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中山大学颁士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰王珥 大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰 专业：微生物学 硕士生：王珥 指导教师：刘建忠教授 摘要 番茄红素是类胡萝b 素的一种，具有极强的抗氧化能力和消除自由基的能 力，其在抗衰老和防癌方面的功能受到人们越来越多的关注。使用番茄为原料制 备番茄红素的方法成本较高且提取率不高，不适用于工业生产，因而人们主要应 用微生物发酵的方法制备番茄红素。与天然产番茄红素的微生物相比，应用基因 工程构建的产番茄红素大肠杆菌具有发酵时间短、安全、经济等优点，是工业化 生产的主要备选菌种。 在本研究中，我们主要应用代谢工程和定向进化的技术方法对产番茄红素大 肠杆菌的代谢途径进行了修饰，目的是获得提高番茄红素产量的大肠杆菌工程 菌。我们以代谢途径关键酶基因d x s 和细胞中的转录调控因子r p o s 为对象，进 行了基因组合表达、启动子替换与定向突变，均提高了番茄红素的产量。然而对 结果进行整合与筛选后，番茄红素产量并未继续提高。得出以下结论，首先，关 键酶基因d x s 和转录调控因子r p o s 的过量表达能够定向提高代谢流，从而提高 番茄红素产量7 3 6 和1 3 3 6 ；第二，基因组的基因表达效果强于质粒载体的 表达效果，t 5 启动子替换后的e c o l ib w 2 5 11 3 ( a g d h a ，a a c e e ，t 5 d r s ， p a c l y c 0 4 ) 菌株能够有效提高番茄红素产量1 2 4 4 ；第三，通过易错p c r 突 变方法，我们获得的突变基因d 2 、d 2 3 及r 2 3 ，较未突变菌株能够有效提高番 茄红素产量1 7 1 、2 0 5 、3 6 o 。 关键词：番茄红素，大肠杆菌，启动予替换，随机突变 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰 t h em o d i f i c a t i o no fm e t a b o l i cp a t h w a yi n e s c h e r i c h i ac o l if o rl y c o p e n ep r o d u c t i o n m a j o r ：m i c r o b i o l o g y n a m e ：y u ew a n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rj i a n z h o n gl i u a b s t r a c t l y c o p e n e i sak i n do fc a r o t e n o i d sw h i c hb e c o m e sm o r ea n dm o r ep o p u l a rf o ri t s a n t i - o x y g e n a t i o na n da n t i - c a n c e ra b i l i t y i ti se x p e n s i v ea n d i n e f f i c i e n tt op r o d u c e l y c o p e n ew i t ht o m a t o e s ，s ot h i sm e t h o di sn o ts u i t a b l ef o r t h ec o m p a n y i nf a c t ， p e o p l eu s em i c r o b i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o nt op r o d u c el y c o p e n e c o m p a r i n gw i t h m i c r o o r g a n i s m sw h i c hc o u l do f f e rl y c o p e n ei nn a t u r e ，t h ee n g i n e e r e dm i c r o o r g a n i s m s l i k ee s c h e r i c h i ac o l ih a v em o r ea d v a n t a g e st op r o d u c el y c o p e n ew h i c hi n c l u d e s h o r t e rf e r m e n tt i m e ，s a f e ra n dm o r ee c o n o m i c ，a n dt h i sk i n do f m i c r o o r g a n i s m s b e c o m e st h ep r e f e r r e dc h o i c ei nt h ei n d u s t r y i nt h i ss t u d y , w em o d i f i e dt h em e t a b o l i cp a t h w a