（微生物学专业论文）乳杆菌生产生物可降解聚酯单体的研究.pdf

山东大学硕e 学位论空 中文摘要 乳酸菌是能从可溶性碳水化合物发酵产生大量乳酸的一群细菌，它们无芽 孢、不运动、革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性，根据塘代谢途径可将乳酸菌分 为专性同型发酵、专性异型发酵和兼性异型发酵。目前乳酸菌已广泛应用于食品、 医药保健、工业发酵、饲料等领域其中，乳酸菌生产化工产品，特别是新型聚 酯的单体的研究和应用越来越受到重视。 1 ，3 - 丙二酵( 1 ，3 - p r o p a n e d i o l ，1 , 3 p d ) 是合成新型聚酯化学纤维p 1 t 的单 体，p 1 r r 具有强的生物可降解，是目前国际上合成纤维新品种开发的热点。近年 来，利用微生物法生产1 , 3 - p d 在国内外都有较多报道，而乳酸菌生产1 , 3 - p d 的 研究相对较少作为食品级安全的乳酸菌，借助代谢工程技术过量生产1 ，3 p d 具有潜在的可能性。 本论文从腐败果酒中分离到一株能利用葡萄糖和甘油共发酵生产1 , 3 - p d 的 乳杆菌。经过形态观察、生理生化和1 6 sr r n a 扩增产物专一性位点的酶切验证， 鉴定该菌株为短乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s b r e v i s ) ，命名为肋b r e v i s w 5 1 7 。为了检 测l b b r e v i sw 5 - 1 7 产生l ，3 - p d 的两个关键酶甘油脱水酶( g l y c e r o ld e h y d r a t a s e ， o d h t ) 和l ，3 丙二醇氧化还原酶( 1 , 3 - p r o p a n e d i o ln a d + o x i d o r e d u c t a s e ，p d o r ) 活性，首先确定了超声波破碎菌体细胞的条件，其结果为：2 0 m l 发酵液离心后 的菌体重悬于2 0 m l 的磷酸钾缓冲液( p h 7 o ) ，超声破碎6 7 s ，间歇4 s ，次数 9 9 ，功率3 0 0 w ，细胞破碎率达到6 0 7 0 0 , 6 。 在厌氧条件下，菌株l b b r e v i sw 5 1 7 能利用分解葡萄糖过程中产生的还原 力n a d h ，还原甘油生成l ，3 - p d 。本论文对菌株l b b r e v i sw 5 1 7 产生l ，3 p d 的发酵条件进行研究，由结果可知，当葡萄糖：甘油为0 0 5m o l f l ：0 1m o l l 时， 厌氧发酵7 0 h 可得l ，3 p d1 1 2 0m m o l l ，甘油的转化率为o 3 0m o l m o l ，g d h t 和p d o r 的最大酶活性分别为0 8 4u m l 和3 8 0u m l 。此外，该菌株在有氧条 件下也能生成1 , 3 p d ，产量为7 1 2m m o f l ，但其关键酶的活性较厌氧时低，此 山东大学硕 学位论文 特性研究为代谢工程改造乳酸菌生产l ，3 p d 奠定了基础。 l 乳酸是生产可降解聚酯乳酸p l a 的单体，乳酸菌在生长过程中能产生大 量乳酸。为了降低乳酸生产成本，本论文以玉米芯水解液为碳源发酵生产【广乳 酸，以实现废弃生物质资源的高值化，进而维持自然界的碳平衡。 玉米芯经盐酸水解后产生大量单糖，经液相色谱分析，d 木糖为7 2 , , - 7 8g ，l ， d 一葡萄糖为1 0 - - 1 2g ，l ，l - 阿拉伯糖为9 0 1g ，l 。将实验室保藏的多株乳杆菌接 种到玉米芯水解液中，培养后筛选得到一株能最大程度转化这三种单糖为l 乳 酸的植物乳杆菌l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m $ 3 4 。并对l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m $ 3 4 的代谢特点进行了研究。结果发现，将玉米芯水解液以l ：4 - 稀释后，发酵5 0h ， l - 乳酸的产量达9 0g 几，乙酸为2 9g ，l ，葡萄糖和阿拉伯糖的质量利用率为 1 0 0 ，木糖的质量利用率为2 9 4 。为了进一步提高对木糖的利用效率，对玉 米芯水解液培养基的成分进行了优化，获得最佳培养基组成为( g ，l ) ：玉米芯水 解液( 1 ：4 ) ，大豆蛋白胨2 0 ， 地) 2 c 羽5 仍2 ，k 2 h p 0 4 2 ，c a c 0 31 0 ，p h 6 o 在此基础上，利用5l 发酵罐发酵5 0h ，l 乳酸和乙酸的终浓度分别为3 2 0g 几和 1 4 6g 几木糖的利用率由2 9 4 提高到3 9 6 ，阿拉伯糖和葡萄糖几乎消耗完全 关键词：短乳杆菌；植物乳杆菌；1 ，3 丙二醇；葡萄糖和甘油共发酵；生物炼 制：l - 乳酸；玉米芯 山东大学颀j ：学位论文 a b s t r a c t l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) i sag r o u po f 掣- a r n - p o s i t i v eb a c t e r i at h a tc o u l dp r o d u