（药剂学专业论文）血管活性肠肽鼻腔喷雾剂的研究.pdf

删目录血管活性肠肽鼻腔喷雾剂的研究血管活性肠肽鼻腔喷雾剂的处方前研究与方法”1 0附图15附表“1 9讨论2 1小结2 1参考文献2 2第二部分v i p 鼻腔喷雾剂鼻粘膜纤毛毒性的研究前言“2 3刖看”2 3材料与方法2 3结果”2 8附图3 0附表”3 3讨论“3 5小结3 6参考文献3 7第三部分v i p 鼻腔喷雾剂鼻粘膜吸收的研究前言3 8刖舌”3 8材料与方法3 8结果”4 2附i 药”4 4附表5 0讨论51小结”5 2参考文献5 3第四部分v i p 鼻腔喷雾剂药效学的研究前言”5 4日吾”5 4材料与方法5 5结果“5 8i 村图6 0讨论6 3小结”6 4参考文献6 5第五部分v i p 鼻腔喷雾剂的毒性考察前言“6 6刖舌“6 6材料与方法6 6结果”6 9附图7 0附表7 5讨论7 8d 、结7 8参考文献7 9结论8 0综述鼻腔给药的研究进展8 2致 射9 0个人简历“9 1中文摘要血管活性肠肽鼻腔喷雾剂的研究摘要目的：随着社会老龄化程度的增加，神经退行性疾病已严重影响老年人的生活质量，同时给社会及家庭带来很大的压力和负担。老年性痴呆的重要病理类型就是阿尔茨海默症( ，据统计全世界a d 患者已超过2 0 0 0万。但由于脑组织的天然生理屏障一血脑屏障( b l o o d b r a i nb a r r i e r ，b b b )的存在，使9 8 以上强有力的药物无法通过血脑屏障靶向于脑，发挥中枢治疗作用。鼻腔与脑组织间存在着解剖学上的直接联系，鼻腔给药后部分药物可经嗅粘膜吸收进入嗅球或脑脊液，从而绕过b b b 直接转运入脑，发挥中枢治疗作用。因此鼻腔给药是以非侵入性的给药方式提高药物的脑内递释，具有安全、有效、便捷的特点。血管活性肠肽( v a s o a c t i v ei n t e s t i n a lp e p t i d e ，v i a ) 是一种含2 8 个氨基酸的神经肽，具有显著的促进记忆和智力的作用，本文结合v i p 的理化性质和鼻腔给药的特点，制备一种使用方便，患者顺应性好，起效快，局部用药刺激性小的鼻腔给药剂型，为该药的临床应用提供依据。方法：本文首先采用h p l c 方法，对v i p 在不同p h 值、不同离子强度溶液、温度以及人工胃液和人工肠液中的稳定性进行了考察，对v i p的生物学及化学稳定性进行了初步的了解，为v i p 的制剂学研究奠定基础。采用蟾蜍上颚粘膜为模型，考察了v i p 主药，不同种类的壳聚糖、吸收促进剂及防腐剂对鼻纤毛运动的影响，采用在体蟾蜍上颚粘膜法对不同吸收促进剂的v i p 鼻腔喷雾剂进行了处方筛选。采用大鼠在体鼻腔循环灌流法，对不同浓度的壳聚糖和不同种类的吸收促进剂对v i p 在大鼠鼻腔中的吸收促进作用进行了考察，最终确定处方。采用a 1 3 2 5 3 5 侧脑室注射诱导a d 动物模型，通过v i p 不同给药方式，由m o r r i s 水迷宫实验评价该给药系统对小鼠空间记忆障碍的改善作用。最后，从对家兔眼部刺激性、大鼠鼻纤毛形态及大鼠鼻粘膜组织切片几方面对v i p 鼻腔喷雾剂的安全性进行了评价，为该制剂的应用提供依据。结果：研究的结果表明，v i p 的化学稳定性具有p h 依赖性，v i p 在酸性及中性条件下稳定，p h 7 时几乎无降解，但v i p 在碱性条件下不稳中文摘要定，p h _ 1 3 时3 0 m i n 已完全降解。此外，离子强度对其稳定性无影响。v i p 的化学稳定性同时具有温度依赖性，冷冻条件下稳定。另一方面，v i p的生物学性质不稳定，在人工胃液和人工肠液中极易被降解，所以不适于口服给药。纤毛毒性实验结果表明，药物对蟾蜍上颚粘膜纤毛运动没有影响，吸收促进剂纤毛毒性大小顺序为：e d t a ( o 1 0 0 ) p e g 4 0 0 0 ( 2 5 ) h p p c d ( 5 ) 1 3 c d ( 2 ) ，通过筛选防腐剂选择三氯叔丁醇。基质选择毒性较小的壳聚寡糖，基质在低浓度时纤毛毒性较小，随着浓度的增加纤毛毒性随之增大。用在体法对四种不同处方纤毛毒性进行了考察，四种不同处方纤毛毒性大小顺序为：p - c d ( 2 ) 处方 i - i p p c d ( 5 ) 处方e d t a ( 0 1 ) 处方 o 0 5 ) 。考察了壳聚对p 的促吸收作用，结果表明随着壳聚糖浓度增加v i p 的吸收速率常数( 目也随之升高，而且对鼻腔吸收速率常数( k ) 使用q 检验进行两两比较，彼此之间都存在显著性差异( p o 0 5 ) ，壳聚寡糖对v i p 的鼻腔吸收有明显的促进作用，并筛选了壳聚糖最佳用量为1 5 。考察了i b - c d 、h p d c d 与壳聚糖合用的促吸收效果，吸收速度常数( k )分别为0 0 0 7 7 和0 0 0 9 8 ，比单纯的同浓度v i p 水溶液分别提高了7 倍和9 倍，最终确定h p b c d ( 5 ) 为p 鼻腔喷雾剂的吸收促进剂。