yi nt h ee s c h e r i c h i ac o l i ，b y m e a n so fm e t a b o l i ce n g i n e e ra n dd i r e c t e de v o l u t i o nm e t h o d s w eh o p et h a tw ec o u l d f i n a l l yg a i na ne n g i n e e r e de s c h e r i c h i ac o l iw i t ht h ei m p r o v e dl y c o p e n ep r o d u c t i o n t h e t a r g e t si nt h i se x p e r i m e n ta r e o n eo ft h ek e ye n z y m e sd x sa n do n eo ft h e t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o r sr p o s w eo v e r - e x p r e s s e dd i f f e r e n tg e n e st o g e t h e r , r e p l a c e d t h ep r o m o t e r ，a n dm u t a t e dd x sa n dr p o s f i n a l l y , w eg o tt h ei m p r o v e dl y c o p e n e p r o d u c t i o nb ye v e r ys i n g l em e t h o d t h e n w ep u ta l lt h er e s u l t st o g e t h e r , b u td i dn o t g e ta ni m p r o v e dp r o d u c t i o n w eg o tt h ec o n c l u s i o n sa sb e l o w ：f i r s t t h e o v e r - e x p r e s s i o no fg e n e s 加a n dr p o sc o u l di m p r o v et h ep r o d u c t i o nb y7 3 6 a n d 13 3 6 ；s e c o n d ，t h ee f f e c to fe x p r e s s i o ni nt h eg e n o m ei sb e t t e rt h a ni nt h ep l a s m i d ， w eg o ta1 2 4 4 i m p r o v e dp r o d u c t i o ni ne c o l ib w 2 5 1 1 3 ( z s g d h a ，z s a c e e ，i 5 一d x s ， i i 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰 王硐 p a c - l y c 0 4 ) c o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o ls t r a i ne c o l ib w 2 5113 ( p a c l y c 0 4 ) ；t h j r d ， a f t e re r r o r - p r o n ep c r , w eg o tt h r e em u t a t i o n s ：d 2 ，d 2 3o ft h e 加g e n e , r 2 3o ft h e r p o sg e n e ，w h i c hc o u l di m p r o v et h ep r o d u c t i o nb y17 1 ，2 0 5 ，3 6 o ，c o m p a r e d w i t hu n m u t a t e do n e s k e yw o r d s ：l y c o p e n e ，e s c h e r i c h i ac o l i ，p r o m o t e rr e p l a c e m e n t ，r a n d o mm u t a t i o n i i i 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红索产量的代谢途径修饰 王弱 a m p a r a b p c m l d c w d d h 2 0 d n t p e b e c o l i e p 管 g h l m m l n m l m o l p c r r p m s o d a m p i c i l l i n l ( + ) - a r a b i n o s e b a s ep a i r c h l o r a m p h c n i c o l d r yc e l lw e i g h t 缩略语表 氨苄青霉素 l 阿拉伯糖 碱基对 氯霉素 细胞干重 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 e m i r