（微生物学专业论文）一株欧文氏菌的分离及其溶藻特性的研究.pdf

= = 摘要 有害藻类水华频繁爆发已成全球性环境灾害。溶藻细菌，控制水华爆发有 巨大的潜力，已经引起了国内外不少学者的关注。我们选择武汉市7 个富营养 化池塘为采样点，自2 0 0 1 年4 月份到2 0 0 2 年l o 月份，以9 种常见淡水蓝藻 为宿主，采用改良的液体和固体感染方法来分离淡水溶藻细菌，获得了一种高 效分离淡水溶藻细菌的方法。我们共分离了4 株溶藻细菌，并对其中的一株溶 藻细菌m 1 4 的溶藻特性进行详细的研究，结果如下： 溶藻细菌m 1 4 分离于狂欢岛池塘的水华水样中，对溶藻细菌m 1 4 菌株进行 培养特征、形态观察及生理生化特性测定，结果表明：m 1 4 为一株革兰氏阴性 短杆菌，在蛋白胨琼脂培养基中，能够形成黄色湿润的圆形菌落：过氧化氨酶 阳性，氧化酶阴性，苯丙氨酸脱羧酶阴性，为发酵性代谢，参考有关文献可初 步鉴定为一种欧文氏菌。 在液体培养基中m 1 4 对鱼腥藻( a n a b a e n ap c c 7 1 2 0 ) 、鱼腥藻( a n a b a e n a s p 5 9 5 ) 、鲍氏织线藻( 用e c t o n e m ab o r y a n u mi u 5 9 4 ) 、坑形席藻( p h o r m i d i u m f o v e o l a r u mi u 4 2 7 ) 、伪枝藻( s c y t o n e m ah o f m a n n ii u l 5 8 1 ) 、念珠藻( n o s t o cs p 9 6 ) 等丝状蓝藻具有强烈的溶解作用，在8 d 内能全部溶解藻细胞。细菌培养物 的无菌滤液对蓝藻仍具有强烈的溶解作用，这表明菌株m 1 4 是通过分泌细胞外 物质的方式实现溶藻的。通过采用不同培养阶段的m 1 4 的无菌滤液进行溶藻实 验得知：m 1 4 从稳定期开始能够分泌溶解宿主的次生代谢物质。 我们还研究了改良培养基对m 1 4 溶藻效果的影响，结果表明：适量的蛋白 胨和酵母膏能明显地提高m 1 4 的作用效果。当b g l l 培养基中牛肉膏和蛋白胨 含量分别为0 5 和0 4 时。并不影响鱼腥藻的生长。在这两种培养基中m 1 4 的溶藻周期明显缩短。 关键词：溶藻细菌蓝藻分离溶藻试验 a b s t r a c t t h ei n c i d e n c eo f h a r m f u l a l # b l o o m s ( h a b s ) h a sr e c e n t l y i n c r e a s e di n f r e q u e n c y a sal o n g - t e r mt r e n do nag l o b a ls c a l e a l g a e - l y s i n gb a c t e r i at h a tc o u l d k i l lb l o o m - f o r m i n g p h y t o p l a n k t o n h a v e b e e ni s o l a t e df r o mt h en a t u r e i ti sn o w t h o u g h t t h a tt h o s eb a c t e r i am a yt e r m i n a t eh a r m f u la i g a lb l o o m sa n d r e g u l a t ea l g a l p o p u l a t i o nd y n a m i c s i nb o t hf r e s h w a t e ra n dm a r i n ee n v i r o n m e n t s t h e l y t i ce f f e c t s o f a l g a e - l y s i n g b a c t e r i ao nt h e i rh o s tc e l lm a y p o s s i b l y b eaf a c t o ri np o p u l a t i o n d y n a m i c so f a l g a e i nn a t u r oa n d m a y c o n t r i b u t et ot h eo f t e n - o b s e r v e ds u d d e n d i s a p p e a r a n c eo f a l g a lb l o o m s i nn a t u f a le n v i r o n m e n t s n o w , m o r ea t t e n t i o n sh a v e f o c u s e do nt h ei s s u et h a ta l g a e - l y s i n gb a c t e r i aa c t 嬲a p o s s i b l ef a c t o r t om i t i g a t e t h ea d v e r s ee f f e c t so f h a b s w a t e r s a m p l e s w f f f eo o l l e c t e df r o mt h es u r f a c eo f s e v e n e u t r o p h i cp o n d s i n w u h a n c i t yd u r i n g t h e p e r i o df r o ma p r i l ，2 0 0 1t os e p t e m b e r 。