m o r r i s 水迷宫实验结果表明空白模型组小鼠表现出明显的空间记忆障碍特征，与正常对照组存在显著性差异，说明老年痴呆模型建模成功；皮下注射及鼻腔给予v i p 水溶液，随训练天数的增加，小鼠潜伏期并没有明显缩短的趋势，结果和空白模型组无统计学差异；以4 0 p g m l 的剂量鼻腔给予v i p 鼻腔喷雾剂后，小鼠的空间记忆有所改善，却与模型组无统计学差异；以2 0 0 p g m l 的剂量鼻腔给予鼻腔喷雾剂后，对小鼠的空间记忆障碍起到了明显的改善作用，实验结果和正常对照组无显著性差中文摘要异，说明该给药系统可有效的增加v i p 的入脑量，对小鼠中枢胆碱能系统发挥了一定的保护作用。毒性实验结果表明，该制剂刺激性积分为1 3 7 5 分，在o 3 分之间，按照眼部刺激性评价标准刺激程度属于无刺激性，给药一周后，大鼠鼻粘膜下少量的炎性细胞浸润，鼻纤毛完整，只有轻微的毒性，而且损伤可逆，v i p 鼻腔喷雾剂基本安全可靠。结论：本研究制备的v i p 鼻腔喷雾剂处方设计合理，性能稳定，鼻腔给药安全性评价其毒性较小，并且对鼻粘膜的损伤可逆，本剂型使用方便，药效学实验表明药效可靠，基本达到了实验设计的目的。关键词：v i p ；鼻腔喷雾剂；壳聚糖；纤毛毒性；大鼠鼻腔在体循环实验；a p 2 5 - 3 5 ；m o r r i s 水迷宫实验英文摘要s t u d yo nn a s a ls p r a yo fv a s o a c t i v ei n t e s t i n a lp e p t i d ea b s t r a c to b j e c t i v e ：w i t hi n c r e a s i n go ft h ep o p u l a t i o no ft h ea g e dp e r s o n ，m a n yb r a i nd i s e a s e sh a v eb e c o m eas e r i o u se f f e c tt ot h eq u a l i t yo fa g e dp e r s o n s l i f ea n di th a sb r o u g h tg r e a tp r e s s u r ea n db u r d e nt os o c i a la n df a m i l y a l z h e i m e r sd i s e a s ei sav e r yi m p o r t a n tp a t h o l o g yt y p eo fs e n i l ed e m e n t i aa n da c c o r d i n gt os t a t i s t i c s ，t h e r ea r em o r et h a n2 0m i l l i o np a t i e n t ss u f f e r i n gf r o ma d 9 8p e r c e n to ft h ed r u gd e l i v e r yi n t ot h eb r a i ni sm a d ed i f f i c u l tb yt h ep r e s e n c eo ft h eb l o o d - b r a i nb a r r i e r ( b b b ) ，w h i c hi st h en a t u r a lp h y s i c a lb a r r i e r so fb r a i n i na n a t o m y ，t h e r ei sad i r e c tl i n kb e t w e e nn a s a la n db r a i n ，a f t e ri n t r a n a s a la d m i n i s t r a t i o ns o m eo ft h ed r u g sc a l lb ea b s o r b e db yt h en a s a lm u c o s ai n t ot h eo l f a c t o r yb u l bo re e r e b r o s p i n a lf l u i da n dd r u g sc a nb y p a s st h eb b bt ot h eb r a i n b yt h a tw a yd r u g sc a nc u r ed i s e a s e so fc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m t h e r e f o r e ，i n t r a n a s a la d m i n i s t r a t i o ni san o n i n v a s i v ew a yt oi m p r o v et h eb r a i nd e l i v e ro fd r u g ，i