i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l i g r a v i t y h o u r l i t e r m o l a rc o n c e n t r s t i o n m i n u t e m i l l i l i t e r m o l a r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v o l u t i o np e rm i m u t e o p t i c a ld e n s i t y 溴化乙锭 大肠杆菌 微量离心管 重力加速度 小时 升 摩尔浓度 分钟 毫升 摩尔 聚合酶链式反应 每分钟转数 秒 光密度 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰王碉 u ul u n i t m i c r o l i t e r 7 4 单位 微升 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 o ， fl 学位论文作者签名： j ，形1 日期：砷i o 年1 6 月歹日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅。有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索。可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 保密论文保密期满后适用本声明。 学位论文作者签名：可硐 导师躲秽 日期：加，口年月f 日 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰王珥 第1 章前言 1 1 番茄红素简介 番茄红素( l y c o p e n e ) 是类胡萝b 素的一种，因最先发现于番茄而得名。其化 学式为c 4 0 h 5 6 1 ，分子量为5 3 6 8 ，是一种含有1 1 个碳一碳共轭双键、2 个非共轭 双键的非环状平面共轭多不饱和脂肪烃。番茄红素纯品为针状深红色晶体，熔点 ( 反式) 为1 7 4 ，不溶于水，难溶于甲醇、乙醇等极性有机溶剂，溶于丙酮、乙 醚、己烷，易溶于氯仿、苯、二硫化碳、油脂等。由于具有众多顺反异构体，番 茄红素稳定性很差，易发生顺反异构化和氧化降解，光、氧化剂、金属离子等均 会导致它的损失。 番茄红素是所有类胡萝卜素( 包括b 一胡萝卜素) 中最有效的单线态氧淬灭剂， 具有极强的抗氧化能力和消除自由基的能力 2 】 3 】。除此之外，番茄红素还可以 诱导细胞间信息传递，抑制细胞增值，增加免疫力等【4 】。经实验证实，番茄红 素能够防止紫外线对皮肤的损害，可防止紫外线引起的色斑、黑斑等，抵抗皮肤 的老化 5 】；还可以预防癌症，血液中番茄红素浓度与前列腺癌、食道癌、胰腺 癌、胃肠癌、乳腺癌、皮肤癌、膀胱癌等的发生率呈负相关，尤其在预防前列腺 癌方面作用明显 6 】【7 】。由于番茄红素能够保护低密度脂蛋白免受氧化破坏，因 此其可以调节胆固醇的代谢，减少心血管疾病的发病危险 8 】。因此，番茄红素 已经成为国际市场上保健食品研究的新热点，显示出广阔的发展前景。 在番茄红素的制备上，以番茄为原料的制备方法包括直接粉碎法、有机溶剂 浸提法、超临界c 0 2 萃取法、微波法、酶反应法等，主要是以番茄皮为原料进行 提取，其提取工艺受到原料的影响较大，成本相对较高，提取率不高，不利于工 业生产，同时，有些提取方法使用了大量的有机溶剂，在最终产品中很有可能因 有残留而影响产品的质量 4 】。比较而言，另一种工业生产的方法微生物发酵因 其培养周期短、安全、经济等优点在实际应用中价值明显，于是人们开始关注使 用微生物发酵的方法进行番茄红素的生产。 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰王碉 图1 1 番茄红素的化学结构 f i g u r e1 - 1c h e m i c a ls t l c t u r eo fl y c o p e n e 天然的能够合成番茄红素的微生物主要有噬夏孢欧文氏菌( e r w i n i a u r e d o v o r a ) 、草生欧文氏菌( e r w i n i ah e r b i c o l a ) 、三孢布拉氏霉菌( b l a k e s l e at r i s p o r a ) 等，而在工业上直接用于发酵生产番茄红素的主要是三孢布拉氏霉菌【9 】。三孢 布拉氏霉菌发酵属于嗜氧高粘性发酵，是一个周期长，生产成本高的过程，同时 其代谢过程的优化可能会引起潜在的毒性，因而工业生产过程成本相对较高且效 率较低，于是人们希望能够构建易于进行工业生产的基因工程菌合成番茄红素。 由于近年来系统生物学和代谢工程的快速发展，分子与细胞水平的代谢途径 重组成为可能，为了满足大规模生产番茄红素的需要，应用“生物工厂”( 例如 e s c h e r i c h i ac o l i ) 生产番茄红素备受关注，应用工程菌进行番茄红素的生产有诸多 好处： 工程菌能够提供充足的前体供合成利用； 表达酶由于没有各种反馈的抑制作用，其在宿主体内可以维持平衡，使 得代谢流有效地流向目的产物。