（微生物学专业论文）大肠杆菌产13丙二醇工业化菌株的构建及调控.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：张浩军日期：2 脾相i d 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅：本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后 论文作者签名：裂浩拿 山东大学硕十学位论文 摘要 1 ，3 丙二醇英文缩写为1 ，3 p d o 。是无色、无味的粘稠液体。可溶于水、醇、 醚等多种有机溶剂。主要用于增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成，也用于 食品、化妆品和制药等行业。其最主要的用途是合成苯二甲酸丙二醇酯( p t t ) 。 p ，丌较p e t ( 聚对苯二甲酸乙二酯) 、p b t ( 聚对苯二甲酸丁二酯) 具有更优良 的性能，兼具p e t 的高性能和p b t 的易加工性，具有广阔的应用前景，是目前 合成纤维新品种开发的热点。目前用化学方法合成l ，3 一p d 成本较高，设备投资 大，技术难度高，产品分离纯化困难，特别是催化剂的制备较难，且产生c o 等 污染环境的废气。与化学合成方法相比，微生物生产1 ，3 一p d 具有生产成本低、 转化率高、产物分离简单、无环境污染等优点。其纤维比普通纤维长1 5 ，而 且是生物可降解纤维。本实验室之前的研究证明由葡萄糖一步法合成l ，3 p d 是 可行的，现在利用代谢调控和微生物发酵优化的方法构建可用于工业生产的基因 工程菌。 已发现在酿酒酵母( s a c c h a r a m c e sc e r e v i s i a e ) 中存在甘油合成途径。当环境渗 透压升高时，s c e r e v i s i a e 将启动高渗甘油应答途径( t h eh i 曲o s m o l a r i t yg l y c e r o l r e s p o n s ep a t h w a y , h o g 途径) ，通过合成并在胞内累积甘油以便维持细胞内外渗透 压的平衡。3 磷酸甘油脱氢酶( g p d l ) 和3 磷酸甘油磷酸化酶( g p p 2 ) 是甘油合成 途径中的关键酶。目前发现能以甘油为底物发酵生产l ，3 丙二醇的自然菌株如克 雷伯肺炎杆菌( k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ) 、丁酸梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u m b u t y r i c u m ) 、弗氏柠檬酸菌( c i t r o b a c t e r f r e u n d i i ) 、乳酸杆菌等( l a c t o b a c i l l i ) ，其 中以克雷伯肺炎杆菌和丁酸梭菌有较高的甘油耐受率和l ，3 丙二醇得率。由于肺 炎杆菌中1 ，3 丙二醇合成途径已研究的较为明白，且其生化特性与大肠杆菌 ( e c o l i ) 非常接近，这就为菌种的基因改良和利用基因工程技术构建新的菌种 提供了便利，故选择肺炎杆菌中1 ，3 丙二醇合成酶的基因作为在大肠杆菌中异源 表达合成1 ，3 一丙二醇酶的基因。克雷伯氏肺炎杆菌是兼性厌氧菌，在以甘油为底物 和厌氧环境下启动l ，3 p d 合成系统d h a 途径。合成1 ，3 丙二醇有两个关键酶， 甘油脱水酶和1 ，3 丙二醇氧化还原酶，近来自大肠杆菌中发现1 ，3 丙二醇氧化还 原酶的同工酶，由基因y q h d 编码。 本研究从酿酒酵母中克隆g p d l 和g p p 2 基因，构建由单个启动子控制两个 山东，：学硕i 。学位论文 基因表达的多顺反子质粒；从肺炎杆菌中克隆d h a b 和d h a t 基因( 或者y q h d 基 因) ，构建由同一启动子控制多个基因表达的重组质粒，然后将这两个重组质粒 共转化导入大肠杆菌，成功实现了大肠杆菌由葡萄糖直接发酵生产1 ，3 丙二醇的 策略。在此基础上，我们从代谢调控和微生物发酵优化的角度，分别在质粒改造， 同工酶，菌种优化，代谢途径改造等几个方面对构建的基因工程菌进行了优化， 最终我们构建了一种不需要昂贵的诱导剂而产量却更高的微生物发酵体系，这使 1 ，3 一丙二醇的微生物发酵工业生产向前迈进了一大步。