（茶学专业论文）茶黄素酶促氧化制备技术的研究.pdf

摘要 茶黄素( t h e a f l a v i l l s ，t f s ) 是目前茶叶深度开发领域中研究的热点成分，在天然药物、功 能食品、日用化工、功能饮料等领域有着广泛的应用前景。但是，红茶中茶黄素的含量非 常低，从红茶中提取制备茶黄素，分离纯化难度大且得率低，工业化生产成本高，这严重 影响着茶黄素产业化开发的进程及茶黄素的广泛应用。本文在前人研究的基础上，通过摸 索最佳反应条件，选用不同的酶源和底物，采用生物酶促氧化的方法制取含量较高的茶黄 素粗品，旨在为茶黄素的提取分离与纯化提供高含量的基料。本研究首次使用的苹果和梨 子作为多酚氧化酶口p 0 ) 的酶源来制取茶黄素，取得了很好的效果，为茶黄素的酶促氧化 制各提供了一条新的高效途径。 反应条件的优化研究表明，在本试验的反应体积下，茶黄素酶促合成的最佳条件为： 温度为3 0 ，反应体系的最佳p h 值为4 8 ，底物浓度为o 9 1 0 0 m l ，酶浓度为2 8 1 0 0 i n l ( 以鲜叶重量计) ，通氧量为o 4 血。温度和p h 值是反应体系中两个重要的影响因素 ( p 茶叶 苹果 微生物( 1 号，多孔菌，a l 抑1 0 r 螂；2 号，毛栓菌，7 砌咖州硝；3 号 和4 号是作者分离纯化得到，属于尚未鉴定的霉菌类) 。利用梨子p p o 制取茶黄素，其含 量高达4 5 7 2 7 ，制率也高达4 1 1 1 。而在供试的茶鲜叶中，苹云较好，槠叶齐次之，在 以苹云冷冻叶为酶源制取的茶黄素含量达3 3 7 3 7 ，制率达4 2 2 2 ，非冷冻叶的茶黄素达 1 4 5 ，制率为7 2 2 2 。在自选微生物菌种中，自选4 号 3 号 2 号和1 号。 不同底物的筛选试验研究表明，在本试验条件下，高e g c 的几茶素氧化效果最好。 小叶种儿茶素比大叶种儿茶素的效果要好。 双液相试验研究表明，不同的酶源对双液相体系的试验效果不同，就茶鲜叶而言，采 用双液相效果明显比单液相显著。在双液相系统中，非冷冻叶制取茶黄素其总含量达 4 9 3 0 8 ，制率为5 9 4 4 。而对苹果和梨予而言，单液相比双液相要效果好些。 不同缓冲液试验研究表明，在利用茶鲜叶制取茶黄素时，从t f s 含量来看，乙酸一乙 酸钠缓冲液要比柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液好些，但从得率来看，前者比后者要低。 关键词：茶黄素，儿茶素，生物制备，酶促氧化。单液相，双液相 a b s 仃a c t n l e 出l a v i i l s s ) i s 也eh o t - 吨r e d i e n to fi nm e 瑚e a r c h 舶l do ft e ac o m p r e h e l l s i v e d e v d o p m e n ta tp r e s e n l t h 嗽a r ea ( t 曲【s i v e 雄 p l i 幽np s p e c t s i 1 1t l l ef i e l d so fn a 删 m e d i c i n e ，m n c t i o n a lf o o d s ，d a i l yc h e m i c a li n d u 曲f i m c t i o n a lb e v e r a g e 咖h o w e v e r t h e c o n 衄l t so f t h c a n a v i 璐i sv e r yl a w mb l a c kt e a ni sd i 母c m tt o s e p 跚l t e 锄dp u r i 母廿l e 吐l e a n a v i n s6 啪b l 扯k t e a 柚d 让屺y i e l d r a ：t eo ft f se x 虹t e d 丹o mb l kt e ai sl o ww h i c hr e s u n s i nh i 曲c o s ta n da 胝t si t st l l ei n 蜥a l 面d p m d u c t i o ns e r i o l l s l ya n di t s 晰d ea p p l i c a t i o n n l i s p a p e r i sb 器e do nt l l ef o m c re 砸 出e n t a l 阳s i d t s ，t h l o u g hp m b i n gi n t ot 1 1 eb e s tr e a c t i o n c o n ( 1 m o 轧i e c t i n gd i a c r e n t 衄乃仰i e u r c e s 龃di t s 酬【b s 廿a t e s ，t h eh i g h e rc 傩c e n to ft h 砌a v i 璐 s e l 斑6 n i s h c dp r o d u c tc a nb e 嘲篮db yu s 喀e 啮髓砸c 