碳水化合物水解酶等) 将菌体的高分子物质水解成小分子而溶解所得的物质杨李益【2 3 】等对酵母浸膏 的生产工艺进行了研究。为了去除酵母泥中残余的酒花苦味，须对废弃啤酒酵母 进行预处理，比较简单的方法是采用小苏打处理啤酒废酵母，但s h o t i p r u k a 【卅 发现采用旋转式微滤装置对啤酒废酵母进行脱苦处理，效果较好吴方思等人【2 5 】 对啤酒废酵母自溶条件进行了优化，在最佳条件下自溶测得氨基氮收率为5 1 4 但吴鑫颖等人哳1 研究的结果却截然不同，通过正交实验发现对酵母自溶影 响因素依次为：温度 p h 值 食盐用量 加水量，其氨基氮收率可达到5 9 4 2 。宋莲 军等人口刀研究发现最佳自溶条件为：加水量为1 ：2 ，p h 6 5 ，在4 7 5 2 下自溶2 4 小时此时氨基氮含量可达到5 4 9 m g 1 0 0 m 1 添加一定量的酶能促进啤酒酵母溶 解，研究表明，葡萄糖化酶，甘露聚糖酶，b 一1 ，3 葡聚糖酶，真菌酸性蛋白酶， 木瓜蛋白酶对酵母自溶有促进作用，使用葡萄糖化酶时，自溶液中含较高的葡萄 糖，但其中氨基氮含量却比不上使用蛋白酶时氨基氮的含量m 1 祝忠付 2 9 1 在研 究啤酒酵母自溶过程中发现，添加中性蛋白酶及b 一葡聚糖酶对酵母自溶有较大 帮助，食盐对酵母自溶有促进作用，在5 0 1 3 下酶解2 0 j 、时，氨基酸浓度达到了 5 6 0 m g 1 0 0 m 1 陈洁等人【蚓研究发现啤酒废酵母在经过预处理后，加入一定量的 核酸酶，在4 0 m p a 下均质3 次，然后升温到5 5 1 3 ，白溶3 0 j , 时得到酵母抽提物中5 一核苷酸含量高达6 3 7 m g g 利用酵母可以生产含有十多种氨基酸、多肽、呈味核苷酸、维生素、多种微 量元素的调味品。利用啤酒废酵母生产营养酱油的方法有两种，一种是利用废酵 母自溶液和豆粕按一定比例发酵而成口1 】【3 2 1 另一种方法是将废酵母自溶液和不 同鲜味剂调配而成3 孔冯启利等m 1 将酵母提取液与不同鲜味剂如谷氨酸钠，肌苷 酸钠，鸟苷酸钠等配合，并添加各种香辣组分，得到鲜昧强烈，风味各异的新型调味 品钟跃远【3 习使用酸碱对啤酒废酵母进行预处理，自溶过程中添加木瓜蛋白酶 并采用逐步升温法，自溶效果较好，产品收得率较高李犁3 6 】在废酵母自溶时 添加麦根酶，可以把酵母r n a 分解成5 核苷酸，它能降低产品粗糙感，使酱油 风味变得柔和k o u t i n a s a a 【3 7 】等发现在使用啤酒废酵母生产酱油的过程中，啤酒 7 利用啤酒废酵母制备多肚的研究 废酵母的自溶程度受p h 影响较小，但受温度，初始固体浓缩物浓度和发酵周期 影响较大。 啤酒废酵母还可以用于生产胞壁多糖，酵母细胞壁由8 5 9 0 碳水化合物及 1 0 1 5 蛋白质组成，约一半的碳水化合物主要为葡聚糖和甘露聚糖，细胞壁中 还含有大量甘露糖蛋白【3 l j 。葡聚糖和甘露聚耱在人的消化道中难以被消化，可 作为膳食纤维发挥作用，并具有增强细胞免疫力，提高巨噬细胞活性及治癌等功 效【埘刘娘新i 椰】等研究人员采用酵母自溶与机械破碎相结合的方法提取胞壁多 糖，使得胞壁多糖得率达到1 0 ，纯度达8 3 张玉香，尹卓容【4 1 】用酶法从啤酒 酵母中提取的甘露糖蛋白，经乙醇沉淀和层析提纯，样品中含多糖8 8 ，含蛋白 质1 2 ，薄层层析表明单糖组分中只有甘露糖。 在啤酒酵母泥中添加一定的双歧因子可发酵生产双歧酵母保健食品【4 2 】最 近较多利用啤酒废酵母泥生产营养果醋【4 3 1 ，发酵酸奶饮料1 4 4 1 ，生产营养蛋白粉【4 5 1 等等。 