本实验的结果对于其他同 类型的微生物发酵体系也有一定的指导意义和现实价值 关键词：甘油；1 ，3 丙二醇；基因工程菌；共转化；代谢通量 2 山东大学硕f j 学位论文 a b s t r a c t 1 ，3 - p r o p a n e d i o l ( 1 ，3 - p d o ) i sat h r e e - c a r b o nd i 0 1 a ne m e r g i n gl a r g e v o l u m e a p p l i c a t i o no f1 , 3 一p di sa sa m o n o m e ri nt h es y n t h e s i so fp o l y e s t e r sf o ru s ei nc a r p e t a n dt e x t i l ef i b e r sa n ds oo n a v a r i e t yo fc h e m i c a lr o u t e st o1 , 3 - p d oi sk n o w n i ti sc u r r e n t l ym a n u f a c t u r e d b ys y n t h e t i cp r o c e s s e sb e g i l l i l i n gw i t hp e t r o l e u md e r i v a t i v e ss u c ha sa c r o l e i no r e t h y l e n eo x i d e n l ec h e m i c a lm e t h o d sa r ee x p e n s i v ea n dg e n e r a t ew a s t es t r e a m s c o n t a i n i n ge n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s a l t h o u g h1 , 3 - p d oi sp r e s e n t l ym a i n l yp r o d u c e d b yt h e s ec h e m i c a lw a y s ，t h e r ei saw o r l d w i d ei n t e r e s ti np r o d u c i n gt h i sc h e m i c a lb ya b i o t e c h n o l o g i c a l r o u t e m e t a b o l i c e n g i n e e r i n g ，t h em o d i f i c a t i o n , d e s i g n a n d c o n s t r u c t i o no fb i o c h e m i c a lp a t h w a y s ，i sa ne m e r g i n gd i s c i p l i n eo fp o t e n t i a l i m p o r t a n c et oc h e m i c a l s w eh a v ek n o w nt h a ts a c c h a r a m c e sc e r e v i s i a ec a n p r o d u c eg l y c e r o lb y c o n v e r t i n gg l u c o s et h r o u g ht h ef r u c t o s e - 1 6 - b i s p h o s p h a t ep a t h w a y w h e no s m o t i c p r e s s u r er i s e s ，s c e r e v i s i a e c a l ls t a r tu pt h e h i g ho s m o l a r i t yg l y c e r o lr e s p o n s e p a t h w a y ( h o gp a t h w a y ) ，w h i c hs y n t h e s i z e sa n da c c u m u l a t e sg l y c e r o lt om a i n t a i nt h e b a l a n c eo fo s m o t i cp r e s s u r eb e t w e e nt h ec e l lm e m b r a n e a n dt h ek l e b s i e l l a p n e u m o n i a ec a l lc o n v e r tg l y c e r o lt o1 , 3 - p d o i nk l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ，c i t r o b a c t e rf r e u n d i i , a n dc l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ， t h eg e n e se n c o d i n gt h et h r e es t r u c t u r a ls u b u n i t so fg l y c e r o ld e h y d r a t a s e ( d h a b1 3 ) a n d l o c a t e da d j a c e n tt oag e n ee n c o d i n gas p e c i f i c1 , 3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s e ( d h a t ) a l t h o u g ht h eg e n e t i co r g a n i z a t i o nd i f f