（有机化学专业论文）基于活性的丝苏氨酸蛋白磷酸酶探针的设计与合成.pdf

基于活性的丝苏氨酸蛋白磷酸酶探针的 设计与合成 有机化学专业硕士研究生卢冬静 指导教师官智教授何延红教授 摘要 蛋白质磷酸化及其水解是细胞功能调控机制的重要部分，生物体中的大多信号传导与蛋 白磷酸酶有关。蛋白磷酸酶是一大类负责去磷酸化反应的重要蛋白，但因为其较低的丰度， 复杂的作用模式，使得人们至今仍未透彻了解它在调节生理过程中发挥作用。“基于活性的 蛋白质分析( a c t i v i t y - b a s e d p r o t e i n p r o f i l i n g ，a b b p ) ”这一方法的提出使得对蛋白磷酸酶这 种痕量调控蛋白进行大规模的分析成为可能。本文采用这一思想方法设计，并合成了可以用 在活细胞中丝苏氨酸蛋白磷酸酶分析，服务于蛋白磷酸酶的蛋白质组学研究的化学探针。 研究成果如下： 1 通过对已成功应用的各类化学探针进行比较研究，结合蛋白磷酸酶特点，应用“基于 活性的蛋白质分析”这一思想，设计了丝苏氨酸蛋白磷酸酶活性探针。 2 对探针合成引入氟原子中的问题，进行了不同氨基保护下圣基吖- 氨基膦酸酯氟化反 应的研究，筛选得到了具有较好氟化效果的氨基保护基邻苯二甲酰基( p h t h ) 。 3 应用上述研究结果，使用p h t h 作为氨基保护基，完成探针活性基团，并与“点击柄” 对接，成功制得可用于活细胞中丝苏氨酸蛋白磷酸酶分析的目标探针 关键词：基于活性的蛋白质分析丝苏氨酸蛋白磷酸酶活性探针 点击化学亲核氟化氨基保护 d e s i g na n ds y n t h e s i so f a c t i v i t y b a s e dp r o b ef o rs e r t h r p r o t e i np h o s p h a t a s ep r o f i l i n g g r a d u a t es t u d e n to fo r g a n i cc h e m i s t r y ：d o n g j i n gl u s u p e r v i s o r ：p r o f d r z h ig u a np r o f d r y a n h o n gh e a bs t r a c t p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o na n dd e p h o s p h o r y l a t i o no fp r o t e i na 托w i t hr e s p o n s i b i l i t yf o r s i n g n a lc o n d u c t i o ni no r g a n i s m s p r o t e i np h o s p h a t a s e s , w h i c hc o n t r o lt h ep r o c e s so f d e p h o s p h o r y l a t i o no fp r o t e i n s ，c o n s t i t u t eal a r g ef a m i l yo fs i g n a l i n ge n g y m e s f o ri t s l o w - a b o u n d a n c ea n dc o m p l e xm e c h a n i s m s nv i v o ，u n t i ln o ww es t i l lc a n n o tu n d e r s t a n dm e i f f u n c t i o n st h o r o u g h t l y h e r e ，c h e m i c a lp r o b e sw e r ed e s i g n e da n dp r e p p e df o rs e r t h rp r o t e i n p h o s p h a t a s e sa n a l y s i sb a s e do nt h e i rc a t a l y t i cm e c h a n i s m nv i v o t h e yc a l lb eak i n d o fn e wt 0 0 1 t op r o f i l es e r t h rp r o t e i np h o s p h a t a s e si nl i v ec e l l c o n c l u s i o n sa n dr e s u l t sw e r ed i s c r i b e db d o w ： 1 a f t e rs t u d ys o m ed i f f e r e n tk i n d so fp r o b e sw h i c hh a v eb e e nu s e ds u c c e s s f u l l y , c o m b i n e d w i t ht h es t r u c t u r e so fp r o t e i n p h o s p h a t a s e s ，a na