（微生物学专业论文）橙色红曲菌聚酮合酶基因的克隆.pdf

摘要 摘要 真菌聚酮类化合物是一类庞大的次级代谢产物，具有结构和功能的多样性， 它包括洛伐他汀、色素和各类真菌毒素等。聚酮合酶( p k s ，p o l y k e t i d cs y n t h a s e ) 是介导聚酮化合物合成的关键酶本论文以橙色红曲菌a s 3 4 3 8 4 为出发菌株， 从中克隆p k s 基因，为后期的功能鉴定及p k s 基因全长的克隆奠定基础。具 体的研究内容和结果如下： 1 根据已知的真菌p k s 基因之序列，设计了2 对简并引物( p k s f l r 1 和 p k s f l r 2 ) ；以橙色红曲菌a s 3 4 3 8 4 基因组d n a 为模板，p c r + 扩增获得了4 条p k s 基因片段，分别命名为p k s l ( c o n f i 9 1 ) 、# s 2 ( c o n t i 9 2 ) 、p k s 3 ( c o n t i 9 3 ) 和p k s l 0 ( c o n t i g l 0 ) 。经b l a s t 比对发现，p k s 2 与n c b i 中已公布的紫色红曲 菌删序列( a j 4 1 4 7 2 9 ，7 1 4 4 b p ) 完全同源 2 根据p k s l 、p k s 3 和p k s l 0 的序列，设计了3 对特异性的引物( p f l p r l 、 p f 3 佃r 3 和p f l 卯r 1 0 ) ；用3 对特异引物从橙色红曲菌a s 3 4 3 8 4f o s m i d 文 库中进行p c r 筛选，获得了3 个阳性黏粒；采用超声波破碎阳性黏粒，并将 其克隆至p u c l 8 载体中，分别构建了3 个2 4 k b 的亚克隆文库：以 p f l p r l 、p f 3 p r 3 和p f l 0 p r l 0 为引物，分别从对应的亚克隆文库中筛选阳 性克隆子，获得了3 条p k s 基因，即m a p k s l 、m a p i 窿3 和i , c 4 p l 口l o 3 经生物信息学分析，m a p k s l 为非还原型p k s 基因，其编码的蛋白可 能参与桔霉素的合成；m a p k s 3 和m a p k s l o 为还原型p k s 基因，其翻译蛋白与 负责催化合成t 一毒素、洛伐他汀的聚酮合酶均有同源性 关键词：聚酮合酶橙色红曲菌a s 3 4 3 8 4 简并引物克隆 i v a b s t r a c t a b s t r a c t f u n g a l 叫y k c t i d e sm al a r g ef a m i l yo fs e c o n d a r ym e m b o l k e se x h i b i tav a s t d i v e r s i t yo fs t r u c t u r ea n df u n c t i o n , i n c l u d i n gl o v a s t a t i a , p i g m e n t sa n dm y c o t o x i n s t h e b i o s y n t h e s i so ff i l g a lp a l y k e t i d e si sg o v e r n e db yk e ye n z y m e s i nt h i sp a p e r , w e c l o n e dp k sg e n e sf x o mm o n a s c u sa u r a n t i a c u sa s 3 4 3 8 4 ，t om a k et h ef o u n d a t i o no f t h ec h a r a c t e r a t i o no ff u n c t i o na n dt h ec l o n i n go ff u l l l e n g t hp k sg e n e s t h em a i n r e s e a r c hr e s t a t sa r ea sf o l l o w s ： 1t w op a i r so fd e g e n e r a t ep r i m e r s ( p k s f l r 1a n dp k s f v r 2 ) w e r ed e s i g n e d b a s e do ns e q u e n c e sf r o mk n o w nf i l g a lp k sg e n e s f o u rp k sf r a g m e n t sw c 北 m p l i f i c df r o mm o n a s c u sa u r a n t i a c u sa s 3 4 3 8 4u s i n gp k s f l r 1a n dp k s f l r 2 ，a n d n a m e d p k s l ，p k s 2 ，p k s 3a n dp k s l 0 ，r e s p e c t i v e l y t h eb l a s ts e a r c h e s ( n c b dr e v e a l e d , p k s 2w a sap a r to f p k s l ( 7 1 4 4 b p ，a c c e s s i o nn o s a j 4 1 4 7 2 9i ng e n b a n k ) i nm o n a s c u s p u r p u r e u s ，r e p o r t e do n l yi na d a t a b a s e 2t h r e es p e c i f i cp r i m e r s ( p f l p r i p f 3 p