e ea l a r g ea n l o u n to fl a c t i ca c i df r o ma v a i l a b l ec a r b o h y d r a t e s t h e ya r oe a t a l a s e - n e g a t i v e w i t h o u te n d o s p o r e sa n dm o v e m e n t a c c o r d i n gt ot h em e t a b o l i ct y p e so fs u g a r , l a b w a sc l a s s i f i e da st h r e e c a t e g o r i e s ：h o m o f e r m e n t a t i o n , h e t e r o f e r m e n t a t i o na n d f a c u l t a f i v eh e t e r o f e r m e n t a t i o n n o w a d a y sl a bi sw i d e l yu s e di nt h ef i e l d so ff o o d , h e a l t hf o o d ，m e d i c i n e ，e n s i l a g e ，s c i e n t i f i cr e s e a r c ha n ds oo n 1 1 l ep r o d u c to fi n d u s t r y m a l e r i a l s e s p e c i a l l yt h em o n o m e ro fn e wp a t t e r n so fp o l y e s t e r , i sp a i do nm o r ea n d n k 傥c l o s ea t t e n t i o n 1 , 3 - p r o p a n e d i o l ( 1 ，3 - p d ) i st h em o n o m e ro f p o l y t r i m e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ( p t l ) b e c a u s eo fi t sb i o d e g r a d a b i l i t ya n dh i g h - p e r f o r m a n c e mh a sc o m ot ob eah o t s p o t d u r i n gt h ee x p l o i t a t i o n so fn e wp o l y e s t e ro v e rt h ew o r l d i n r e c e n ty e a r s ，p u b l i c a t i o n s w e 托f o c u so nt h ep r o d u c t i o no f1 , 3 - p db yk l e b s i e l l ap n e u m o n i d ea n dc l o s t r i d i u mi n b o t hc h i n aa n da b r o a dw h i l et h es t u d i e sa b o u tp r o d u c t i o no fy 1 1 rb yl a bw o r en o t e n o u g ha so t h e rb a c t e r i a y e tt h eo v e r p r o d u c t i o no f1 , 3 - p do fl a bb ym e t a b o l i s m e n g i n e e r i n gh a sp o t e n t i a lp o s s i b i l i t y i nt h i sp a p e r , am a i no fl a c t o b a c i l l ii s o l a t e df r o ms p o i l a g ew i n e ，w h i c hc o u l d p r o d u c e1 , 3 - p db yg l u c o s e - g l y c e r o lc o f e r m e n t a t i o n , w a si d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u s b r e w sb a s i n go nt h er e s u l t so fb i o c h e m i c a le x p e r i m e n t sa n dp s t id i g e s t i o no fp c r p r o d u c t i o no f1 6 sr r n a ，a n dw a sn a m e da sl b b r e v i sw 5 - 1 7 t oa n a l y z et h ee n z y l n o a c t i v i t i e so f g l y c e r o ld e h y d r a t a s e ( g d h t ) a n d1 , 3 - p r o p a n e d i o ln a d + o x i d o r e d u c