2 0 0 2 1 1 l ew a t e r s a m p l e s w e l ef i r s t l yp r e - t r e a t e d , t h e nm o d i f i e di n f e c t i v em e t h o d si nb o t h l i q u i da n d a g a rm e d i a w e r ec a r r i e do u tt oi s o l a t ea l g a e - y s i n gb a c t e r i aw h i c hc a n l y s eo r i n h i b i tn i n e c y a n o b a c t e r i ap r e s e n t e di nt h i sp a p e r w eh a v ed e v e l o p e da n e f f i c i e n t s c r e e n i n g m e t h o df o r a l g a e - l y s i n g b a c t e r i ai nf r e s h w a t e r f o u rs t r a i n sa l g a e l y s i n g b a c t e r i aw 讹o b t a i n e d , a n dm o r es t u d i e dw e r ec o u d u e t e do nt h es t r a i nm 1 4 ，t h e f o l l o w i n g s a r e s u l t s m 1 4w a si s o l a t e df r o m k h d ( k u a n g h u a n d a n ) p o n d i nt h ed e c l i n eo f a c y a n o k c t e r i a lb l o o m a c c o r d i n g t ot h es t u d i e so nt h em a j o r b a c t e r i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s 。i tw a s i d e n t i f i e d 船a e r w i n i a s p t h eb a c t e r i u m i sg r a m n e g a t i v e ， s t r a i g h tr o d s m a n y k i n d s o f c a r b o h y d r a t e sc 强b eu t i l i z e d ，b u t 1 1 0g a si sp r o d u c e d g e l a t i n 啪n o tb e l i q u e f i e d c a t a l a s ei sn e g a t i v ea n d8 g i n i n ed i h y d r a l a s ea n d o x i d s s et e s t sa r ep o s i t i v e i ts h o w e d p o t e n ta l # d d s la c t i v i t ya g a i n s t f i l a m e n t o u s c y a n o b a c t e r i a ：a n a b a e n a p c c 7 1 2 0 、a n a b a e n a s p5 9 5 ，p l e c t o n e m ab o r y a n u m i u 5 9 4 、p h o r m i d i u m f o v e o l a r u mi u 4 2 7 s c y t o n e m ah o f m a n n i i u l 5 9 la n dn o s t o c s p 9 6w h e nw ec o - c u l t i v a t e dt h e m ，r e s p e c t i v e l y b a c t e r i a lc u l t u r ef i l t r a t ee x p e r i m e n t s l i s h o wt h a tt h eb a c t e r i m ms t r a i nm 1 4 g i v e s l e t h a le f f e c t so nf i l a m e n t o u s c y a n o b a c t e r i a b ym e a n s o f e x t m c e l l u l a r p r o d u c t s p r e l i m i n a