（水生生物学专业论文）筛选与铜绿微囊藻生物钟蛋白相互作用的蛋白.pdf

摘要 摘要 生物钟是广泛存在于蓝藻、植物和动物细胞中的内源计时系统，它可以实时调 控各种代谢和行为，从而使机体更好地适应环境。蓝藻是具有生物钟的最简单生物， 由k a i 基因簇编码的k a i a 、k a i b 和k a i c 蛋白是生物钟计时机制的核心蛋白。这三 种蛋白相互作用调节k a i c 的磷酸化状态，从而产生昼夜节律信息。 为了更好地了解生物钟的计时机制，我们采用不同的方法筛选和m i c r o c y s t i s a e r u g i n o s ap c c 7 8 0 6k a i 蛋白相互作用的蛋白。首先，我们采用免疫共沉淀的方法 在c 配0 时筛选到一个和k a i a 相互作用的蛋白，它是水解酯和脂肪的水解酶；接着， 我们以h i s 6 k a i b 蛋白为诱饵，通过p u l l d o w n 共筛选到四个和k a i b 相互作用的蛋 白，它们分别是异化的亚硫酸还原酶a 亚基、假想蛋白、3 奎尼酸脱氢合成酶和未 知蛋白( 命名为b 6 ) ；然后，通过免疫共沉淀筛选到两个和k a i c 相互作用的蛋白， 其中一个蛋白是氨基葡萄糖水解酶，它在c t 2 0 时和k a i c 相互作用，另一个蛋白在 c t 8 时和c t 2 0 时都能和k a i c 相互作用， 学分析可知b 6 是压力蛋白a ( u s p a ) ， 可能具有核酸酶功能。 我们将之命名为c 4 蛋白。通过生物信息 c 4 蛋白属于d u f 8 2 0 家族，该家族蛋白 我们利用p u l l d o w n 和细菌双杂交两种方法进一步验证k a i b 和u s p a 、k a i c 和 c 4 之间的相互作用。p u l l d o w n 结果表明k a i b 和u s p a 、k a i c 和c 4 在体外存在相 互作用。细菌双杂交系统中k a i b 和u s p a 有相互作用的信号，但我们没有检测到 k a i c 和c 4 相互作用的信号。 生物信息学分析结果显示属于d u f 8 2 0 家族的c 4 蛋白和c 1 9 6 蛋白都具有限制 性内切酶的保守功能域。为了研究c 4 蛋白和c 1 9 6 蛋白的功能，我们设计了酶切实 验以检验其核酸酶活性。结果表明c 4 蛋白和c 1 9 6 蛋白都可以酶切m i c r o c y s t i s a e r u g i n o s ap c c 7 8 0 6 染色体和p u c1 9 质粒。c 4 蛋白酶切p u c1 9 和染色体的最适合 b u f f e r 分别为：lb u f f e r 和kb u f f e r ；c 1 9 6 蛋白酶切p u c l 9 和染色体的最适合b u f f e r 分别为：mb u f f e r 和kb u f f e r 。c 4 蛋白和c 1 9 6 蛋白酶切染色体和p u c l 9 质粒的最 适合温度为6 l ；c 4 蛋白酶切染色体和p u c l 9 质粒具有酶活的最高温度为6 7 ； c 1 9 6 蛋白酶切染色体时具有酶活的最高温度为6 7 ( 2 ，而酶切p u c l 9 质粒时具有酶 筛选与铜绿微囊藻生物钟蛋白相互作用的蛋白 活的最高温度为6 4 c 。这些结果说明了c 4 蛋白和c 1 9 6 蛋白是热稳定核酸酶。 关键词：铜绿微囊藻；生物钟蛋白；蛋白质相互作用；核酸酶活性 l l 摘要 a b s t r a c t i ti st h ee n d o g e n o u sc i r c a d i a nc l o c ko f t h ec y a n o b a c t e r i a ，p l a n t sa n da n i m a l s t h a tc o n t r o lm a n yc e l l u l a rp r o c e s s e sa n dc o n f e ra na d a p t i v ea d v a n t a g ef o rt h e s e o r g a n i s m so nac o m p e t i t i v ee n v i r o n m e n t c y a n o b a c t e r i aa r et h es i m p l e s to r g a n i s m s k n o w nt oe x h i b i tc i r c a d i a nr h y t h m s t h ep r o t e i n sk a i a ，k a i ba n dk a i ce n c o d e db y k a ig e n ec l u s t e ra r ee s s e n t i a lf o rc i r c a d i a nc l o c kr e g u l a t i o n t h ek a i c p h o s p h o r y l a t i o nc y c l er e g u l a t e db yt h ei