似i d 蕊o n t h ea i l no f 也i sp a p e ri st o o 位r l es e m i f i i l i s h e dp r o d u c tw 抽h i g b 髓t f sf o rf i 卫r i h 尉e x 咄6 0 n ，s e 】p a 瑚士i o na n d p u r i & 砒i o n p o p m 耻a p p l ea 1 1 dp e 盯h a v e 丘r s t l yb 咖州船m i 士l a lp o l y p h e n o l 【i d 蹈e ( p p o ) s o u r c e t o p r e p a r e t l l 睫n v a v i s i n t h i s 碍s 明曲av e 碍鲫d 坞础h 船b e e n 删m d 喊c h o 彘r san e w e 伍c i e mw a yt op m d l l c et l l e a n a v i n sb y a 坛y m a d c a m d a 虹o i l t h er e s m t so fr e a c t i 伽c o n 删o no p t i n l i z a t i o ns b o w e dm a tt h eo p t i i n l l mc o n d m o no f 龇a n a v i 璐b y 吼l z y t n 撕co 姬删o n i st l l a tt e m p c 曲：t l l i s3 0 ，p hv a l u eo f t h e p 他s e n ts y s 蛐i s 4 8 ，也ec o n c e i 啦硝o no f s u b s t r a 托si 80 9 1 0 0 m l ，也ec o n c e n t r a t i o no f e n 碍m e s i s2 8 虮o o m l ( b a d o nt h e 蜘o s h w e i g b 主) ，o x y g e n 糟t ei so 4 l n i n t c 釉p 舶m l 他s 趾dp h v a l u e si n 廿l er e a c t i o n s y s t e m 缸e t h cm o s t i m p o r t a n ti n f l u e n c c 自c t o 墙( p f 托s ht e al e a f a p p l e m i c m b c m c o n t e n to f t f s i s4 5 7 2 7 b y l l s i n g p p o p 雠，肌d 也ey i e l d 阳：t e o f s i s4 1 1 1 ，i i lm e e 1 1 珂m e 硒m t l e a p i n g i s b 改t e r t l 眦2 ：l l u i 1 1 l e c o n 把n t o f t f s i s3 3 7 3 7 b y 璐i n g p p o 勘m p 堍t e a 舶z 睨，翘d 也e 弭e l d 魄o f t f s i s 4 2 2 2 t h e c o n t e n t o f t f s i s l 4 5 b yu s i n gp p 0 舶mp i n gy u n t e au n 舶n e n ，a n d 吐圮y i d dr a 把o f t f si s7 2 2 2 a m o n gm e e 卿e s f - r o m s e l f s c r e e n e dn 】j c r d 0 唱a n i 锄，t b e f e i s 西es e q u 髓c ea s n o 4 n o 3 n o 1a n d n o 2 t h es d b s t 阻t e ss e l c c t i o ni i i d i c a t c d1 h a t 吼d e rm i se x p c 渤e n t a lc o n d m o n ，m eo x i 删o n e f f i c i e n c yo fm e c a t 酣i l i n sc o n t a i n i n gh i 曲e g ci s ”b e s t m n w l l i l e ，血ec a 慨h i i l s 麟仃a 曲e d 丘_ 0 mt h es m a l lt e al e a f i sb e t t e r1 l l a nt l l ec a t c c h i i la 曲e a c t e df - m mb i gt e a1 朗f i i t h er e s e a r c ho f b i - l i q l l i dp l a s e ss y s t e mt e s t ss h o w e dt l l a tt h e r ea r cd i 丘毫r e r i tr e s u l t sw i t l l d i 腩r e