r ys t u d yr e v e a l e dt h a tt h es t r a i nc o u l d s e c r e t es o m ee x t r a c e l l u l a rm a t e r i a l sw h i c ha r er e s p o n s i b l ef o rt h e a l g i c i d a la c t i v i t y f r o mt h e s t a t i o n a r ys t a g e w ea l s os t u d i e dt h ee f f e c to f s o m e o r g a n i cs u b s t a n c e so nm 1 4a l # c i d a l a c t i v i t y n e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg r o w t ho f a n a b a e n a s p5 9 5w a s n t a f f e c t e db y s o m e o r g a n i cs u b s t a n c e si nm o d e r a t ec o n c e n t r a t i o n s n ea l # e i d a la c t i v i t yo f m l 4 c o u l db e p r o m o t e d i nt h eb g l lm e d i a s u p p l e m e n t e d w i t h 0 5 p e p t o n e o r0 4 0 0 y e a s t e x t r a c t k e yw o r d s ：a l g a e - l y s i n g b a c t e r i a c y a n o b a c t e r i a i s o l a t i o n a l g i c i d a le x p e r i m e n t i l l m 稚a s t e 牝r $ t 敞i 诬s i s 1 、文献综述 富营养化已成为当今世界上水体普遍存在的环境问题。有害藻类水华 ( h a r m f u la l g a lb l o o m ，h a b ) 的爆发则是富营养化引起的生物污染现象。藻 类是依靠光合作用产生能量的水生生物，它既能产生人们需要的大部分氧气， 也能产生大面积的水华。因此对藻类，特别是水华的控制受到国内外有关专家 的高度重视。众多科研人员致力于研究影响水华消长的各种原因，以期获得 有效的防治方法。有文献报道：在水华的发生、发展和消亡过程中，细菌以及 细菌和水华藻类的相互作用是影响藻类生长的关键性的调控因素圆。但是藻菌 关系在水华的种群动力学中是否起关键作用，是怎样起作用的以及究竟通过什 么机制起作用，却尚未得到透彻的研究。 藻菌关系在水生生态系统的碳循环和营养再生中起重要的作用，文献中报 道较多的是细菌和藻类之间的营养相互关系。通过比较我们可以看出：在生态 学中，藻菌关系的研究多数源自对有害藻类水华所引起的环境和人体健康负面 效应的关注。因此细菌和藻类并不简单被认为是一个相邻的营养组成部分，而 筛选对：水华藻类有特异抑制作用的细菌已经引起了广泛的关注，许多研究人员 已经把溶藻细菌作为缓解有害藻类水华危害的一种潜在的生物”。 1 1 溶藻细菌的研究概况 所谓溶藻细菌是指：通过直接或间接方式，抑制藻类生长，或杀死藻类， 从而溶解藻细胞的细菌叫。在英文文献中，溶藻细菌的名称多为a l a g e 1 y s i n g b a c t e r i u m 或a l g i c i d a lb a c t e r i u m 。目前国内对溶藻细菌的研究还不多，文献中 尚无统一名称。其实，溶藻细菌的研究已有数十年的历史。早在1 9 2 4 年，g e i t l e r 报道一种粘细菌p o l y a n g i u m p a r a s i t i u m 寄生在刚毛藻c l a d o p h o r a 上，使藻死 亡旧。随着藻类学、水生生态学和环境科学研究的进展，溶藻细菌在国外文献 中陆续有一些报道，主要有：粘细菌( m y x o b a c t e ，) “”、噬胞菌属 ( c y t o p a g a ) “”、纤维弧菌属( c e l l v i b r i o ) 、节杆菌( a r t h r o b a c t e r ) “”、屈挠 细菌属( f l e x i b a c t e r ) 、蛭弧菌( b d e l l o v i b r i ob a c t e r i o u s ) 、杆菌( b a c i l l u s ) 、黄杆 菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、弧菌( h b r i o ) 啪。1 、腐生螺旋体属( s a p r o s p i r a ) 、假 = = 。 单胞菌( t s e u d o m o n c 阽) 珊刮、鞘氨醇单胞菌属( s p h i n g o m o n a s ) m 1 、交替单胞菌 臼l t e r o m o n a s ) 。”