n t e r a c t i o n sa m o n g k a ip r o t e i n sg e n e r a t e st h e t i m i n gm e c h a n i s m o fc i r c a d i a nr h y t h m s t h ep r o t e i n - p r o t e i na s s o c i a t i o na m o n gt h ek a ip r o t e i n sa n do t h e rp r o t e i n sm a y b eac r i t i c a lp r o c e s si nt h eg e n e r a t i o no fc i r c a d i a nr h y t h m s t ol e a r nm o r ea b o u th o w c y a n o b a c t e r i at e l lt i m e ，t h ep r o t e i n si n t e r a c t e dw i t he a c hk a ii nm i c r o c u s t i s a e r u g i n o s ap c c 7 8 0 6w e r er e s p e c t i v e l yi d e n t i f i e db yc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o no r p u l l - d o w n on ep r o t e i ni n t e r a c t e dw i t hk a i a ，f o u rp r o t e i n si n t e r a c t e dw i t hk a i ba n d t w op r o t e i n si n t e r a c t e dw i t hk a i cw e r ep i c k e do u tr e s p e c t i v e l y t h ep r o t e i n i n t e r a c t i o nw i t hk a i aw a sa l p h a b e t as u p e r f a m i l yh y d r o l a s e f o u rp r o t e i n si n t e r a c t e d w i t hk a i bw e r ed i s s i m i l a t o r ys u l f i t er e d u c t a s ea l p h as u b u n i t ，u n n a m e dp r o t e i n p r o d u c t ( n a m e db 6 ) ，h y p o t h e t i c a lp r o t e i na m u c _ 12 7 3 a n d3 - d e h y d r o q u i n a t es y n t h a s e t w o p r o t e i n si n t e r a c t e dw i t hk a i cw e r ep u t a t i v eu d p - 2 ，3 - d i a c y l g l u c o s a - m i n e h y d r o l a s ea n du n k o w np r o t e i n ( n a m e dc 4 ) i tw a si n d i c a t e dt h a tb 6w a su n i v e r s a l s t r e s sp r o t e i na ( u s p a ) a n dc 4b e l o n g e dt od u f 8 2 0s u p e r f a m i l yw h i c hm a yh a v e n u c l e a s ea c t i v i t yb yb i o i n f o r m a t i c s t h ei n t e r a c t i o n so f k a i bw i t hu s p aa n dk a i cw i t hc 4i nv i t r ow e r eb o t h f u r t h e rc o n f i r m e db yp u l l - d o w n o n l yt h ei n t e r a c t i o no fk a i bw i t hu s p ai nv i v ow a s d e t e c t e db yb a c t e r i o m a t c ht w o h y b r i ds y s t e mw h i l et h ei n t e r a c t i o no fk a i cw i t hc 4 w a s n td e t e c t e d c 4a n dc 19 6h a v eb e e np r e d i c t e dt ob e l o n gt ot h ep d 