n te i l z y l i l es o u r c e sa tt l i ec x p e 血1 e n t so f b i o - l i 吣dp h 鹋e r e g a r d i n gp p o 丘0 m 舶s h t e a l e a t h er e s u ho f b i l i 删dp h a s es ) 咖i so b 、，i o 璐趾dn 岫姗础汕l e t l l 觚t h cs i 赠e l i 删d p h a s es y s t c m mb i - l i q i l i dp h 嬲e ss y s t e mt e s t s ，血ec o n t e n to f t f si s4 9 3 0 8 b y u s i n gp p 0 丘o m p i n g l t e a u 丘0 z e n ，a n d 龇y i e l d r a t e0 f t f s i s5 9 ，“。h 0 w e v e r ，也c r e i so p p o s i t cr e s 池 也a ts 崦l el i 叫dp h a s ci ss l i 西1 u yb e i ：t e r t h 釉b i l i 叫dp h 黜w h c nm cp p o i s 舶m 印p l ea n d p e a l t h ec o m p a r i s o no fb u 虢rs o l u 曲珊s b a w e dt h a ta c e t i ca c i ( k 咣虹ca c i ds o d i 啪b u 妇衙 s 0 1 l n i o ni sk t t e rt i l a nc i t r i ca c i i s o d i u mh y d r o g e np h o s p h a t eb l l f f l e rs o l l 城o na c c o r d i n gt ot l l e c o n t e n to ft f sw h 吼n e s ht e al e a fi su s e d 船p p os o u r c e h o w e v e r t h el 删盯i sb e 戗e rt l 姗t l l e f o m l e r b 髂e do ny i e l dr a ：t co f t f s k e yw o r d s ：t h 住n 盯i n s ； t e ac 曩t 钾h 姐 瑚呻r 印a 训o n ；e n 彤m a t i c0 x i d a t i o n ； s i n g i e - l i q u 试p h a s e ；b 玉- h q u i dp h 懿嚣 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 詹古u 时间：九巾中年6 月6 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：结 u时间：咖y 年；月6 日 导师签名jt a 聋 帆彷口p 年6 月8 日 一f x l j l 日l j 吾 茶黄素最早是由r o b e n s e a h ( 1 9 5 硝1 卅从红茶中发现的，茶黄素是多酚类物质氧化形 成的一类能溶于乙酸乙酯的具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称，包括茶黄素( t f ) 、茶 黄素单没食子酸( t f 3 g 和t f 3 g ) 和茶黄素双没食子酸( t f d g 等。茶黄素是构成红茶 品质的主要成分之一，与红茶品质，尤其是汤色密切相关【5 1 ，也是与红茶价格呈正相关重 要品质指标如7 】。茶黄素具有多种药理功能与保健功效，在某些方面甚至优于儿茶素碡r 2 0 1 ， 因而，在医药保健品和日用化工等方面具有广阔的开发前景。 1 茶黄素形成机理的及组成 1 9 5 7 年，r o b 盯b 首先发现茶黄素，此后，并对其作了进一步研究p 1 1 。另外t h k m o 吲、 b e r k o 研t z 吲、c o l l i c r 【2 4 l 、s h a 阳c o 嘲、宛晓春闭等分别在茶黄素的形成机理和途径上做 了大量的研究。到目前为止，已发现并鉴定的茶黄素种类及其前导物情况如下( 共1 6 种) ： ( 1 )l e g c + l - e c t f i 。n 媛啦砘l l 茶黄素l a ( 2 )d g c + l e c t f l bm 疆a v 蛔b 茶黄素i b ( 3 ) l - e g c + d c 一耳l ct h 曲n 确茶黄素l c ( 4 ) l e g c g + l e c t f 3 - g助朋妇8 v j n 一3 g a l l a 七e茶黄素3 没食子酸酯 ( 5 ) l e g c g h ，e g c 一疆二3 - gt h n a v i n 一3 刊l a t e茶黄素一3 - 没食子酸酯 ( 6 )l - e g c g + l e c g t f - 3 ，3 gt h 舶n a v i l l 3 ，3 一g a l l 疵茶黄素一3 ，3 。