ti ss a f e ，e f f e c t i v ea n dc o n v e n i e n t v a s o a c t i v ei n t e s t i n a lp e p t i d e ( v i p ) w h i c hi san e u r o p e p t i d ec o m p o s e do f2 8a m i n oa c i d sh a sas i g n i f i c a n te f f e c ti np r o m o t i n gm e m o r ya n di n t e l l i g e n c e c o m b i n i n go ft h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t yv i pa n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fn a s a la d m i n i s t r a t i o n ，w ep r e p a r ean a s a ld r u gd e l i v e r ys y s t e mw i t he a s yu s i n g ，g o o dp a t i e n tc o m p l i a n c e ，t a k i n ga c t i o nq u i c k l ya n dl i t t l ec i l i o t o x i c i t y , p r o v i d i n ge v i d e n c ef o rt h ec l i n i c a la p p l i c a t i o n s m e t h o d s ：t h es t a b i l i t yo fv i pi nd i f f e r e n tp hv a l u e s ，i o n i cs t r e n g t h ，t e m p e r a t u r e ，a r t i f i c i a lg a s t r i cf l u i da n da r t i f i c i a li n t e s t i n a lf l u i dw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fv i p w a sc a l c u l a t e db yh p l cm e t h o d t op r o v i d et h et h e o r yb a s i sf o rt h ef o r m u l a t i o nd e v e l o p m e n to fv mt h ec h e m i c a la n db i o l o g i c a ls t a b i l i t yo fv i pw e r es t u d i e d t h ee f f e c t so fv i p 、i f f e r e n tk i n d so fc h i t o s a n 、a b s o r p t i o ne n h a n c e r sa n dp r e s e r v a t i v e s0 1 1m u c o c i l i a r ym o v e m e n tw e r ee x a m i n e du s i n gt h et o a dp a l a t em o d e l w ee x a m i n e dt h ee f f e c to fd i f f e r e n tv i pn a s a ls p r a yw i t hv a r i o u sa b s o r p t i o n4m e t h o d sw a su s e da sa l le x p e r i m e n t a lm o d e lt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a na n da b s o r p t i o ne n h a n c e r so nt h er e g u l a t i o no fn a s a la b s o r p t i o no fv i p m i c ew e r ei n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a ri n j e c t e dw i t ht h ea g g r e g a t e da 3 2 5 35t om i m i ca d t h es p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o r yc a p a c i t i e so fm i c ew e r em e a s u r e db