相对的，原产菌株存在对次级代谢产物的调控途 径，严格控制其浓度避免影响菌体生长，对其终产物产量提高有限制； 在工程菌体内，质粒的高效重组表达能够有效的减少中间产物的毒性， 有利于提高代谢流的有效性； 在工程菌体内，一方面能够生产出有活性的终产物，同时由于其高效的 存储能力使得番茄红素的大规模发酵成为可能 1 0 ，1 1 ，1 2 】。 但大肠杆菌并不能自主合成番茄红素，而只能通过2 甲基d 赤藓糖醇4 磷 酸( m e p ) 途径合成番茄红素的前体物质异戊烯焦磷酸i 验( i s o p e n t e n y l p y r o p h o s p h a t e ， i p p ) 和二甲基丙烯焦磷酸( d i m e t h y l a l l y lp y r o p h o s p h a t e ，d m a p p ) 。m i s a w a 等通过 将生产番茄红素的功能基因c r t e , c r t b 和c r t l 克隆重组后导入大肠杆菌并成功诱 导表达，使得大肠杆菌具有了生产番茄红素的能力 1 3 ，1 4 。 2 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红索产量的代谢途径修饰 da u v ej e pp a t h w a y l i l u c o s e 删即加一了 e n g i n e e r e dm e v a l o n a t ep a t h w a y ：乙u 2 十u h 2 1 g 】 i 1 f f g d h a ，、 砌 曲 l y c o p e n e 矗 a 占 矗 o c o q 8 图1 2 重组大肠杆菌工程菌中番茄红素的代谢途径 f i g u r e1 - 2m e t a b o l i cp a t h w a y o fl y c o p e n ei ne n g i n e e r e de c o l i i d i ：i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t ei s o m e r a s e ；d r s ：1 - d e o x y x y l u l o s e - 5 - p h o s p h a t es y n t h a s e ； p c k ：p h o s p h o e n o l p y m v a t ec a r b o x y k i n a s e ；p p c ：p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s e ； p p s ：p h o s p h o e n o l p y r u v a t es y n t h a s e ；a c e e ：p y r u v a t ed e h y d r o g e n a s e s u b u n i tel ； g d h a ：g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ；c r t e ：g g p ps y n t h a s e ；c r t b ：p h y t o e n es y n t h a s e ； c r t i ：p h y t o e n ed e s a m r a s e ；i s p a ：f p ps y n t h a s e ；f d h f ：f o r m a t ed e h y d r o g e n a s eh ； a c k a - p t a ：a c e t a t ek i n a s eaa n dp r o p i o n a t ek i n a s e2 3 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰王碉 1 2 代谢工程简介 1 9 9 1 年，著名生化工程专家，美国加州理工学院化学系教授b a i l e yj e 首先提 出“代谢工程”的概念 1 5 】，即：代谢工程是指应用d n a 重组技术对细胞的酶运输 及调节功能进行的有目的修饰，从而改变生物中已有的代谢和表达调控网络，以 更好地理解细胞的代谢途径，并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程。随 着基因组学( g e n o m i c s ) 、蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 、转录组学( t r a n s c r i p t o m i c s ) 、代 谢组学( m e t a b o l o m i c s ) 等相关学科的兴起，代谢工程的应用方法和范畴越来越广。 以番茄红素的代谢修饰为例，代谢工程的基本思路如下： 1 ) 提高通向目标产物的代谢流：这种方法最为常用，通过对代谢过程的定 点修饰，能够有效的提高代谢产物的常量。其修饰作用主要有两个方向：提高前 体产量与控制中间产物毒性。 在大肠杆菌中，番茄红素的代谢流主要包含四个阶段。首先，合成最初的代 谢前体3 磷酸甘油醛( g 3 p ) 和丙酮酸( p y r u v a t e ) ，在此阶段，由于丙酮酸是细胞代 谢中许多初级代谢产物的前体物质，其细胞内含量是足够多的。