- 没食子酸酯 ( 7 )l - e c + g a 一( - ) t f 4e p i m i 绷a “c a c i d表茶黄酸 t f 3 g t f 3 g 1 6 o 0 0 0 o 0 0 o o o 0 o 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -【00_【嚣目v捌如搬椴糕 表2 不同温度对茶黄素形成的影响 1 a b l e2t h ee 彘c to f 锄p m t m t h e a n a v i n sf b 哪a d 0 i l 1 5 1 0 5 0 2 02 63 03 74 1 温度( ) 一t f 3 g 一t f 3 g r t f d g 一t f 一t f s 图3 温度对茶黄素合成的影响 f i g 3t k c 彘c t o f t e l n p 啊l i e 也e a n 删璐f o r n l 撕 1 3 底物浓度对茶黄素形成的影响 在确定好最适p h 值和温度的条件下，本试验还进行了最适底物浓度试验。儿茶素不 但是多酚氧化酶的底物，同时若底物浓度过高则成了多酚氧化酶的抑制剂，过低则底物不 够，不能达到最佳效果。本试验体系中分别选择了2 5g 、3 7 5g 、5g 和6 2 5g 做单因素试 验。试验结果表明( 如图4 所示) ，当反应的底物为2 5 9 ，即底物浓度为0 5g ，1 0 0 l l 时， 茶黄素的形成量最低；当反应底物达5g 即lg 仃o o n l l 时，茶黄素含量达最大值：底物超过 5 o g ，即为6 2 5g 时比底物为5 0g 要略微低些。从底物浓度对茶黄素单体的合成影响来 看( 如表3 所示) ，在所选底物浓度范围内，t f 3 g 的极差最小( 0 2 6 8m 1 0 0 1 1 ) ，说明底 物浓度对单体t f 3 g 的影响不大。极差最大的是t f ，说明底物浓度对t f 的影响相较大， 一_【目oo-【暑一枷如缸_ 这和温度对茶黄素单体形成的影响相似。其次是t f 3 g ，其极差为o 8 1 5m 1 0 0 咖。d g 最小，其极差为0 3 3 5i 叫1 0 0 恤l ，底物浓度对茶黄素各单体形成影响大小顺序是 t f t f 3 g t f d g t f 3 g 。 从各单体及总量来看，底物为5g ，即浓度为1 1 0 0i n j 时各含量均达最大值，故可判 定在该反应体系下最佳底物为lg 1 0 0 础左右。 表3 底物浓度对茶黄素合成的影响 t 矗b l e3t t 艟g f f b c to f s u b s l 撇c o n c e i 删佩咖t l l e a f l a “1 1 sf b 玎n a t i o n ： 目 昌 h 釜 目 - ， 嘲i 如 艟蜒 槭 绦 1 6 1 2 8 4 0 底物浓度( g ) - 一t f 3 g i t f 3 g - i r - t f d g 一t f - i 一t f s 6 2 5 图4 底物浓度对茶黄素合成的影响 f i g 4t h e e 船c to f t l l es u b s 啦把c 呻呲i o f t h eo i i 跚他舐c 也e a 玎a v i n 3 1 8 1 4 酶液浓度对茶黄素形成的影响 在本试验中，酶液的浓度是以茶鲜叶重量来计算的。分别选择了6 2 5g 、7 8 1 6g 、9 3 7 5 g 、1 0 9 3 8g 、1 2 5g 、1 4 0 8 2g 和1 5 6 2 5g 作为酶浓度进行单因素试验，试验结果表明( 如 图5 所示) 。 当酶浓度在6 2 5g 和9 3 7 5g 之间时，茶黄素总量的形成量很低，6 2 5g 时为3 6 8 m g l o o n d ，9 3 7 5g 时为4 9 1 8m g 1 0 0 m i e 从9 3 7 5g 后，随酶浓度增加茶黄素含量急剧增 加，直到酶浓度增加至1 0 9 1 3 8g 后，茶黄素含量的增加减慢，1 4 0 8 2g 后出现降低，而当 酶浓度为1 4 0 8 2g 时茶黄素总含量达1 4 9 6 6 m g ，1 0 0 l n l ，此后，茶黄素含量出现降低。所以， 在本试验反应体系中酶最佳浓度为1 4 0 8 2g ，即2 8 1 6 4g ，1 0 0 m l 。 ： 害 2 5 毯 蠖 芑 1 5 1 0 5 0 6 2 57 8 1 69 3 ，7 5 1 0 9 3 81 2 51 4 0 8 21 5 6 2 5 酶浓度( g ) + t f 3 g + t f 3 ，g + t f - * 一碍j 卜1 f s 图5 酶浓度对茶黄素合成的影响 f 遮5t h e e 壤：c to f e n 研m r 峨n 咖觚剐岫e n ct h n a v i n s 1 5 外源酶酶促氧化的最佳反应时间( 粗酶液) 本试验结果表明( 如表4 、5 、6 和7 所示) ，在同样反应条件下，t f s 达最大值的时 间是随p h 值增加而延长，随反应温度的升高而缩短，随底物浓度的减少而延长，随酶浓 度降低而延长。