一( d e ) x ks u p e r f a m i l yo f n u c l e a s e s t h e r e f o r e ，t h e i rd n ac l e a v a g ea c t i v i t i e sw e r ea n a l y z e d b o t hc 4a n dc 19 6 c a nl e a dt od n a d e g r a d a t i o ni ns u i t a b l ec o n d i t i o n c 4i sm o s ta c t i v ei nla n dk b u f f e r w h i l eo p t i m u mb u f f e r so fc 19 6w e r eka n dm b u f f e r t h e ”o p t i m u m ”t e m p e r a t u r ef o r i i i 筛选与铜绿微囊藻生物钟蛋白相互作用的蛋白 c 4a n dc1 9 6e n z y m e sw a s61o ca n dh i g h e r t e m p e r a t u r e sa b o v e6 4 cl e a dt oas h a r p d e c r e a s ei nr e a c t i o nr a t e s k e y w o r d s ：m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ap c c 7 8 0 6 ；c i r c a d i a nc l o c kp r o t e i n s ；n u c l e a s e a c t i v t y ；p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n s i v 缩略词及中英文对照 缩写中文全名 英文全名 k d a干道尔顿 k i l o d a k o n b p 碱基对 b a s ep a i r s d s十二烷基硫酸钠 s o d i u md o d e c y ls u r f a t e p m s f苯甲基磺酰氟p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e i p t g 异丙基一1 3 - d 硫代半乳糖苷i s o p r o p y l - b e t a d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e t r i s 三羟甲基氨基甲烷( h y d r o x y m e t h y l ) m e t h a n e p m f肽指纹图谱p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t m s质谱 m a s ss p e c t r o m e t r y m a l d i t o f 基质辅助激光解析 m a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 监缳躺崖园z 钷 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 萱蘼够士与名因勰题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 蒸蘼钐寺与菇目z 移实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：亏吗 矽夕年舌月1 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ， ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：量曷 矽7 年6 月 日 前言 上一j - 刖舌 1 铜绿微囊藻简介 铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ) 是蓝藻门，蓝藻纲，色球藻目，色球藻科， 微囊藻属的单细胞藻。幼植物体为球形或圆形的实心群体，后长成为网络状的 中空囊状体，随后由于不断扩展，囊状体破裂而形成网状胶群体。群体胶被透明 无色。细胞球形或近球形，直径3 7 1 t m ，蓝绿色，一般具气囊。多生长于净水 中，在春、夏季节生长旺盛，常形成水华。发生水华时，水面常有蓝绿或黄绿色 藻膜。 目前铜绿微囊藻的研究主要集中在以下几方面：一、对铜绿微囊藻水华成因 的探讨；二、研究营养物质( 如氮、磷) 、微量元素( 如镍、铁、锌等) 和生理 环境对铜绿微囊藻生长的影响；三、研究铜绿微囊藻水华的防治( 如紫外线辐射、 粘土絮凝、化学除藻等) ；四、对铜绿微囊藻毒素的毒性和作用机理的研究。另 外，研究人员还从分子水平上开展对铜绿微囊藻的研究，例如种属鉴定，光合作 用的相关基因克隆及分子机制的研究等。