1 2 2 2 啤酒废酵母在生物制药工业中的应用 啤酒酵母由于含有多种氨基酸、核酸、维生素、酶类和其它生物活性物质， 因而在生物制药行业中具有广阔的开发前景。目前。主要用于药用干酵母、核酸 及其衍生物，果糖二磷酸钠、谷胱苷肽、辅酶a 、b 族维生素等产品的生产和开发 目前药用干酵母己成功用于医疗预防，其药理作用是帮助消化，提供蛋白质、 维生素等营养 s o d ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) 是超氧化物歧化酶的简称日前采用啤酒废 酵母生产s o d 的研究常有报道明景熙i 倒采用不同工艺流程提取s o d ，结果表明， 萃取离心法提取s o d 回收率达到7 3 ，纯化倍数达9 6 倍，使用该方法提取得到 的s o d 总酶活力达到3 0 0 0 u l m g 1 ，6 - 二磷酸果糖又称f d p ，对休克，急性心肌梗塞，心肌缺血等症状具有良 好疗效，是临床上广泛应用的心血管特效药。使用啤酒废酵母生产p d p 具有一定 的社会和经济价值。齐香君等人 4 r l 研究了啤酒酵母生产f d p 的工艺条件，结果 表明：p h 对转化过程影响最大；最佳转化工艺是蔗糖加入量6 ，磷酸盐4 。 p h 6 5 ，转化温度为3 0 c ，转化时间为6 h 李祥等人郴】研究发现发酵液中氯化 8 利用啤酒废酵母制各多肚的研究 镁的浓度，p h 值是1 ，6 一二磷酸果糖最主要的影响因素最佳发酵参数为发酵温度 3 7 c ，葡萄糖浓度0 4 m o l l ，p h 6 5 ，有机溶剂的添加量约6 发酵液中l ，6 一二磷 酸果糖的量最高可达7 0 5 m g m l 。 核糖核酸在医学上可作为生产治疗癌症、脑震荡、肝炎、带状疱疹、冠心病、 病毒性疾病药物的原料，用啤酒废酵母提取r n a 的方法很多。如自溶法、酶法、 盐热法、碱法等。但广泛应用于工业化生产的有稀碱法和浓盐法。马文峰研 究发现用浓盐法提取r n a ，如果控制好盐浓度，加热温度，絮凝剂用量等条件可 使r n 收得率达g u 8 0 ，纯度达9 0 以上卞菁等人【j 在温度8 5 ( 2 ，酵母浓度1 0 ，盐浓度1 0 ，提取5 h ，锝到r n a 于品，纯度达到6 9 ，净得率达1 7 8 毛宁 等人【卯】研究发现采用浓缩抽提法比用传统方法直接抽提核酸得率提高1 倍左右， 提取最佳酵母浓度和盐浓度维持在8 左右，但其提取温度升高到1 2 0 ，提取时 间缩短到4 0 r a i n 李珊等人【躅研究发现酵母浓度8 ，盐浓度6 ，抽提温度9 5 ，抽提时间6 h 是提取啤酒废酵母r n 的适宜条件，在此条件下r n a 得率为3 2 3 。h e e j e b n gc h a e 【5 3 运用酶制剂处理酵母细胞，使得提取的5 一核苷酸量达到 较高水平研究表明，外切蛋白酶用量对固形物和蛋白质回收率。酵母水解程度 有极大影响内切蛋白酶和外切蛋白酶用量为0 6 时，使得固形物回收率达到 4 8 3 5 3 1 先用蛋白酶再用核酸酶处理可使核苷酸量达到最大，5 一磷酸 二酯酶和磷酸腺苷脱氨酶最佳浓度为0 0 3 。在最佳酶组合，酶用量及处理顺序 情况下，固形物回收率高达5 3 1 ，57 一核苷酸达到3 6 7 l e e j o n gs 0 0 等人 l 算l 采用自溶方法使得酵母细胞内的核糖核酸释放出来，在6 0 ，p h 7 o 的条件下 自溶6 h ，是产生核苷酸的最好条件，磷酸嘌呤核苷酸( l 肝) 达到6 2 m g g ，磷酸 鸟苷酸( c m p ) 达g l j s 5 5 m g g ，腺核苷酸最佳产生条件为6 0 c ，p h 6 5 ，自溶6 h 谷胱甘肽具有清除自由基，解毒，促进铁质吸收及维持红细胞免疫等多种生 理功能，临床用于中毒性肝炎和感染性肝炎治疗，有机物及重金属的解毒，癌症 辐射和化疗的保护，抑制白内障以及角膜与视网膜疾病的改善，广泛用于食品及 化妆品工业等。