反应时间是茶黄素酶促合成中最灵活最关键的因素。时间过短，t f s 未达 最大值，时间过长，则形成的t f s 会被消耗。从表4 表7 可以看出，在外源酶反应体系 中最佳反应时间应该在1 0 0 2 0 0i n i i l 之间。 1 9 表4 p h 值对反应时间的影响 t a b l e 4t h ce 髓c t o f p h v a l 瑭 石m eo f 也e a 妇a “n sm 豳啪p o j n t 表6 底物浓度对反应时间的影响 1 曲l e6t h ee f r e c t0 f n 舱“咀眦哺d o no f 锄b s 咖她o nt i m eo f m 啪i f l a v i 略m c i i i i 眦p o n 表5 温度对反应时间的影响 t a b l e 51 1 1 ee 彘c to f m e t 哪p e r a m m 蚰6 m eo f m 嘣l a “n sm a x j m 姗p o i n t 表7 酶浓度对反应时间的影响 1 b b l e 7 t h e e 瞰t o f l l l e 姗n n 砒i o no f 朋巧m eo n 劬e o f t t i c a f l a v i n sm 舣i 蛐| l i lp o i n t 2 最佳反应条件的确定 2 1 正交试验结果 根据单因素试验结果，确定了各因素( 温度、p h 值、底物浓度以及酶浓度) 的主要水 平范围，进行4 因素3 水平正交实验( 如表8 ) 。 对t f s 的分析，通过极差与直观分析表明( 见表9 ) ，各因素对茶黄索总量影响的顺序是 a b d c ；结合k 值最佳组合是a l b 2 c i 现，即以p h 值为4 8 ，温度为3 0 ，底物为1 8 g ，即o 9g 1 0 0 m l ，酶浓度为5 6g ( 即2 8g ，1 0 0 m 1 ) 时反应效果最好。 表8 因素水平表 t a b l e 8f 8 c t i l e v e l s1 j s t 水平ph值温度( )底物浓度( g )酶浓度 i e v e lab cd l4 82 7 1 85 0 25 o3 0 2 05 6 35 23 3 2 26 2 注：酶浓度以茶鲜叶重量计 表9i j 9 ( 3 4 ) 正交试验表 t a b l e9t h e 切【b l eo f 甜m 伽| o n a le x p e f i i n e n to f t l l cb ( 3 试验号a bcd 指标( m 1 0 0 m 1 ) t f gt f 3 gt f 3 gt f d gt f l1 2l 3l 42 52 6 2 73 83 93 k i3 0 5 0 8 k 2 2 9 9 0 4 k 3 2 3 6 9 4 r6 。8 1 4 9 4 0 63 1 2 01 9 8 81 8 1 52 4 8 3 1 1 4 6 84 1 1 l2 3 4 42 3 7 52 6 3 8 9 6 3 44 6 0 51 4 4 l1 5 4 62 0 4 2 9 2 6 54 4 8 41 4 9 61 4 5 51 8 3 0 1 0 5 5 94 8 6 61 6 2 l1 “8 2 4 2 4 l d 0 7 84 7 1 81 7 1 41 4 9 22 1 5 3 7 7 2 02 8 6 21 3 7 71 4 0 72 0 7 4 9 1 1 13 3 1 6l 一4 01 9 2 22 1 3 3 6 8 6 32 2 8 91 0 6 01 6 1 51 9 0 0 t = “1 0 4 h = 8 0 1 4 1 0 p 菩7 8 5 9 4 3 q a 7 9 5 4 2 47 9 0 7 6 4 7 8 6 11 67 跖9 3 4 1 11 ：! 墼! ：坚! ：! 翌 ! ：! ! ! 表l ot f 3 g 极差分析表 1 曲l e1 0 1 瓢e t a b l eo f 曲辩r v 撕a n a l y 出o f m g ab cd k l1 1 8 6 31 0 4 6 6 1 1 1 s 51 0 j 弭5 k 2 k 3 1 4 0 6 9 8 4 6 7 1 2 2 9 3 1 1 6 1 3 1 0 8 8 4 1 2 3 3 3 1 1 + 6 9 2 1 2 j 4 0 5 r5 6 0 3 1 8 2 7 1 4 52 1 3 l t f 3 g 的正交试验和极差分析表明( 如表1 0 ) ，各因素对t f 3 g 的影响程度依次为a d b c ，综合各因素k 值和宣接比较，t f 3 g 酶促合成的最佳条件是a j b 2 c 3 d 3 即p h 为 2 i 。：，。：，。一一撇 。2 3 2 3。3，2嬲娜粥朔勰” c ； 。2 3 ，2 3 。