目前有关蓝藻生物钟的研究主要集中在 模式生物聚球藻( s y n e c h o c o c c u se l o n g a t u sp c c 7 9 4 2 ) 中，而对其他蓝藻尤其是 引起蓝藻水华的优势藻种铜绿微囊藻的研究较少。借鉴聚球藻生物钟研究的 经验，本实验室也发现铜绿微囊藻的光合作用、细胞分裂、a t p 含量、生物钟 k a i 蛋白的表达等都具有明显的昼夜节律性乜。3 3 ，并且通过染色体步移法从铜绿 微囊藻中克隆出了它的生物钟基因妇谢、勋诏、加以( g e n b a n k 登录号为 d q l 5 6 1 5 2 ) h 1 ，为了进一步研究k a i 蛋白的计时机制，分别制备了k a i a 、k a i b 、 k a i c 的多克隆抗体瞄1 。同时通过酵母双杂交系统筛选到一些和k a i 相互作用的蛋 白，如：和k a i a 相互作用的t r c f ( t r a n s c r i p t i o nr e p a i rc o u p l i n gf a c t o r ) 、h e l i c c 、 l e u p h e t r a n s 1 等蛋白；和k a i c 相互作用的o m p r ( o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ) 、 c 1 9 6 7 1 等蛋白。 2 蓝藻生物钟研究进展 2 1 蓝藻的节律性 以前人们普遍认为生物昼夜节律的产生依赖于真核细胞的某些结构，并且 对于细胞分裂速度较快、分裂周期短于2 4 h 的原核生物来说，以2 4 h 为周期的内源 筛选与铜绿微囊藻生物钟蛋白相互作用的蛋白 计时系统的存在并不具有实际意义，因此生物钟曾一度被认为是真核生物才具有 的特征她引。但2 0 世纪8 0 年代， s t a l 等、m i t s u i 1 等、g r o b b e l a a r 等1 2 1 相继报道 了蓝藻的固氮作用在光暗周期或连续光照下均表现昼夜节律性。通过深入研究发 现这是因为可以将大气中的氮气转化为氨的固氮酶对氧气敏感，白天光合作用发 生时固氮酶的活性减弱，晚上增强。单细胞蓝藻就是这样依靠生物钟将产氧的光 合作用与厌氧的固氮作用分隔开来。1 9 9 3 年k o n d o 等人还对蓝藻生物钟进行遗传 研究，他们将荧光素酶基因连接到聚球藻s y n e c h o c o c c u se l o n g a t u sp c c 7 9 4 2 的 p s b a 瑾因的启动子上，结果带荧光素酶基因的聚球藻表现出近似昼夜节奏的生 物发光现象n 劓，通过e m s 突变他们还获得了周期长度不同的钟突变体。继续研究 发现蓝藻基因组中的很多启动子都是受生物钟控制的，大部分的启动子在白天处 于激活状态，如：p s b a , k a i a ，勋诏c 和僻，但有少部分的启动子是在晚上处 于激活状态，如：p w 1 4 1 。p 妒腥促进固氮作用的关键基因，它的产物对氧气敏 感，所以p 啦晚上时处于激活状态，固氮作用开始进行。有部分实验室n 5 1 认为 k a i a b c q b 央振荡器通过s a s a r p a a 双组份感应因子，经由r p a a 这个转录因子而 实现对基因表达节律的控制。 但是来自e c o l i 的异源启动子如：c o n l i p n 嗣和t r c pn 7 3 在蓝藻se l o n g a t u s 中仍有节律性，这表明基因组不是单纯通过转录因子这个途径来调控的，还可能 存在其他的机制调控染色体上的基因表达。2 0 0 6 年s m i t h 发现染色体的类核紧 缩存在昼夜节律n 引、2 0 0 7 年w o e l f l e 发现质粒的拓扑变化同样存在昼夜节律n 钔， 这对分析异源启动子在蓝藻中同样存在节律性的原因提供了一个新的思路，他们 认为转录与否及转录的速度是依赖于d n a 的拓扑结构，所以类核紧缩和质粒拓 扑结构的周期性变化导致了启动子活性的周期性变化n 8 剖。最近的研究表明蓝藻 基因的节律表达是由多种机制共同调节的，包括d n a 的拓扑结构和转录因子的 活性等。 蓝藻中基因表达的节律性是很稳定的，即使是细胞分裂，也不会影响这种 节律性。m o r i 等人发现子细胞会延续母细胞的节律险引，细胞分裂不会影响生物 钟。无论蓝藻细胞分裂与否，生物钟的节律都以近似2 4 h 的周期运行。虽然细胞 分裂不影响生物钟，但是生物钟却影响着细胞分裂，细胞分裂主要集中在白天， 而晚上减慢甚至停止陴1 。最近的研究表明影响蓝藻生物钟节律的c i k a 和c d p a 基 前言 因同样会影响细胞分裂，c i k a 缺失株细胞不分裂，但c d p a 基因的表达可以使c i k a 缺失株细胞重新产生分裂佣。 生物钟的存在对于单细胞原核生物蓝藻而言具有非常特殊的适应意义， 与其它单细胞原核生物不同，在蓝藻细胞中呼吸作用、光合作用或者固氮活动( 某 些固氮蓝藻) 以及各种营养物质的新陈代谢等多种生理活动同时进行。如何避免 放氧的光合作用与厌氧的固氮活动二者之间的矛盾，以及怎样利用外界各种环境 因素来协调自身生理活动等所有问题都因生物钟的准确调控而得到了很好的解 决：1 2 ；船。