e r ss o m e w h a ta m o n gt h e s em i c r o o r g a n i s m d ， t h e s eg e n e sa r ec l u s t e r e di nag r o u pw h i c ha l s oc o m p r i s e sd h a b 4a n do r f 2 b ( g e n e s e n c o d i n gad e h y d r a t a s er e a c t i v a t i o nf a c t o r sf o rg l y c e r o ld e h y d r a t a s e ) t h es p e c i f i c 1 , 3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s e ( d h a t ) o ft h e s em i c r o o r g a n i s ma r ek n o w nt ob e l o n g t ot h ef a m i l yo ft y p ei i ia l c o h o ld e h y d r o g e n a s e s 1 1 1 eg e n e ( y q h d ) i ne c o l ie n c o d e sa h y p o t h e t i c a lo x i d o r e d u c t a s ca n dc o n t a i n st w oa l c o h o ld e h y d r o g e n a s es i g n a t u r e sa l s o f o u n di nt h ec i t r o b a c t e rf r e u n d i ia n dk l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 1 , 3 一p r o p a n e d i o l d e h y d r o g e n a s ee n c o d e db yt h ed h a tg e n e i t sa ni s o z y m eo ft h e1 , 3 - p r o p a n e d i o l o x i d o r e d u c t a s e ( d h a t ) i nt h i sp a p e r ，m e t a b o l i c p a t h w a y f r o mg l u c o s et o 1 , 3 - p r o a p a n e d i o lw a s s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e di nr e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o bb ye x p r e s s i o no fg p d la n d 3 山东人学硕卜学位论文 g p p 2g e n e sf r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ee b y 10 0a n dd 1 1 扭a n dd h a tg e n e sf r o m k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ，r e s p e c t i v e l y h p l ca n a l y s i sc o n f i r m e dt h a tt h ec o n v e r s i o no f g l u c o s et o1 , 3 - p r o p a n e d i o lb yt h i sr e c o m b i n a n tb i o c a t a l y s t w ea n a l y s e dt h ei m p a c t s o fd i f f e r e n tt y p eo fp l a s m i d si n e c o l ir e c o m b i n e ds t r a i n sa n dm e t a b l i cf l o w so nt h e t i t e ro fg l y c e r o la n d1 , 3 - p r o p a n e d i 0 1 k e yw o r d s ：g l y c e r o l ，1 , 3 一p r o p a n e d i o l ，g e n ee n g i n e e r i n g ，c o - t r a n s f o r m e d , m e t a b l i c f l o w 4 山东大学硕l 。学位论文 ! m nn u u 量量量鼍皇曼皇量 1 甘油的简介和研究历史 第一章绪论 1 1 甘油的应用领域 甘油是瑞典药剂师斯柴尔( s c h e e l e ) 于1 7 7 9 年在橄榄油与一氧化铝反应时 偶尔发现的一种具有甜味成分的物质。