2 3 埘m | 昙m拍”巧t 5 0 ，温度为3 0 ，底物为2 ，2 9 ，酶浓度为6 2 9 。 表1 1t f 3 g 极差分析表 t a b l el l1 1 l et 曲l eo f o b 辩砒i o na 坶s bo f t f 3 g k l 5 7 7 34 8 6 1 5 “2 4 6 6 9 k 24 8 3 1 5 7 0 5 4 9 0 0s 4 3 5 k 34 1 7 7 4 2 1 5 4 4 3 94 6 7 7 r1 5 9 6 1 4 9 01 0 3 3 0 7 6 6 t f 3 ，g 的正交试验和极差分析表明( 如表1 1 ) ，各因素对t f 3 g 的影响程度依次为a b c d ，综合各因素k 值和直接比较，t f 3 g 酶促合成的最佳条件是a l b 2 c l d 2 即p h 为4 。8 ，温度为3 0 ，底物为1 8 9 ，酶浓度为5 6 9 。 表1 21 h ) g 极差分析表 t a b l e1 2m 协l eo f o b s e r v a 矗o n 鞠幽，s so f t f d g k 1 5 7 3 64 ，6 7 7 5 2 2 9 5 0 7 8 l c 24 5 9 5 5 9 4 5 5 4 4 5 5 - 2 7 4 k 3 4 9 4 44 6 5 3 4 6 0 l4 9 2 3 r1 。1 4 l 1 2 9 2 o 8 “0 3 5 l t f d g 的正交试验和极差分析表明( 如表1 2 ) ，各鼠素对t f d g 的影响程度依次为b a c d ，综合各因素k 值和直接比较，t f d g 酶促合成的最佳条件是a l b 2 c 2 d 2 即p h 为4 8 ，温度为3 0 ，底物为2 0 9 ，酶浓度为5 6 9 - 表1 3t f 极差分析表 1 捌c 1 3 t h e t a 陇o f o b s 州砒i 删d y s i s d f t f l ( 26 4 0 7 7 1 9 5 6 3 6 8 6 8 6 5 k 36 t 0 7 6 胂5 6 5 4 0 6 - 0 0 5 r 1 0 5 6 1 1 0 0 o 4 0 1o 8 6 0 1 下的正交试验和极差分析表明( 如表1 3 ) ，各医素对t f 的影晌程度依次为b a d c ，综合各因素k 值和直接比较，t f 酶促合成的最佳条件是a i b 2 c l d 2 即p h 为4 8 ，温 度为3 0 ，底物为1 8 9 ，酶浓度为5 6 9 。 通过上述茶黄素各单体以及总量的极差分析表明，合成不同t f 组分的最佳反应条件 有所差别，各因素对茶黄素各单体以及总量的影响率不尽相同( 见表1 4 ) 。 2 2 表1 4 各因素的影响率( 单位：呦 t a b l e1 4 n e 胡砸m t i o0 f 衄蛐仇t o r o n s y n m 哦m e a f l a v i n s ( u n n ：) 由于茶黄素总量水平是现阶段研究的重点目标，采用a l b 2 c t d 2 组合( 即以p h 值为 4 8 ，温度为3 0 ，底物为1 8g ，酶浓度为5 6g ) 是获得高含量茶黄索的最佳反应条件。 2 2 正交试验的方差分析 为找出四个控制因素在t f s 形成中的作用大小及变异来源。对正交试验结果进行了方 差分析，结果见表1 5 。 从方差分析表可以看出，p h 值的差异最大，呈显著性水平( p 如0 5 ) ，其次是温废，但 也是呈显著水平( p o 0 1 ) ，且影响率也很小( 见表1 4 ) ，底物浓度的对茶黄素的影响率最小，影响率为 1 1 2 ( 见表) 。 表1 5 正交试验方差分析表 t a b l c1 s n 埠t a b l e o f v 耐a n c e 如曩l y s i 言o f o 啦! o g o m i e 邳嘶m e n t 变异来源 偏差平方和 自由度 均方f 值显著水平 s vs sd fm sf 、r a l u el s 3 反应时间对茶黄素形成的影响( 非提酶) 本试验是在正交试验确定的最优条件下进行的不提取粗酶液试验( 即将茶鲜叶捣碎后 2 3 直接利用而不过滤等) ，目的是确定不提酶液的反应最佳时间。试验结果表明( 如图6 ) ， 与提取粗酶液相比，不提取粗酶液的反应最佳时间提前到4 0m j n ，反应时间在o 4 0m i i l 之间时，t f 3 g 、t f 3 g 、t f d g 、t f 以及t f s 含量随时间的延长而增加，当4 0 m i i l 时茶 黄素总量达最大，茶黄素各单体基本也同样在4 0m i n 达最大值，尤其是t f 3 g ，变化趋势 几乎和茶黄素总量一样，4 0 m 斑后，特别是在4 0 m i i l 到6 0 f n i n 的期间，t f s 下降比较快， 特别是t f 3 g ，6 0m i n 后，t f s 及各单体含量基本呈恒稳下降。