因而g 3 p 的合成 便成为限制此阶段效率的关键步骤。f a r m e r 等人通j 吐p p s , p p c , p c k 的过量表达， p y k 的敲除等促进从丙酮酸至u g 3 p 的代谢流，成功的提高了番茄红素的产量【1 6 】。 其次是合成中间产物i p p 与d m a p p 的m e p 途径。此途径中的限速步骤主要是5 磷酸脱氧木酮糖( d x p ) 的合成过程。k i m 等通过将催化d x p 合成的基因d x s 进行过 量表达，成功的提高了番茄红素产量约4 倍 1 7 】。第三个阶段是大肠杆菌本身含 有的最后一个阶段，此阶段合成中间产物法呢基焦磷酸( f a r n e s y lp y r o p h o s p h a t e ， f p p ) ，其中影响代谢流的主要因素是i p p 的胞内浓度以及i p p 与d m a p p 的平衡。 为了提高i p p 的浓度，y o o n 等在大肠杆菌体内引入了m v p 的下半部代谢途径 ( m e v a l o n a t el o w e r p a t h w a y ) ，最终提高了约3 倍多产量 1 8 】。v a d a l i 在e 厅中引入 了全部m v p ( m e v a l o n a t ep a t h w a y ) 途径使得乙酰辅酶a ( a c c o a ) 作为前体能够合 成i p p ，最终提高产量2 倍 1 9 】。最后一个步骤是引入合成番茄红素的三个功能基 因c r t e b l ，其中训化合成栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸( g e r a n y l g e r a n y l p y r o p h o s p h a t ，g g p p ) 的过程被证明是限速步骤【2 0 】，通过提高此酶活性，最终提 高- j g g p p 的合成效率，进而提高了番茄红素的产量。 4 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰 王珥 在控制中间产物的毒性方面，由于引入外源代谢途径会在细胞内产生大量中 间代谢物，若无法完全利用，则有可能表现出毒性而影响细胞生长。为了减少中 间产物的毒性，可以通过分析翻译前期m r n a 的稳定性来确定影响番茄红素产量 的因素，从而控制最终番茄红素的产量 2 1 1 。w i l l i a m 等根据代谢途径构建了一个 严格调控的启动子n 缸调节子。通过设立信号分子，感应器，控制子，启动 子，并对限速步骤进行分析，使得该调节子控制区域内的基因表达水平受到了严 格调控，避免了因过量或不足表达导致的中间产物的累积并产生毒性，最终有效 提高了番茄红素的产量 2 2 】。 修饰代谢途径或引入新途径过程中，最常用的工具便是质粒。但是不同质粒 的选择可能会因中间产物的累积程度不同而导致最终产物产量发生较大差异。例 如：不同拷贝数的质粒对番茄红素产量的影响各不相同，采用高拷贝质粒，番茄 红素的产率及稳定期细胞浓度比采用低拷贝质粒低，这正是由于其在代谢过程中 产生了大量的无用中间代谢物 1 7 ，2 3 。 2 ) 扩展与构建新的代谢途径：一般是指通过基因工程手段引入外源基因( 簇) 等，使原有代谢途径进一步向前或向后延伸，使细胞从不能合成某种代谢产物转 变为能够合成此代谢产物，例如引入仃愿引基因簇，使得原本无法生产番茄红素 的大肠杆菌具有了生产番茄红素的能力，从而为番茄红素的生产提供了一个可能 的途径。又例如k i m 课题组引入链霉菌的甲羟戊酸盐途径，提高前体i p p 的量， 并分别与基因敲除和过量表达相结合，最终显著提高了番茄红素产量 2 4 ，1 8 】。 代谢工程包括3 个重要步骤：细胞途径的重构和修饰，修饰后细胞表型的严 格评价( 表型表征) ，根据评价结果设计进一步的修饰( 优化设计) 。在表型表征中， “组学”技术( 基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢物组学、代谢通量组学等) 起着极为重要的作用。因为途径修饰需要知道基因的功能才能进行，而由于生物 体的复杂性，修饰一个或多个基因后所得细胞的表型可能与预期结果不同，因 而需要运用最近发展的各种组学技术寻找高通量表型表征评价，验证有关基因或 途径的功能，发现具有新功能的基因或途径，揭示生物复杂网络的代谢及调控机 理，并据此进行合理设计，继续进行代谢工程循环，直至实现代谢工程所希望的 目标。 代谢工程可在细胞与分子水平上认识和改造细胞，其不仅在解释细胞生理特 性上具有重要的科学意义，而且潜在的应用跨越了生物技术的全部领域，例如扩 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰王弱 大底物利用范围，阻断副产物的生成，生产异源蛋白即新物质，提高某物质生产 速率及能力，降解环境有害物质或提高环境适应能力，用于人类疾病诊断和基因 治疗等 2 5 】。 根据微生物代谢工程技术绘制的细胞工厂的蓝图，人类能够创造多样化的细 胞工厂，这些微米级的细胞工厂能够快速的高质量的生产出我们所需要的目的产 物，在社会的可持续发展中扮演极其重要的角色。 