c t i v i t y - b a s e dp r o b e f o rs e r t h rp r o t e i n p h o s p h a t a s e sw a sd e s i g n e d 2 s t u d yd i f f e r e n tp r o t e c t i o ng r o u p sf o r a m i n oi nt h ef l u o r i n a t i o nr e a c t i o no fa - h y d r o x y l - 丫- a m i n o - p h o s p h o n a t e a n df o u n dt h a tp h t h a l o y li st h eb e s to n ei nt h ef l u o r i n a t i o n 3 u s i n gp h t h a l o y la st h ea m i n op r o t e c t i o ng r o u p ，t h ea c t i v ep a r to fp r o b ew a ss y n t h e s i z e d t h e n ，t a r g e tp r o b ef o rs 既t h rp r o t e i np h o s p h a t a s e sw a sp r e p a r e ds u c c e s s f u l l yb yc o m b i n e da c t i v e p a r to f p r o b ew i t hr e p o r tg r o u p ，w h i c hc a nb eu s e df o rs e r t h rp r o t e i np h o s p h a t a s ea n a l y s i si nl i v e c e l l k e y w o r d s ：p r o t e o m e ；a c t i v i t y - b a s e dp r o t e i np r o f i l i n g ( a b b p ) ；s e r t h rp r o t e i np h o s p h a t a s e s ； a c t i v ep r o b e ；c l i c kc h e m m t r y ；n u c l e o p h i l i cf l u o r i n a t i o n ；a m i n op r o t e c t i o n 独创性声明 学位论文题目：基于活性的丝菱氨酸蛋白磷酸酶 探针的设计与合成 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者：签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名： 签字日期：年月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：一 通讯地址： 导师签名： 签字日期：年 月 日 电话：( ) 邮编： 第一章前言弟一早月i j 苗 1 1蛋白质组学与蛋白磷酸酶 1 1 1蛋白质组学 2 0 0 3 年4 月，人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 首席科学家 c o l l i n s 博士宣布人类基因组序列图谱绘制成功，h g p 的目标全部实现，标志着 h g p 的的完成，同时也标志了“后基因组时代( p o s tg e n o m ee r a ，p g e ) 【1 捌 的 来临。2 0 0 1 年的s c i e n c e 杂质也已将蛋白质组列为2 0 0 2 年六大研究热点之一【3 ，4 】。 2 1 世纪生命科学已从基因组的研究进入功能基因组的研究，也就是说要在 蛋白质结构的基础上研究基因编码的各种蛋白质的功能，并从传统的单个蛋白质 的研究走向蛋白质组的研究，从而更加深入地揭示生命活动的奥秘。这些方面的 功能工作构成了当今生命科学研究的前沿，即蛋白质组科学【5 6 】。 蛋白质组学发展的时间很短，但是它提供的关于生命系统的信息甚至比十年 前开始的“基因组革命”还要多，这是因为蛋白质组学所包括的信息极其丰富。 基因有序列，而蛋白质不仅有序列，还有功能、生化功能和生理功能，并且它们 的活性还受到化学修饰、细胞定位以及蛋白质与其他分子的相互作用等因素的影 响。如图1 1 所示，如果把基因比作遗传指令的携带者，那么蛋白质就是执行这 些指令的分子，正是从蛋白质我们得知细胞和微生物是如何构造和维持生存的， 又是如何在生命活动的某一环节出现问题时死亡的【7 】。 d n a m r n a 一蛋白质一细胞功能 基因组 蛋白质组 。基因组学”。蛋白质组学” 图1 1 基因组学和蛋白质组学的生物化学关系 s c h e m e1 ir e l a t i o n s h i po fg e n o m i e sa n dp r o t e o m i c si nb i o c h e m i s t r y 与基因组学研究相比蛋自质组学研究更加接近实用，有着巨大的市场前景， 以在药物开发中的应用为例，蛋白质组研究可能会使药靶的数量增长十倍。