1 8 2 3 年法国的谢弗勒尔发现甘油的成分 是甘油和脂肪酸的酯，并发现用苛性碱或硫酸能分离出脂肪酸和甘油。1 8 3 6 年 法国的珀卢兹报导了甘油的实验式c 3 h 8 0 3 。1 8 8 3 年贝特洛证明了甘油的化学结 构是三元醇，分子式为c h 2 0 h c h o h c h 2 0 h 。 甘油是最简单的三羟基醇。又称丙三醇。在自然界中甘油主要以甘油酯的 形式广泛存在于动植物体内，在棕榈油和其他极少数油脂中含有少量甘油。甘 油是肥皂工业的副产物，也可以利用特种酵母发酵糖蜜制得；也可以丙烯为原 料合成甘油；以油脂为原料制取肥皂时可得到甘油；也可用发酵或人工合成法 制取 1 】。 甘油可用于制造硝化甘油，醇酸树脂等。也可用作飞机和汽车液体燃料的抗 冻剂，玻璃，纸的增塑剂以及化妆品、皮革、烟草、纺织品等的吸湿剂。在实 验室中可用于保存标本【2 】。 甘油被大量用作化工原料，用于制造合成树脂、塑料、油漆、硝酸甘油、油 脂和蜂蜡等，还被用于制药、香料、化妆品、卫生用品等工业中 3 】。 我国甘油的主要消费结构如下：涂料3 6 ，牙膏3 5 ( 高级牙膏含甘油1 5 - 2 0 之间) ，医药6 ，卷烟6 ，化妆品5 ，其它1 妣【4 】。目前我国甘油受到制皂工 业的发展的限制，肥皂产量下降，甘油原本供不应求的局面将更加严重。发达国 家甘油来源有化学合成法，其产量与制皂工业生产的甘油相等。我国在六七十年 代即建立合成法中间工厂，但一直未工业化，原因是生产成本高、污染大。 发酵法是继皂化法( 油脂水解) 、化学合成法之后的第三种甘油生产方法。 随着石油能源的日趋减少，化学合成法生产甘油的经济效益不断下降，合成洗涤 剂的发展造成皂化法生产的甘油产量停滞不前，采用生物发酵生产甘油就营运而 生。利用耐渗透压酵母合成甘油的方法是一项国际领先的技术，与一般发酵法相 比，该方法是在需氧而不是微氧或厌氧下生长；不需要加入转向剂：酵母可在较 高的糖浓度生长发酵；糖的转化率可达到6 0 5 。一 山东，：掌坝l 。学佗论文 我国的甘油消费构成与西方发达国家相比，相差很大。全球甘油供应目前正 在形成紧张局面。在2 0 0 7 年4 、5 月份里，精甘油的价格史无前例地上涨了6 美分 磅，同时粗甘油正在寻找新的市场和用途、市场需求量在增加。2 0 0 7 年4 月1 日美 国市场上精甘油价格，不同等级上涨了6 7 美分磅，据说这种价格上涨的趋势 显得极为稳健。事实上，全球甘油供应紧张的局面已经形成。而我国近2 0 年来甘 油产量始终在年产3 万t 左右，进口量也是3 万t 上下，这说明我国是丙三醇缺口大 国。 1 2 甘油的生物合成 在酿酒酵母( s a c c h a r a m c e sc e r e v i s i a e ) 中发现了甘油合成途径。当环境渗透压 升高时，s c e r e v i s i a e 将启动高渗甘油应答途径( t h eh i 曲o s m o l a r i t yg l y c e r o l r e s p o n s ep a t h w a y , h o g 途径) ，通过合成并在胞内累积甘油以维持细胞内外渗透压 的平衡。酿酒酵母细胞中的3 一磷酸甘油脱氢酶有两种：一类存在于线粒体中 ( g u t ，e c1 1 9 9 5 ) ，以f a d + 为辅酶，在甘油的分解代谢途径中催化3 一磷酸 甘油生成磷酸二羟丙酮。另一类存在于胞浆中( g p d ，e c l 1 1 8 ) ，以n a d + 为辅 酶，催化磷酸二羟丙酮生成3 一磷酸甘油，是甘油合成途径的关键酶。该酶有两 个同工酶，即g p d j 和p d 2 ，分别由g p d l 和g p d 2 基因编码。当环境渗透压升高 时，g p d l 的m r n a 的转录水平提高，启动h o g 途径。酵母细胞将合成并在胞内 累积甘油以便维持细胞内外渗透压的平衡；g p d 2 的表达不受环境渗透压变化的 诱导，而是受缺氧条件的诱导，不依赖于h o g 途径，当在缺氧条件下生长时， 酵母细胞将合成并在胞内累积甘油以便维持细胞的氧化还原平衡 6 】。 s c e r e v i s i a e 的g p d l 由3 9 1 个氨基酸组成，分子质量4 2 ，8 6 9 k d 。其氨基酸序 列存在两个功能区域：n a d + 结合区域和催化区域。r o s e 等以渗透压敏感甘油缺 陷突变株o s g l 一1 为宿主细胞，并利用构建在穿梭载体y c p 5 0 _ e 的酿酒细胞基因 组文库对其进行转化，最终成功克隆到g p d l 的编码基因g p d l 并对其进行了序列 分析。根据s c e r e v i s i a e 的g p d l 基因推导出的氨基酸序列，与兔子的3 一磷酸甘油 脱氢酶的氨基酸序列进行了比较，发现该酶的前1 2 7 个氨基酸残基与该酶n a d + 结合功能有关。进一步研究表明，在第4 2 至4 7 个氨基酸残基部位，还存在该类酶 普遍保守的g l y x g l y xxg l y 结构域( ) 【”代表任意氨基酸) ，此结构域与a m p 的 连接有关。通过序列比较，发现氨基酸残基p r 0 1 0 7 与h i s 一1 3 2 也是其酶功能所 6 山东大学硕卜掌位论文 必须的。