邱雁临嗍研究了从啤酒废酵母中提取谷胱甘肽的工艺流程及提 取参数，结果表明最佳提取条件为：上柱g s h 抽提液最适p h 值7 0 ，最适洗脱剂 p h 4 4 的磷酸盐缓冲液h l i u 等) k i w i 研究发现可以在溶剂中添加l 一蛋氨酸作为 产生谷胱甘肽的引物，当啤酒废酵母的浓度达至 j 3 0 9 l ，葡萄糖和l 一蛋氨酸浓度 9 利用啤酒废酵母制备多肚的研究 分别为3 0 9 l 和1 o g l ，谷胱甘肽量达到1 3 1 8 m g g 。 ， 啤酒酵母细胞壁含有葡聚糖。分为碱不溶性、碱溶性、酸溶性三种其中碱 不溶性葡聚糖能增强免疫力。有抗癌、抗病毒、降低血脂等功能，其生产工艺【研 如下：酵母泥一洗涤、脱色一加蛋白酶处理、离心一加碱处理、离心一碱处理、 离，c , - - 酸处理、离心一沉淀物用乙醇脱水一千燥一成品。m ，s u p h a n t h a r i k a l 锯 发现最佳抽提b 一葡聚糖的工艺是在9 0 下，用1 o nn a o h 配成l ：5 ( w o 碱液进 行抽提l h 。李花霞等人【5 9 1 以啤酒废酵母为原料，结合自溶，酶解和碱溶等方法 优化碱不溶性葡聚糖的制备条件，结果表明采用1 o m o l l n a o h 碱溶处理啤酒废酵 母7 5 h 效果较好，成品不含甘露聚糖，碱不溶性葡聚糖得率为9 5 9 张开诚【删 采用超声波法提取酵母葡聚糖。发现得到的产品主要为( 1 - 3 ) 一b d _ 葡聚糖，产 品得率可达近3 0 ，与酸碱法，酶一酸碱法相比具有工艺简便，成本低廉，没有酸碱 废水排放，对环境污染较少等优点。f r e m u n d s t e f a n 等人【6 i 】也发现以往的热碱， 热酸方法提取酵母中的葡聚糖不仅会减低其生物活性，而且产率也不高，而采用 酶法提取( i - 3 ) 一p d - 葡聚糖可使纯度高达9 2 ，产量达到8 7 ，而且产品的生 物活性没有受到影响。 1 2 2 3 啤酒废酵母在饲料行业中的应用 蛋白饲料添加剂。含有丰富的蛋白质，通常作为生产蛋白饲料添加剂及混合 饲料的蛋白源旧，可配制畜牧、鱼虾等饲料，前景十分广阔。 1 3 啤酒废酵母多肽开发价值及项目研究的意义 许多小分子肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质与能量，而且还具 有防治疾病、调节人体生理机能的功能。这些功能是原蛋白和其组成氨基酸所不 具备的，目前，生物活性肽引起食品学术界的广泛重视，而对蛋白质营养价值的 评价也从蛋白质的消化性、氨基酸组成及含量发展到蛋白质序列中某些特定小肽 的生理保健功能上来，实现了蛋白质生物化学、生理学与营养学的一大飞跃 一般多肽的生产主要是将蛋白质进行控制性的水解，再分离精制而成啤酒 废酵母中含有非常丰富的蛋白质，利用其生产多肽可以采用两种方法，即自溶法 利用啤酒废酵母制各多肚的研究 和酶水解自溶法操作简单、成本较低，但是需要较长的时间：酶是一种生物催 化剂，是一类能够改变生化反应速度的蛋白质与自溶法相比，酶水解所需的时 间较短，可以通过控制一定的酶解时间取得所需的肽段，但其工序较复杂，并且 成本偏高。 