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海分枝杆菌培养及致病性研究 海分枝杆菌培养及致病性研究 摘要 海分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u mm a r i n u m ，m m a r i n u m ) 为一种腐生性非典型分 枝杆菌，其分布遍及世界各国，它存在于海水、淡水中，为接触感染。随着对海洋 的开发利用，人、鱼共患的疾病存在潜在的危险性，目前已有许多关于海分枝杆 菌对人类感染的病例报道。海水养殖人员、海洋捕捞人员、渔民以及观赏鱼养殖 人员等，感染的几会明显增加。本文从感染的病变组织中分离到分枝杆菌菌株， 通过对其培养和药物敏感试验、再次感染斑马鱼和实验鼠以及分离细菌致病性蛋 白的实验，进行致病机理的研究。 ( 1 ) 分枝杆菌的分离试验：从人感染的脓液组织中，分离培养出的分枝杆 菌( r 1 ) ，以及从活体的蟹体表分离到的分枝杆菌( y 1 0 ) ，分别与标准海分枝杆菌 菌株进行对照研究发现，培养菌落的对光反应，即产生黄色反应菌落、对9 种药 物的敏感性试验结果、抗酸染色特性、化学反应特性，以及构成菌株壁蛋白质的 分子量大小均表现出一致性，说明这三种分枝杆菌菌株的基因来源有共性。 ( 2 ) 斑马鱼的感染试验：选择健康的幼斑马鱼6 0 条，随机选取3 0 条，每 1 0 条为一组，分别给予腹腔内注射o 1m l 液体的y 1 0 、r 1 和标准海分枝杆菌菌 液，分别放置于2 8 恒温的水箱中养殖，观察斑马鱼的生存情况。腹腔内注射 0 1m l 海分枝杆菌菌液，3 0 条斑马鱼相继在7 天内死亡。从死亡的斑马鱼尸体 上可以看到受感染的病变组织，病变组织变成暗棕红色，打开腹腔可以看到坏死 组织，从病变组织中已经分离、培养到海分枝杆菌的致病菌株。 ( 3 ) 小鼠和大鼠的感染模型建立：分别选取1 2 只健康鼠，随机分成实验组 和对照组。根据感染途径的不同，实验组又分成实验组a 、b 和实验组c 。实 验组a ：经鼠的尾静脉注射分枝杆菌菌液；实验组b ：经鼠的腹腔注射分枝杆菌 菌液；实验组c 经消化道感染。对照组鼠给予经尾静脉注射同等剂量的生理盐 水做对照。感染第1 周后，重复感染一次，第8 周采取其尾静脉血分别进行细胞 因子( 白细胞介素、干扰素一g a m m a 和肿瘤坏死因子一a l p h a ) 、免疫球蛋白( i g a 、i g g 和i g m ) 、c 反应蛋白和补体( c 3 和c 4 ) 的检测。细胞因子检测采用酶联免疫吸附 试验( e u s a ) ：免疫球蛋白、c 反应蛋白和补体的检测方法采用全自动生化分 析仪测定。 海分枝杆菌培养及致病性研究 海分枝杆菌对昆明鼠有致病性，从尸体解剖病理切片标本中可以看到明显的 肉芽肿斑块，肉芽肿包含大量的颗粒状物质，即干酪样坏死物。感染2 周后的小 鼠外周静脉血中白细胞介素检测结果，实验组a 和b 小鼠在感染期间血清中白 细胞介素i l 2 、i l 4 、i l 1 0 、i l 1 2 差异无统计学意义( p 0 0 5 ) ，与实验组c 和对照组小鼠比较有明显的增加，i l 4 和i l 1 0 增加的更加明显。几2 和i l 1 2 与对照组差异有统计学意义( p o 0 5 ) ；i l 4 和i l 1 0 与实验组c 和对照组差异 有统计学意义( p o 0 5 ) 。补 体检测：实验组a 、b 和c 组之间，c 3 、c 4 、c r p 的含量差异无统计学意义 0 0 5 ) ，实验组a 、b 和c 组与对照组之间的差异有统计学意义( 仁3 8 8 2 5 8 ， p 0 0 5 ) ，对照组与实验组之间的差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ， b u th i g h e rt h a nt h a to fg r o u pca n dc o n t r o lg r o u p ( p o 0 5 ) i l - 4a n di l 一10w e r em o r e i n c r e a s e dc o m p a r e dw i t hi l - 2a n di l 一12 ( p 0 0 5 ) t h e r ew e r es t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e i i li l 4a n di l - 1 0i ng r o u paa n db ，ca n dc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) b u tt h e r ew a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e b e t w e e nt r i a lg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) i nt r i a lg r o u p sa ，ba n dc w h i l et h e r ew a s s t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eb e t w e e nt r i a lg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ，为无统计学意义：p 0 0 5 ) ，与实验组c 和对照组小鼠比较有明显的增加，i l - 4 和i l 1 0 增加的 更加明显。