r 3a n dp f i o p r l 0 ) w e r ed e s i g n e d b a s e do ns e q u e n c e so fp k s l ，p b 3a n dp k s l o ，r e s p e c t i v e l y t h r e ep o s i t i v ef o s m i d c l o n e sw e r es c r c e n e z tf r o maf o s m i dl i b r a r yo f m o n a s c u sa u r a n a a c u sa s 3 4 3 8 4u s i n g e a c ho ft h et h r e 圯s p e c i 丘cp r i m e rp a i r s a f t e rd i s t r u p t i o no fp o s i t i v ef o s 血d sb y u l t r a s o n i e a t i o n , t h es o n i c a t e dd n a w e r es u b c l o n c di n t op u c l 8t oc o n s t r u c tt h r e e 2 - 4 k bl i b r a r i e s t h r e ep k sg e n e sw e r eo b t a i n e df r o mt h ec o r r e s p o n d i n gs u b e l o n e l i b r a r y , a n dd e s i g n a t e dm a p k a l , m a p k s 3a n dm a # s l o , r e s p e c t i v e l y 一 3b yb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo fm a p k s lw a s p o s s i b l e l yt h ec i t f i n i nb i o s y n t h e t i cp k sa n dc l a s s i f i e d a sn o n - r e d u c i n g p k s w h e r e a st h et r a n s l a t e ds e q u e n c e sf r o mm a p k s 3a n dm a p k s l ob a dh o m o l o g o u sw i t h p k si n v o l v e di nt - t o x i na n dl o v a s t a t i nb i o s y n t h e s i sa n dc l a s s i f i e da sr e d u c i n gp k s k e yw o r d ：p o l y k e t i d e m o n a s c u sa u r a n t i a c u sa s 3 4 3 8 4 d e g e n e r a t ep r i m e r d o n e v 缩略语 缩略语 b p 勋 d n a 麟 。b 6 l b e d l a s d s p e g 4 0 0 0 d n t p t b e p b s p c r 1 拖 p k s k s a t d h m e t e r k r a c p c y c 缩略语 英文名 b a s ep a i r i c i l o b a s cp a i 墙 i ) e o x y d b o n u d e i ca c i d m a l te x t r a c ts u c r o f 沁m e d i u m d e g r e eb a u m e l u r i ab e r t a n im e d i u m e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y e t h y l e n eg l y c o l4 0 0 0 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e t r i s b o r i ca c i d e d t ab u f f e r p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t h i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e p o l y k e f i d es y n t h a s e i m o s y n t h a s c a c y lt r a n s f e r a s e d e h y d r a t a s e m e t h y lw a n s f e r a s e f i e t or c d u c t a s c e n o y l 础c t a 【s e 删c a r i e rp r o t e i n c y c l a s e 中文名 碱基 千碱基对 脱氧核糖核酸 麦芽汁培养基 波美度 l b 培养基 乙二胺四乙酸 十二烷基磺酸钠 聚乙二醇4 0 0 0 脱氧核苷三磷酸 陆硼酸缓冲液 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 三羟基氨基甲烷 聚酮合酶 酮体合成酶 酰基转移酶 脱水酶 甲基转移酶 烯脂酰还原酶 酮体还原酶 酰基载体蛋白 环化酶 缩略语 m s a s n r p r h r u 阿k s l d k s d e b s m c t h y l s a l i c y l i ca c i ds