yt h em o r r i sw a t e rm a z ep r o c e d u r ev i ad i f f e r e n td m s t r a t i o n so fv i p t op r o v i d et h eb a s i sf o rt h ea p p l i c a t i o no ft h ep r e p a r a t i o n ，t h et o x i c i t yo fv i pn a s a ls p r a yw a ge v a l u a t e di ni r r i t a t i o no fr a b b i te y e s ，m o r p h o l o g yo fr a tn a s a lm u c o s ac i l i u ma n dp a t h o l o g yo fr a tn a s a lm u c o s a or e s u l t s ：t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t a b i l i t yo fv i pw a sp h d e p e n d e n t pw a ss t a b l ei na c i da n dn e u t r a ls o l u t i o n ，a n da l m o s td i d n td e g r a d ed u r i n gp h _ 7s o l u t i o n h o w e v e r , i tw a si n s t a b i l i t yi nb a s i cs o l u t i o na n dd e g r a d e dc o m p l e t e l ya t30 m i ni np i ll3s o l u t i o n i o n i cs t r e n g t hd i dn o ta f f e c ti t ss t a b i l i t y v i p w a ss t a b l ei nf r e e z i n gc o n d i t i o n sb u ti td e g r a d e da tl o wc o n c e n t r a t i o ni nc o l ds t o r a g e f u r t h e r m o r e ，pw a sd e g r a d e ds oq u i c k l yi na r t i f i c i a lg a s t r i cf l u i da n da r t i f i c i a li n t e s t i n a lf l u i dt h a ti tw a sn o ts u i t a b l ef o ro r a la d m i n i s t r a t i o n t h ee f f e c to fv i pa n ds o m ee x c i p i e n t so nm u c o c i l i a r ym o v e m e n tw e r ee x a m i n e d v i ps h o wn ot o x i c i t yt ot h ec i l i a r ym o v e m e n t t h eo r d e ro fc i l i o t o x i c i t yo fa b s o r p t i o ne n h a n c e r sw a se d t a ( 0 1 ) p e g 4 0 0 0 ( 2 5 ) li p - 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o r d e rk i n e t i c s t h el i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nr e m a i n e dv i pa n dt i m ew a sg o o d i tw a ss h o wt h a ti n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fv i pd i dn o tc a u s eag r e a tc h a n g eo ft h ev i pn a s a la b s o r p t i o nr a t ec o n s t a n t s ，m e a n w h i l ee a c hp o i n td i dn o th a v es t a t i s t i c sd i f f e r e n c e t h er e s e a r c ho ft h ee n h a n c i n ga b s o r p t i o ne f f e c to fc h i t o