现代 新药研究与开发的关键是寻找、确定和制备药物筛选的药靶。基因组研究表明人 类有数万个基因和更多的蛋白，其中许多蛋白是控制人类疾病的潜在靶点，粗略 估计可能存在的药物靶点约有3 0 0 0 - 1 5 0 0 0 个，而目前应用的药靶还不到5 0 0 个。 随着蛋白质组研究工作的不断深入，将会发现展示所有可能的药物作用靶点，以 及针对这些靶点的全部可能的化合物【8 1 。 1 1 2重要的痕量调控蛋白蛋白磷酸酶与蛋白激酶 生物体能迅速对体内环境变化和外界刺激产生应答反应，细胞内生理过程， 有条不紊的进行，这些反应过程靠复杂的调控机制调剂，其中大多数调控机制是 由蛋白质的构象变化所介导的【9 】，而蛋白质本身的构象变化常常是变构效应和蛋 白质一级结构上发生各种共价修饰来实现的。 几乎所有的蛋白质在合成过程或合成后都要经过某些形式的修饰，有的是肽 链骨架的剪接，有的则是特异氨基酸侧链的化学修饰，这种现象称为翻译后修饰 ( p o s t - t r a n s l a i o n a lm o d i f i c a t i o n , p t m ) 。翻译后修饰可以直接调控蛋白质的活性， 同时也使蛋白质的化学结构远远超过遗传密码子所编码的2 0 种氨基酸可提供的 组合数，从而增加了蛋白质结构和功能的多样性【l 们。现今发现的蛋白质修饰形式 已有几百种，如二硫键的配对、硫酸化、甲基化以及羟基化修饰，有些修饰会使 蛋白质的化学结构改变，有些修饰是蛋白质与配体或者蛋白质问相互作用所需 的，还有些修饰会直接影响蛋白质的生化活性。蛋白质组学中涉及较多的3 种修 饰形式是磷酸化( p h o s p h o r y l a t i o n ) 、糖基化( g l y c o s y l a t i o n ) 和泛素化 ( u b i q u i t i n y l a t i o n ) 的研究。这3 种修饰形式是真核细胞中广泛存在的，大约9 0 以上的蛋白质存在这3 种类型的修饰。 蛋白磷酸化( p h o s p h o r y l a t i o n ) 和去磷酸化( d e p h o s p h o r y l a t i o n ) 是上述过程 最常见、最重要的可逆修饰方式，经磷酸化后的效应蛋白的活性，与去磷酸化后 的恰好相反。磷酸化与去磷酸化的平衡主要由蛋白激酶( p r o t e i nk i n a s e s ，p k ) 和 磷酸酶( p r o t e i np h o s p h a t a s e s ，p p p ) 调控，如图1 2 所示。在哺乳动物的细胞周 期中，大约有1 3 的蛋白质发生过磷酸化的修饰，而在脊椎动物基因组中，有5 的基因编码蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶【i l 】。蛋白激 酶是一类将a t p - 丫位的磷酸基团转移到底物的氨基酸残基上引起靶蛋白发生磷 酸化的调节酶，它通过促进功能蛋白的磷酸化而使细胞对各种刺激做出相应的反 2 应。蛋白磷酸酶则是负责水解蛋白上氨基酸残基磷酸的调节酶，使底物蛋白失活。 参与蛋白磷酸化和去磷酸化的酶与一般的激酶和酸碱性磷酸酶不同，他们的作 用对象为蛋白质，且有严格的特异性，通常按其接受磷酸化、去磷酸化的基团不 同，主要可分为：丝苏氨酸蛋白激酶( 如p k a ，p k b ，p k c ，p k g ) ，酪氨酸蛋 白激酶( 如e g f 受体) 及兼有丝苏及酪氨酸蛋白激酶( 如m e k ) 。同样的，蛋 白磷酸酶( p p p ) 也有丝苏氨酸蛋白磷酸酶( p s e r p 研) 和酪氨酸蛋白磷酸酶 ( p t p ) 。这两种酶的底物，即磷酸化或去磷酸化的蛋白质，称为磷蛋白 ( p h o s p h o p r o t e i n ) 。目前估计在任一时期，真核细胞生物总蛋白中都约有l 3 是 被磷酸化的，人类蛋白质组中含有多约l o 万个潜在的磷酸化位点。大多数磷蛋 白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物形态存在【1 2 】。磷 酸化修饰本身很微妙，而且一种蛋白质可能只有小部分在特定的时期被修饰， t h r e o n i n v 0 如 一 一0 7 i i y ； o o 沙n ，i e t y r o s i n e i y i j j 0 n ， 凸人h 一o 。6 p k h o o| j j 0 n ，i p h o s p h o s e r i n e p h o s p h o t h r e o n i n e p h o s p h o t y r o s i n e 图1 2 1 n 1 蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化作用下的磷酸化和去磷酸化过程 s c h e m e1 2 p h o s p h o r y l a t i o na n dd e p h o s p h o r y l a t i o nr e a c t i o n s c a t a l y z e db yk i l l 勰e $ a n dp h o s p h a t a s e s 3 。