y n t h a s e 甲基水杨酸合成酶 n o n - r e d u c e d 非还原型 p a r t i a l l yr e d u c e d 部分还原型 砸g h l yr e d u c e d高度还原型 l o v a s t a t i nn o n a k c t i d es y n t h a s e洛伐他汀九酮体合成酶 l o v a s t a t i ad & c t i d es y a t h a s e洛伐他汀二酮体合成酶 6 - d c o x v c r y t h r o n o l i d ebs y a t h a s c 6 - - 脱氧一红霉内酯b 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) 魏酸签字目期：叼年畛月纠日 学位论文版权使角授权书 本学位论文作者完全了解直昌盔堂有关保留、使用学位论文 自：规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直曼太堂可以将学位论又的全 部或部分内窑编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制孚段保存、汇编本学位论文。同对授权中国科学技术苗患研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息胡臣务。 l 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名磊缎策霞 导师签名：刁专为 l 签字日期：b - 川年f 胡) 旧签字日期：3 唧荦f 二月卅日 第1 章引言 第1 章引言 1 1 聚酮化合物与聚酮合酶( p o l y k e t i d es y n t ：h a s e ，p k s ) 1 1 1 聚酮化合物 聚酮化合物是一类庞大的次级代谢物家族，广泛存在于细菌、真菌和植物 中，包括许多抗生素、真菌毒素及部分天然色素掣”。这类化合物具有许多生物 学活性，如抑制纽菌( 如红霉素、四环素) 、真蓖( 如灰黄霉素、两性霉素) 、 寄生虫( 如a v c n n e , c t m 、奈马克丁) 、癌症( 如多柔比星、c u e 庙y n = s ) 和免疫抑 制等活性，有些已被广泛地应用于医药、畜牧和农业，也越来越为人们所重视， 主要因为：( 1 ) 无可比拟的生物学活性使之具有巨大的新药物开发潜力和商业 价值，聚酮化合物所形成的药物已用于几乎所有重要的疾病治疗，每年的销售 额超过了1 0 0 亿美元；( 2 ) 独特的结构和合成机制为人们研究酶催化的分子 机制、分子识别和蛋白质的相互作用提供了空前的契机；( 3 ) 催化该类物质合 成的聚酮合酶所具有的可塑性，可以使人们方便地通过组合生物合成手段来获 得新的化合物。且前已发现了1 0 0 0 0 多种聚酮化合物，而由之衍生出的新产物 更是难以记数。 1 1 2 聚酮合酶( p k s ) 聚酎化合物的合成是以一个启动单元和若千延展单元为原料经反复醇醛缩 合和延伸而成，其过程与脂肪酸的合成类似。在合成途径中它们均会产生含有 多个酮基的中间代谢产物。催化合成这些中间产物的关键酶称为聚酮合酶 ( p o l y k e f i c l = s y n t j 弛s e ，p i ) 目前已经发现的聚酮合酶按结构和催化机制大致可分为i 型( 又称模件 型) 。型( 又称重复型) 及型( 又称查尔酮型) 三大类1 2 。细菌来源的p k s 常属于前二型，植物聚酮合酶常属于型。 r 模件型p k s 是一个拥有多个模件( m o d u l e ) 的巨型多功能多肽，它以酶结 一 第1 章引言 构域( d o m a i n ) 的形式参与聚酮碳链延伸的每一步生化反应，每个结构域只参 与整个聚酮碳链构建中的一步生化反应，并按顺序催化生物合成。参与一轮合 成反应的所有结构域称为一个合成酶单位，编码这个合成酶单位的d n a 称为 一个模块( m o d u l e ) 。不同酶有不同的活性结构域组合，但通常至少包括酮体合 成酶( k c t o s y n t h a s e ，k s ) 、酰基转移酶( a e y lt x a n s f e r a s e ，a t ) 和酰基载体蛋白 ( a c y lc a d e rp i o t e i n ，a c p ) ( 图1 - 1 a ) 。属于i 型p k s 的爱酮产物包括红霉素、 雷帕霉素、利福霉素和阿维菌素p ，4 】以及较新研究的洛伐他汀和埃波霉素1 5 。 重复型p k s 是一个多功能酶复合体，只包含一套可重复( i t e r a t i v e ) 使用 的结构域，每一结构域在重复的反应步骤中被多次用来催化相同的反应，主要 负责芳香族聚酮化合物的合成( 图1 1 b ) 。 型p k s 是来自植物和细菌的迭代同型二聚体酶。1 9 9 9 年，日本东京大 学的f u n a 等1 6 首次发现了一种类似苯基苯乙烯酮合成酶的p k s ( c h a l c o n e s y n t h a s e - - l i k ep k s ) 咄p p a 。r p p a 是一个在链霉菌( s t r e p t o m y c e t es p ) 中 发现的与芳香族聚酮化合物苯基苯乙烯酮合成相关的酶，它是一种同二聚体酶 并可重复进行缩合反应( i t e r a t i v e ) ，催化芳香族聚酮化合物淡黄霉素( f l a v o l i n ) 生物合成( 图1 - l c ) 。1 1 7 型p k s 和其它两种p k s 迥然不同，它们不依赖于作 为酰基载体的a c p 及其上的4 一磷酸泛酰巯基乙胺。