t a s e 0 d o r ) ，w h i c hw e l et h et w ok e yc n z y m e $ i np r o d u c t i o no fl ，3 - p db yl b b r e r i s w 5 1 7 t h ec o n d i t i o n so fu l t r a s o n i cd i s r u p t i o nc e l lw e r om a d ea t t e m p t t h er e s u l t s h o w e dt h a t , c e i l so f 2 0m lf e r m e n t a t i o nb r o t hw e r er e s u s p e n d e di n2 0m lp o t a s s i u m p h o s p h a t eb u f f e r ( p h 7 0 ) a f t e rc e n t r i f u g a t i o n ，7 6su l t r a s o u n d so n , 4su l t r a s o u n d so f f , 9 9t i m e s ，3 0 0w p o w e r 山东大学硕士学位论文 l b b r e v i sw 5 - 17c o u l dp r o d u c er e d u c i n gp o w e rn a d hi nt h em e t a b o l i s mo f g l u c o s ea n dn a d hc o u l dr e d u c eg l y c e r o lt o1 , 3 - p du n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n s w h e nt h er a t i oo f g l u c o s et og l y c e r o lw 嬲o 0 5m o l l ：0 1m o l l t h ey i e l do f1 , 3 - p d w a s1 1 2 0m m o l la n dt h ec o n v e r s i o no f g l y c e r o lt o1 , 3 - p dw a s0 3 0m o l m o lb yl b b r e v i sw 5 - 1 7f o r7 0h o u r s i n c u b a t i o na t3 l t h eh i g h e s te r z y i t t oa c t i v i t i e so f g d h ta n dp d o rw c r e0 8 4u m la n d3 8 0u m l r e s p e c t i v e l y m o r e o v e r , i tw a s f i r s t l yf o u n dt h a tl b b r e v i sw 5 - 1 7c o u l da l s op r o d u c e 1 , 3 - p du n d e ra e r o b i c c o n d i t i o n st h o u g ht h ep r o d u c t i o nw a so n l y7 1 2m m o f la n dt h ee n z y m ea c t i v i t i e s w e r el o w e rt h a nt h o s eu n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n s t h i ss t u d yw a sa t t r i b u t i n ga f o u n d a t i o nf o rp r o d u c t i o no f1 , 3 p db yl a b l a bc o u l dp r o d u c el - l a c t i ca c i da st h el l l o n o r f l e ro fa n o t h e rb i o d e g r a d a b l e p o l y e s t e r , p o l yl a c t i ca c i d ( p l a ) t h es e c o n dp a r t so ft h i st h e s i sw o r k e do nt h e f e r m e n t a t i o no fl - l a c t i ca c i df r o mc o i ns t e e pl i q u o ri np o i n tv i e wo f b i o r e f m e r y i n o r d e rt or e a l i z et h eh i 曲a d d e dv a l u ep r o d u c t i o no fs c r a pb i o m a s sa n dm o l e ，t ok e e p t h ec a r b o ne c o l o g i c a lb a l a n c e c o r ns t e e pl i q u o rt h a to b t a i n e df r o mc o ms t e e ph y d r o l y z o db yh c ic