p八 丫。 且洲 y o 因而被修饰的靶蛋白的数量很有限，即使靶蛋白的丰度很高，很多修饰形式的混 合存在也会使某一种特定修饰形式的该蛋白含量很低，这使得磷蛋白的检测和定 量都很困难。 p k ，p p p 及各自相应底物共同组成一个信号传导网络，调节人体内细胞生 长、分化、代谢、细胞周期、细胞间通讯、细胞迁移及基因转录、离子通道活动、 免疫应答等过程。这些信号网络的任何环节出现不协调，都有可能导致异常的磷 酸化去磷酸化，最终引起包括肥胖症、癌症和糖尿病在内的多种疾病【1 4 】。 1 1 3 蛋白磷酸酶的分类 原核生物中蛋白质的磷酸化位点常在组氨酸( h i s ) 、天冬氨酸( a s p ) 、和谷 氨酸( g l u e ) ，此外，在赖氨酸( l y s ) 、精氨酸( a r g ) 和半胱氨酸( c y s ) 上也 会发生磷酸化修饰。真核细胞蛋白质的磷酸化翻译后修饰一般是0 磷酸化，即 磷酸化位点在蛋白质的丝氨酸( s e r ) 、苏氨酸( t h r ) 和酪氨酸( t y r ) 残基侧链 的羟基上，按其作用于蛋白质的残基种类不同划分为：丝氨酸蛋白磷酸酶( s e r i n e p r o t e i np h o s p h a t e ，p s e r ) 、苏氨酸蛋白磷酸酶( t h r e o n i n ep r o t e i np h o s p h a t e ，p t h r ) 和酪氨酸蛋白磷酸酶( p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e s ，p t p s ) 。 1 丝苏氨酸蛋白磷酸酶： 丝苏氨酸蛋白磷酸酶主要包括p p l 、p p 2 a 、p p 2 b 、p p 2 c 和p p x ，见表1 1 ， 各种均有亚型【1 5 】，可以组成不同的全酶。p p s 是一类含有金属的酶，通过直接攻 击p 原子底物中的活化水分子起到催化作用，可使蛋白上p s e r p t h r 去磷酸化的 蛋白磷酸酶。p p s 参与了众多的生理活动：如细胞内糖代谢、钙转运、肌肉收缩、 表1 1p p s 的分类与分布 t a b l e1 1s o r t sa n dd i s t r i b u t i o no fp p s p p s分布 p p l p p 2 a p p 2 b p p 2 c p p x 胞浆p p l l ，肌浆内质网p p l g ，肌丝p p l m ，核中p p l n 主要位于肌浆，少数位于线粒体及核 主要位于胞浆 细胞膜上 核及中心体上 4 基因表达、蛋白质合成、细胞凋亡等1 6 】。 2 酪氨酸蛋白磷酸酶： 酪氨酸蛋白磷酸酶组成了一个庞大的酶家族，在人体中超过1 0 0 种【1 7 】，主要 成员及分类见表1 2 。p t p s 是重要的调节信息酶，在细胞增殖、分化、代谢、迁 移、生长中起关键作用。与蛋白丝苏氨酸磷酸酶不同，蛋白酪氨酸是不含金属 的酶类，其通过一个共价的磷酸化半胱氨酸中间体开始催化过程，其作为信号传 导的调节因子，通过除去酪氨酸残基上的磷酸基因对信号传导产生“开 、“关 效应【18 1 。 表1 2p t p 家族及分类 t a b l e1 2m e m b e r so fp t pf a m i l y p t p 种类主要成员 胞内p t p p t p l b 、s h p l 、s h p 2 、p t p h i 、f a p 1 受体( r p t p ) p t p 4 、c d 4 5 、p t p7 、p t p ”、l a r 双专一p t p ( d s p t p )m k p 一3 、v h r 、c d c 2 5 、p t e n 低分子量p t p ( i m w )结构简单，仅有p t p 结构和c ( x ) 5 r 基序 1 1 4 蛋白磷酸酶在调控作用中的重要性和复杂性 多数细胞内信号途径为蛋白磷酸化所调节，蛋白的磷酸化可产生蛋白间相互 作用的新识别序列，从而调控蛋白质的稳定性，最重要的是调节酶的活性。蛋白 激酶可催化蛋白磷酸化反应，近几十年来备受关注，细胞信号传导的重要发现也 多来自蛋白激酶的研究。正是由于多种蛋白激酶与疾病的发生和发展有关，因此 常被作为新的药物发现的靶点。很多针对特定蛋白激酶的小分子抑制剂已处于不 同的临床开发阶段【1 9 。2 1 1 。 早期的一些观点认为，蛋白磷酸酶( p p p ) 是- d , 类非特异性的水解酶，随 机的逆转磷酸化效应，无选择性的遏制蛋白激酶( p k ) 的作用。但很快，这种 看法被证实过于简单化。事实上，p p p 组成了一个与p k 相平行的复杂多样的酶 家族，在结构多样性和复杂性方面并不逊于p k 。另外，生物化学和遗传学研究 表明，p p p 在信号传导途径中具有双向作用，在许多哺乳动物的组织和细胞生理 活动中扮演重要的角色【2 2 2 3 】。