i 型和型p k s 常常 通过a c p 活化酰基c o a 的底物，而型p k s 直接作用于酰基一c o a 活化的 简单羧酸。尽管结构和机制不相同，但所有类型的p k s 都是通过酰基一c o a 的 脱羧缩合和k s 结构域或亚基催化c c 键的形成。在进化关系上型p k s 与其它p k s 及己知的脂肪酸合成酶也相距甚远。 2 墨! 兰! ! 量。 f i lt y p * i1 1 1 g b l a a y 3 3 8 6 3 1 1p o l y k e t i d es y n t h a s e m o m s e u sp u r p u r e u s l e n g t h = 2 3 9 s c o r e = 2 7 8b i t s ( 7 1 0 ) ，e x p e c t = 9 e 一7 4 i d e n t i t i e s = 1 3 4 1 3 4 ( 1 0 0 ) ，p o s i t i v e s = 1 3 4 1 3 4 ( 1 0 0 ) ，c r a p s = 0 1 3 4 ( 0 ) f r a m e = + 1 互也l q 垒盟8 ：! lp o l y k e t i d es y n t h a s e 【m o n a s c u sp u r p u r e u s 】 l e n g t h = 2 0 6 1 s c o r e = 2 7 8b i t s ( 7 1 0 ) ，e x p e c t = 9 e 7 4 i d e n t i t i e s = 1 3 4 1 3 4 ( 1 0 0 ) ，p o s i t i v e s = 1 3 4 1 3 4 ( i o o ) ，g a p s = 0 1 3 4 ( 0 ) f r a m e = + 1 堡盆翌盟! 堑竖2 i ：! ip o l y k e t i d es y a t h a s e ，p u t a t i v e a s p e r g l l u sc l a v a t u sn r k l1 】 g b e a w 0 8 8 9 5 1 p o l y k e t i d es y a t h a s e ，p u t a t i v e 【a s p e r g i l l u sc l a v a t u sn r r li 】 l e n g t h = 2 5 8 2 s c o r e = 2 7 4b i t s ( 7 0 1 ) ，e x p e c t = l e - 7 2 附录 i d e n t i t i e s = 1 3 4 1 4 4 ( 9 3 ) ，p o s i t i v e s = 1 3 9 1 4 4 ( 9 6 ) ，g a p s = 0 1 4 4 ( 0 ) f r a m e = + 1 r e t x p0 0 1 2 7 3 8 4 2 1 1p o l y k e t i d es y n l h 笛e ，p u t a t i v e a s p e r g m u sc l a v a t u sn r r l1 】 曲l 垦型! 丝! ：3ip o z y k e t i d es y n t h a s e ，p u t a t i v e 【a s p e r g i l u sc l a v a t u sn r r l1 】 l e n g t h = 2 4 2 1 s c o r e = 1 8 3b i t s ( 4 6 4 ) 。e x p e c t = 3 e - 4 5 i d e n t i t i e s = 8 9 1 4 4 ( 6 l ) ，p o s i t i v e s = i i i i l 4 4 ( 7 7 ) ，g a p s = 0 1 4 4 ( 0 ) f r a m e = + 1 g b a a r 9 0 2 4 4 11 p o l y k e t i d es y n t h a s e b o t r y o t i n i af u c k e l i a n a l e n g t h = 2 2 6 4 s c o r e = 1 7 9b i t s ( 4 5 4 ) e x p e c t = 5 e 4 4 i d e n t i t i e s = 8 6 ，1 5 2 ( 5 6 ) ，p o s i t i v e s = 1 1 8 1 1 5 2 ( 7 7 ) ，g a p s = 5 1 5 2 ( 3 ) f r a m e = + 1 g b l a a s 5 7 2 9 0 1 1p o l y k e t i d es y n t h a s e 【o i b b e r e l l az e a l l e n g t h = 4 1 5 s c o r e = 1 5 3b i t s ( 3 8 7 ) ，e x p e c t = 3 e 3 6 i d e n t i f i e s = 7 9 1 4 8 ( 5 3 ) ，p o s i t i v e s = 1 0 4 1 4 8 ( 7 0 ) ，g a p s = 4 1 4 8 ( 2 ) f r a m e = + 1 附录bn a p k s i 序列的比对结果 s c o r e s e q u e n c e sp r o d u c i n gs i g n i f i c a n ta l i g n m e n t s ：( s i t s ) d 西2 罂q q l 2 玺! 