有关另一同工酶g p d 2 的研究相对较少，它1 扫4 4 0 个氨基酸组成，分子量 4 9 ，4 2 1 k d ，与g p d l 在氨基酸序列上具有6 9 的同源性。这两个同工酶通常以 二聚体形式存在。 将酿酒酵母中产甘油的相关基因3 一磷酸甘油脱氢酶基1 - g l ( g p d l ) 和3 一磷酸 甘油酯酶基i 习( g p p 2 ) 导入到大肠杆菌中，从而在大肠杆菌中构建一条由葡萄糖经 糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮( d h a p ) 再经3 一磷酸甘油脱氢酶和甘油磷酸化酶 的共同作用生成甘油的代谢途径，在不产甘油的大肠杆菌中构建一条新的转化葡 萄糖生成甘油的代谢途径。利用此工程菌生产甘油具有生产工艺简单、成本低廉、 副产物少、产物分离简单等优点，是“绿色”生产甘油，具有广阔的应用前景；而 且在此工作的基础上还可进一步改造代谢途径获得转化葡萄糖生产1 ，3 丙二醇的 基因工程菌。因而构建工程茵生产甘油是甘油生产的发展趋势，国外已有d u p o n t 和g e n e n e o r 公司进行相关研究【7 8 】。本研究从酿酒酵母中克隆g p d l 和g p p 2 基因， 构建由单个启动子控制两个基因表达的多顺反子表达质粒，然后导入大肠杆菌， 进行利用大肠杆菌发酵生产甘油的研究。 21 , 3 丙二醇的简介和研究历史 2 11 , 3 丙二醇的合成方法及研究进展 2 1 1 1 ，3 丙二醇的合成方法 l ，3 丙二醇英文缩写1 ，3 p d o 。是无色、无味的粘稠液体。可溶于水、醇、 醚等多种有机溶剂。主要用于增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成。也用于 食品、化妆品和制药等行业，其最主要的用途是作为聚合物单体合成性能优异的 高分子材料。不但可以使聚酯塑料具有自然循环的可生物降解特性。而且是制造 性能优异的新型聚酯纤维聚对苯二甲酸丙二酯( p t t ) 的重要单体原料。可替代 乙二醇、丁二醇生产多醇聚酯。p t r 较p e t ( 聚对苯二甲酸乙二酯) 、p b t ( 聚 对苯二甲酸丁二酯) 具有更优良的性能，兼具p e t 的高性能和p b t 的易加工性， 具有广阔的应用前景。是目前合成纤维新品种开发的热点 9 1 0 】。p t t 是纺织工 业中一种新型聚酯化学纤维，性能明显优于p e t 和p b t ，具有优异的回弹性( 拉 伸2 0 时弹性恢复可达1 0 0 ) 、易染性( 能在无载体的情况下常压沸染) 、抗 污性、耐磨性、低吸水性以及良好的色牢度( 抗紫外、臭氧、氮氧化合物) ，兼 7 山东，：学硕i ，学位论文 曼鼍鼍皇量量詈量量鼍量曼邑曼曼曼曼鼍量曼鼍- - , , i i 量量曼曼量曼曼曼量寰 具涤纶、锦纶甚至氨纶的优点，可制作高度蓬松的b c f 纱、复合纤维、地毯、 弹力织物、非织造布，适合衣着及多种潜在用途。作为一种新型聚酯纤维，p t t 的研发生产引起了世界合成纤维行业的重视。 由于1 ，3 一p d 的价格昂贵阻碍了p t t 的发展，因此1 ，3 - - p d 工业化生产将 是p t t 生产的关键 1 1 】。 目前生产1 ，3 一p d 的方法主要是两种化学方法合成【1 2 】，如下： 丙稀醛法：丙稀醛水合得到3 一羟基丙醛( h p a ) ： c h 2 = c h c h o + h 2 0 h o c h 2 c h c h 0 ； h p a 催化加氢得1 ，3 - - p d ： h o c h 2 c h c h 0 + h 2 h o c h 2 c h c h o ， 环氧乙烷法：环氧乙烷在催化剂作用下与c o 和h 2 羰基反应生成h p a ， c h 2 一c h 2 + c o + 2 t - 1 2 h o c h 2 c h c h 0 1 、 o 分离出的h p a 经催化加氢生成l ，3 一p d 。 用化学方法合成1 ，3 一p d 成本较高，设备投资大，技术难度高，产品分离纯 化困难，特别是催化剂的制备较难，且产生c o 等污染环境的废气。 除化学方法合成外，美国d u p o n t 公司开发了1 ，3 一p d 的生物合成技术，将碳 水化合物( 如葡萄糖等) 用微生物发酵一步制得1 ，3 一p d ，这一方法成本极为低 廉。另一些报道则利用克雷伯杆菌( i d e b s i e l l a ) 、肠细菌属( e n t e r o b a c t e r ) 等以 甘油为底物生产1 ，3 一p d ，与化学合成方法相比，微生物生产1 ，3 一p d 具有生产成 本低、转化率高、产物分离简单、无环境污染等优点 1 4 - 1 5 。而且，由于1 ，3 一 p d 是利用碳水化合物合成，其进一步合成的纤维与普通的p t t 纤维相比不仅具有 相似的特性，还有更优良的特性，其纤维比普通纤维长1 5 ，而且是生物可降解 纤维，因此具有广阔的应用前景。 2 1 2 国际1 , 3 丙二醇研究现状 长期以来，全球1 ，3 p d o 的工业产量低，价格高，阻碍了p t l 行业的发展， 如1 9 9 1 年的产量仅为1 0 0 吨，市场占有率远不及7 , - - 醇等。