IL-2与IL-15对NK细胞亚.ppt

IL-2与IL-15对NK细胞亚群表型和功能的调节作用,组员：聂晓晓孙昊孙胜岩王句斐王鹏史彦鹏,摘要：,IL-2和IL-15对于调控体内淋巴细胞功能和稳态起重要作用。对二者及其受体细胞生物学和分子生物学的认识为癌症免疫治疗提供了应用前景。二者在体外具有类似的刺激淋巴细胞增殖作用,然而在体内的作用却明显不同。不同生理功能是由于各自不同受体亚基介导的不同信号转导通路、不同受体亚基表达模式。本实验是针对IL-2和IL-15对NK细胞亚群表型和功能的调节作用的研究。,关键词：IL-2;IL-15;NK细胞;表型；细胞毒,实验目的：探讨IL-2和IL-15对NK细胞亚群表型和功能的调节作用。,原理：,IL-2主要由T细胞分泌,通过自分泌和旁分泌的方式不仅作用于T细胞,而且对NK细胞、B细胞、单核细胞也具有促进其增殖分化和效应功能的作用。IL-15不仅在空间结构上与IL-2类似,而且IL-15R和IL-2R共有c和c亚单位,能够促进造血祖细胞分化为CD56+NK细胞。我们用IL-2和IL-15分别刺激新鲜分离PBMC或加入到混合淋巴细胞培养(MLC),比较其对NK细胞表型和功能的免疫调节作用,为探讨IL-15对成熟NK细胞的作用、全面了解IL-2和IL-15免疫学功能异同,以及NK细胞在免疫系统及免疫调节中的作用提供依据。,药品与仪器：,PE-CD56、PE-IgG1和FITC-IgG1、FITC-CD16、冻存的Daudi细胞、K562细胞、RPMI1640、小牛血清、Ficoll、rhIL-2和rhIL-15（使用前测定生物学活性）、Na2CrO4、流式细胞仪、计数仪,PBMC的分离与培养,无菌抽取正常人外周血,肝素抗凝,Ficoll密度梯度法分离PBMC,培养于含有不同浓度为rhIL-2或/和rhIL-15的100mL/LFCSRPMI培养液中,在37。C,50mL/LCO2条件下培养3d。,混合淋巴细胞培养(MLC),无菌抽取正常人外周血,采用Ficoll密度梯度法分离PBMC,按每2mL培养基中含有1.5106PBMC和0.5106经3000Rad照射过的Daudi细胞,培养于24孔板中,加入不同浓度rhIL-2或rhIL-15,于培养第4天补加含同种浓度细胞因子的新鲜完全培养基,37摄氏度,50mL/LCO2继续培养2d。,免疫荧光染色和流式细胞术分析(FCM),收集细胞因子刺激的PBMC或MLC细胞,调整细胞数为1.0107mL-1,加入1:20细胞悬液50uL(用DPBS稀释)灭活正常兔血清,室温作用10min。加入PE-CD56和FITC-CD16进行膜表面双色荧光标记,对照组加入PE-IgG1和FITC-IgG1,4摄氏度作用30min。用洗涤液洗涤2次。加适量固定液,FCM检测。,NK细胞杀伤水平的检测,收集对数生长期K562细胞,调整细胞数为2.0106mL-1,加入51Cr3.7MBq,37摄氏度孵育1.5h,中间每隔15min晃动1次。标记完毕后洗涤3次,调整靶细胞数至1.0105mL-1,加入96孔U型板,100uL孔。收集细胞因子刺激的PBMC或MLC细胞,作为效应细胞,按照不同的效靶比加入含有预先标记K562细胞的96孔U型板中,37摄氏度孵育4h,200g离心5min,收集上清液每孔100L,用计数仪测定CPM值,按以下公式计算特异性杀伤率。特异性杀伤率=(实验组CPM-自然释放CPM)(最大释放CPM-自然释放CPM)100%,结果预测,1、IL-2和IL-15对NK细胞亚群表型的影响在PBMC培养中加入50U/mLIL-2或IL-15时,CD56+细胞百分率较空白对照组上升。IL-2和IL-15组CD56bright亚群比例明显增加。在MLC中加入50U/mLIL-2或IL-15时,CD56+细胞百分率较空白对照组上升，且NK细胞亚群由空白对照组CD56dim为主转变成以CD56bright细胞为主。2、IL-2和IL-15促进NK细胞的杀伤功能在PBMC中加入0、50、500和1000U/mL的IL-2或IL-15培养3d后，在不同浓度细胞因子刺激的NK细胞组杀伤水平均高于对照组NK细胞,并呈剂量依赖关系。尽管经MLC产生的NK细胞本身即具有较高水平的杀伤率,当加入0、50、500和1000U/mL外源性IL-2或IL-15培养6d后,杀伤水平明显升高,并与所加入细胞因子浓度呈剂量依赖关系。,3、IL-2和IL-15协同促进NK细胞杀伤功能在PBMC中加入50U/mLIL-15和0、5、50、500和1000U/mL的IL-2,培养3d后当效靶比为5：1时,加入50U/mLIL-2组NK细胞杀伤水平明显高于50U/mLIL-15组与IL-2组的杀伤水平,具有明显协同作用,讨论,IL-2和IL-15具有相似空间结构,其相应受体共用c、c亚单位,但在功能上两者并不完全相同。虽然IL-2和IL-15均可刺激T细胞增殖、调节B细胞的增殖与分化,但IL-15对NK细胞的发育和分化的调节作用十分明显。研究表明,IL-15能够促进CD34+造血干细胞定向分化为NK细胞。IL2和IL15能明显上调其NK细胞的比例,且NK细胞亚群分布由CD56dim为主转变成CD56bright细胞为主。这可能与不同条件下NK细胞IL-2R和IL-15R表达状态不同有关。静止的NK细胞上一般只表达IL-2中亲和力受体,低剂量IL2不能有效促进其杀伤水平;而IL-15可通过IL-2R、链有效传递活化信号,对相同剂量IL-15的反应性高于IL-2的刺激。在MLC中,由于同种异体抗原刺激CD4+细胞产生大量细胞因子,NK细胞活化后表达高亲和力IL-2R,因此对IL-2刺激的反应性明显升高。低剂量IL-15和IL-2具有协同刺激NK细胞杀伤功能的作用,可能是由于低浓度IL-2,不能诱导高亲和力受体的表达,当加入IL-15后,促进IL-2高亲和力受体的表达,从而促进NK细胞杀伤功能。CD56bright亚群的增加,将对细胞因子