s a ns h o w e dt h a ti n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a na d d e dt h e v 【pn a s a la b s o r p t i o nr a t ec o n s t a n t s ，m e a n w h i l ee a c hp o i n th a ds t a t i s t i c sd i f f e r e n c e c h i t o s a ni n c r e a s e dn a s a la b s o r p t i o no fv i pa n dt h eb e s tc o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a nw a s1 5 w ea l s or e s e a r c ht h ee n h a n c i n ga b s o r p t i o ne f f e c tw h e np - c da n dh p - p c dc o m b i n e dw i t hc h i t o s a n t h en a s a la b s o r p t i o nr a t ec o n s t a n t so fv i pw a s0 0 0 7 7a n d0 0 0 9 8 c o m p a r ew i t ht h es a m ec o n c e n t r a t i o no fv i p ，t h en a s a la b s o r p t i o nr a t ec o n s t a n t so fv i pw a si n c r e a s e db y7t i m e sa n d9t i m e s e v e n t u a l l yw es e l e c t e dh p - 1 3 - c d ( 5 ) t ob et h ee n h a n c i n ga b s o r p t i o no ft h en a s a ls p r a yo fv i ei nt h em o r r i sw a t e rm a z ep e r f o r m a n c et h ea p 2 5 35c o n t r o lg r o u ps h o w e dd e f i c i t s i ns p a t i a lm e m o r y t h ea 1 3 2 5 35c o n t r o lg r o u ph a ds i g n i f i c a n t l yl o n g e re s c a p el a t e n c yc o m p a r e dw i t ht h en o r m a lc o n t r o lg r o u pm i c ea n di ti m p l i e dt h em e t h o do fe s t a b l i s h m e n to fa dm i c ew a sf e a s i b l e s u b c u t a n e o u sa d m i n i s t r a t i o na n di n t r a n a s a la d m i n i s t r a t i o no fv i ps o l u t i o ns h o w e dn oe f f e t eo ni m p r o v e m e n t si ns p a t i a lm e m o r ya n dc o m p a r e dw i t ht h ea p 2 5 - 35c o n t r o lg r o u pt h ee s c a p el a t e n c yd i dn o th a v es t a t i s t i c sd i f f e r e n c e i n t r a n a s a la d m i n i s t r a t i o no fv i pn a s a ls p r a y ( 4 0 i - t g m 1 ) s h o w e dg o o de f f e c ti ns p a t i a lm e m o r yb u tc o m p a r e d 、i n lt h ea 3 2 5 - 3 5c o n t r o lg r o u pt h ee s c a p el a t e n c yd i dn o th a v es t a t i s t i c sd i f f e r e n c e n t r a n a s a la d m i n i s t r a t i o no fv i pn a s a ls p r a y( 2 0 0 肛g m i ) i m p r o v e dt h