、交替假单胞菌( p s e u d o a l t e r o m o n a s ) 慨。蚓和反硝化产碱杆 菌( a l c a l i g e n e sd e n i t r i f i c a n s ) 等。这些细菌多数为革兰氏阴性菌，它们的作 用对象比较广泛，既有蓝藻，也有硅藻和甲藻( 具体情况见表1 ) 。 1 2 溶藻细菌的生态学意义 1 2 1 溶藻细菌在水生生态系统中的作用 在水生生态系统中，细菌和微型藻类是数量最多、分布最广的生物。在海 洋生态系统中，细菌和藻类种群的时空分布特征和相互作用已得到很好的 研究，结果表明：一个种群的生物( 细菌或藻类) 分泌的次生代谢产物对另一 个种群的生物( 细菌或藻类) 可能有益，也可能有害。物种间这种相互拮抗能 力提供了一个可能的反馈机制，这种机制在控制藻类和细菌的种群演替和种群 动力学中起重要作用。f u m k i 和k o b a y a s h i ( 1 9 9 1 ) 的工作表明：当c h a t t o n e l l a t i n f f g “口将要达到最大的细胞浓度时，周围的一些细菌能够促进c h a t t o n e l l a a n 细船的生长：相反地，当c h a t t o n e l l aa n 咖u a 水华消亡时，有些细菌又能够 抑制该藻的生长。因此细菌和藻类之间的关系是复杂多变的，水华的不同发展 阶段，可能有不同的细菌对藻类起作用n ，。 无论在海洋生态系统，还是淡水生态系统，都已经成功地分离了多抹溶藻 细菌，这些细菌多属于嗜纤维菌属( c y t o p h a g a ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i a ) 、 交替单胞菌属0 t t e r o m o n a s ) 和交替假单胞菌属( p s e u d o a l t e r o m o n a s ) 。它们的宿 主范围比较广泛，对多种微型藻类具有溶解作用，在自然生态系统中能够将微 型藻类的种群密度调节到一个适当的程度。溶藻细菌，作为水生生态系统中生 物种群结构和功能的重要组成部分，对维持藻类生物量的平衡具有非常重要的 作用呱3 i “，它们对浮游藻类的溶解作用可能是调节水生生态系统中初级生产 力的一个重要因素“。 值得注意的是，溶藻细菌不但对有害藻类有溶解作用，而且对一些有益的 藻类如固氮蓝藻“3 “1 、与珊瑚虫内共生形成珊瑚的虫黄藻( z o o x a n t h e l l a e ) 等 均有溶解作用1 1 。研究已经证明细菌对虫黄藻的溶解作用，是地中海沿岸珊 瑚礁生态系统褪色的一个直接原因瑚，。 2 总之，藻菌关系在有害藻类水华的生消过程中起重要作用。而细菌对有害 藻类的的溶解作用为有害藻类水华的防治提供了新的生物控制可能性。不少 国外研究者认为：溶藻细菌普遍存在于水生生态系统中，水华的迅速消退很可 能与溶藻细菌的感染有关。”1 。随着全球水体富营养化的加剧，水华的爆发日 趋频繁，其造成的环境和经济问题日益引起人们的重视，在利用物理、化学和 其它生物方法防治水华甚不理想的情况下，溶藻细菌作为水华防治的可能生 物，引起了众多科研人员的关注，溶藻细菌的研究已成为未来一个时期内富有 挑战性的课题。 1 2 2 溶藻细蘸对藻类生长和水华动力学的影响 水华种群动力学，包括水华的发生、发展、消退，是受一系列复杂的物理、 化学和生物因素相互作用的制约。在自然水体中，某段时间内某一区域某种浮 游藻类的种群生长符合下列方程： n t = n o p k 。鼬妇- k s - k g ) 其中n 。代表该浮游藻类种群的生长率：k 代表浮游藻类细胞的繁殖速率；k i 代表漂移( i m m i g r a t i o n ) k 该区域的浮游藻类细胞的比率；k a 代表流出( w a s h o u t o rf l u s h i n g ) 的浮游藻类细胞比率；k i n 代表死亡( m o r t a l i t y ) 的浮游藻类细胞比率； k s 代表下沉( s i n k i n g ) 的浮游藻类细胞比率；k g 代表被捕食( g r a z i n g ) 的浮游藻 类细胞比率。溶藻细菌通过分泌细胞外生长抑制物质或溶藻物质，或者是直接 攻击宿主藻类细胞，从而影响k 和k i n 的值，进而影响浮游藻类的种群生长。 尽管多数的溶藻细菌往往有广泛的宿主范围，但是某些细菌的次生代谢产物能 够以物种特异性的方式影响或者终止藻类的繁殖。细菌和藻类在细胞水平上的 这种相互关系，能够调节水华的种群动力学，同时也能够影响藻类群落中优势 物种的演替嘲。 - 表1 ；已报道的溶藻细菌及其作用方式 t a b l e l ：as u r m n a r yo f s o m e a l g a e l y s i n gb a c t e r i a = = 。 溶藻菌株宿主 作用方式参考文献 4 m 耻a s t e 靴r s t 敝i w _ s i s 1 2 3 细菌影响水华动力学的可能作用模式 根据溶藻细菌和藻类是否直接相互接触对溶藻细菌进行分类是很重要的。 