1 3 细胞全局调控简介 无论是过量表达还是敲除替换，其作用目标都是针对代谢过程中的某一个或 几个基因。但是在细胞中，所有反应是作为一个整体来代谢运作的。一个或几个 基因的改变可能引起细胞内多种基因的有效应答，而整个细胞内部的所有改变是 我们无法完整预测的。于是出现了许多在应用代谢工程方法时，实际结果不同于 理论结果的情况。在这种背景下，人们希望能够在细胞整体水平上调控代谢方向， 因而出现了多种全局调控代谢方法。目前已报道的细胞全局调控研究方向包括在 染色体水平上的随机敲除与随机过量表达基因 2 6 ，2 7 ，以细胞整体转录或翻译过 程为目标的定向突变 2 8 ，还有利用基因组重组以获得目标或者有利性状的全局 调控方法 2 9 ，3 0 】。 转录是基因表达的第一步也是最关键的一步。转录过程包括启动子识别、起 始、延伸和终止。若能对细胞转录水平进行全局调控，则有可能实现细胞的全局 优化，提高目标产物的产率。细胞全局转录机制工程( g l o b a lt r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r ye n g i n e e r i n g , g t m e ) 便是这样一种技术 3 0 】。g t m e 主要是通过突变转 录过程中与r n a 聚合酶特异结合的各种因子，改变r n a 聚合酶的启动子偏好 性以影响转录水平，从而对基因转录进行全局调控，提高目标产物产量。具体来 说，就是利用各种计入，例如易错p c r 方法，对转录组分进行突变，然后将其 连接在低拷贝的表达载体上，转化到宿主细胞，筛选高产工程菌。 转录过程主要由r n a 聚合酶所催化，原核生物的r n a 聚合酶通常由5 个 亚基组成：6 ，b ，d 和两个q 亚基。其中，6 亚基能识别模板上的信息链和启 动子，保证转录能从固定的正确位置开始。b 和b 亚基参与和d n a 链的结合。 6 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰 王弱 选择6 因子作为突变目标，是因为其突变体能够改变r n a 聚合酶与启动子 的结合，直接影响转录过程的启动。在细胞中含有许多种类8 因子，如激活压力 蛋白表达的63 8 因子，它能够在压力条件下激活某些调控蛋白的表达，提高细 胞对压力的承受能力 3 1 】。 人们应用g t m e 已经取得了许多成果。2 0 0 5 年，a l p e r 通过随机敲除与随机 过量表达等发现转录过程中的某些基因能够极大程度的提高番茄红素的产量 3 2 ，3 3 。与基因组改组方法相比，g t m e 不需要原生质体制备和融合的步骤，操 作方法简便，且定向性和有效性更强。通过对r p o d 转录效率的检测及其与传统 突变方法如n t g 突变的对比，k l e i n - m a r c u s c h a m e r 等确定了以全局转录因子为 作用对象的方法的突变高效性【3 4 】。之后，通过对仞以的突变，同一个课题组 又获得了对丁醇耐受的菌株，并获得了l 广酪氨酸( l - t y r o s i n e ) 产量和透明质酸 ( h y a l u r o n i ca e i d ) 产量提高的菌株 3 5 】。而通过对r p o d 的突变，a l p e r 等提高了工 程菌对乙醇和对乙醇与十二烷基硫酸钠( s d s ) 同时存在的耐受能力，并在多个主 程菌中提高了番茄红素产量，获得了最高7 7 m g l 的产量，说明了g t m e 的有效 性 2 8 】。y u 等通过r p o s 和r p o d 的突变，获得提高透明质酸产量的菌株【3 6 】。 1 4 定向进化简介 获得工业微生物的传统方法是应用化学和物理方法对基因组进行多轮突变， 然后筛选出适合的表型。这些突变主要由诱变剂所引发，诱变剂包括化学诱变剂 和物理诱变剂两种。化学诱变剂是一类能对d n a 起作用、改变其结构、并引起 遗传变异的化学物质。通常包括羟胺、亚硝基胍f r c r g ) 、吖啶橙、亚硝酸和5 溴尿嘧啶，物理诱变所使用的主要是紫外线( u v ) 、丫射线和x 射线等。其中号称 超级诱变剂的n t g ，变异频率为1 2 至1 8 。无论是化学还是物理诱变方法， 其作用对象都是整个基因组，虽然理性筛选的提出较随机筛选极大地提高了筛选 效率，然而这些方法经常会获得一些无法预知的突变，在研究其表型机制上遇到 很多困难。 因此人们希望能够用更可控的方法，使得进化的定向性更强，减少无意和反 向突变。应运而生的便是酶的定向进化技术。酶在代谢途径中扮演着重要的角色， 生物体内每一个反应都是由酶所催化的。人们通过对代谢过程的研究，确定了影 7 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰王碉 响代谢途径效率的关键酶以及能够控制整个代谢流流量的调控因子。对关键酶和 调控因子的突变，能够定向的改变其功能活性，提高代谢流的效率，提高目的产 物的产量 3 7 】。 目前人们开始应用分子生物学的方法，对代谢过程中的关键基因或者代谢途 径进行修饰，在对代谢途径分析与预测的基础上选择目的基因，定向地改变表型。 