o n t a i n e d 7 2 7 8g n o fd - x y l o s e ，1 0 - - 1 2 班o fd - g l u c o s ea n d 虬l lg lo fl - a r a b i n o s e a n a l y z e db yh p l c l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m $ 3 4s c r e e n e df r o mt h es t r a i n ss t o c k si n o u rl a b o r a t o r yc o u l dc o n v e r tm o s tm o n o s a c c h a r i d e si nt h ec o r ns t e e ph q u o rt ol - l a c t i c a c i d t h er e s e a r c ho nm e t a b o l i cc h a r a c t e r so fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m $ 3 4s h o w e d t h a tt h ep r o d u c t i o no f l - l a o d ca c i da n da c e t i ca c i d 陀咒9 0e j la n d2 9g la f t e r5 0 h i n c u b a t i o nf r o mt h ec o i n s t e e pl i q u o r ( 1 ：4 ) m e d i u m ，r e s p e c t i v e l y a n dt h e p e r c e n t a g e so ft h ec o n s u m e dg l u c o s e ，x y l o s e ，a n da r a b i n o s ei nw e i g h t sw e 1 0 0 ， 2 9 锄a n d1 0 0 , r e s p e c t i v e l y f o rt h ea d v a n c e m e n to ft h eu t i l i z a t i o no fx y l o s e t h e o p t i m i z e dc o ms t e e pl i q u o rm e d i u mw a sa sf o l l o w i n g ( g l ) ：c o ms t e e pl i q u o r ( 1 ：4 ) ， b e a np e p t o n e2 0 , ( n 1 4 ) 2 q 口，0 72 ，k 2 h p 0 42 ，c a c 0 31 0 ，p h 6 0 b yt h ee n do f f e r m e n t a t i o nf o r5o | hi n5l f e r m e n t o r , t h ep r o d u c t i o no fl 1 a c t i ca c i da n da c e 6 ca c i d w e r eu pt o3 2 0g la n d1 4 6g l ，r e s p e c t i v e l y t h ep e r c e n t a g e so ft h ec o n s u m e d 山东大学顽土= 学位论文 x y l o s ei nw e i g h t sw e n tu pt o2 9 4 f r o m3 9 0 w h i l eg l u c o s ea n da r a b i n o s ew c l e a l m o s tc o n s u m e do u t k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l t u ab r e v i s ，l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，1 , 3 - p d ，g l u c o s e - g l y c e r o l c o f e r m e n m t i o n ，b i o r e f i n c r y , l - l a c t i ca c i d , c o r ls t e e p 山东丈学硕士学位论文 缩略词表 原创性声明 本人郑重声明，所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行 研究工作所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果对本论文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识 到本声明的法律责任由本人承担 论文作者签名：。1 诬盔日期：堑丑：主：兰 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文全部或部分内容缩入有 关数据库进行检索，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文和汇 编本学位论文 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：醢导师签名：坦日期：她 山东人学硕。