溶藻细菌对宿主的作用方式给我们提供了重要的启示：通过溶藻细菌的作用方 式，我们可以了解藻菌关系的作用机制，同时能够指导我们尝试分离和鉴定一 些介导特殊效应的物质，如特异性针对有害藻类的溶藻物质，从而获得高效的 生物杀藻剂。 从表l 我们可以明显看出：直接或间按溶藻作用与某些种属的细菌是紧密 偶联的。如粘细菌、噬胞菌属是通过直接接触( d i r e c ta t t a c k ) 溶藻的；而黄杆 菌属、弧菌，交替单胞菌、交替假单胞菌等通过分泌代谢物质的间接方式 ( i n d i r e c t a t t a c k ) 溶藻的。这种现象间接地反应了不同种属细菌的特异性的表型 特征。由于细菌在水生生态系统中的存在方式表现出一个明显的趋势：附着状 态( 附着在藻类细胞表面) 和游离状态，而合成胞外酶往往发生在浮游细菌群 落中游离的细菌中。所以，溶藻细菌很可能通过直接的物理相互作用或者向周 围水体中分泌高度特异性的生物活性物质来实现溶藻效果。并且某些细菌生物 活性物质的合成也受藻菌表面互相接触地调控，即只有当细菌附着在藻类表面 时才能启动分泌机制。比如d a r f t 等研究发现：9 种从废水中分离的粘细菌可 以溶解：鱼腥藻、束丝藻、微囊藻和颤藻。其机理是粘细菌直接与宿主细胞相接 触，产生了溶解纤维素的酶，消化宿主的细胞壁，进而溶解宿主细胞n 。1 。 在很大程度上，溶藻细菌对水华藻类和一些与水华藻类共存的其它浮游藻 类都有强烈的抑制作用。不管细菌溶藻是通过何种方式，已经鉴定的许多种溶 藻菌株或者能够溶解多个种属，或者单个种属，甚至某一种的藻类，因此这种情 况表明细菌能够影响浮游藻类的种群演替，即当溶藻细菌作用于非水华藻类 时，导致水华藻类占优势，引起水华的爆发；当溶藻细菌作用于水华藻类时， 可能会引起水华的消退。 d o u c e t t eg j ( 1 9 9 9 ) 根据自己的研究结果提出了一个溶藻细菌影响水华种 群动力学的可能作用模式。该作用模式是建立在对一株溶藻细菌( c y t o p h a g a 4 1 d b 0 2 ) 和它的宿主裸甲藻( g y m n o d i n i u m ) 之间的相互作用研究的基础上， 并且得到了野外的研究工作的支持。这个概念性的模式由四个基本的阶段组成， 各个阶段及其之间的相互演变关系如下：1 ) 初始阶段溶藻细菌作为其特异 m 黜惦 r 。牡1 t s t 敞h e s i s 性宿主周边微生物群落中的组成部分，数量很少，宿主藻类细胞密度很低或者 基本没有宿主细胞；1 ) 一2 ) 水华发生时，藻类密度增加，藻类分泌的有机 物也随之增加，导致水体中有机营养物质增多，周边环境中细菌总数同步开始 增加。2 ) 一3 ) 水华开始发展时，宿主藻类细胞数迅速增加，溶藻细菌能够优 先利用藻类分泌的有机物，其绝对数量( 即溶藻细菌的总数) 和相对数量( 即 在细菌群落中的比例) 增加，溶藻细菌杀死宿主细胞，释放有机物质。这导致 了一个反馈机制：进一步刺激周边细菌群落中溶藻细菌的生长和活性；3 ) 一4 ) 在水华的发展阶段，上述反馈机制在变化的时空范围内继续起作用，最终，在 一些因素的协同作用下，促进水华开始消亡；4 ) 一1 ) 当水华开始消退时，伴 随宿主藻细胞减少，导致有机物质减少，溶藻细菌在利用藻类有机物方面的优 势被消减到与其他细菌一样的初始水平，数量开始减少“”。这个概念性的模式 过于简化水华这个物理、化学和生物因子综合作用的事件。但是作为一个理想 化的模式是有助于研究溶藻细菌和水华的种群动力学关系的。 1 3 溶藻细菌研究的最新进展 1 3 1 溶藻细菌的分离方法 正如多数微生物既可利用固体培养基又可利用液体培养基进行培养一样， 溶藻细菌的分离基本可分为两种思路：一种是利用液体感染的方法进行分离； 另一种是利用固体感染的方法进行分离。液体感染的筛选方法适用范围广，但 筛选程序比较复杂，工作量较大；固体感染的筛选方法相对而言比较简单、直 观，但仅适合分离宿主能在固体培养基中生长的藻类的溶解细菌，国外研究者 多采用软琼脂顶层平板法( s o f t - a g a ro v e d a y c rt e c h n i q u e ，以下简称s a o l t ) 。 i 3 1 1 液体感染筛选方法 利用液体感染方法筛选溶藻细菌，不同的研究者采用不同的方法。 h a y a s h i d a s 和y o s h i k a w a k 等采用随机分离方法，即先从水样中分离细菌，获 得纯培菌株，然后将纯培菌株分别加入藻类的培养物中进行共同培养，通过检 测能够导致藻类生物量下降或藻细胞溶解的菌株即为溶藻细菌眦“。这种方法 劳动量较大，如果水样中不含有溶藻细菌，前期的工作就成了无用功。所以研 究者一般先确定水样中是否含有溶藻细菌，确认水样中含有溶藻细菌后在进行 m 酣a s t e 牝r s t 敝h e s i 。 分离筛选。i m a ii 发展了一种利用液体培养基分离海洋溶藻细菌的方法“”， 程序如下：采集水样，经0 8 | im 滤膜过滤，除去比细菌大的颗粒，然后用 藻类培养基对水样进行1 0 倍递增梯度稀释，取i m l 各个稀释梯度的水样分别 加入到内含4 m l 预培养藻类培养物中，设置5 个平行进行培养。