目前制取生物活性肽多采用大豆，花生等为原料，采用廉价的啤酒废酵母作 为原料的研究目前没有报道，本研究的意义在于，采用啤酒废酵母这一丰富的蛋 白原料制取生物活性肽不仅综合利用了啤酒厂的大量废渣一啤酒废酵母，既减 轻了废酵母对环境的污染程度，又能给啤酒厂带来一定的经济效益，有利于啤酒 厂的可持续性发展，这实为一个一举多得的办法，为解决啤酒厂废渣环境污染闯 题提供了一种新的思路和方法。此外，生物活性肽还可用于食品和制药等工业 1 4 论文主要研究内容 本论文主要研究啤酒废酵母多肽的制各工艺，分离纯化及其生物活性的测 定采用正交实验设计方法确定了自溶法制备啤酒废酵母多肽的最佳工艺条件， 同时采用响应面方法优化了蛋白酶酶解法制备啤酒废酵母多肽的工艺条件。本论 文还摸索了啤酒废酵母多肽液的精制，利用等电点法去除啤酒废酵母多肽液中的 核酸，确定了活性炭脱色的最佳工艺最后利用葡聚糖凝胶( s e p h a d e x g 2 5 ) 层 析法分离啤酒废酵母多肤并且测定其总抗氧化性。 本论文创新之处体现在两方面，一方面是利用非常廉价的废弃物啤酒废酵母 作为制备多肽的蛋白原料，这方面的研究目前没有报道。另一方面是本论文采用 了响应面实验设计方法优化了蛋白酶酶解法制备多肽的工艺条件。 利用啤酒废酵母制各多肚的研究 第二章啤酒废酵母制备多肽的工艺研究 2 1 引言 许多小分子肤不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质与能量，而且还具 有防病治病、调节人体生理机能的功能这些功能是原蛋白质和其组成氨基酸所 不具备的，目前已从酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白、卵白 蛋白、丝蛋白、胶原蛋白、水产蛋白等的酶解物中制得一系列功能各异的生物活 性肽但是利用啤酒废酵母制各多肽的研究却未见报道。本章中研究了利用啤酒 废酵母制备多肽的工艺，比较三种不同制备方法( 自溶法，木瓜蛋白酶酶解法， 菠萝蛋白酶酶解法) 之间的差异，分别采用正交实验方法设计和响应面实验方法 设计优化了制备多肽的工艺条件。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料与仪器 啤酒废酵母贵州蓝剑瀑布啤酒集团有限公司提供；n a c l 、n a h c o ，、n a o h 、 h c l 、三氯乙酸( t c a ) 等试剂分析纯； p h s - 2 5 型精密数显酸度计上海伟业仪器厂生产；t g 3 2 8 a 型分析天平奥豪斯 国际贸易( 上海) 有限公司；梅特勒一托利多a g l 3 5 天平上海梅特勒仪器公司； 电热恒温水浴锅天津太斯特仪器有限公司；t d l - 4 0 b 型离心机上海安亭科学仪 器厂；y x q - l s - 5 0 s i 型立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂。 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 粗蛋白的测定 凯氏定氮法旧】 1 2 利用啤酒废酵母制各多肚的研究 2 2 2 2 氨基氮含量的测定 采用甲醛滴定法测赳6 叼 2 2 2 - 3 多肽得率的测定 采用三氯乙酸( t c a ) 沉淀法与甲醛滴定法相结合进行测定，取1 0 m l 上清液 加1 0 m l2 0 ( 质量分数，下同) t c a ，搅匀静置半小时后在4 8 0 0 r m i n 下离心 1 0 r a i n ，所得离心上清液记作上清液陬 】分别用凯氏定氮法和甲醛滴定法测定 上清液中的总氮含量和氨态氮含量，则多肽氮量和多肽得率按下式进行计算嘲： 多肽氮量= 上清液f r c 总氮量一上清液。