另外，o u y a n g 等人的实验啪1 以及d i d i e r 等人构建的模型都已证明， 当生物钟周期与环境光暗周期接近时，藻细胞具有更强的竞争优势。 2 2 蓝藻生物钟 蓝藻是目前发现的具有昼夜节律的最简单生物，其许多生理过程如：固氮作 用、呼吸作用、光合作用、氨基酸吸收、细胞分裂、基因表达、染色体结构变化 等都具有节律性n 8 ：舯。而且这种节律性都符合生物钟的3 个判断标准：( 1 ) 在稳恒 条件下近于2 4h 的周期长度，也就是说，即使没有光暗、温度或湿度等环境信号 的循环变化，依然表现出内源性的节律性；( 2 ) 某些物理、化学条件可以重拨生 物钟的时相；( 3 ) 周期长度具有温度补偿效应，在机体的正常温度范围内，温度 的改变不影响生物钟的周期长度。 蓝藻生物钟和其它所有的生物钟一样，由三部分组成：中央振荡器( c e n t m l o s c i l l a t o r ) ，信息输入途径( i n p u t ) 和信息输出途径( o u t p u t ) ”口引。环境信号( 光、温 度、化学物质等) 通过输入途径传输到中央振荡器，处于生物钟核心的中央振荡 器发出相应的节律变化信号，然后通过信息输出途径放大后传递给受生物钟调控 的相关基因，最后与其它基因协作共同反映出具有节律的生理活动n 。生物钟的 每一环节都是由许多基因和反式作用因子共同完成，作为生物钟的核心部分一中 央振荡器，则是由几个关键基因，也就是通常说的生物钟基因构成的，生物钟的 调控正是通过钟基因表达产物和钟相关基因表达产物间接或直接的相互作用来 实现。 虽然蓝藻生物钟和其他生物具有同样的基础特征，但蓝藻的生物钟基因和相 关蛋白质及调控机理还是具有一定的独特性2 1 。下面主要介绍蓝藻生物钟的输入 途径，中央振荡器，输出途径的组分及调控机制的研究进展。 筛选与铜绿微囊藻生物钟蛋白相互作用的蛋白 2 2 1 输入途径 外界环境的时间信号如光照和温度等都可以引导生物钟使其振荡周期和环 境同步啪1 。输入途径接收信号并传送信号到中央振荡器，设定振荡时相。蓝藻的 环境因子进入中央振荡器的机制与真核生物不同，真核生物钟的输入途径一般至 少含有一个直接把光信息传递给中央振荡器的光感受器泓。3 副，但是在se l o n g a t u s 中一直没有发现可以影响时钟重置的光感受器。目前已确认与输入信号有关的 l d p a ( 1 i g h t d e p e n d e n tp e r i o d ) 和c i k a ( c i r c a d i a ni n p u tk i n a s e ) 蛋白，都对细胞的氧化 还原状态敏感堋1 。而且2 0 0 8 年另一个可以影响生物钟的氧化还原激活蛋白 圳t 1 已经被确认具有和c i k a 相互作用的能力汹1 。这些结果都表明e l o n g a t u s 生物钟的输入途径可能是感应细胞的氧化还原状态而不是直接感应光信号。不管 输入途径是通过什么机制来感应的，c i k a 、p e x ( p e r i o de x t e n d e r ) 和l d p a 蛋白是输 入途径的关键蛋白已得到确认。 c i k a 是组氨酸蛋白激酶h p k ( h i s t i d i n ep r o t e i nk i n a s e ) 和自磷酸化酶，属于 细菌双组份信号传导家族m 1 ，是信号输入途径的组成成分，能为聚球藻提供重置 生物钟时相的环境信息。其n 一端氨基酸序列表明它是对细胞的氧化还原状态敏感 的感应因子g a f ( g u a n o s i n em o n o p h o s p h a t ea s s o c i a t e df a c t o r ) ，可能起接受信号的 作用，在其中部有组氨酸激酶特征性的h ，n ，d f 和g 保守序列，在c 端还有响 应调控因子的接受结构域p s r ( p s e u d o r e c e i v e r ) 。c i k a 的失活能缩短基因节律 性表达周期，改变周期性振荡相位，c i k a 突变株在不同时间经过暗处理后基本上 不能对生物钟时相发生调制，即丧失了感受环境光暗信号变化的能力。靼1 。c i k a 虽是个组氨酸蛋白激酶，但却一直没有找到响应因子r r ( r e s p o n s er e g u l a t o r ) 。 c i k a 是通过其自激酶活性来调节自身磷酸化的( 图1 1 ) ：c i k a 的p s r 能封闭h p k 结构域的h i s 残基，该残基能行使c i k a 的激酶活性。g a f 和p s r n 匕分别与未知蛋 白相互作用从而使c i k a 构象发生改变，从而实现c i k a 激酶活性的正调控和负调 控乜5 = a s op s r 能, 与醌类物质 d b m i b ( 2 ，5 一d i b r o m o - 3 一m e t h y l 6 一i s o p r o p y l p b e n z o q u i n o n e ) 结合而加速c i k a 的降 解，l d p a 能促进这种作用m 1 。 