从茶黄素的增加量来看( 如 图7 ) ，在前2 0m i i l t f s 增加量相当迅速，增加总量值最大，达3 3 8 1m l o o l l ，说明反应 前2 0n l i n 对茶黄素合成非常重要，是茶黄素重要的形成期。在2 0m i l l 4 0 血之间虽比前 2 0 l i nt f s 总量增加减慢，但是仍较快速，这说明此时间段同样是茶黄素酶促合成的重要 阶段。在4 0m m 6 0m i n 之间出现了负增长，且负增长相当大，达到1 4 9 9m g ，1 0 0 l l ，这 说明此时间阶段茶黄索发生了进一步的氧化聚合形成了t l b ，茶黄素总含量出现下降趋势， 6 0m i n 以后基本上都是负增长，这迸一步说明反应时间超过4 0l n i n 后，茶黄素由原来的酶 促合成大于氧化聚合转化为茶黄素的氧化聚合大于酶促合成。由此可知，在非提取酶试验 中反应的最佳时间与提酶反应的最佳时间不同，表现为大大提前，并且自始至终t f 3 g 的 变化是茶黄素变化的主体。 通过对不提取粗酶液的反应时间的研究，选择4 0m i l l 左右来终止酶促反应，这为后面 进一步研究打下了基础。 7 0 0 6 0 0 5 0 0 毛4 0 o 栅3 0 0 镁 如2 0 o b l o o 0 0 02 04 0 6 08 01 0 01 2 01 4 01 6 01 8 0 反应时间( m i n ) - 一t f 3 g 卜t f 3 g - r t f d g 卜t f i t f s 图6 茶黄素合成量随时间变化 f i g 6c h a n g e so f l l l 硼硎舾f o 彻a t i o nw 沛t i m e 2 4 从儿茶素的残留量来看( 如图8 ) ，儿茶素总量在前6 0m i m 减少非常快，且在2 0m i n 4 0 1 1 1 i n 之间，儿茶索的减少量达最大值( 如图9 ) ，特别是e g c g 和e g c 减少量最大：6 0 m i n 后，儿茶素总量减少非常慢。根据前面对茶黄素合成总量的分析可知，在前4 0m i n 。 儿茶素的减少恰好和茶黄素的增加一致；6 0 m j n 后，虽然儿茶素仍在减少，但是茶黄索总 量却没有增加，反而在减少，两者的同时减少，说明反应仍在进行，但此时儿茶素氧化形 成的t f s 与t f s 的氧化聚合之平衡向不利于t f s 积累的方向转移。不同的儿茶素组分的变 化规律不同，前6 0n l i l l 儿茶素总量的减幅量很大，特别是e g c 、e g c 0 、g c 6 和e c g 从 一开始就急剧减少，直到4 0m i n 时，减少量达最大值，此后，e ( 挖o 、0 c g 和e c g 到8 0 m i i l 时含量基本很低了，e o c 直到1 0 0m m 时才降到最低水平，而儿茶素总量在6 0m i n 时 就已残留不多了：b c 、d l c 在2 0 m m 后就开始急剧减少，其中e c 在6 0m i n 时减少量 达最大值，到8 0i n i n 时减少量基本很少了，d l 七在4 0m 证时减少量达最大值，d l - c 到 6 0m m 时减少量基本报少了。 图7 茶黄素增加量随时问变化 f 培7 血咄i i l go f 血c a n a y i 璐w i i 吐m 。 1 0 0 0 誊7 0 0 捌4 0 0 加 摇 = - 8 1 2 0 0q 2 04 0印 1 0 0 1 2 0 1 4 01 6 01 7 0 时间( i n ) + b g c 一d l - c 一e c e 0 + 6 c 6 卜- 麟+ c a c h l n 总 图8 残留几茶素随时间的变化 p 毽8 1 1 l e 璐d u 缸o f 土e c h 妇w 弛t i m e b g c d l _ c 置k b g c g o c g e c g 口总量 图9 儿茶素的减少量随时问的变化 f i g 9 d 唧髑5 h 1 9 0 f c a 士e c h i 璐埘m “r 4 不同反应底物( 儿茶素) 对茶黄索形成的影响 本试验主要选择了三种几茶素作为反应的底物，即以太叶儿茶素、小叶儿茶素以及高 含量e g c 儿茶素，不同儿茶素各单体含量见表1 6 。试验结果表明( 见表1 7 ) ，对荼黄素 总量来言。效果捧序为：c b a ，最大值为2 9 5 1 6 ；对于不同的茶黄索组分而言，各反 应底物之间表现一定的差异。对t f 3 g 而言，效果排序为：a c b ，最大值为8 3 9 3 ；对 t f 3 ，g 而言，效果排序为：c b a ，最大值为7 + 2 3 5 对t f d g 丽言，效果排序为： b c a ，最大值为6 ，6 6 5 ：对t f 而言，效果排序为：b c a ，最大值为9 6 0 3 ( 各自 的h ：p l c 图谱见图1 0 、1 l 和1 2 ) 。就t f s 而言，在本试验条件下，选择高含e g c 儿茶索 是最理想的。 