与p k 类似，p p p 的功能失调一样会导致体内的病 5 理改变。因此，可以将p p p 作为新的靶点，设计开发出一系列具有另一种作用 模式的药物。 在p p p 的底物中即包括p k 的作用产物，如酶、调节蛋白、结构蛋白和转录 因子等。并且除调控p k 产物的磷酸化状态外，p p p 也可直接作用于p k ，因此 许多p k 的活性也受磷酸化作用的调节2 4 1 。很多p k 通过磷酸化“激活环 内的 氨基酸来活化，如有丝分裂原激活的蛋白激酶( m a p k ) 因结构中“激活环”内 的酪氨酸、苏氨酸磷酸化而活化；而p p 2 a 对磷酸苏氨酸( p t h r ) 的去磷酸化或 m a p k 磷酸酶对这两种残基去磷酸化可导致m a p k 的活性丧失。又如c d 4 5 使 s i c 酪氨酸激酶家族“激活环”内苏氨酸的去磷酸化也可导致激酶失活。而p p 2 a 、 c d 4 5 都是p p p 家族中的成员【2 5 】。 由此可见，p p p 是一大类控制人体蛋白质去磷酸化的关键酶，与p k 的去磷 酸化相拮抗或相协同，并且有着同等的重要性和更为复杂的调节机制。p p p 与 p k 协调控制着包括细胞内信号传导、细胞生长、分化、代谢、细胞周期、细胞 间通讯、细胞迁移、基因转录、离子通道活性以及对免疫反应和存活等多方面进 行调节，现已逐渐成为新的研究热尉2 6 , 2 7 】。 1 1 5蛋白质组时代的蛋白磷酸酶研究 复杂生物体的基本单位是细胞，而在细胞生命活动基本上是由蛋白质相互间 网络式反应与结构的表现。蛋白质组学使我们可以从总体、综合的角度，在分子 水平上来研究和把握生命现象，这对于理解生命的本质及生命科学的几乎每一个 分支都必将带来强有力的推动。 蛋白质的可逆磷酸化是细胞功能调节机制的一个重要部分，作为在细胞中发 挥调控功能的蛋白磷酸酶和蛋白激酶，其重要性远远超出一般的蛋白质，这使得 针对蛋白磷酸酶的研究成为蛋白质组时代的重要内容。虽然现有技术可以采用 系列技术方法来对蛋白质进行大规模鉴定，但全面分析蛋白磷酸酶家族仍然是一 个挑战，而更近一步的挑战是要全面理解这些蛋白磷酸酶如何通过去磷酸化过程 实现细胞内的信号传导，完成对具体的生理过程的调节。 一种疾病在其表现出在任何可察觉的病症之前，肯定已经有某些蛋白质发生 了变化。因此，随着研究的不断深入，将来可以利用找到的与疾病密切相关的某 种蛋白磷酸酶作为关键和标志性蛋白应用于疾病的早期诊断、药物筛选和病理研 6 究等十分有意义的工作。 1 2 蛋白质组研究中分离技术的不足 人们在憧憬蛋白质组研究的美好未来的同时，也应看到“蛋白质组”作为新 兴领域在许多方面还很稚嫩。众所周知，蛋白质研究的第一步是蛋白质的分离， 目前蛋白质组学研究中分离环节的两大支撑技术是二维凝胶电泳( t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c r t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 和多维液相色谱( m u t i d i m e n s i o n a ll i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ) 【2 9 】，而后者经常与一些液相分离方法如毛细管电泳或色谱聚焦 相结合。如图1 3 所示，当前蛋白组研究很大程度上依赖于二维凝胶电泳，它是 目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，2 - d e 的灵敏度虽然已 达到飞摩( f m 0 1 ) 级水平，但仍然没有能力发现痕量蛋白质，很难将细胞组织内 多种痕量的调控蛋白分离显示出来 3 0 , 3 1 】。二维凝胶电泳是一个强大的工具，但基 于二维凝胶电泳的蛋白质组学仍然面临许多挑战。 样品 细胞、组织、体液 j 图像分析、数据处理+ 一二维凝胶电泳一 电转印到膜匕 i 胶上原位酶切 i 厂 广肽了物 e s i m s m s p s d ，m a l d i ， m a l d i t f o f f m s t o f m s 叫二0 肽序列标签 【一 e d l m 匝降解氨基酸分析 i n 端序列 l 氨基酸组成 l 蛋白质鉴定 图1 3 蛋白质组分析流程 s c h e m e1 3t h ep r o c e s so f p r o t e o m i c sa m l ) r s i n g 7 此外，生物体中大部分蛋白质是低丰度蛋白质，而低丰度蛋白质往往是执行 重要生物功能的蛋白质，如调控蛋白、信号传导蛋白和受体蛋白等。这其中也包 括大量潜在的药物靶点：酶、受体、离子通道。蛋白磷酸酶和蛋白激酶在蛋白质 的翻译后修饰发挥重要作用的酶家族，对发生在生物体内的新陈代谢具有控制作 用，而这些功能的实现都依赖于酶的活性。应用传统分离技术得到的酶，不能保 证其具备活性，因此也难以满足后续针对与酶活性相关的研究需要。 1 3 “基于活性的蛋白质分析 在痕量酶蛋白质分离中的应用 蛋白质组学采用一系列技术方法来对蛋白质进行大规模鉴定，显然没有一种 技术能适用于所有的应用，不同的技术有各自的优缺点。