前言 厂、 fp 5 r y 萨 诿 图1 1c i k a 磷酸化的调控 f 1 1r e g n l a t i o no f c i k a p h o s p h o r y l a t i o n c i k a c 端的p s r 镕构域台封闭h p k 结构域上的碡酸化位点，从m 阻碍c i k a 发生磷酸化。当 r 通过与丰知蛋 白相互作用定位于细胞的极端时，就解陈7 对c i k a 自激酶的m 碍g a i - 咀加强c i k a 的自磷酸化作用( 用 十呼表示) p s r 阻止c i k a 的自磷酸化作用( 用- 号表示) p e x 能抑制k a i a 的转录具有延长聚球藻生物钟周期的作用，是生物钟的修 饰因子，可能对生物钟的作用方式起修饰作用，其自身表达也受生物钟控制。p e x 突变能导致周期长度的缩短。p e x 与k a i a 、k a i b 、k a i c 闻不存在直接的相互作用 【 k a t a y a m a 霉m 通过转座予插入突变鉴定了参与输入途径的基因蛐叫，l d p a 突 变明显地降低聚球藻感受光强度变化的能力。从序列推断l d p a 编码的l d p a 蛋白 含有2 个铁硫中，d 3 f e - 4 s ，4 f e - 4 s ，参与氧化还原反应，从而影响昼夜节律1 。 i v e v a 等发现l d 曲蛋白含有2 个f 目s 4 铁硫中心，能够感受细胞的氧化还原状态， 并可节律性地与c i k a 、k a i a 等其它蛋白形成复合物“”。 总之，中央振荡器通过输入途径与外界环境保持协调一致，光强变化能改变 细胞的氧化还原状态，输入组分p e x 、c i k a 、l d p a 厦过感应细胞还原状态而感受 光通量变化传递光信号，如：l d p a 是还原激活的铁硫蛋白，c i k a 通过p s r 结构域 与醌类物质d b m i b 结台而改变自身在细胞内的丰度( 图1 6 ) 。p e x 蛋白的表达量 受到光的影响，它能结合到缸谢基因肩动子抑制妇埘基凼表达。任何输入组分的 。缝萝 。渗。暴i碧 筛选与铜绿微囊凛生物钟虽白褶作用的蛋白 缺失都会导致昼夜节律周期的缩短，而加快生物钟。 22 2 中央振荡器 中央振荡器是由一组呈近臼节律表达的基因及其编码的蛋白质组成，是维持 内源性生物钟运作的核心元件。蓝藻的中央振荡器是由k a i a 、k a i b 和k a i c = 种 蛋白组成的。 2 22 1 k a i 蛋白分子结构，功能及其相互作用 k a i c 蛋白全长5 1 9 个氨基酸，由2 个重复的结构域( 即l 2 6 0 位氨基酸的ci 区和2 6 1 5 1 9 位的c 1 i 区，中间由1 3 个氨基酸残基连起来，2 4 8 到2 6 0 位) 组成。 c i 区和c 1 i 区十分相似，但二者功能并不相同，c i 区没有磷酸化位点，而c i i 区是功能中心，含有三个磷酸化位点和与k a i a 结合的残基“2 “1 。k a i c 形成六聚 体环状结构，在电子显微镜下观察到六聚体形成的颗粒“。聚球藻的k a i c 同型六 聚体晶体结构是由ci 和c i i 平行相叠而成的双圆环结构( 图1 2 ) ，各个亚基围成 一圈，在中央形成一条沟。中央沟的一端，ci 端开口较大，而c 1 1 端则由6 个精 氨酸残基将沟封闭起来，可能形成进入c1 i 中央锥形沟的开关1 。 罐j 噶 瓣。 “i 饕爨“ 图l 也k a i 蛋a l t 0 3 d 结构图“” f i g 1 2 3 ds t r u c t a r e s o f t h e k a i ”1 左 ：角为k a l a = 聚体( 单体分子质量为3 0 k d 0 “) ：右l 拍为k a l b 删聚体( 单体升于质t 为i i k d a “”) ； 中t 为k a 】c 六体( 单仆分于质量为5 8 k d a “”) 。k a i a 和k a i b 备十基用不同的觑色& 1 f 。k a j c 所有的亚 基就一种颜也表世足站台的a t p 分了用黄色采，$ 4 3 1 4 1 t 4 3 2 磷酸化位点用“色表示。每十k a c 单 伴有ci 自c i 【站拇域。 前言 ci 区和ci i 区各有一个保守的谷氨酸残基即w a 墩e r s 结构域，具有a t p 酶 活性可以水解a t p 呻1 。如果把w a l k e r s 结构域的k 2 9 4 突变为h ，那么在体外生物 钟节律就消失了油1 。在一个生物周期中，实际a t p 的消耗量远远超过按照只有 k a i c 磷酸化需要a t p 的计算量，这说明：不只是k a i c 磷酸化需要消耗a t p ，大部 分a t p 是被k a i c 的a t p 酶消耗掉的。k a i a 力【l 强k a i c 的a t p 酶活性，而k a i b 会轻 微地抑制k a i c 的a t p 酶活性。