i l 2 和i l 1 2 与实验组c 和对照组差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ；i l - 4 和i l 1 0 与实验组c 和对照组差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 ( 二) 补体和c 反应蛋白的检测结果 三组实验大鼠血清中补体的检测结果见表2 。 表2 大鼠血清中补体检测结果( m g d 1 ) t a b 2t h ec o m p l e m e n tr e s u l t si nb l o o ds e r u mo fr a t ( m g d 1 ) 以上数据经统计学分析得知，试验组a 、b 和c 之间，c 3 、c 4 、c r p 的 含量差异无统计学意义( t - - - - 0 7 2 1 8 1 ) ，p 0 0 5 。实验组a 、b 和c 组与对照组之 间的差异有统计学意义( t = - 3 8 8 - 2 5 8 ，p 0 0 5 ) ，对照组与实验组之间的差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 4 3 4 实验讨论 4 3 4 1 细胞因子 4 3 4 1 1 丫- 干扰素( i n t e r f e r o n 丫，i f n 吖) 1 9 5 7 年i s a a c s 和l i n d e n m a n n 首先发现了病毒干扰现象，即病毒感染的细胞 能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒的复制，因而命名为干扰素。目前己 知干扰素并不能直接杀伤病毒，而是诱导宿主细胞产生数种酶，干扰病毒的基因 转录或病毒蛋白组分的翻译。根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学 活性的差异，可分为a 干扰素( m t e r f e r o na ，i f n a ) ，p 一干扰素( i n t e r f e r o np ，i f n - p ) 和 r 干扰素( i n t e r f e r o n 丫，i f n - y ) 。 1 9 6 5 年w h e e l o c k 等首先在p h a 刺激的白细胞培养上清中发现具有i f n 样 抗病毒物质，但在p h = 2 条件下即失去抗病毒的活性。1 9 7 3 年y o u n g e r 和s a l v i n 发现来自淋巴细胞培养上清中存在一种i f n ，但抗原性不同于以往发现的i f n ， 遂命名为i i 型i f n ，1 9 8 0 年统一命名为i f n 吖。1 9 8 1 年g o e d d l e 等将i f n 吖基因 克隆成功。 ( 一) i f n 吖的产生：主要由活化t 细胞产生，在小鼠由t h l 亚群产生。当 抗原、p h a 或c o n a 刺激后t 细胞分泌i f n 吖，通常与i l 2 的产生相一致。目 前认为巨噬细胞活化因子( m a f ) 的主要活性存在于i f n 吖中。此外，活化n k 细 胞也可产生i f n 丫。 ( 二) i f n - 丫的分子结构和基因：人和小鼠i f n 吖基因分别定位于1 2 号和1 0 5 9 海分枝杆菌培养及致病性研究 号染色体，在d n a 水平上i p 3 q 吖基因与i f n a p 基因无同源性。人和小鼠i f n 吖 在d n a 水平上有6 5 左右同源性，在氨基酸水平的同源性只有4 0 左右。小 鼠成熟i f n 吖分子由1 3 3 个氨基酸残基组成。人i f n - 丫成熟分子由1 4 3 个氨基酸 组成，糖蛋白以同源双体形式存在，分子量为4 0 k d a ，其生物学作用有严格的种 属特异性。 ( 三) i f n - 7 受体：人i f n y 受体基因定位于第6 号染色体，小鼠在第1 0 号染色体。i f n - 7 受体分布广泛，受体阳性细胞每个细胞约表达1 0 0 - - 一1 0 0 0 个受 体。裸肽分子量5 0 k d a ，糖基化后9 0 k d a ，其n 末端与i f n a b 受体有一定的同 源性，具有种属特异性。 i f n - q 受体为穿膜糖蛋白，胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别有2 2 8 、2 2 1 和 2 2 3 个氨基酸残基，从胞膜外区结构特征来看，属于细胞因子受体干扰素受体家 族，最近命名为c d w l1 9 。