与基因组研究不同，蛋 白质组学的主要缺点是缺乏一种类似与p c r 的方法，也能扩增低丰度蛋白质， 而这就意味着灵敏度是一个主要问题，那些丰度很低的蛋白质是很难测定到的。 此外，目前的分离手段无法分离活性酶与不具备活性的酶，远远不能满足更进一 步研究的需要，特别是当前的蛋白磷酸酶研究已经受限于传统的分离技术。因此， 在2 - d e 为主导技术的蛋白质组研究领域，发展一种对低丰度的蛋白质更灵敏， 同时基于活性的分离技术，以对其进行有效分析的工具是非常必要的。 正是在这样的背景下，一个被称为“基于活性的蛋白质分析( a c t i v i t y - b a s e d p r o t e i np r o f i l i n g ，a b b p ) 的新方法被提出来【3 2 _ 3 4 1 ，以适应在广谱蛋白质存在下 的某些微量蛋白质的分析。这个方法使用酶的一种特殊小分子抑制剂，叫做“基 于机理的抑制剂 ( m e c h a n i s m - b a s e di n h i b i t o r ) 【3 5 】或酶活性探针( a c t i 妒b a s e d p r o b e ) 。探针结构中通常包括活性基团( p r o b ea c t i v eg r o u p ) 、报告基团( r e p o r t e r g r o u p ) 和臂( l i n k e r ) 。其中，活性基团是模拟酶的天然底物而设计的，它可专一 地与相应酶的活性部位共价相结合，达到俘获酶的效果，并使酶不可逆的失去活 性。报告基团是为了易于检测和分离，在设计及合成探针时加入的功能团，可以 是荧光发色团，也可以是b i o t i n 等。报告基团和活性基团二者通过臂相连。利用 酶活性探针能从复杂的蛋白质组中，将感兴趣的酶进行有效的分离鉴定 ( p r o f i l i n g ) ，甚至直接从活细胞中对感兴趣的蛋白质进行俘获【3 6 】。 迄今为止已经运用a b b p 方法对一些重要的蛋白质酶家族进行了研究，如蛋 白酪氨酸磷酸酶m3 引、丝氨酸水解酬3 9 矧、半胱氨酸蛋白酶 4 1 , 4 2 】、糖苷酶h 3 1 、 8 去泛素化酶【删。探针技术所具备的优点之一就是可以借助分子生物学知识和有机 合成技术针对某一类型的酶设计、合成一系列结构各异的活性探针，并且能够对 筛出的具有活性的探针的结构进一步优化设计，从而得到活性、选择性更加优良 的探针。就蛋白磷酸酶而言，该家族有1 0 0 多成员，考虑到蛋白磷酸酶一般由多 个亚基组合而成，其全酶的数量并不一定比蛋白激酶少很多，它们具有差异的底 物和不同的细胞功能，而探针设计、合成及应用都十分灵活的特点使其非常适用 于蛋白磷酸酶的研究。使用酶活性探针筛查和确定蛋白质组中某类蛋白酶的活 性，既可以筛选该类蛋白，简化分析体系，又可以直接获取其功能信息。这种方 法弥补了其他蛋白质组学方法的不足，已经成为功能蛋白质组学研究的主要策略 之一，在经典蛋白质组学与功能蛋白质组学问起到桥梁的作用，是一个进展很快 的方向【4 5 4 8 。 1 4 论文选题目的和意义 本文运用“基于活性的蛋白质分析这一思想，借鉴了成功蛋白质探针的设 计经验，同时结合丝苏氨酸蛋白磷酸酶底物的结构特点设计了可应用于活体细 胞研究的含氟的小分子活性探针。比较了当前有机分子中引入氟原子的三种常用 方法，在根据探针分子结构特点确定了氟化方法后，对所设计探针进行了逆合成 分析，设计了自易得原料起始的合成线路。以3 一氨基丙醇为起始原料，经过氨基 保护、羟基氧化、p u d o v i k 反应、亲核氟化、脱保护和酰化后得到了目标探针。 此外，我们针对在合成目标活性探针中，a 一羟基吖一氨基膦酸酯氟化反应遇到 的问题经行了深入系统的研究。选取了不同类型的具有代表性的氨基保护基，如 b o e 、f m o c 、p h t h 、t s 、b z 等，分别进行了氨基保护，并进行了氟化反应的研究， 在比较了反应结果的差异后，结合相关的文献报道讨论了具有这类结构特征的化 合物中氨基保护基在氟化反应中发生的反应或所起的作用，给出了在进行此类反 应时氨基保护基选择的参考意见。本文运用这一研究结果，在制备活性探针关键 的氟化步中选用了有较好反应结果的p h t h 为氨基保护基，合成了重要的中间体昏 单氟膦酸酯，最终在随后的实验中顺利得到了目标探针分子。 蛋白磷酸酶在生物体内是重要的调控蛋白，负责磷酸化蛋白质的脱磷酸化， 保证细胞内信号的传导。本文采用“基于活性的蛋白质分析 这一方法，完成探 9 针的设计、合成部分的工作。后续工作是将运用a b b p 思想所设计的活性探针应 用在蛋白磷酸酶家族中的蛋白丝苏氨酸磷酸酶的研究中，与未知生物功能的蛋 白质相互所用，以分离富集细胞内痕量蛋白质，确定其功能。具体思路主要是借 助合成的活性探针在细胞内与特定的酶作用，使其不可逆的失活，并与探针共价 结合。破碎细胞后，使用炔键化的生物素与探针末端预留的叠氮基发生反应，即 运用“点击化学”方法达到生物素标记特定酶的目的。最后，将生物素标记了的 酶用亲核素富集，完成目标蛋白的分离。