竖：l ih y p o t b c d c a lp r o t e i nc i m g0 7 0 8 1 【c o c c i d i o 鲢 e o l a s s s 8 6 0 4 1 1p o l y k e t i d es y n t h m s e x a n t h o p m m l i am m v i r i d i s 堑 g 四2 翌q q l 3 1 3 墅2 ：! lh y 】p o t h e u c a lp r o m i na n o g g o l s s o 【a s l r g n 。笪 d b j l b a d 4 4 7 4 9 11 e i t r i n i np o l y k = d d cs y n t h a s e m o m s p u r p m e u s 盟 d i 五i b a d 4 4 7 4 9 1 1e i a i n i n 叫y b d d es y = h a s e 删【踟sp u r p u n = ) 1 e n g t h = 2 5 8 4 s c o r e = 5 4 3b i t s ( 1 3 9 9 ) e x p e c t = 9 e - 1 5 3 i d e n t i f i e s = 2 6 7 4 3 8 ( ) ，p o s i t i v e s = 3 3 8 4 3 8c ”) ，g a p s = 4 4 3 8 ( o ) f r a m e = + 1 q u e r y 1 s b j c t5 4 2 q u e r y1 8 1 s b j c t6 0 2 o u e r y3 6 1 s b j c t6 6 2 o u e r y5 4 1 s b j c t 7 2 2 0 u e r y7 2 1 s b j c t 7 8 2 e v a l u e 5 e 1 5 9 1 5 7 2 e 1 5 3 9 e - 1 5 3 i l y r a c s s s a v v h o a c i 【a i l s g b c r a i g g t n v 删p i f q m g s f l s p t g q c i 【p f b 啊a c s s s + v + 恸忙+ + i l s g e ca l a g gn v + t + p 耵n i g s f l s p t g q c i c p f d l d t a c s s s s v a i a c l c s i l s g e c n g a l a g g v n v i t s p n 啪咖a g a s f l s f r g q c i 【p f d a b a d g y c r g e g i 1 r f in 5 t a i e d g d o i u 汀i a s t a v y o n q n c t p i f v p n s p s l s 豇j ad g y c r g e g + v f i k + l s + a id g d 0 + gi a s tv y o n o n o riv p n + s l s e l f 觚g d g y c l g e g v g v f i k r i s s a i a d g d q v f g v i s 删m 础c 1 a i t v p n a i s l s f 皿v 1 1 砸 i r p k q i v e h g t g l p v g d p a e y e s i l r v l g g p n r s t p u 咕s v k g l i g l i t d vr + alp ki t w e a h g t g tv g d p a e y + ivg g pr slg s v k g l + g h t 1 d w 舳a r l e p i i t l v e a m b t a v g d p a e y d g i r a v f p i r s d v l s l g s v k g l v g h t e c t s g v i s l i i 【1 r ii m i n b g y i p p q a s f l l l 舢p s i i 【 l p 日j 眦i a l l 也t p 彻f r a i i e cs g v + s l i kl u i + g + i p p q s f + + + n p s + ae + + i + t + lmf r a a l i e c a s g w s l i k l l i i q q g f i p p q s f s s i n p s ln 帐 e e k i e i s t r l k p 仰a p f r m l i y g a s g s n s l i v t o a p s a r d - p t i q v l e g a i c y p 开f f 唱p d d i c s l i c s w 匹r f l r f i q s n n y g a s g s n s + + v t op + + p + tlgy p f - d * s l + s yr + f + + h 酣y g a s g s n a 叫w t q p p n i t e t p s l 叶l p g l 【s 1 p f l r i s a f i ) o q s l 胚w r r l r q f l e 1 l 3 6 0 6 6 1 5 4 0 7 2 1 7 2 0 7 8 1 8 9 7 8 3 8 附录 q u e r y8 9 8 s b j c t8 3 9 q u e r y1 0 7 8 s b j c t8 9 9 q l l e l y1 2 5 8 s b j c t9 5 9 l c i v s a i ( n f s p r n l a f n l s r q s 际耵g r a a i f a s l i g e 吼t a l g n r , n s s v a p t v r p a1 0 7 7 k4 - 矾8n l 十f4 - + 0 s n + + a + f + + + e l + l +g+p 翻a d k n l s v a 舢f q v a c q s n 眄l p q l v f s a s t k e e l n r a l a s f e k g s t d f p s v q l p d8 9 8 t r c f g g q i s t f v g l d r q l y d n w i l r s l l d r c d a v c i i i k g s i y p i f e 船妒i s d1 2 5 7 + p v + l c f 粥o q + s t + v g l n + + + y hi l ry l d + c d a + c + ls i y p a i f + r + p id p k p v i l c f g g q v s t y v g l d q e n 鸺t a i ir i l l f i d q c d a m c l s l g l q s i y p a i f q i l s p i 助9 5 8 w k l q t s l f a i q y s c a l ( s 1 3 1 1 v + l q t + l f a + q y s c a k + i v q l o i a l f a m q y s c a k a9 7 6 附录0n a p k s 3 序列的比对结果 s c o e e s c q u c n c p t o d n c m gs i g n i f i c a n ta i i g n m 坞：( b i t s ) v a l u e 西翌盟! 逊3 2 1 ：! ip o l y k e t i d cs y n t h a p u t a t i v e a s p e r g m , , 1 2 4 40 0 匹壁嫂1 2 2 殛1 2 ：! lh y p o t h e t i c a lp r o t e i nc h c 抡_ 0 3 1 0 1 【c h a e t m n i 。塑0 0 丝n 2 翌煎2 1 2 4 5 娈：l ih y p o t h e t i c a lp r o m i na n l l 9 0 5 9 4 0 【a s r r g i l 。查盟0 o 堡n 2 罂鲤i 2 竖塑ip o l y k e t i d es y n t h a s e , p u t a t i v , , a s p c r g i l h t - 墨2 0 0 d 雹婴3 艘z 丝：! ih y p o t h e t i c a lp r o t e i nf g l 0 5 4 8 _ 1 【1 e n b b e r e n ao c6 8 10 0 g b 垡d k r 9 2 2 1 3 1 p o l y k e t i d es y n t h a s c 【g i b b c m l l am o n i l i f o r m i s l避0 0 一dbilbad8368411 p k s np o l y b d d es y n t h a s ef o ra l m n a p y r o n eb l 地0 0 d b j b a d 8 3 6 8 4 ；t i p k s np o l y k c t i d es y a t h a s ef o ra l t e m a p y r o n eb i o s y n t h e s i s a l t e m a r i as o l n i 】 k 耻曲= 2 5 5 1 s c o r e =6 8 0b i t s ( 1 7 5 4 ) ，e x p c a = 0 0 i d e n t i t i e s = 3 6 0 7 4 1 ( 4 8 ) ，p o s i t i v e s = 4 8 2 7 4 1 邮) ，g a p s = 2 6 7 4 1 ( 3 ) f f a l i l c = + 2 。i l e r y 7 4p i v v g l s f r f p g g a n s d f a l i i 瑚l a n g p j 怛w s k v p k d i 瑚n a d a f y h p d n g r k g t f y v r g2 5 3 p + a + + g + + f rp gae a + 儿g 烈a + + + p k d rnd a f n 踟_ rg +r s b j e t4 p v a i i g i a f r g p g d a r d p f a f y r l v e g 孙【 砌吧i p k d r y n r d f y l 硎d s e r l g s i q 哑i6 3 q u e r y2 5 4 s b j c t6 4 q u e l y4 3 4 s b j e t 1 2 4 o u e r y6 1 4 s b j c t1 8 4 a 肝l e 皿i a a f d a p f f s i s n e l 【 蛐帕q 咖l e a t y e y e n g i 甩即_ i ，1 ，g s 盯a c n i f f l + + df d a p f f s i + e a k a m d pr + l l 啪+ e n a g + l evg + + t 啊+ m 唧口叩f k v f a p f f s i t p k e a p t h r i l l e a t y e g f e n a g l s l e k y s g t c r s c y i g t l s h 町g 硎u i 邱虹f s 舢t g s i t s i i n r i s 删k g p s v m i d t