i f n 吖与受体结合后可活化多种i f n 吖调节的基因。 目前已知，i f n - 7 刺激后至少有2 0 种蛋白被表达，其中1 2 种是i f n 刺激后所特 有的。这种表达是由于活化特异的d n a 结合蛋白使其从胞浆移位到胞核，如干 扰素刺激的基因因子2 ( i n t e r f e r o n - s t i m u l a t e dg e n ef a c t o r2 , i s g f 2 ) 和y - 干扰素激活 因子( g a m m a - i n t e r f e r o na c t i v a t i o nf a c t o r , g a f 或s t a t 9 1 ) 结合到i f n 基因启动子中 两个称之为丫干扰素活化点( g a m m a - i n t e r f e r o na c t i v a t i o ns i t e ，g a s ) 和干扰素刺激 的反应元件( i n t e r f e r o n - s t i m u l a t e dr e s p o n s ee l e m e n t ，i s r e ) 的位置上。i f n - 7 可促进 h l a b 、h l a d r 、i p 一1 0 、p 1 激酶和2 - 5 a 合成酶的合成，其中p 1 激酶可能抑 制病毒蛋白的翻译，而2 - 5 a 合成酶则可裂解病毒r n a 。 ( 四) i f n y 的生物学活性：i f n 吖生物学作用有较严格的种属特异性， 人i f n 吖只作用于人或灵长类动物的细胞。 ( 1 ) 诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细 胞、星状细胞等m h ci i 类抗原的表达，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别 过程。此外， i f n 吖可上调内皮细胞i c a m 1 ( c d 5 4 ) 表达，促进巨噬细胞f c l , r 表达，协同诱导t n f 并促进巨噬细胞杀伤病原微生物。 ( 2 ) 促进l p s 体外刺激小鼠b 细胞分泌i g g 2 a ，降低i g g l 、i g g 2 b 、i g g 3 和 i g e 的产生；抑制由i l 一4 诱导的小鼠b 细胞增殖，i g o l 和i g e 产生以及f c e r i i 表达；促进s a c 诱导的人b 细胞的增殖。 海分枝杆菌培养及致病性研究 ( 3 ) 协同i l 2 诱导l a k 活性，促进t 细胞i l 2 r 表达。 ( 4 ) 诱导急性期蛋白合成，诱导髓样细胞分化。 i f n 吖作为t h l 型细胞因子对有机体起到免疫保护作用，当有机体受到致病 菌的感染时，i f n - q , 的分泌会增加。我们研究的实验结果表明：大鼠受到海分枝 杆菌的感染后第8 周，血清中i f n 吖的含量明显增加，与对照组比较有明显的改 变，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 说明t n f n 在抗海分枝杆菌的作用方面并非是主要的细胞因子。研究表明在抗 肿瘤方面发挥有效的生物学作用。保护机体免于肿瘤的发生，抑制肿瘤细胞、或 杀伤肿瘤细胞。t n f a l p h a 作为一种炎症性细胞因子，h w a n gs a 等认为促炎症 反应因子t n f a l p h a 的分泌在分枝杆菌感染的小鼠是受到限制的，以免造成组 织病理学的改变。r o t t m a nm 等研究认为i f n g a m m a 和t n f 在控制小鼠感染 分枝杆菌方面是重要的因素，它们控制分枝杆菌的迟缓的生长。i f n g a m m a 受 体或耵师一a l p h a 受体缺陷的小鼠，肝脏和脾脏的损伤明显。b h a t n a g a rs 等研究 认为b c g 感染的小鼠，分枝杆菌的成分抗原，1 9 k d 的脂蛋白刺激巨噬细胞，可 以产生t n f a l p h a ，与我们的研究相一致。 4 3 4 1 3 可溶性细胞因子受体( s l l 2 r ) 细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。细胞因 子与其受体结合后启动复杂的细胞内分子间的相互作用，最终引起细胞基因转录 的变化。i l 2 r 为i 型细胞因子受体家族成员，其受体有游离的形式即可溶性细 胞因子受体( s l l 2 r ) 。s l l 2 r 可作为相应细胞因子的运载体，也可与相应的膜 型受体竞争配体而起到抑制作用。本研究表明：海分枝杆菌感染的大鼠外周血清 中s l l 2 r 水平明显增高，说明大鼠体内存在免疫功能的异常，与对照组比较 s l l 2 r 差异有明显的统计学意义( p o 0 5 ) 。 c h un h 等研究认为人类感染结核分枝杆菌后，血清中s i l 2 r 的分泌会增加， 应用i l 2 治疗后分泌会减少。