过程如图1 4 所示： 不同种类的酶 ge 一s 探针在细胞内与特定酶结合 生物素标记的酶 栗和索将杯记酶冒粟 图1 4 使用探针对酶进行分离、富集 s c h e m e l 4 s e p a r a t i o na n de n r i c h m e n to fe n z y m e sb yu s i n gp r o b e s 应用不同的化学探针筛查出细胞中所有的丝苏氨酸蛋白磷酸酶，并对其进 行研究，筛选出与之相互作用的化合物的工作属化学蛋白质组学( c h e m i c a l p r o t e o m i c s ) 的研究领域。这种筛查既可得到未知蛋白，又提示了蛋白相应的配 体化学探针，提供了药物开发的苗头或先导化合物【4 9 - 5 2 ，具有一石二鸟的作 用，是化学生物学在蛋白质组时代的重要工作。 1 0 参考文献： 【l 】n o w a k e n t e r i n gt h ep o s t g e n o m ee r a s c i e n c e ，1 9 9 5 ，2 7 0 ：3 6 8 3 7 1 【2 】c h a i rbt t r a w l i n gf o rp r o t e i ni nt h ep o s t - g e n o m ee r a n a t u r eb i o t e c h , 19 9 6 ，1 4 ：15 4 4 3 】f i e l d ss p r o t e o m i c si ng e n o m e l a n d s c i e n c e ，2 0 0 1 ，2 9 1 ：1 2 2 1 - 1 2 2 4 闱p e n n i s ie w h a t sn e x tf o rt h eg e n o m ec e n t e r s ? s c i e n c e ，2 0 0 1 ，2 9 1 ：1 2 0 4 - 1 2 0 7 【5 】a l b e r t sb t h ec e l la sac o l l e c t i o no fp r o t e i nm a c h i n e s ：p r e p a r i n gt h en e x tg e n e r a t i o no f m o l e c u l a rb i o l o g i s t s c e l l19 9 8 ，9 2 ：2 91 - 2 9 4 【6 】a b b o t ta a n dn o wf o rp r o t e o m e n a t u r e ，2 0 01 ，4 0 9 ：7 4 7 【7 】t y e mm ，m a n nm f r o mg e n o m i c st op r o t e o m i c s n a t u r e2 0 0 3 ，4 2 2 ：19 3 19 7 【8 】叶胜能，梁琼麟，罗国安。化学基因组学研究进展及其应用。中国天然药物，2 0 0 4 ，2 ：6 5 6 9 【9 】钱小红，贺福初，蛋白质组学：理论与方法( 第一版) ，北京：科学出版社，2 0 0 4 ，1 3 0 1 3 1 【1 0 】r m t w y m a n 著，王恒棵，袁静，刘先凯等译，蛋白质组学原理( 第一版) ，北京： 化学工业出版社，2 0 0 7 ，1 5 2 1 5 6 【l l 】h i t t ok j a m e seb ，m a r t i neu s eo fa n u b o d i e sf o rd e t e c t i o no fp h o s p h o p r y l a t c dp r o t e i n s s e p a r a t e db yt w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s p r o t e o m i c s ，2 0 0 1 ，1 ：1 9 4 1 9 9 【1 2 c o h e net h er e g u l a t i o no fp r o t e i nf u n c t i o nb ym u l t i s i t ep h o s p h o r y l a t i o n - a2 5y e a ru p d a t e t r e n d sb i o c h e m s c i 2 5 ：5 9 6 - 6 01 【1 3 b i a l yl ，w a l d m a n nh 1 n h i b i t o r so fp r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e s ：n e x t - g e n e r a t i o nd r u g s a n g e w c h e m i n t e d2 0 0 5 ，4 4 ：3 81 4 - 3 8 3 9 【1 4 l ij ，y e nc ，l i a wd ，e ta 1 p t e n ，ap u t a t i v ep r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s eg e n em u t a t e di n h u m a nb r a i