培养一段时间 后，取黄化的培养物适量加入到正常生长的培养物中，保证有足够的细菌杀死 宿主藻类，最终将黄化的培养物涂布平板分离细菌，然后从优势菌种筛选溶藻 细菌。在水生生态系统中，细菌的数量一般比原生动物高几个数量级，水样经 过过滤和稀释，大大的消除了原生动物对藻类的捕食作用，从而提高了溶藻细 菌的筛选效率。h n a m u r an ( 2 0 0 i ) 采用与i m a ii 相似的方法分离溶解微囊藻的 细菌，同时对分离溶藻细菌的水样进行了比较，指出水华期水样是分离溶藻细 菌的最好样品，从其中能够分离较多类属的、高效的溶藻细菌嘲。 总之，利用液体感染方法分离溶藻细菌，不同的研究者或多或少的采用了 下述程序：水样的采集及预处理；水样和藻类的共同培养；黄化培养体 系中优势细菌的分离；溶藻细菌的筛选 1 3 1 2 固体感染筛选方法 1 3 1 2 1 涂布平板法 在国体培养基分离溶藻细菌主要利用空斑形成( p l a q u ef o r m a t i o n ) 的方法 进行。涂布平板法即将宿主藻在琼脂培养基中预培养至藻落出现，然后将水样 涂布藻落上继续培养，待出现扩展的溶藻空斑后，从单个空斑取样，转入细菌 培养基，最后划线获得溶藻菌株“2 蚓。由于涂布接种的方法易于机械性损伤藻 类，同时也难以分离一些抑制藻类生长细菌，效果不太理想，目前采用者甚少。 1 3 1 2 2 软琼脂顶层平板法( s a o l t ) 获得细菌溶藻空斑的另一个方法是s a o l t 法，1 9 6 4 年s a f f e r m a n 首先采 用s a o l t 法分离和检测蓝藻病毒，1 9 7 0 年s h i l o 始用于分离检测溶藻细菌， 后经许多研究者的不断发展和完善啪“1 ，目前已成为一种分离溶藻细菌，尤其 是淡水生态系统中溶藻细菌的常用方法“。其基本操作思路如下：制备两种藻 类固体培养基，琼脂培养基( a g a r m e d i u m ) 和软琼脂培养基( s o f l - a g a r m e d i u m ) ， 以琼脂培养基作底层平板，水样、预培养的藻和熔化并冷却至4 7 c 的软琼脂 培养基混合均匀迅速倾注到底层平板，琼脂固化后进行培养，至扩散的溶藻空 斑出现后，通过单斑纯化获得溶藻菌株。由于软琼脂培养基中琼脂含量低，凝 固时间长，保证了足够的操作时间。采用s a o l t 法时噬藻体、原生动物和 溶藻细菌都可以形成空斑，因此对溶藻细菌形成的空斑的鉴定和辨认尤为重 要。s h i l o 、y a m a m o t o 和s a k a t a t 的研究结果表明：细菌形成的空斑多在接种 后3 5 天出现，病毒形成的斑在接种卜3 天即可出现，而且细菌形成的空斑多 内陷于琼脂，为坑形空斑k 4 枷。而噬藻体1 天左右即可形成的空斑，并且形成 的斑比较圆，透明度高，扩展速度较快。 无论在液体还是在固体培养基中，溶藻细菌的分离效率与水样的预处理有 密切的关系，但是排除噬藻体和原生动物的干扰，而不影响溶藻细菌的浓度是 十分困难的。此外，由于细菌间的相互依赖关系和我们缺乏对细菌特殊营养需 求的了解，采用传统的培养方法，有些细菌是不能被分离培养的“删。s u z u k i 的研究发现：在海洋环境中，通过培养获得的1 6 s r r n a 序列远远少于直接从 环境中获得的序列。这给分离溶藻细菌带来了困难，这些矛盾的解决都需要 技术和方法上的突破。 1 3 2 溶藻过程中藻菌生物量变化的检测方法 在溶藻细菌的作用过程中，藻类生长受到抑制或细胞溶解导致生物量的下 降，溶藻细菌获得藻类释放的有机物质，其数量也要发生变化。为了深入了解 藻菌关系，特别是自然水生生态系统中藻类与溶藻细菌的种群动力学关系，必 须对藻类和溶藻细菌的生物量变化进行检测。 1 3 2 1 ，藻类生物量的测定 藻类生态学中比较困难的工作就是生物量变化的测定。测定叶绿素a 含量 比较准确，但操作复杂：利用相差或微分干涉显微镜进行藻细胞计数法操作简 单，但工作量大，特别是有些溶藻细菌能够导致宿主的细胞大小发生变化 ”。”】，在这种情况下细胞计数的可靠程度就很低。近年来利用荧光技术检测 藻类的生物量成为一种常用的方法。i m a ii 等采用荧光仪，通过活体荧光q n v i v of l u o r e s c e n c e ) 检测技术，测定叶绿素a 的荧光参数，由于叶绿素的荧光值 与叶绿素a 含量是正相关的，因此它能够代表藻类的生物量溉“。光合效率的 变化也能够准确地反应藻类生物量的变化，便携式脉冲调制荧光仪( p a m ) 的 研制给实验室和野外工作带来了极大的方便。r o s e n b e r ge 在研究细菌介导的 珊瑚褪色时发现，病原弧菌( h b r i o s h i l o ia k i ) 能够抑制虫黄藻的光合效率。 利用脉冲调制荧光仪检测结果表明实验组虫黄藻的光合量子产量 ( p h o t o s y n t h e t i cq u a n f i 啪y i e l d ) 能够迅速下降，而对照组则不发生变化，表明 弧菌能够迅速的抑制虫黄藻光合效率。 1 3 2 2 溶藻细菌生物量的测定 细菌的检测一般采用平板计数法、显微镜直接计数法和荧光显微镜计数法 等。