1 二学位论文 1 1 乳酸菌简介 第一章绪论 乳酸菌是指利用可溶性碳水化合物产生乳酸的细菌总称，是一类兼性厌氧、 过氧化物酶阴性、无芽孢、不运动的革兰氏阳性菌1 1 1 。乳酸菌只是一种习惯叫法， 并不是微生物分类学上的名称。 依据伯杰氏系统细菌学手册第二版，乳酸菌分属于细菌界中五个门：门 b 热袍菌门( t h e r m o t o g a e ) ，包括闪烁杆菌属( f e r i d o b a c t e r i u m ) 和栖热袍菌 属( t h e r m o t o g a ) 2 个属；门b x 硬壁菌门( f i r m i c u t e s ) ，包括瘤胃球菌属 ( r u m i n o c o c c u s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、利斯特氏菌属( l i s t e r i a ) 、芽孢乳杆 菌属( s p o r o l a c t o b a c i l l u s ) ，葡萄球菌属( s t a p h y l o c o c c u s ) 、乳杆菌属 ( l a c t o b a c i l l u s ) 、片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 、肉杆菌属( c a r n o b a c t e r i u m ) 、肠球 菌属( e n t e r o c o c c u s ) 、四联球菌属( t e t r a g e n o c o c c u s u s ) 、明串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 、 链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、乳球菌属( i _ 矗c t o c o c c u $ ) 和海洋杆菌属 ( m a r i n i l a c t o b a c i l l u s ) 等3 0 个属；门b x f f 放线菌门( a c t i n o b a c t e r i a ) ，包括动 弯杆菌属( m o b i l u n c u s ) 、罗氏菌属( r o t h i a ) 、科里氏杆菌属( c o r i o b a c t e r i u m ) 、 阿托波氏菌属( a t o p o b i u m ) 和双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) 和从双歧杆菌属中 新分出的2 个新属s c a r d o v i a 和p a r a s c a r d o v i a 共7 个属；门b xx 拟杆菌门 ( b a c t e m ) ，包括拟杆菌属( b a c t e r o i d e s ) 和巨单胞菌属( m e g a n o m a s ) 2 个属； 门b x 梭杆菌门( f u s o a c c t c r i a ) ，包括纤毛菌属( l e p t o t r i c h i a ) 和塞巴德鲁氏菌 属( s e b a l d e l l a ) 2 个属，总共有4 3 个属，超过5 0 0 个的种和亚种。在2 0 世纪 年代前，乳酸菌主要按细菌的形态、培养条件、糖的利用、代谢产物等进行 分类；年代后，增加了乳酸菌细胞d n a 中g + c 含量测定；9 0 年代以后，采 用1 6 sr d n a 序列分析和基因探针、类脂分析和醌类等分析技术进行测定、分类。 聚合酶链式反应( p o l y m c r a s cc h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 和核酸分子探针杂交技术是 乳酸菌现代分类和鉴定最常用的方法【2 l 。 山东大学硕士学位论文 1 9 8 6 年k a n d l e r 和w e i s s 根据乳酸菌的糖发酵特点将乳酸菌( 主要是乳杆菌 属) 划分为三个生理类群( c a t e g o r y ) f 3 l ： i 同型乳酸发酵，经e m p 途径从葡萄糖产生8 5 以上的乳酸，不能发酵戊 糖或葡萄糖酸盐。典型的菌株有德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i ) 、嗜酸乳 杆菌( l a c t o b a c i u u sa c i d o p h i l u s ) 、卷曲乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc r i s p a t u s ) 、马乳杆 菌( l a c t o b a c i l l u se q u i ) 等。 同型乳酸发酵途径的总反应式为： 葡萄糖+ 2 a d p + 2 p i + 2 n a d + 一2 乳酸+ 2 a t p + 2 ( n a d h + h + ) ； 异型乳酸发酵，经p k u - i k 途径从葡萄糖产生等量乳酸、c c h 、乙酸和( 或) 乙醇。