直至u 1 9 9 5 年德国 d e g u s s a 公司以丙烯醛为原料合成l ，3 一p d 的新工艺开发成功，以及美i 雪s h e l l 公司 8 山东：学硕j 。学位论文 i - - im 皇曼鼍曼 用环氧乙烷为原料开发出低成本的1 ，3 一p d ，才使1 ，3 p d 有了很大的发展。资料统 计，2 0 0 1 年全世界1 ，3 p d 生产能力已达1 3 6 万讹，据业内人士预测，n 2 0 l o 年的 p t t 纤维年需求量将达nlo o 万吨。 目前全球1 ，3 p d 的生产基本上被德国d e g u s s a 公司、美国壳牌公司和美国 杜邦公司三家垄断。三个公司各自采用的是不同的技术路线。d e g u s s a 公司采用 的是丙烯醛水合氢化法，壳牌公司采用的是环氧乙烷碳基化法，两个公司走的都 是“石化合成路线”。另一家1 ，3 p d 生产商杜邦公司采用的是自己创新的生物工 程法 1 6 1 。 杜邦和g e n e n e o r 公司合作开发的生物技术通过以下3 个步骤合成1 ，3 丙二醇： 将可转化甘油为1 ，3 丙二醇的基因d h a b 和d h a t 克隆到甘油生产菌中；将可转化糖 为甘油的基因g p d l 、g p p 2 克隆n 1 ，3 丙二醇茵；将d h a b 、d 1 1 a t 和g p d l 、g p p 2 克隆到其它以葡萄糖为底物的微生物细胞中进行表达。 葡萄糖在厌氧条件下经发酵生成1 ，3 p d ，反应分为三部分：( 1 ) 中间体制 备与发酵；( 2 ) 浓缩与副产物回收；( 3 ) 脱水与产品精制纯化。转基因工程菌 e c o l i 固定在一个球形聚合基地物上，置于发酵罐中，葡萄糖底物被厌氧发酵。 发酵液在出离发酵罐时首先经过过滤环节，发酵中多余的细胞和其它固体废物被 分离出去。过滤后的滤液在两步反应平行进行的脱水结晶装置中经过脱水结晶 处理，在该装置中，滤液首先被浓缩处理，一些诸如醋酸纳、重碳酸钠等副产品 被沉淀下来，含有1 ，3 p d 和水的蒸汽进入除水反应柱中，水与l ，3 p d 被分离。分 离后的粗1 ，3 p d 进入纯化装置中经过纯化后，即得精制的l ，3 p d 产品。 在全球石油能源日益短缺的情况下，杜邦公司的生物工程路线被业界视为相 当具有发展前景的新技术。 2 0 0 0 年，杜邦公司和英国t a t e & l y l e 公司于在美国伊利诺斯州在一套规 模为4 5 4 吨年的中试装置上转基因工程茵发酵法生产1 3 丙二醇的技术进行了验 证并获得成功。2 0 0 1 年2 月，杜邦公司已将美国金斯顿的1 2 万吨年s o r o n ap t t 装置转变为由谷物生产的1 ，3 p d 来生产p t t 。 目前市场上所能获得的杜邦公司的新型p t t 纤维产品s o r o n a 聚合物主要是在 美国北卡罗莱纳州的金斯顿工厂用连续聚合的石化技术生产的，同时也采用了部 分德国韦塞林基于石化路线生产的1 ，3 p d 作原料。但随着杜邦与t a r e & l y l e 合资 项目的成立，杜邦有望实现以生物技术为基础的s o r o n a 聚合物的商业化生产。目 9 山东人学硕l 学化论文 ! i ； 一 i 量曼毫曼鼍曼皇曼曼曼曼曼曼量曼鼍曼皇曼量舅舅曼曼量 前杜邦转移到中国等地的s o r o n a 聚合物生产，只是提供p t t 切片用于聚合生产 p t t ，技术含量相对较低，对杜邦的1 ，3 p d 生物法生产技术垄断不构成任何威胁。 从传统来看，杜邦公司为了垄断市场，从不对外销售1 ，3 p d ，只向客户销售p t t 切片及其下游产品。 2 0 0 4 年5 月2 6 日，杜邦和t a t e & l y l e 公司已建立了一家合资公司杜邦 t a t e & l y l eb i o p r o d u c t ，l l c 公司，使用两家公司共同开发的专有发酵和精制工 艺，由谷物发酵制取l ，3 丙二醇。新成立的合资公司将专注于用生物法生产 1 , 3 p d 。 2 1 3 国内1 , 3 丙二醇的研究现状 2 1 3 1 国内研发进展 国内科研单位1 9 9 6 年开始关注1 ，3 丙二醇生产技术发展；1 9 9 7 年国家开始同 d up o n t 等国外公司进行技术转让谈判，但遭到拒绝；1 9 9 8 年我国可以向国外企 业高价进口l ，3 丙二醇，国内大型石化公司也开始看好p t l 聚酯项目，这促使国 内一批科研单位开始研发1 ，3 丙二醇。 目前国内开展丙烯醛法的研发单位主要有上海石化、兰州石化、黑龙江 石油化工研究院、华东理工大学等；开展环氧乙烷法的研发单位主要有中石化北 京化工研究院、中科院兰州化物所等；开展微生物发酵法的研发单位主要有清华 大学、华东理工大学、大连理工大学、山东大学、江南大学、东南大学、沈阳农 业大学、安徽科苑集团等。但目前绝大多数研发单位还处于小试、中试阶段，没 有实现工业化。 国内2 0 0 2 年开始实现1 ，3 丙二醇工业化生产，首家生产企业是山东邹平铭兴 化工有限公司，采用化学合成法，规模在千吨级。