ed e f i c i t si ns p a t i a lm e m o r ya n dc o m p a r e dw i t ht h en o r m a lc o n t r o lg r o u pt h ee s c a p el a t e n c yd i dn o th a v es t a t i s t i c sd i f f e r e n c e i ts u g g e s t e dt h a tt h ea d m i n i s t r a t i o ns y s t e mc a l le n h a n c et h eq u a n t i t yo fv i pe n t e r i n gi n t ot h eb r a i na n di tc a l la l s op r o t e c tt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e mo fm i c e t h er e s e a r c ho ft o x i c i t ys h o w e dt h a tt h es c o r eo ft h ep r e p a r a t i o nw a s1 37 5 a c c o r d i n gw i t ht h es t a n d a r do ft o x i c i t yt h ep r e p a r a t i o nh a dn o6c u r a t i v ee f f e c ti sr e l i a b l e ，w h i c hb a s i c a l l ym e tt h ea i mo ft h i ss t u d y k e yw o r d s ：v a s o a c t i v ei n t e s t i n a lp e p t i d e ( p ) ；n a s a ls p r a y ；c h i t o s a n ；c i l i o t o x i c i t y ；r a ti ns i t un a s a lp e r f u s i o nm e t h o d ；a 1 8 2 5 35 ；m o r r i sw a t e rm a z et e s t i n g 研究论文血管活性肠肽鼻腔喷雾剂的研究引言中枢神经系统( c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，c n s ) 的疾病包括脑肿瘤、中枢神经系统感染、慢性疾病、药物成瘾、癫痫、周期性偏头痛、神经变性疾病、精神分裂症和中风疾病等。在中枢神经系统的疾病中老年性痴呆的发病率正呈逐年上升的趋势，阿尔茨海默症( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 是老年性痴呆的重要病理类型之一。据统计，我国有1 2 9 亿人口超过6 0 岁，老年性痴呆患病率约占6 0 岁人口的1 0 左右，其中a d 患者占5 左右，估计已有约6 4 5 万。随年龄每增加5 岁，a d 的患病率将增加两倍，在8 0 8 5岁的病人中有2 0 的老年人患有老年性痴呆，是继心脏病、肿瘤和脑卒中之后的第四位死因，给患者家庭、社会造成了很大的压力及负担。血脑屏障( b b b ) 是存在于血液和脑组织间的一层屏障系统，它对于维系脑内环境的相对恒定十分重要，但同时也是药物进入脑组织发挥治疗作用的主要屏障，9 8 以上强有力的药物无法通过血脑屏障，而不能靶向脑部达到治疗效果。穿透b b b 设计的方案有手术植入、载体机制、渗透作用、前药原理等，但均不太理想。鼻腔与脑组织间存在着解剖学上的直接联系：鼻腔的嗅粘膜上皮含双极嗅细胞，由其形成的嗅神经穿过筛板进入中枢神经系统的嗅球，因此，鼻腔给药后部分药物可经嗅粘膜吸收进入嗅球或脑脊液，从而绕过b b b直接转运入脑，发挥中枢治疗作用。因此鼻腔给药是以非侵入性的给药方式提高药物的脑内递释，具有安全、有效、便捷的特点，已经成为脑内靶向给药研究的热点之一。血管活性肠肽( v i p ) 是一种含2 8 个氨基酸的神经肽，具有显著的促进记忆和智力作用，但其体内稳定性差，容易被蛋白水解酶降解破坏，从而失去活性，且不易透过b b b ，临床应用受到很大限制。鼻腔给药与口服剂注射给药相比，可以避免胃肠道的破坏，避免肝脏的首过效应，药物吸收迅速，起效快，患者顺应性好，综上所述鼻腔给药适用于v i p 此类作用于中枢神经体统的大分子蛋白多肽类药物。v i p 鼻腔给药也同样存在很多问题，主要是该类药物分子量大，透粘膜吸收能力差；而且稳定性不佳，鼻腔给药易受鼻腔内酶降解；又易被鼻纤毛清除，因而入脑量很低，无法达到有效的临床剂量。因此，提高多肽研究论文蛋白药物的稳定性，增加其透膜吸收已经成为该类药物经鼻腔入脑的一个关键问题。壳聚糖具有生物黏附性、促吸收作用和消炎作用，同时还是一种优良的酶抑制剂。