典型的菌株有酸粉乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d i f a r i n a e ) 、短乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sb r e v i s ) 、布氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u 譬b u c h n e r i ) 、丘状乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sc o l l i n o i d e s ) 、胃乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sg a s t r i c u s ) 、肠膜明串珠菌 等( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) p k 途径中以肠膜明串珠菌( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) 和乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sb r e v i s ) 为代表的异型乳酸发酵途径的总反应式分别为： 葡萄糖+ a d p + p i + n a d + 一乳酸+ 乙醇+ c 0 2 + a r p + n a d h + i i + 葡萄糖+ 2 a d p + 2 p i 一乳酸+ 乙酸+ c 0 2 + 2 a t p i - i k 途径中以两歧双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u mb i f i d u m ) 为代表的异型乳酸发 酵途径的总反应式为： 2 葡萄l g + 5 a d p + 5p i 一2 乳酸+ 3 乙酸+ 5 a t p ： 兼性异型发酵，从葡萄糖产生8 5 以上的乳酸，能发酵戊糖或葡萄糖酸 盐。典型的菌株有干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e d 、泡菜乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s 2 山东大学顾t 学位论文 k i m c h i i ) 、戊糖乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s ) 、植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 等。 以戊糖乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s ) 为代表的乳酸菌戊糖发酵的总反应 式为： 1 2 乳酸菌的应用 核糖+ 2 a d p + 2 p i 一乳酸+ 乙酸+ 2 h 2 0 + 2 a t p ，乳酸菌广泛分布于自然界中，其代谢产物对人类的生产生活具有重大影响。 随着研究的深入，乳酸菌的应用领域越来越广阔，包括乳酸菌食品、乳酸菌保健 食品、乳酸菌药品、乳酸菌工业品、乳酸菌饲料、e m 和乳酸菌科研用途六大应 用领域，而且还在不断扩大。 乳酸菌食品在东西方的文明进程中不断发展变化，受到民众的喜爱。常见的 乳酸菌发酵食品有酸乳、干酪、泡菜、火腿等。用作发酵剂的菌种有嗜热链球菌 ( t h e r m o p h i l u s ) 、保加利亚乳杆菌( l b b u l g a r i c u s ) 、嗜酸乳杆菌( l b a c i d o p h i l u s ) 、植物乳杆菌( 肋p l a n t a r u m ) 、乳酪链球菌( 眈l a c t is u b s p 1 a c t i c s ) 、 双乙酰乳链球菌( sd i a c e t i l a c t i s ) 、啤酒片球菌( p e d i o c o c c u sc e r e v i s i a ) 及各种 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 等。乳酸菌还具有各种医疗保健作用，如改善胃肠 功能、抗过敏、抗肿瘤、增强免疫调节、降胆固醇、改善高血脂、预防龋齿、有 益长寿等。 乳酸菌产生的各种细菌素受到极大关注目前，国内外已从乳酸菌的产物中 分离到上百种乳酸菌素，根据其特点可以分为四类：i 类，羊毛硫类抗生素；i i 类，热稳定性小分子肽；类，热不稳定性大分子蛋白质；类，蛋白复合体 其中乳链菌素n i s i n 的研究最早，应用最广n i s i n 对革兰氏阳性菌呈广谱抗菌作 用，尤其是抗热性芽孢菌，但是对革兰氏阴性菌、酵母或霉菌很少或没有抑制作 用。1 9 6 3 年起f a o w h o 专家委员会确认了n i s i n 的毒性数据并推荐了在食品中 的使用量，此后n i s i n 作为食品防腐剂在5 0 多个国家得到应用，其中，以加工 山东丈学硕士学位论文 干酪产品和罐头食品的应用范围为主。 乳酸菌主导发酵的青贮饲料，口感香甜，营养丰富，是畜牧业重要的越冬饲 料组成部分。青贮饲料是利用饲草在青绿状态时收割，贮存在密封容器里，经叶 表乳酸菌发酵或人为加入添加剂，产生乳酸使饲料酸化( p h 4 0 左右) ，从而抑 制腐败微生物的生长，使大部分营养物质和水分得以保存的一种青绿多汁饲料 乳酸菌利用青贮材料中的糖进行乳酸发酵，不仅可以使饲料p i t 值降低从而抑制 腐败菌的生长，而且在发酵过程中产生大量营养和风味物质，特别适于牛、马、 羊等反刍动物的饲养【4 1 除了传统的食品、医药和饲料应用，乳酸菌生产的化工产品逐渐得到越来越 多的开发。