其中平板计数法只能计数可培养的细菌，显微镜直接计数法和荧光显微镜 计数法计数的为培养体系中的总菌数。由于目前科研或生产中用的藻种多数混 有细菌，为单种培养，并非纯培养。因此这几种计数方法特异性、灵敏性较低， 不适合藻菌关系过程中溶藻细菌的检测。近年来发展的微孔板一m p n 法和免疫 荧光检测方法是检钡4 溶藻细菌的一个新方向嘶3 叼。 1 3 2 2 i 微孔板_ 佃n 法 对于宿主可在琼脂平板上生长的藻类来说，溶藻细菌的检测多采用s a o l t 法，其中每个空斑代表一个溶藻细菌。1 9 9 8 年h n a ii 发展一种检测和计数不能 在琼脂堵养基中生长的藻类溶藻细菌的方法微孔板- i p n 法( m i c r o p l a t e m p nm e t h o d ) ，这是基于统计学原理的一种方法，能够获得所检测项目的最可 能值。其程序如图l ，具体步骤为：用藻类培养基将预培养的宿主藻适度稀释， 分别取稀释液0 5 m l 加入到一次性的4 8 孔无菌组织培养微孔板中。待检样品 先经0 8 胁的滤膜过滤除去比细菌大的颗粒，用灭菌海水作l o 倍递增梯度稀 释，分别取各个梯度的稀释液0 5 m l 加入到内含0 5 m l 宿主藻类的微孔中，设 置5 个平行，密封防止水分蒸发，按宿主的培养条件培养一段时间，定期置倒 置显微镜下观察，其中9 9 的藻细胞死亡的微孔记作阳性，统计各个稀释度中 阳性微孔的数目，同时以灭菌的海水样品作对照。根据各个稀释度中阳性微孔 的数目查m p n 表或利用计算机程序进行计算，估测出溶藻细菌的最可能值。 为检测微孔板一m p n 法的准确性，h n a ii 将溶藻细菌噬纤维菌( c y t o p h a g a j 1 8 m d l ) 定量加到天然除菌水样中( 水样中的细菌通过d a p i 染色的表面荧光 显微镜计数) ，以噬纤维菌( c y t o p h a g aj 1 8 ，m 0 1 ) 的宿主为敏感藻类，利用微孔 板m p n 法对噬纤维菌( c y t o p h a g a j 1 8 m 0 1 ) 进行计数，所得值与最初加入值具 有可比性，表明微孔板m p n 法检测自然水环境中的溶藻细菌具有可行性。 9 酉噌 舀l o * d l l u t l o n 凰+ 凰 l 旷 n 丛 p r e c u l t u r ei n o c u l a t i o n ( p h y t o p l a n k t t m ) ( 0 5 m 1 ) 1 矗m 图1 ：微空板一m p n 法检测溶藻细菌的主要程序 f i g u r el ：p r o c e d u r ef o r t h e m i c r o p l a t em p n m e t h o df o rt h ee n u m e r a t i o n o f a l g a e - l y s i n g b a c t e r i a 最后需要指出的是，利用微孔板肝n 法检测溶藻细菌，易受噬藻体和捕 食藻类韵原生动物的干扰，不能十分有效地区分样品中不同类型的溶藻微生 物。但是由于这三种微生物个体大小的差异，利用0 8 帅的滤膜基本上可以除 去原生动物，通过0 2 阳的滤膜可以除去几乎所有的细菌，因此通过滤膜预处 理水样，然后分别利用微孔板忡n 法检测溶藻微生物的数量，溶藻细菌的数 量基本上为经0 8 岫的滤膜过滤后水样中的溶藻微生物数减去经0 2 胁的滤膜 过滤后水样中溶藻微生物的数量。 1 3 2 2 2 免疫荧光检测方法 免疫荧光检测方法的原理是利用抗体与抗原特异性结合的特性，制备溶藻 细菌的抗体，并用荧光素对抗体进行标记，标记后抗体在合适条件下以适当的 比例与水样孵育一段时间后通过表面荧光显微镜( e p i f i u o r e n c em i c r o s c o p e ，e f m ) 来检测水样中溶藻细菌的数量。i m a ii 首次利用免疫荧光方法检测了日本s e t o 内海中溶藻细菌交替单胞菌臼l t e r o m o n a ss p s ) 与其宿主种群动力学关系的 时空变化特征嘲。下面以溶藻细菌噬纤维菌j 1 8 m 0 1 为例阐述一下其具体方法 一双染荧光免疫检测方法：即对水样中的细菌利用d a p i 染色，噬纤维菌 1 0 警n 出扩舀 i 射一牡r s t 敞h e s i s j l s z m 0 抗体采用荧光素f i t c 进行标记。主要程序如下：用终浓度0 5 的 戊二醛固定1 0 1 5 m l 样品，然后通过0 2 ) i r a 的滤膜过滤；以终浓度为 0 5 腿i q l 的d a p i 室温条件下对水样染色5 m i n ：0 2 细过滤的海水的蒸馏水 洗涤一次；用溶藻细菌噬纤维菌j 1 8 l 0 1 的初次抗体( p r i m a r ya n t i b o d y ) 室温 孵育1 5 m i n ，p b s 冲洗两次：荧光素f i t c 标记的二次抗体( s e c o n d a r ya n t i b o d y ) 孵育1 5 m i n ，p b s 冲洗两次i 用表面荧光显微镜计数，至少镜检3 0 个视野。 免疫荧光检测方法灵敏度高。