在一个振荡系统中，k a i c 和k a i a 、k a i b 混合时， 一个k a i c 单体每天只消耗1 6 分子a t p ，而和k a i c 同属r e c a 超家族的其他任何一 个蛋白消耗的a t p 量都比k a i c 多，比如：r u v b 每天消耗8 1 0 3 分子a t p ，这说明 和r e c a 超家族其它蛋白相比，k a i c 的a t p 酶活性很弱。同时，t e r a u c h i 等人发现 k a i c 的a t p 酶活性与生物周期是相关的，如：周期缩短的k a i c 突变株的a t p 酶活 性比野生型强，而周期延长的突变株的a t p 酶活性比野生型低。同时缺乏磷酸化 节律的k a i c 的a t p 酶仍具有温度补偿效应。因此他们认为k a i c 的a t p 酶活性是形 成蓝藻内源生物钟的最基础机制啪1 。 ci i 区a t p 结合区域附近存在3 个重要的磷酸化位点t 4 3 2 ，$ 4 3 l ，t 4 2 6 ，这 些位点突变使昼夜节律消失h 2 ：删，但不影响k a i c 六聚体的形成h 2 堋1 。目前认为 t 4 3 2 和$ 4 3 1 是关键的磷酸化位点，而t 4 2 6 的功能还不清楚。k a i c 有四种磷酸化 状态：完全磷酸化状态( s t k a l i c ) ，$ 4 3 1 磷酸化状态( s k a i c ) ，t 4 3 2 磷酸化 状态( t k a i c ) 和非磷酸化状态( u k a i c ) 。在体外，k a i c 的磷酸化和去磷酸 化是一个连续的过程喳k 硎( 图1 3 ) ，从u k a i c 开始，k a i c 先在t 4 3 2 发生磷酸 化，紧接着$ 4 3 1 磷酸化，这样就达到了s t k a i c 的状态；去磷酸化时，t 4 3 2 先去 磷酸化，接着$ 4 3 1 去磷酸化，最后变成u k a i c 。无论在什么时候，这四种磷酸 化状态是并存的，它们的比例可能决定振荡器的状态，也就是说：如果t k a i c 的含量很高，那么就将进入磷酸化的状态；如果s k a i c 的含量很高，那么就将进 入去磷酸化的状态瞄别。 筛选与铜绿微囊藻生物钟蛋白相互作用的蛋白 图1 3k a i c 的节律磷酸化模型i s 3 l f i g 1 - 3 am o d e lo f t h ek a i cp h o s p h o r y l a t i o nr h y t h m i f o l 在生物钟周期中，k a i c 的磷酸化具有规律性。k a i a 不断重复地与k a i c 结合，从而促进k a i c 磷酸化。从非磷 酸化状态( u ) 开始，k a i c 首先在1 4 3 2 位点发生磷酸化( t ) ，接着$ 4 3 1 磷酸化达到完全磷酸化( s t ) 状态， 然后t 4 3 2 位点开始去磷酸化，变成只有$ 4 3 1 是磷酸化的状态( s ) 。k a i b 优先结合s k a i c ，这样就形成包 括k a 认在内的三重复合体，从而促使k a i c 回到非磷酸化状态。图中磷酸化状态用绿色表示，去磷酸化状态 用红色表示 k a i c 是个自激酶和自磷酸化酶，它单独存在时自磷酸化酶活性占优势，但 和k a i a 、k a i b 一起孵育时，k a i a 会迅速而且重复地结合到k a i c 上，从而改变了 k a i c 自磷酸化酶的绝对优势，k a i c 的自激酶活性增强，而k a i a 的这种行为同时 受至u k a i b 的负调控阻州。k a i c 中从双圆环六聚体结构突出来的c 端4 8 8 - - 4 9 7 残基 称做a 环。当没有k a i a 、k a i b 时，a 环的暴露和包埋处于一种动态平衡，分别 决定着k a i c 的磷酸化和去磷酸化。当k a i a 结合到k a i c 的ci i 时，会使得a 一环处于 稳定的暴露状态m ：勰瑚3 ，暴露的a 环可以使得a t p 结合区域靠近磷酸化位点，这 样就加强了k a i c 的磷酸化。k a i b 不能直接和a 环接触，所以不能直接影响k a i c 的磷酸化，但是k a i b 可以通过失活k a i a 而减弱k a i c 的自磷酸酶活性啼1 ：鸵1 。虽然 现在普遍认为：k a i b 和k a i a 竞争结合k a i c 呦1 ，但是结构学和生物化学的数据都 强烈表明k a i a 和k a i b 在k a i a b c 三重复合体中以一种未知的机制共同启动去磷 酸化2 1 ：嬲1 。 k a i c 是形成同型异型钟蛋白复合物的核心，为k a i a k a i b k a i c 大分子复 合物的形成提供支架“4 1 。蛋白复合体的形成和解聚决定了中央振荡器的时相k 前言 6 羽。在整个生物周期中，k a i c 约有1 0 1 5 和k a i a 形成k a i a k a i c 复合体，这个 量是恒定的嘲，或者改变很小钉。而k a i b k a i c 复合体和k a i a k a i b k a i c 复合体 的量变化很大，在k a i c 去磷酸化阶段达到最大值7 油朋1 。