近年来，随着人类对环境问题的重视，可持续发展已经为世界各国政 府和民众认可并积极推广，利用微生物资源进行化工产品的生产得到重视。作为 食品级安全菌株的乳酸菌在代谢过程中产生的有机醇、酸等，不仅可作为化工行 业的基础原料，还对自然环境友好，属于可降解生物材料的单体，具有广阔的应 用前景，其中的代表为1 ，3 丙二醇和【广乳酸。 1 2 1 利用乳杆菌生产1 。3 _ 丙二醇 1 ，3 丙二酵( 1 , 3 - p r o p a n e d i o l ，1 , 3 - p d ) ，分子式为c ，i - h 0 2 ，无极性，无色 或灰黄色粘稠状透明液体，可溶于水以及醇、醚等多种有机溶剂主要用于增塑 剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成，也用于食品、化妆品和制药等行业，还可 用于制备其他饱和聚酯，如聚萘二甲酸丙二醇酯( p t n ) 和共聚聚酯( p e l g 、p c i a 、 p a 临) ；用于制备新型聚氮酯( 包括发泡产品、弹性作、粘接剂和涂料) 和精细 化工产品( 包括防冻液、粉末涂料，溶剂，道路融雪剂，药品等) ；甚至能用于 花卉切面的保鲜荆【习和动物饲料的合成剂嗍1 ，3 p d 最主要的用途是作为聚合物 单体合成性能优异的高分子材料，不但是制造性能优异的新型聚酯纤维聚对苯二 甲酸丙二酯( p o l y t r h n e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ，p 1 t ) 的重要单体原料，可替代乙二 醇、丁二醇生产多醇聚酯。而且可以使聚酯塑料具有自然循环的生物可降解特性。 4 山东丈学硬l 学位论文 o l l h o c o 1 1 c o h 对苯二甲酸( p - p h t h a l i ca c i d ) o l l p o c + h o ( 托a 岛a i ro h 1 ，3 - 丙二二酵( 1 。3 - m ) 聚对荤= 甲酸褥二礴( 删 图1 1 1 , 3 一p d 和p 1 广r 的化学结构 f i g 1 1t h ec h e m i c a ls m t c t u r eo f1 3 一p da n dp r r r y r r 是纺织工业中一种新型聚酯化学纤维，较p e t ( 聚对苯二甲酸乙二酯) 、 p b t ( 聚对苯二甲酸丁二酯) 具有更优良的性能，兼具p e t 的高性能和p b t 的 易加工性，特别是它有优异的回弹性( 拉伸2 0 时弹性恢复可达1 0 0 ) 、易染 性( 能在无载体的情况下常压沸染) 、抗污性、耐磨性、低吸水性以及良好的色 牢度( 抗紫外、臭氧、氮氧化合物) ，兼具涤纶、锦纶甚至氨纶的优点，可制作 高度蓬松的b c f 纱、复合纤维、地毯、弹力织物、非织造布，适合衣着及多种 潜在用途。作为一种新型聚酯纤维，m 的研发生产引起了世界合成纤维行业的 重视，是目前合成纤维新品种开发的热点据美国s h e l l 公司预测，到2 0 1 0 年世 界p 1 广r 纤维需求量将超过1 0 0 万t r 丌 目前工业上主要采用化学法合成1 , 3 - p d ，包括德国d e g u s s a 公司的丙烯醛水 合成法、美国s h e l l 公司的环氧乙炔法和环氧丙烷法等尽管化学合成法技术成 熟，但同时具有设备投资大、技术难度高、重金属催化、污染环境等缺点，所以 近年来利用微生物发酵法生产l ，3 p d ，再经化学聚合成为p 1 t 合成的一条新途 径嘲。 山东大学硕士学位论文 能利用甘油产生l ，3 - p d 的微生物有克雷伯氏菌属( k l e b s i e l l a ) 、柠檬酸菌属 ( c i t r o b a c t e r ) 、梭状芽孢杆菌属( c l o s t r i d i u r a ) 、肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 和乳 杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 等。其中，研究和报道最多是克雷伯氏肺炎杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 。由于该菌株为条件致病菌，在发酵过程中存在安全隐患，并且单 纯利用甘油具有发酵周期长、生产成本高等缺点，所以采用基因工程菌株、混合 菌株发酵和两段双( 多) 底物法等生产1 , 3 - p d 受到关注1 9 , 1 0 ，i i , 1 2 1 美国d u p o n t 公司联合g e n e n c o r 公司，开发申请了以湿磨玉米、淀粉、纤维素和麦芽糊精为 原料，利用基因工程菌生产1 , 3 p d 以及从发酵液中提取1 , 3 - p d 的一系列九大专 利，在2 0 0 0 年开始了基于转基因工程菌、由葡萄糖生产i ，3 - p d 的中试，并于2 0 0 6 年3 月建成一套能力为5 0k t a 的生产装置国内的清华大学和大连理工大学也 开展了较深入的研究，清华大学有关生物法生产1 , 3 - p d 的专利共有9 项，工艺 路线有两条：两段( 好氧、厌氧) 双底物( 葡萄糖、甘油) 集成发酵生产1 , 3 - p d ； 以甘油为碳源的两段( 好氧、厌氧) 发酵生产1 , 3 - p d ，已经获得中试成功大连理 工大学有关生物法生产l ，3 p d 的专利共有4 项，工艺路线有两条：甘油经过一 步发酵生产1 , 3 - p d ；葡萄糖和淀粉或纤维素等酶解产物经两步发酵法生产 1 3 p d i l 3 1 。 