特异性强通过特异性荧光抗体的制各能够准确的 检测水体中某一细菌的数量。影响免疫荧光检测方法精确度的一个重要因素就 是抗原和抗体之间的交叉反应，这就要求我们对待检测的溶藻细菌进行深入的 研究，获得其独特的抗原结构，制备特异性的单克隆抗体，避免与系统起源上 相近的细菌发生交叉反应而影响检畏4 结果。 1 3 3 溶藻细菌的作用方式的研究 溶藻细菌作用方式，一般分为下列两种情况：一是直接溶藻，即直接进攻 宿主( d _ r e c ta t t a c k ) ，它需要细菌与藻细胞直接接触，甚至侵入藻细胞内：二是 间接溶藻，即间接进攻宿主( i n d i r e c t a t t a c k ) ”3 ，主要包括细菌同藻竞争有限营养 嘲或细菌分泌胞外物质溶藻。近年来，文献报道较多的是细菌分泌胞外物质到 环境中抑制藻的生长，导致藻细胞的溶解。 i 3 3 1 直接溶藻 粘细菌是最早报道和报道较多的溶藻细菌。s h i l o ( 1 9 7 7 ) 4 1 、d r a f t ( 1 9 7 5 ) “”， 李勤生和黎尚豪( 1 9 8 1 ) m 3 分别报道粘细菌同蓝藻细胞相互接触，导致藻细胞溶 解，但是这种溶藻作用仅发生于宿主的营养细胞，对异形胞、静息孢予不产生 影响。! _ r a m a m o t o ( 1 9 7 7 ) 嘲从土壤中分离一种细菌m 1 f 一1 通过直接方式溶解鱼腥 藻( 包括异形胞和静息孢子) 。m a r i 也g c 0 9 8 4 ) 啪从发生水华的铜绿徽囊藻中 分离一株类似蛭弧菌的细菌，这种细菌能够侵入铜绿微囊藻的细胞内并溶解宿 主。细菌可内生于不同种类的淡水或海洋藻类中，它们既可存在于细胞核中， 也可存在于细胞质内，甚至细胞器中，但是这种寄生并不引起宿主的溶解。因 此能够侵入宿主细胞并溶藻就有特殊的意义。m i t s u t a n i ( 1 9 9 2 ) “”、 i m a i i ( 1 9 9 3 ) 1 7 和d o u c e t = t egj ( 1 9 9 9 ) 1 1 硼分别报道噬胞菌( c y t o p h a g as p a 5 y 、 j 1 8 m 0 1 和4 1 b g 2 ) 的培养物对硅藻有强烈的溶解作用，而无菌滤液对宿主 m 耻a s t e 壮r s t 舣h e s i 。 则不起任何作用。i m a i 。i ( 1 9 9 5 ) 嗍j 焚察到滔株交蛰单胞蓥( , 4 l t e r o m o n a s $ 拄：a i nr a n ds ) 也可通过窟接方式溶解某黧藻类。 1 3 3 2 闺援溶藻 通过间接方式溶藻是纲藏溶藻的主要方式。细菌可以通过释放特异性或非 特异性的细胞外物质，如蛋白质8 1 、羟胺“”、抗生索恤1 、多肽、氨基酸啉” 簿耪震杀死藻缩熬。这类缁蓠常凳鹃有弧菡、穰萃瓣蕴、黄秆蔷、交耱单耱壤， 交替假单胞蔼等。 1 3 3 2 1 假单胞菌 霰萃貔麓是擞遴较多熬一种势泌蕊静裙葳溶藻熬细蓑。b a k e r k ( 1 9 7 8 ) 潮 发现某种假单胞菌t 9 2 7 2 b 通过分泌一种高分子量的热稳定的化合物能够杀 死硅藻( t h a l a s s i o s i r a p s e u d o n a n a ) 。s h i n s a k u h ( 1 9 9 1 ) 跚3 证明了施氏假单胞菌 释放一些高潘槛豹溶藻物震，能够选择经熬蓉死绿戆藻类熬c h a t t o n e l l a a n t i g u a ，最低的致死浓发为0 弱，但与之共同培养的黄咫鱼却不受锫何影响。 d a l d a a m a ( 1 9 9 3 ) 嘲报道铜绿假单胞菌产生一些低分予量的扩散髋吩嗪类色豢 物蔟强燕溶瓣一黧莲藻鞫绿藻。毽是必须注意t 缓攀藏蓥多为条俘致病蓥，戆 够产生内毒素、月旨酶、摄白酶、d n a 酶等物质，对人、动物或植物有害。在 利用假单胞菌为材料筛选溶藻物质时应考虑到这一点，避免产擞潜在的负两效 应。 1 3 3 2 2 交替假单胞荫 交替假单胞菌是最近几年研究较为深入的溶藻细菌。l o v e j o y c ( 1 9 9 8 尸 在怼淡大剩疆素帮豹h u o n 溪日遴纷缨蘩耪爨调查封分离到一掾交替骰萃黪麓 y ，对有害的水华藻类( g y m n o d i n t u m ，c h a 盯o n e l l a 、h e t e y o s i g m ) 有溶解作用， 能在三个小时内便藻细胞死亡，但是对菜种骨条藻和蓝藻( o s c l l l a t o r i a s p ) 苓敏感。k a t o 。， 1 9 9 8 ) 渊鼹海零撵鹣串分离4 攘交鸷假单蕤蓥a 2 7 、a 2 8 、a 2 9 、 a 3 0 能移裂解骨条藻( s k e l e t o n e m a c o s t a t u mn i e s 3 2 4 ) 。从其中二株a 2 8 、a 2 9 中分剐分离两种隐蔽型质粒p a s 2 8 、p a s 2 9 ，留们在大小和限带8 往酶切位点方 嚣是翱镁豹。疆p a s 2 8 梵爨发凌皴，融念是c o l l 震粒p c r i i c 梅建一个稳定 的遗传转化累统嵌合质粒p a s