本研究即选用壳聚糖作为载体材料，首先对v i p 的生物学及化学稳定性进行了研究，考察了药物及辅料的纤毛毒性，然后采用大鼠鼻腔在体灌流法，考察了吸收促进剂对v i p 的促吸收作用；采用m o r r i s水迷宫法对v i p 鼻腔喷雾剂进行了药效学的评价，最后研究了制剂的毒性。本研究为v i p 鼻腔给药系统的开发打下基础，为蛋白多肽类药物鼻腔给药提供思路。研究论文第一部分血管活性肠肽鼻腔喷雾剂的处方前研究- t 刍莉吾本章对血管活性肠肽在不同p h 值( 2 o 、4 o 、7 o 、9 o 、1 1 o 、1 3 o ) 、不同离子强度溶液、温度以及人工胃液和人工肠液中的稳定性进行了考察，对血管活性肠肽的生物学及化学稳定性进行了初步的研究，确定了血管活性肠肽的储存方式和影响血管活性肠肽稳定性的主要因素，为v i p的制剂学研究提供依据。材料与方法1 仪器与试药1 1 仪器p 5 8 0 型高效液相色谱仪美国戴安公司c 1 8 色谱柱( 1 u n ac 1 8 柱，2 5 0 4 6 m m ，5 1 a m )美国p h e n o m e n e x 公司u 3 0 1 0 紫外分光光度计日本日立公司f 3 3 酸度测定仪北京屹源电子仪器科技公司7 8 1 磁力加热搅拌器金坛市岸头国瑞实验仪器厂2 r s 71 万分析天平德国s a t r i o u s 公司真空恒温干燥箱天津市鑫洲科技有限公司1 2 药品与试剂血管活性肠肽( 纯度9 9 )胃蛋白酶三氟乙酸( 纯度9 9 )胰蛋白酶( 化学纯)盐酸氢氧化钠甲醇( 色谱纯)北京奥科生物技术有限责任公司美国s i g m a 公司o r g 脚c s国药集团化学试剂有限公司北京化工厂北京化工厂美国f i s h e r研究论文乙腈( 色谱纯)美国f i s h e r2 1 血管活性肠肽h p l c 分析方法的建立2 1 1 血管活性肠肽检测波长的确定精密称取v i p 适量，配制浓度约为2 0 嵋m l 。1 溶液，将该溶液在2 0 04 0 0 n m 范围内进行紫外全波长扫描，确定v i p 检测波长。2 1 2 色谱条件色谱柱：p h e n o m e n e xl u n ac 1 8 柱( 2 5 0 x 4 6 m m ，5 p m ) ；流动相：乙腈：o 1 三氟乙酸( 体积比2 6 5 ：7 3 5 ) ；检测波长：2 2 0 n m ；流速：l m l m i n ；柱温：2 0 ；进样量：2 0 山。2 1 3 专属性试验按照v i p 鼻腔喷雾剂处方( 参照第三部分) ，配制不含v i p 的空白鼻腔喷雾剂溶液，吸取3 0 0 j - d ，用流动相稀释至l m l ，另外用流动相配制浓度为5 0 岭m l 1 的v i p 溶液，上述两种溶液各进样2 0 山，记录色谱图，观察辅料在主药位置处有无色谱峰，对v i p 测定是否存在干扰。2 1 4 标准曲线的绘制精密称取v i pl m g ，置5 m l 量瓶中，加入流动相适量使溶解，定容，摇匀，配制浓度为2 0 0 “g m l q 的储备液，以流动相为溶剂配制成相当于浓度分别为9 、1 8 、3 6 、7 2 、9 0 、1 2 0 和1 5 0 p g m l q 的样品，分别吸取2 0 p l进样，记录色谱图。以峰面积对质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。2 1 5 精密度和重复性配制低( 9 1 x g m l 。1 ) 、中( 7 2 烬m l 1 ) 、高( 15 0 1 x g m l 。) 三个浓度的v i p 溶液，分别于o 、2 、4 、6 、8 h 和0 、l 、2 、3 、4 d 进行h p l c 测定，计算r s d 值，得日内，日间精密度。配制中浓度( 7 2 甥m l 。1 ) 样品，用h p l c 分析方法连续测定9 次，求得各结果之间的r s d 值为方法重复性。2 1 6 检测限和定量限信噪比分别为3 ：1 和1 0 ：i 时计算v i p 浓度，得v i p 检测限和定量限2 2 血管活性肠肽化学稳定性的考察研究论文2 2 1v i p 在不同p h 溶液中的稳定性取蒸馏水适量，以o 1 m 0 1 l 1 盐酸和o 1 m 0 1 l q 氢氧化钠调节溶液p h值分别为2 0 、4 0 、7 0 、9 0 、1 1 0 、1 3 0 ，取2 5 0 9 9 m l _ 的v i p 溶液适量，用系列p h 溶液分别稀释成每l m l 含有v i p2 5 1 , t g 的样品，放置3 0 m i n 后测定其含量，每个样品平行操作三份，以剩余百分率对p h 值作图，观察降解趋势。2 2 2 不同离子强度对v i p 含量的影响由于v i p 等电点是9 8 2 ，含有两个酸性氨基酸和六个碱性氨基酸，当p h 值低于等电点时带有正电荷，考虑到不同离子强度可能对其含量有影响，所以对其进行了离子强度稳定性的考察。