2 0 0 4 年，黑龙江辰能生物工程 有限公司建成微生物发酵法1 ，3 丙二醇试验装置并投产对外销售。 由于看好1 ，3 丙二醇市场前景，国内不少企业在积极开发1 ，3 丙二醇项目， 主要是上海石化股份有限公司、黑龙江辰能生物工程有限公司、河南天冠集团公 司等。此外，吉林市招商局、蚌埠市招商局、黑龙江友谊甘油厂、青岛琅琊台集 团等也提出1 ，3 丙二醇项目进行招商引资。 1 0 山东大学硕f ：学1 迂论文 近期微生物发酵逐渐成为各国研究的热点，并取得很大进展。1 ，3 一p d 可以通 过发酵甘油来生产，并在多种细菌中，例如克雷伯氏菌，柠檬酸菌，梭状芽孢杆 菌属，肠杆菌属，乳杆菌属发现了能够生产l ，3 一p d 的菌株。一般以甘油为唯一 的碳源厌氧条件下进行，没有其他的还原性等价物受体时，产量较少。为此，人 们通过加入还原性等价物的辅助底物来提高产量。 连续发酵在一个开放的系统中发生，在生化反应器中以一定的速度添加新鲜 培养基，同时以相同的速度流出培养基，从而使反应器内的液量维持恒定，培养 物在恒定状态下生长的培养方法，连续发酵通常含高密度的培养基，从而使微生 物的生长速度和代谢活性处于恒定状态，达到稳定高速培养物微生物或产生大量 代谢产物的目的。 z e n g 和d e c k w e r 等研究了用肺炎杆菌进行甘油连续发酵高产1 ，3 - p d 的情况。 其试验条件是：工作容积为2 l ，反应器转速为3 0 0 r r a i n ，添力1 3 0 k o h 使p h 值控 制在7 0 ，培养温度为3 7 摄氏度，当稀释率在1 0 2 5 时，最终1 ，3 p d 的含量为 3 5 2 4 8 5 9 l ，体积产量为4 9 - 8 8 9 l 。这结果相当于理想条件下( 没有乙醇和氢 化物形成) 理论产量的8 0 - 9 6 。t a g 用同样的菌株进行连续培养，稀释率在2 7 时获得丙二醇最大浓度为3 9 3 m m o l l 。s o l o m o n 等在稀释率为2 5 时获得更高一 点的丙二醇浓度，大约4 3 0 m m o l l 。在z e n g 等研究中，稀释率为1 0 时获得丙二 醇最终含量为6 3 8 m m o l l 。这个含量与用肺炎杆菌和丁酸梭菌分别进行分批和补 料分批培养中获得的浓度( 6 5 0 - 8 0 0 m m o l l ) 相近，连续发酵的体积产量大于 1 0 0 。 随着生物技术在化学工业的渗透，生物法生产l ，3 丙二醇工艺逐步完善，条 件温和，操作简单，副产物少，无环境污染，研究也不断深入，以玉米为原料生 产1 ，3 丙二醇技术有望得到进一步发展。 2 21 3 一丙二醇的生物合成 人们已知1 ，3 一p d 能从甘油发酵而产生。已经发现能以甘油为底物产生1 ，3 一 p d 的微生物菌株主要有柠檬酸菌、梭状芽孢杆菌属、肠细菌属、克雷伯杆菌属、 乳酸菌属等【1 7 】。甘油在微生物体内主要有两条基本代谢途径：氧化途径和还原 途径。氧化途径主要包括以下步骤：( 1 ) 甘油经甘油脱氢酶( g d h ) 催化，生 成2 一羟基丙酮( d h a ) ，此酶为厌氧酶，以n a d + 为辅酶。( 2 ) d h a 在a t p 及2 山东人学坝f j 学位论文 一羟基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羟丙酮( d 地心) 。( 3 ) d h a p 进一步代谢 生成丙酮酸，然后通过乙酰c o a 进入三羧酸循环或生成其他小分子醇、酸等代谢 产物。氧化途径生成生物能a t p 和还原当量n a d h 2 ，并伴随着微生物细胞的生长 1 8 1 9 】。还原途径主要有两步酶反应：( 1 ) 甘油脱水酶在辅酶b 1 2 存在下将甘油 转化为中间产物3 一羟基丙醛( 3 一h p a ) 。( 2 ) 在n a d h 2 存在下，3 一) a 在l ，3 一丙二醇氧化还原酶的催化下生成1 ，3 ，p d 。还原途径消耗氧化途径生成的过量 n a d h 2 ，使微生物细胞内的还原物质达到平衡 2 0 】。 以肺炎杆菌为例，在甘油代谢的过程中，其中甘油脱水酶为限速酶，该酶有 三个亚基( 仅、p 、y ) ，需要辅酶b 1 2 作为辅酶，在甘油存在下发生自杀失活，辅 酶b 1 2 的c o c 键不可逆断裂，形成5 脱氧腺苷和烷基钴胺素类似物，被修饰的 辅酶和甘油脱水酶紧密结合，使酶失去活性 2 2 】。在再激活蛋白、a t p 、m n 2 + 或 m 9 2 + 存在下，被修饰的辅酶能够被完整的辅酶替代，使甘油脱水酶能够重新被 激活 2 3 。甘油脱氢酶和1 ，3 一丙二醇脱氢酶在氧存在下会失活，因此如果用原始 菌株做发酵培养，必须在厌氧情况下进行。高浓度甘油可对菌体产生毒性，将转 化1 ，3 一p d 的基因克隆至能利用糖类产生甘油的菌株内，就可避免这一弊端 2 4 。 下图是克伯氏肺炎杆菌d h a 的调节子，它的两个关键酶基因d h a b 、d i l a t 在基 因组上方向相反，说明这两个基因在不同的启动子控制下，转录和翻译的方向相 反。其 d h a b 4 和o r f 2 b 是甘油脱水酶d l l a b 的激活因子【2 5 】。 