但无论何时，k a i c 最 主要的形式是游离六聚体，占全部的4 0 6 0 。而且k a i 复合体的任何蛋白都一 直处于被补充的状态。 k a i a 蛋白是k a i b c 表达的正调控因子，包含约1 8 0 个氨基酸的n 端和约1 0 0 个 氨基酸的c 端两个结构域，c 端氨基酸序列在不同种类蓝藻中高度保守，而n 端氨 基酸序列则具有多样性。k a i a 的c 端呈新型的4 螺旋束结构m 渊1 ，能够形成二聚 体，具有k a i c 结合位点，与k a i c 结合后能刺激k a i c 自磷酸化，与k a i b 结合后其 促进k a i c 磷酸化的能力就减弱。核磁共振研究表明，k a i a 的n 端具有伪接受域， 该区域可能是计时输入结构，接受信息后能调控k a i a 的c 端结构以激活k a i c 的自 激酶活性。同型二聚体k a i a 的结晶结构是一个功能区转换( d o m a i n - s w a p p i n g ) 结 构，一个单体亚基的n 端和另一亚基的c 端可以相互作用h 1 = 蚓。 k a i b 是k a i c 磷酸化的负调控因子，g a r c e s 等呻1 对鱼腥藻a n a b a e n a 的k a i b 同型 二聚体分析发现k a i b 呈0 【p 迂回结构，在细胞内主要以二聚体和四聚体两种形式 存在1 。 2 2 2 2 中央振荡器k a i 基因簇的表达调控 2 0 0 5 年之前，多数研究者都认为，蓝藻昼夜节律的产生和维持等核心过程 和真核生物是相似的，主要建立在对基因进行周期约2 4 h 的转录翻译水平上的负 反馈调节( t r a n s c r i p t i o n a l t r a n s l a t i o n a lf e e d b a c kl o o p ，t t f l ) 的基础上。但蓝藻振 荡器的核心基因k a i 和真核生物的钟基因无序列相似性。勋谢，勋谬，k a i c 以单一 拷贝成簇排列，妇谢单独转录，勋诏和k a i c 在同一启动子( p u i b c ) 的控制下共同 转录。勋谢，k a i b 和砌f c 都是维持聚球藻生理节律所必需的，缺失任何一个都将 扰乱其正常的昼夜节律或导致基因表达的节律消失。勋谢，勋谬，k a i c 分别编 码三种蛋白质k a i a ，k a i b 和k a i c ，其中k a i c 是核心。k a i c 的持续过量表达会抑 制施f b c 的表达，而k a i a 正调控k a i b c 的表达口。由此推断，蓝藻昼夜节律的 产生建立在k a i 转录翻译水平上，k a i 蛋白通过对自身基因的反馈调节作用而产生 昼夜节律。进一步的研究发现k a i c 在持续黑暗处理中仍呈节律性表达泓1 ，因为蓝 藻是专性光合自养生物，转入黑暗中后转录和翻译迅速减少，所以这与昼夜节律 筛选与铜绿微囊藻生物钟蛋白相互作用的蛋白 转录翻译振荡机制模型是互相矛盾的。t o m i t a 等5 1 发现，持续黑暗下，聚球藻 中即使没有k a i b c 产生的m r n a 的累积，或者有足量的转录翻译抑制剂存在， k a i c 的磷酸化仍呈现昼夜节律性，且具有温度补偿性。因此，t o m i t a 等提出昼夜 节律不需要转录翻译水平的调控就可以产生。 2 0 0 5 年k o n d o 课题组等人把k a i a 、k a i b 、k a i c 三种蛋白按一定的比例加入 试管中，再加入a t p ，结果发现k a i c 会产生接近2 4 h 的节律性磷酸化，而且还具 有温度补偿效应，这说明了转录并非节律性产生所必需的，而且温度补偿机制是 由三种k a i 蛋白产生的。随后这个实验结果也被多个课题组所证实啼2 堋堋删，他 们认为生物钟计时机制是不依赖于转录翻译的翻译后振荡( p o s t t r a n s l a t i o n a l o s c i l l a t o r ，p t o ) 。通过进一步的研究，发现k 撕c 在没有转录翻译的体外条件下 仍能保持1 0 个周期以上的磷酸化节律的基础是：l 饧c 六聚体之间会不断地发生单 体转换晦们。m o r i 等人认为这也是生物处于细胞分裂、蛋白质合成和转化、温度剧 烈变化等混乱状态下，生物钟也能准确计时的原因嘟。6 引。处于去磷酸化状态的 k a i c 六聚体会和处于磷酸化状态的六聚体发生单体转化，来源于去磷酸化状态的 k a i c 单体促使与之相邻的来源于磷酸化状态的k a i c 单体发生去磷酸化，这样就 使得k a i c 处于相同的磷酸化状态，具有相同的反应方向。k a i c 就是这样依赖于 单体转换而实现不同磷酸化状态迅速同步呻1 。 e l o n g a t u s 无论是在体外还是在k a i b c 缺乏转录翻译的体内，k a i c 都能产 生节律性磷酸化，但是k a i b 、k a i c 的蛋白量增加都会导致振荡器振荡剧烈嘲1 ， 而且k a i b c 的转录和翻译有助于生物钟节律的恢复。在体外，振荡器在2 0 时就 停止工作，在体内却可以继续工作，这