配制0 0 1 6 、0 0 3 2 、0 0 8 、0 2 和0 5 m o l l 。1 的磷酸二氢钠溶液，用0 1 m o l l 叫氢氧化钠调节p h 至5 o ，取2 5 0 1 t g m l 。1v i p 水溶液5 0 0 1 d 用不同浓度的磷酸二氢钾溶液稀释至5 m l ，放置3 0 m i n ，进样检测，每个样品平行操作三份，以剩余百分率对离子强度作图，观察降解趋势。2 2 3 不同温度对v i p 化学稳定性的影响配制高( 1 0 0 9 9 m l q ) 、中( 2 5 1 t g m l 。1 ) 、低( 1 2 5 p , g m l 。) 三种浓度的v i p水溶液，分别置于冷藏( 6 8 ) 和冷冻( 2 0 ) 条件下保存，于不同时间点取样检测，与o 天的h p l c 峰面积相比较，观察其降解趋势。2 3v i p 的生物学稳定性主要考察v i p 在人工胃液和人工肠液中的稳定性。2 3 1 人工胃液和人工肠液的配制人工胃液的配制：人工胃液的配制：取稀盐酸1 6 4 m l 加水约8 0 0 m l与胃蛋白酶1 0 9 摇匀后，加水稀释至1 0 0 0 m l 即得。人工肠液的配制：取磷酸二氢钾6 8 9 加水5 0 0 m l 使溶解；加o 1 m o l l1 氢氧化钠溶液调节p h 值至6 8 ，另取胰酶1 0 9 ，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1 0 0 0 m l 即得。2 3 2v i p 的生物学稳定性的检测方法精密称取v i p 约1 0 m g ，用蒸馏水配制成2 5 0 1 , t g m l 。溶液，作为母液备用，精密吸取5 0 0 9 l 母液分别用人工胃液和人工肠液稀释至5 m l ，3 7 。c水浴，于不同时间点取样2 0 0 1 d ，进样2 0 1 , d 检测，每个样品平行操作三份，观察其降解趋势。的测定没有干扰。1 3 标准曲线的建立血管活性肠肽在9 1 5 0 9 9 m l 。的线性范围内，浓度( c ) 与峰面积( a ) 线性关系良好，结果见f i g 3 。线性回归方程为：y = 0 1 18 7 x o 1 2 4 3 ，r = 0 9 9 9 91 4 精密度和重复性精密度实验结果见t a b l e l 、t a b l e 2 ，其日内日间精密度均小于2 ，表明该方法的稳定性良好。该方法的重复性r s d 值为1 7 ，小于2 ，重复性较好，符合要求。1 5 检测线和定量限信噪比分别为3 ：1 和1 0 ：1 时v i p 的浓度分别为v i p 的检测限和定量限，得p 检测限和定量限为3 6 0 n g m l 1 和9 0 0 n g m l 。2 血管活性肠肽化学稳定性的考察2 1v i p 在不同p h 溶液中的稳定性v i p 在不同p h 溶液中的稳定性试验结果见f i g 4 ，由f i g 4 可见v i p在不同p h 溶液中，随着p h 值的升高含量有所下降，在p h 2 7 范围内v i p 比较稳定，没有出现明显的降解，说明v i p 在偏酸性条件下较稳定，几乎无降解。在p h 7 1 1 范围内，v i p 出现缓慢降解，但当p h 值超过1 1时，v i p 降解速率显著增快，在p h = 1 3 时3 0 m i n 时已完全降解。因此v i p的稳定性具有p h 依赖性，提示v i p 在储存和制备过程中应尽量保持在偏酸性条件下。2 2 不同离子强度对v i p 含量的影响研究论文不同离子强度对p 含量的影响试验结果见f i g 5 ，由f i g 5 可见v i p在不同离子强度溶液中，随着离子强度的增加含量没有明显的变化，因此离子强度对v i p 的稳定性影响不大。2 3 不同温度对v i p 化学稳定性的影响在6 8 和2 0 。c 温度下对v i p 化学稳定性影响的试验结果见f i g 6 、f i g 7 由f i g 6 可知冷藏条件下( 6 8 。c ) v i p 的低浓度溶液不稳定，3 天含量即降解了3 0 ，但v i p 的中浓度和高浓度溶液较稳定，7 天含量仍在8 5 以上。由f i g 7 可知在冷冻条件下( 2 0 。c ) v i p 低、中、高三种浓度的溶液稳定性均良好，样品冷冻7 天时检测未显示明显的降解趋势。因此该药物的水溶液应该保存在冷冻条件下口3 血管活性肠肽生物学稳定性的考察v i p 在人工胃液和人工肠液中极短时间内就发生降解，以至于在0 m i n取样点也不能检测到v i p 主药。该实验结果与有关文献报道结果相符，根据有关文献报道n 3 可知，v i p在中性肽链内切酶、蛋白水解酶、类胰蛋白酶中均不稳定，v i p 多肽在7 8 ，2 5 2 6 位氨基酸连接处最容易断裂降解，而且降解碎片失去生物活性。实验结果说明v i p 在胃肠道中极容易被降解，所以不适合应用于口服给药系统。f i g 1t h eu l t r