n ，b r e a s t , a n dp r o s t a t ec a n c e l s c i e n c e , 19 9 7 ，2 7 5 ：19 4 3 19 4 7 【15 a d a mm c c l u s k e y , a l i s t a i rt i ls i m , j e n n e t t ea s a k o f f s e r i n e - t h r e o n i n ep r o t e i n p h o s p h a m s ei n t u b i t o r s ：d e v e l o p m e n to fp o t e n t i a lt h e r a p e u t i cs t r a t e g i e s j m e d c h e m ， 2 0 0 2 ，4 5 ：1 1 5 1 - 1 1 7 5 【1 6 b a r f o r dd c o l w o r t hm e d a lk c t u 把s t r u c t u r a ls t u d i e so f r e v e r s m l ep r o t e i np h o s p h o r y l a f i o n a n dp r o t e i np h o s p h a t a s e s b i o e h e ms o ct r a n s ，19 9 9 ，2 7 ( 6 ) ：7 514 6 6 【1 7 l a n d e re s ，l i n t o nl m ，b i t t e nb ，e ta 1 i n i t i a ls e q u e n c i n ga n da n a l y s i so f t h eh u m a ng e n o m e n a t r u e ，2 0 01 ，4 0 9 ：8 6 0 - 9 21 【l s m i c h a e ld j a c k s o n ，j o h nm d e n u m o l e c u l a rr e a c t i o n so fp r o t e i np h o s p h a t a s c s i n s i g h t s f r o ms t r u c t u r ea n dc h e m i s t r y c h c mr e v 2 0 0 1 ，1 0 1 ：2 3 1 3 - 2 3 4 0 【1 9 b r i d g e s a c h e m i c a li n h i b i t o r so f p r o t e i nk i n a s e s c h e m r e v2 0 0 1 ，1 0 1 ：2 5 4 1 - 2 5 7 1 【2 0 1 s c a p p a t i c c ifa m e c h a n i s m sa n df u t u r ed i r e c t i o n sf o ra n g i o g e n e s i s - b a s e dc a n c e rt h e r a p i e s jc l i no n c o l2 0 0 2 ，2 0 ：3 9 0 6 3 9 2 7 【21 1 i n g e b r i t s e nts ，c o h e nep r o t e i np h o s p h a t a s e s ：p r o p e r t i e sa n dr o l ei nc e l l u l a rr e g u l a t i o n s c i e n c e1 9 8 3 ，2 2 1 ：3 3 1 - 3 3 8 【2 2 k e r b e lk f o l k m a nj c l i n i c a lt r a n s l a t i o no fa n g i o g e n e s i si n h i b i t o r s n a t r e v c a n c e r2 0 0 2 ， 2 ：7 2 7 - 7 3 9 【2 3 d e p a o l i r o a c haa ，p a r kikc c r o v s k yvs e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i np h o s p h a t a s e si nt h e c o n t r o lo fc e l lf u n c t i o n a d ve n z y m er e q u l19 9 4 ，3 4 ：19 9 - 2 2 4 【2 4 n e c lbq t o n k snkp r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e si ns i g n a lt r a n s d u c t i n c u r r o p i n c e l l c h e m1 9 9 7 ，9 ：1 9 3 2 0 4 【2 5 方红，刘永学编译，蛋白酪氨酸磷酸酶：治疗前景，国外医学药学分册2 0 0 2