c s s s l v a f l l g t + d + + de + 1 f l i + t gs l 堋+ s 肝+ + l + g p s + + 附c s s s la f l i g t 兀- d f p n l q a i ：d n e g p s i y h a t g r s a s i a s i 幔l s 肝删p s l t v d t a c s s s l t a h i l a c o s u c s g e t s a i v g g s t i i l s p d f f i l l a g p g f l g 嘲 s f d s k a n g y g r g e g v a l a c q s + r + g 队+ + v g g + + + p di l l lp + g k + d + a n g + r ：e g l 五s i l 订碰a 日巧w g g a n f g p 眦s il i 肌 i 【i l s 麟瑚皿a n a n g r g e g f g 4 3 3 1 2 3 6 1 3 1 8 3 7 9 3 2 4 3 q u e r y7 9 4 s i i l k p l d a a l r d g d p i r a i i r g t a t 瑚d g k t p g i a l p s o e a o e e l i r s a y r s a g l g m g q9 7 3 附录 s b j c t2 4 4 q i l e z y9 7 4 s b j c t3 0 4 q i l e r y1 1 5 4 s b j c t3 6 4 q u e l y1 3 3 4 s b j c t4 2 3 q u e r y1 4 6 3 s b j c t 4 8 3 q i l e l y 1 6 4 3 s b j c t5 4 1 q u e r y1 8 2 0 s b j c t6 0 1 q u e l y2 0 0 0 s b j c t 6 6 1 q u e r y2 1 8 d s b j c t7 1 6 i l k p l d a a l r d g di l c a + + t an d g1 i + l p + e a q + e l i ra y + a g + + v t i l i 【p l d a a l r d g d n i r a w l a t a a n e d g h t p g i s l p n s e a q q e l i r r a y q i a g v d p a e 3 0 3 t g y f e l g t g t q a g d p i e t g a i g n r i g 从l 【s a g d p l l i g s i k s n i g 甩e g a s g l a g i v i 【a1 1 5 3 tye a i g t g t q a g d p + ea it i g + +l + g s + k + n i g 皿e g a + g + a g i + i 【a t a y v e a i i g 佑m a g d p l 队r a i l 盯i g s v b g r k s d l w g s v l 【t n i 伽瞄从g v a g i i k a3 6 3 i l i l e i 【g l i p a t a g f e s p n p r 撇q v v s r l t p w p n d g v r r v s v n s 麟a n a i i v1 3 3 3 l + e + g + i p f en pl + n + + + s + l l p + gr rs + n s f g f g g a n a f i “t v e r g 舡p p l 也玎翻御e i d l 阶n 垤i 矗s k l t p 斑i s g p r 融s i n s k f g g a n a l i a4 2 2 i l d d c i i y l o d l n r k d 目t - - s d a s s s g d 咖脚w s e a g s y g t1 4 6 2 i l + d a + lts d + s s+se + + i l e d 从s f l 5 m i g l s g 跚t t a p i 1 p s l s s v 科s h p s d s p s s s a s t v a e e t s g e s s d n i s4 8 2 n g s s p s q t 阻s l i s qf v f s 1 1 h e s g c a d i s r s l a k y l d k k e g a l e s e l 吣1 m 5 e1 6 4 2 + s s + + l f vs + h + g+ l + y lk+ + l + y 1 1 二 d v s s e v l r d v y p i p i 叫l s s h i ) q e g v e r s a e r l o e y l s k t - 一s 册f u l d l i s a5 4 0 脓s k l i a a s s v a e l s o a l q s t g p e p v k s p p a 一路u f s g o g a o w a t m g r e u 1 8 1 9 十r + l 骶hv + s s v + l + + sps a + a f 忭+ g q g a 钾m g rlv k i r r t l p w i l s y a v s s s v s g l r e k i s s l p p _ i r s s t s a i p r i a f v f t g q g a q i n m m g r g l s v 6 0 0