l a w ns d 等认为结核分枝杆菌感染后引起s l l 2 r 分泌增加，合并h i v 病毒感染后分泌降低，可能是t 淋巴细胞的激活受到损害， c d 4 淋巴细胞的消耗有关。而t a d a a 却认为s l l 2 r 水平在肺结核分枝杆菌感染 海分枝杆菌培养及致病性研究 性疾病，血清中的分泌是增高的，新近的感染会更高，s l l 2 r 水平与c 反应蛋 白水平和血沉呈现正相关，与血清白蛋白呈负相关。非结核分枝杆菌感染，免疫 活性的细胞活性受到抑制，可以导致s l l 2 r 分泌水平的下降。m o n t e sj 等提出 s i l 2 r 水平与初始和记忆t 细胞亚群无关。 4 3 4 1 4 补体和c 反应蛋白 补体系统( c o m p l e m e ms y s t e m ) 是由3 0 多种蛋白分子所组成，是迄今所知 机体中最复杂的一个限制性蛋白水解系统( 1 i m i t e dp r o t e o l y s i ss y s t e m ) ，根据各成 分的功能不同，将它们分为三组。第一组为补体系统的固有成分共1 4 个蛋白分 子。即c 1 ( 含三个亚组分：c l q 、c l r 和c l s ) 、c 4 、c 2 、c 3 、c 5 、c 6 、c 7 、c 8 、 c 9 、b 因子、d 因子和p 因子。其中c 1 、c 4 和c 2 仅参与经典激活途径的活化； b 因子、d 因子和p 因子仅参与替代途径的反应；c 5 9 则为上述两条激活途 径共同的末端效应序列。第二组为调节与控制补体系统活化的分子，包括：c 1 抑制物( c i i n h ) ，c 4 结合蛋白( c 4 b p ) 、膜辅助因子蛋i 刍( m c p ) 、促衰变因子 ( o a f ) 、蛋白s ( p s ) 、h 因子、l 因子、血清羧肽酶n 、s 蛋白、c d 5 9 、s p 4 0 4 0 及同种限制因子( h r f ) ，又称c 8 结合蛋白( c s b p ) 。第三组为补体的受体分子， 有c l q 受体( c l q 鼬、i 型补体受体( c r l ) 、i i 型补体受体( c r 2 ) 、型补体受体 ( c r 3 ) 、i v 型补体受体( c r 4 ) 、v 型补体受体( c r 5 ) 、h 因子受体( f i x - r ) 及c 3 a 受 体( c 3 a - r ) 和c 5 a 受体( c 5 a r ) 等。 在正常生理情况下，绝大多数补体固有分子均以非活化形式存在于血清中， 当受到某种激活剂作用后，即出现一系列级联反应，各种补体固有分子依次活化， 最终产生溶细胞性效应。补体分子在活化过程中，可不断形成具有酶活性的中间 复合体( 如c 4 b 2 a , c 4 b 2 a 3 b ，c 3 b b b 及c ( 3 b ) n b b 等) ，裂解有关的补体分子产生多 种活性肽和蛋白片段，发挥不同的生物学效应。但补体系统的级联活化反应，又 受着各种调节分子的严格控制，借以限制补体活化的程度及维持体内补体水平的 平衡。 补体系统的主要生理功能是促进吞噬和溶解靶细胞。因此，是机体免疫防御 机制的重要组成部分，对消除外来抗原的侵害，维护机体内环境的平衡具有重要 作用。但另方面，在一些非免疫性因素的刺激下，补体系统的活化又可产生炎 症反应，并影响凝血及纤溶系统，导致机体正常组织细胞的损伤。因此，补体既 海分枝杆菌培养及致病性研究 是生理性的防御物质，又是造成病理性损伤的介质。 8 0 年代以来，由于分子生物学技术的进展，已对绝大多数补体分子的基因 克隆成功，并揭示了它们的核苷酸和氨基酸序列，从而为研究补体系统各成分的 结构及功能创造了有利的条件。 血清补体c 3 ( c o m p l e m e n t3 ，c 3 ) ，是血清中含量最高的补体成分，分子量 为1 9 5 k d ，主要由巨噬细胞和肝脏合成，在c 3 转化酶的作用下，裂解成c 3 a 和 c 3 b 二个片断，在补体经典激活途径与旁路途径中均发挥重要作用。补体c 3 作 为急性时相反应蛋白，在急性炎症、传染病早期、急性组织损伤、恶性肿瘤、移 植物排斥反应时增高。 补体c 4 ( c o m p l e m e n t4 ，c 4 ) ，由肝脏、吞噬细胞合成，分子量为2 1 0 k d ， c 4 作为c 1 酯酶的底物，在m 9 2 + 的参与下，c 4 裂解为c 4 a 和c 4 b 二个片断， 参与补体的经典激活途径。 我们的实验研究表明：海分枝杆菌感染大鼠后，引起大鼠血清中补体c 3 、 c 4 的水平明显增高，与对照组比较差异有统计学意义( p o 0 1 ) 。说明补体c 3 、 c 4 在防御海分枝杆菌的感染方面起到对有机体的保护作用。 c 反应蛋白( c - r e a c t i v ep r o t e i n ，c r p ) ，是一种能与肺炎链球菌c 多糖发生 反应的急性时相反应蛋白，具有激活补体，促进吞噬细胞和免疫调理作用。c 反应蛋白主要由肝脏产生，分子量1 2 9 k d