据报道，乳杆菌l a c t o b a c i l l u sa2 8 ，l a c t o b a c i l l u sb u c h n e r i ，l a c t o b a c i l l u s b r e v i s ，l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i 及l a c t o b a c i l l u sc o l l i n o i d e s 等在葡萄糖和甘油共存在 条件下能够产生l 3 p d1 1 4 , ”1 7 1 ，成为生产l ，3 丙二醇新的微生物菌种资源； 同时乳杆菌内控制l ，3 - p d 合成的甘油脱水酶( g l y c e r o ld e h y d r a t a s e ，g d h t ) 基因 和l ，3 一丙二醇氧化还原酶( 1 , 3 - p r o p a n e d i o ln a d + o x i d o r c d u c t a s e ，p d o r ) 基因是 工程菌株过量生产l 。3 丙二醇的两个关键基因 6 山东人学颤i ：学位论文 l ( ： l ，。n 。a 。d h 蛾1 一 。n 加a d h 。 z k = + 附翻 沁c t o t e 图1 2 厌氧条件下乳杆菌利用葡萄糖和甘油共转化1 , 3 - p d 的代谢途径1 1 1 p h o s p h o k e t o a s e ；2 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a 辩；3 a c e t a t el i r l a s e ；4 p h o s p h o t r a n s a c e t y l a s e ； 5 a c o h o ld e h y d r o g e n a s e ；6 g l y c e r o ld c h y d 晤t a s e ；7 1 3 - p r o p a n e d i o l ：n a do ) 【i d o r e d u c 臼s c 乳杆菌将甘油作为葡萄糖代谢过程中额外的氢受体，因为乳杆菌体内的甘油 代谢只有还原反应所以需要另外的发酵底物( 如葡萄糖) 供菌体生长并平衡还原 反应i 堪1 葡萄糖首先经过h m p 途径生成5 p 木酮糖，消耗1 分子a t p ，生成2 分子n a d h ；5 p 木酮糖的一部分经e m p 途径生成乳酸，同时消耗1 分子n a d h ， 另一部分经乙酰磷酸分别生成乙酸和乙醇，同时合成1 分子a t p 和1 分子n a d ， 消耗1 分子n a d h 。乙酰磷酸生成乙醇的过程与3 - h p a 向l ，3 p d 的转化过程相 偶联。3 h p a 接受乙酰磷酸生成乙醇时的n a d h + 旷生成1 ，3 p d 和n a d ，该n a d 又被乙酰磷酸循环利用。 7 山东大学硕士学位论文 1 2 2 利用乳杆菌生产卜乳酸 l 乳酸( l 1 a c t i ca c i d ) ，即左旋乳酸，分子式c 3 h 6 0 3 ，无色或浅黄色粘稠液 体，能与水、醇、甘油混溶，微溶于乙醚，不溶于氯仿和二硫化碳。l - 乳酸在食 品、饲料、医药、农药、日用化工、造纸及电子工业等众多领域具有广泛应用。 世界上乳酸总产量的5 0 e 用于食品，由于d 乳酸不能为人体代谢吸收，国际卫 生组织已经控制d 型和d l 型乳酸在食品工业中使用，欧、美、日等发达国家已 完全用l 乳酸替代普通消旋d l 乳酸在医药、食品、饲料中使用。 此外，l 一乳酸是合成新型聚酯纤维聚乳酸塑料( p o l yl a c t i ca c i d ，p l a ) 的原 料。通过乳酸环化二聚物的化学聚合或乳酸的直接聚合可以得到高分子量的 p l a s l 毳 爱曹 l - 毳 挺耪 黼i ，l i - 艟敝 曩雉 图1 3p l a 的生物合成1 1 9 1 f i g 1 3b i o s y n t h e s i so f p l a 圈曰围沾 ? 言 山东人学坝j ：学位论文 和普通的塑料或聚酯相比，p l a 主要有以下几个特点： 1 原料来源充足：生产p l a 的原料为农副产品等可再生性资源，而无需采用石 油、木材珍贵的自然资源，因而对日渐枯竭的石油资源将起到很好的保护作 用，对于石油日渐依赖进口的中国也有独特的战略意义。 2 能耗低：在p l a 的生产过程中，它使用的能耗明显低于p e t 、p a 、p a n 等 石油基树脂，只相当于后者的2 0 5 0 。 3 生物可降解性：p l a 最大的特点就是具有优越的生物可降解性，被废弃后可 在自然界中分解为l 乳酸，最终水解为二氧化碳和水。通过植物的光合作用， 二氧化碳和水又可变成淀粉，这样在自然界中循环，维持生态平衡。用p l a 替代普通塑料可解决当今困扰全世界的白色污染问题。 4 优越的物理性能：p