2 6 表1 6 不同儿茶素各单体含量差异( 单位：) 1 曲l e1 6t h ec o n 佃no f m ei d m d u a lc a t l h i mo f n 他d i 俄r e n tc a t e c h i n s ( i l n n ：) 表1 7 不同儿茶素反应后生成的茶黄素含量( 单位：) t a b l e1 7mc o n t e m0 f t l i e 蝴吖_ 眦舶md i 彘他n tc a 把c h i 瞄( 嘶n ：石) 底物来源 t f 3 gt f 3 gd gt f t f s 注：a 为大叶儿茶紊，b 为小叶儿茶素，c 为高含e g c 儿茶素 图1 0 大叶儿茶素的氧化产物h p l c 图谱 f i g 1 0h p l cc h m m d 叫酗mo f o x id a _ 曲np r o d u c t s0 f b i gl 鼯f c a t e c h i r i s 图1 1 小叶儿茶素氧化产物聊? l c 图谱 f j g 1 1h p 【cc h 埘n 鼬d 鲫no f 嘶d a t i p r o d u c t s o f s m a l l l e a f c 砒l i l i 璐 图1 2 高含e ( 把儿茶素氧化产物的h p l c 图谱 f i g 1 2h p l cd 叫曲：t o g 舢o f o x i d a 土i 蚰p r o d i l c 忸o fh i g h b g cc a t e c h i n s 5 氧气对茶黄素形成的影响 为探明氧气对儿茶素酶促氧化形成茶黄素的影响，本试验选择了三种不同的通气量( 0 l l i n ，o 4u m i n ，0 8i m j n ) ，反应结果如表1 8 所示，当通氧量为o 时，茶黄素含量极低， 其总含量为6 0 1 6 ( 见图1 3 ) ：通氧量为o 4l 加i n 时，茶黄素含量达4 3 3 2 9 ，这说明 了氧气是合成茶黄素中一个重要的必不可少的因素；当通氧量为o 8l ，商n 时，茶黄素含量 4 0 6 8 5 ( 见图1 4 ) ，比通氧量为o 4l 恤i n 减少了，这说明当氧气量达到饱和量之后还可 能加速t f s 向低的进一步氧化聚合。 表1 8 不同通氧量对茶黄素生物合成的影响 t a b l e1 81 ke 慨t o f 讲叽筘m o nt l l n a v i n sb i o s y f 曲韶i s 图1 3 通氧为0 i 由i n 时对茶黄素生物合成的影响 f i g 1 3h p l cc h f 0 1 n a l o j 弘mo f 渤i 瓶i s h e dp 栅u c l o f 蛙t 硼“m sw i 也o u m i n o x y g e n 图1 4 通氧o 8 l 抽i n 时对茶黄素生物合成的影响 f i g 1 4h p l cc h m i n 咖髓吼o f s 锄i 勘i 出e dp r o d u 矗o f t l i e a n a v 雌w i t l lo 8 u m i no x y g 6 不同酶源的筛选 本试验选择了茶鲜叶、苹果、梨子和微生物发酵生产的粗酶作为的催化酶，结果见表 1 9 。在茶鲜叶中选用的主要品种是苹云和槠叶齐，以苹云鲜叶作为p p 0 酶源时，反应产物 中的t f s 含量要比槠叶齐的高，但是从咖啡因含量来看，苹云比槠叶齐要低十个百分点。 从表1 9 中还可以看出，苹果和梨子中的p p o 也能催化合成含量可观的茶黄素。从茶黄素 含量方面看，梨子中p p o 的催化能力要比苹果的强得多，其粗制品中t f s 含量是苹果的 2 5 倍，而且各单体间的相对比例也具同步关系( 见表1 9 ) ，两者的 玎? l c 图谱具有相似性 ( 见图1 6 ，1 7 ) ；然而利用苹果和梨子作为酶源的儿茶素氧化产物构成比例上与茶叶酶源 存在很大差别，利用苹果和梨子合成的茶黄素粗制品中t f 3 g 含量要较高，尤其是在梨子 中，其t f 3 g 含量高达3 0 6 2 8 ，占粗制品中t f s 的2 ，3 强，究其原因可能表现在不同来 源的p p o 在同工酶上的差异，不同植物来源的p p o 同工酶对各儿茶素组分的专一性和选 择性不一样，梨子和苹果p p o 对l e g c g 与l - e g c 的氧化具有较强的催化性，因而t f 3 g 的含量较高。所以，利用不同的酶源来合成单体比例不同的茶黄素粗制品存在可能。 以微生物来源p p o 合成茶黄素的结果见表2 0 。从表中可见，商品微生物酶的效果不 如作者分离纯化的微生物酶效果好。但是，总的看来，利用微生物产酶，再直接利用粗酶 液来合成茶黄索，效果不如茶鲜叶，也不如苹果和梨子。这可能是由于微生物产酶的最佳 条件和利用微生物分泌的胞外p p o 来进行儿茶素酶促合成茶黄素的最佳反应系统存在差 别，微生物的p p o 活性难以充分发挥。 综观上述结果，梨子、苹果、茶叶和微生物p p o 都可以用于儿茶素的酶促氧化，且尤 以梨子p p o 较好，供试的茶叶品种中，苹云比槠许齐效果好，在茶季结束之后，茶鲜时难 以获得，故梨子可以作为理想的酶源补充。 表1 9 不同酶源对茶黄素形成的