通常所说的“酶的定向进化多指采用随机方式构建包含大量突变的基因文库并 对之进行定向筛选的过程。由于这一策略不需要了解蛋白质空间结构和构效关 系，就能获得所需的性质和功能，因此也是目前应用较多的蛋白质改造手段。鉴 于分子生物学基本技术手段的不断发展，定向进化的筛选周期也大大降低。 酶的定向进化方法主要包括以下几种。 在对酶的结构与功能完全了解的情况下，通过对基因上的某一个或几个特定 碱基进行突变，特异的改变酶的结构和功能的技术称为定点突变技术 3 8 】。通过 对谷氨酰胺合成酶基因g l n a 的定点突变，黄星等提高了谷氨酸棒杆菌的摇瓶产 量达1 6 8 9 l 3 9 。 随机突变则是应用易错p c r 等方法对基因上的碱基进行随机突变，以此构 建大容量未知功能的基因文库，通过对所需性状的定向筛选，获得目的突变株， 这种方法非常适用于对于酶和基因的功能并不完全清楚的情况 4 0 】。例如，通过 对关键酶基因g l m s 的易错p c r 定向进化，d e n g 等提高了大肠杆菌工程菌葡萄 糖苷产量达7 0 9 l 4 1 。 在此基础上，通过对获得的突变体进行d n a 重组( d n as h u f f l i n g ) 能够进一 步获得更加有效的突变株 4 2 】。s t e m m e r 等通过对b 内酰胺酶系统进行d n a 重 组，提高其头孢噻肟( c e f o t a x i m e ) 最低抑制浓度( m i c ) 约1 6 ，0 0 0 倍。通过对合成 除虫菌素c h c b 1 过程中的重要基因a v e c 的d n a 重组，k i m 等有效的提高了 除虫菌素c h c b1 的产量 4 3 】。 当前，获得分子多样性的方法越来越多。例如同源性依赖的分子重组，应用 广泛的如r d a - p c r 4 4 ，s t e p 4 5 ，i t c h y 4 6 ，r e t t 4 7 等，而不依赖同源性的 重组则包括基于结构组合的蛋白质工程方法s c o p , e 4 8 ，s c r a t c h y 4 9 等。大 多数方法均建立在初级突变体的基础上，其主要目标是提高基因编码蛋白的相应 酶活，或提高底物特异性等。例如l e e 等通过r e t t 提高了几丁质酶活性达1 5 8 中山大学硕士学位论文 大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰 王弱 倍 4 7 】。z h a o 等对枯草杆菌蛋白酶e 基因进行易错p c r 和s t e p 重组后提高了 其在6 5 。c 时热稳定性最高达5 0 倍【4 5 】。 1 5 研究目的及意义 本实验在前人研究的基础上，以产番茄红素大肠杆菌代谢途径中的关键基因 d x s 和r n a 聚合酶63 8 因子的编码基因r p o s 为对象，希望通过提高酶的表达效 率，以及与其他酶的相互作用来优化细胞的代谢途径，提高番茄红素的产率。具 体包括d x s 基因的启动子置换和定向进化、r p o s 基因的g t m e 。本实验不但构建 了提高番茄红素产量的工程菌，并为提高工程菌的次级代谢产物产量提供了新的 研究方向和实践经验，即对于代谢途径的修饰与更改可以从细胞整体角度出发， 应用细胞全局调控的手段进行定向进化提高生产能力。 9 十m 目i t 女 * 杆自十拇自* * 自n 女p i r * 4 # * 1 日 第2 章材料与试剂 2 1 载体与菌株 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) d h 5 a ，本实验室保存菌种，基因型为 s u p e 4 4 s l a c u l 6 9 伽d l a c z z m l s ) h d s r l 7 f e c a le n d a lg y r a 9 6 t h i - 1r e l a l 。保存形 式为3 0 甘油茵，存于2 0 冰箱中。 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) b w 2 5 1 1 3 ，本实验室保存菌种，基因型为：f ( a r a d - a r a 劢5 6 7 l a c z 4 7 8 7 ( ：r r n b - 3 ) l a 酽 一r p h - i a ( r h a d - r h a b ) 5 6 8 r r n b - 3 h s d r s l 4 。 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) b w 2 5 1 1 3 r 4 9 d h a ，z 3 a c e e ) ，本实验室翁志明同学 所构建。即在大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o 岫b w 2 5 1 1 3 基础上敲除两个基因g d 删a c e e 得到。 克隆载体p m d l 8 t j 3 t a k a r a 公司所购得，图谱见图2 - 1 。 酬雾 遭i 蚕。 ：品嚣篙：嚣杀f n g ) 图2 - 1p m d l 8 - t 载体( 引i i t a k a r a 官网) f i g u r e2 - 1p m d l 8 - tv e c t o r f f m m v c w w t a k a r a c n l 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰王弱 表达载体p b a d 2 4 为h a r v a r dm e d s c h 的g u z m a nl m 惠赠 5 0 】，图谱见图2 - 2 - p b r 3 a m p 图2 - 2p b a d 2 4 质粒 f i g u r e2 - 2p b a d 2 4v e c t o r 表达番茄红素的质粒p a c l y c 0 4 ( 含草生欧文氏菌的基因c ，匠馏和i p i h p l ) 为 u n i v m d c o l l e g ep a r k 的c u n n i n g h a l nf x 惠赠 5 l 】，图谱见图2 3 。 p 图2 - 3p a c l y c 0 4 引自文献 2 4 】 f i g u r e2 - 3p a c l y c 0 4v e c t o rf r o m 【2 4 】 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰 质粒p q e 3 0 为中山大学周世宁教授所惠赠，图谱见图2 - 4 。 a m p p t 56 * h i s c o l e l 图2 4p q e 3 0 质粒 f i g u r e2 - 4p l a s m i do fp q e 3 0 1 2 t 1 十l jj 目 * 女 * # 目十女自* “p t n w 镕酱* m p k d 4 6 质粒为普渡大学w a 加e r 教授惠赠【5 2 ，图谱如图2 - 5 。 图2 - 5p k d 4 6 质粒 f i g t h e2 - 5 p l a s m i d o f p k d 4 6 十m 目i# 目十自镕n l f t r w t # p k d 4 质粒为普渡大学w 蛆n 盯教授惠赠【5 2 】，n i 监如n 2 - 6 。 图2 - 6p k d 4 质粒 f i g u r e 2 - 6 p l 雎m i do f p k d 4 p c p 2 0 质粒为普渡大学w a s m e r 教授惠赠，温度敏感性质粒，带有氨苄青霉素 和氯霉素抗性基因，含n p 基因，通过表达f i p 蛋白可将基因敲除茼株染色体上的2 个f r t 位点之间的序列消除 5 3 】。 2 2 主要培养基 l b 培养基：蛋白胨1 ，酵母提取物o5 ，n a c il 使用纯水配制，1 2 高压灭菌2 0 r a i n 。固体培养基则添加2 琼脂粉。 中山大学硕士学位论文大肠杆菌中提高番茄红素产量的代谢途径修饰 王珥 2 y t 培养基：蛋白胨1 6 ，酵母提取物l ，n a c l 0 5 ，使用纯水配制， 1 2 1 高压灭菌2 0 r a i n 。 2 m 9 培养基( 1 l ) ：5 m 9 盐溶液4 0 0 m l ，l m o l l m g s 0 4 溶液2 m l ，甘油o 5 ， l m o l lc a c h0 1 m l 。5 m 9 盐溶液配制：n a 2 h p 0 4 7 1 - 1 2 06 4 ，k h 2 p 0 41 5 ， n a c l0 2 5 ，n h 4 c 10 5 ，在1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 s o c 培养基：蛋白胨2 ，酵母提取物0 5 ，n a c l0 0 5 ，2 0 m m o l l 葡萄 糖，1 1 5 高压蒸汽灭菌3 0 r a i n 。 t b 培养基：蛋白胨1 2 ，酵母提取物2 4 ，甘油0 4 ，k h 2 p 0 41 7 m m o l l ， k 2 h p 0 47 2m m o l l 。 2 3 实验药品与试剂 2 3 1 主要药品 限制性内切酶：s m ai 、x o ai 、n c oi 、k p ni ，h i n d l i i 、e c o ri ，a fi ， s p hi 、s a li ；p r i m e rs t a rd n a 聚合酶( p r i m e rs t a rp o l y m e r a s e ) ；t 4d n a 连 接酶为t a k a r a 公司产品。 t a qd n a 聚合酶( t a qd n ap o l y m e r a s e ) 、蛋白酶k ( p r o t e i n a s ek ) 、d g l 4 0 0 0 m a r k e r 、l k bl a d d e r 、d l 2 0 0 0m a r k e r 、 i r i s 饱和酚、琼脂糖d n a 凝胶回收试剂 盒为北京普博欣生物科技有限公司产品。 g e i l e m o 印hi ir a n d o mm u t a g e n e s i sk i t 来自s t r a t a g e n e 公司，随机突变连接所 用的t 4 连接酶为n e we n g l a n db i o l a b s 公司原装产品。 l - 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