o r f 2 co r f 2 bd l l a to r f 2 ad h a b1d h a b 2d h a b 3d h a b 4 图1 1 肺炎杆菌中d h a 调节子基因序列 但在自然菌株中发酵或者混合发酵生产1 ，3 一p d ，最能耐受1 ，3 一p d 的肺炎杆 菌和丁酸梭菌其最高产量也只有7 0 9 l 2 1 e 右( 肺炎杆菌最高7 3 3 9 l ) 【2 6 ，并且产品 的分离纯化较困难。甘油脱水酶是1 ，3 一p d 生产的限速酶 2 7 】，对此，可采取的 方法有在原始菌株中扩大甘油脱水酶的活性以进一步提高1 ，3 - - p d 的产量 2 8 ， 或者用基因工程的手段构建基因工程菌生产l ，3 一p d 。 2 3 葡萄糖发酵生产1 3 一丙二醇的设想 由于甘油和其他廉价碳源如葡萄糖相比，价格较高，增加了发酵的成本。而 1 2 山东，：学硕f j 学位论文 自然界中没有能够直接利用葡萄糖产生1 ，3 丙二醇的菌株，因此利用基因工程 构建能将葡萄糖等碳水化合物转化为l ，3 一丙二醇的菌种成为降低发酵成本的重 要手段，也是近年来发酵法生产1 ，3 一p d 研究的热点。 基因工程菌的构建策略主要有四条途径。( 1 ) 将1 ，3 一p d 生产菌的d h a b 、d h a t 基因克隆到甘油生产菌中，从而获得能将葡萄糖转化为1 ，3 一p d 的基因工程菌。 ( 2 ) 将甘油生产菌的g p d l ，g p p 2 基因克隆到1 ，3 - - p d 产生菌中，从而获得能将 葡萄糖转化为1 ，3 - - p d 的基因工程菌。( 3 ) 将1 ，3 p d 产生菌的d h a b 、d h a t 基因 克隆到e c 础中，获得能转化甘油为l ，3 - - p d 的基因工程菌。( 4 ) 将1 ，3 一p d 生产 菌的d 1 1 啦、d h a t 基因和甘油生产菌的g p d l 、g p p 2 基因共克隆到大肠杆菌e c o l i 中，从而获得能将葡萄糖转化为1 ，3 p d 的基因工程菌。 3 生物合成中的代谢调控 3 1 代谢调控实验技术 3 1 1 质粒的选择 在微生物发酵中，质粒的选择很重要，选择合适的质粒能提高产量。但在目 前所发表的英文研究中，构建的基因工程菌1 ，3 丙二醇的产量都很低，且前期工 作较多，构建各种载体用来证明构建的基因工程菌能够产生1 ，3 丙二醇，并从各 个方面分析可能会影响1 ，3 丙二醇产量的原因，但其产量都不高，最高产量为 6 3 9 l ；更多的研究是关于各种产l ，3 丙二醇菌的甘油脱水酶和1 ，3 丙二醇氧化还 原酶的大小，酶活，比对等。 新报道的基因工程菌产1 ，3 丙二醇的研究来自江南大学，其产量达到3 8 0 9 l 。 他们构建的基因工程菌其中的甘油脱水酶d h a b 没有说明来自于什么菌，1 ，3 丙二 醇氧化还原酶是用其同功酶y q h d 代替的，所用载体是其实验室构建的，属于t a c 启动子。t a c 启动子是一个杂合启动子，是t q p 和1 a c 启动子融合在一起，它的表达 效率比单个的仃p 和l a c 启动子要强，但又比t 7 启动子弱【3 0 】。t 7 启动子是当今大 肠杆菌表达系统的主流，诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋 白的5 0 以上。 尽管大肠杆菌因其优异的生化特性，被认为是极佳的基因工程菌，但是其外 源基因的表达需要i p t g ( 异丙基p d 硫代半乳糖昔) 的诱导。这在一定程度上限制 山东= i ：学i 万! 。学位论文 了大肠杆菌用于工业发酵，因为i p t g 的价格比较昂贵，加上i p t g 诱导的超敏感 性，其诱导的时机和浓度又比较难以掌握 3 1 3 2 】。 为了克服这一缺点，我们选择一些不需要昂贵的i p t g 作为诱导物的质粒来构 建基因工程菌。比如温度敏感型的质粒( 例如p c l 4 7 6 ) 作为表达载体。其热诱 导不需要添加外来的诱导物，成本低。p c l 4 7 6 选取九噬菌体转录启动子，3 0 c 阻 遏启动子转录，4 2 c 解除抑制开始转录 3 3 】。另外，本实验室研究了大肠杆菌的 转录调控系统，我们注意到了一个由r p o s 基因表达的西格玛因子r p o s 。r p o s 调 控稳定期相关的基因，同时还调控细菌对一些环境压力的应答，例如：高渗透压， 高乙醇，低营养，低p h 值，高，低温度和高密度等 3 4 3 8 。基于这些特点，本 实验室通过表达基n r p o s 5 - 端的非编码区在大肠感觉中构建了一个非诱导体系。 其能够在菌体累积到一定浓度的时候自动诱导表达外源基因。我们也将其应用在 本研究中。 3 1 2r e d 重组系统 伴随着分子生物学的发展，一种基于九噬茵体r e d 重组酶的同源重组系统已应 用于大肠杆菌基因的敲除。有关九噬菌体重组系统方面的研究已有数十年的历史， 自上世纪6 0 年代开始，就有人报导九编码的产物可以促进细菌发生重组 3 9 】，c l a r k 和他的同事发现具有l r e d 系统的菌株在同源重组时不依赖细菌本身的重组系统， 因而认