c 】氨态氮量 多肽得率= 上清液畔多肽氮量原料总蛋白氮量1 0 0 2 3 自溶法制备啤酒废酵母多肽液的工艺研究 2 3 1 啤酒废酵母预处理条件的确定 啤酒废酵母含有一些大颗粒酒花，树脂等杂质，预处理一方面可以去除这些 杂质，另一方面可以去除酒花等杂质带来的苦味利用小苏打对啤酒废酵母进行 预处理，工艺简单，成本较低。是比较常用的一种方法。本试验将啤酒废酵母加 入约两倍o 4 无菌水，搅拌均匀后，用8 0 目筛网滤去大颗粒酒花，树脂等杂 质，然后加入一倍量的无菌水，并添加一定量的n a h c 0 ，反应一段时间，最后倾 去上清液，再用蒸馏水洗涤两次，离心得干净废酵母本试验考察了处理时间和 n a h c 如使用量对处理效果的影响。 2 j 1 1n a i t c 0 3 使用量对预处理效果的影响 一将啤酒废酵母配成溶液，分别添加o ，0 5 。1 ，1 5 n a h c 0 ，处理1 5 m i n ， 比较n a h c n 使用量对预处理效果的影响由表2 1 可见，l ( w w ) n a h c 0 ，处理 得到的啤酒废酵母苦味大大降低，粗蛋白损失率也最低，据此，以下试验均采用 1 ( 霄w ) n a h c 鸥对啤酒废酵母进行预处理 利用啤酒废酵母制备多肚的研究 2 3 1 2 处理时间对预处理效果的影响 将啤酒废酵母配成溶液，添加i 如w ) n a t c 0 3 ，分别处理1 5 m i n ，3 0 r a i n ，比较 处理时间对预处理效果的影响。由表2 2 可见，1 5 r a i n 和3 0 r a i n 处理效果相差不 大。考虑到实际生产成本，宜选用1 5 m i n ，由此可得出预处理最佳条件为n a h c 0 ，使 用量为1 ，处理时间为1 5 m i n ，这个结果与目前研究相比处理时间大大缩短了 表2 2 处理时间对预处理效果的影响 t a b l e2 - 2 e f f e c t so fu m eo np r e t r e a t m e n t 2 3 2 自溶法制备啤酒废酵母多肽液的工艺确定 许多研究表明，自溶温度，时间，p h 值，自溶促进剂是影响啤酒废酵母自 溶的几个主要因素，本试验就这四个因素进行单因素实验 1 4 利用啤酒废酵母制各多肚的研究 2 3 2 1 自溶温度对多肽得率的影响 经预处理后的酵母泥l o o g ，加蒸馏水2 0 0 m l ，调节p h 为6 0 ，n a c i 用量为 2 ，在温度为4 0 ，4 5 ( 2 ，5 0 ，6 0 条件下白溶3 6 h ，测多肽得率，如图z 一1 ( a ) 所示，随着温度的升高，多肽得率也有所提高，温度为4 5 c ，多肽得率最高。 但当温度继续升高时，多肽得率反而下降，这可能是由于酵母自溶依靠的是自身 的一些酶，当温度较低或过高时，都不利于酶的作用，因此影响多肽得率。因此 选取最佳自溶温度为4 5 2 3 2 2 自溶p h 对多肽得率得影响 经预处理后的酵母泥l o o g ，加蒸馏水2 0 0 r a l ，n a c i 用量为2 ，温度为4 5 ，在p h 为5 5 ，6 0 ，6 5 ，7 0 条件下自溶3 6 h 。测多肽得率，如图2 一l ( b ) 所示，p h 值对自溶的影响较大，在较合适的p h 条件下，酵母自身酶系能得到充 分发挥作用，从图2 2 中可以看出，p h 6 0 是最适作用p h 。 图2 - i 温度，p h 对多肽得率的影响 f 幻2 - 1 e f f e c t