（分析化学专业论文）金纳米通道膜用于dna检测和蛋白质分离的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 纳米通道技术作为生物纳米技术研究的重要内容之一和新的生长点，为生物 组分的有效分离和检测提供了一个新的手段。这种金纳米通道膜具有比表面积大、 纳米通道的尺寸可控等优点使得纳米通道在生物物质分离与检测等领域有广泛的 应用。以金纳米通道膜为载体，基于分子尺寸以及物质所带电荷的差异用于分离 小分子物质等在国外已经开展了大量的工作，而用于d n a 的检测和蛋白质的分 离等工作则相对较少。本文开展了以下几个方面的工作： 1 以聚碳酸酯膜为基底，采用化学沉积法，获得了沉积均匀的金纳米通道。 通过控制沉积金时的条件如温度、压力和时间等，可以控制金纳米通道的孑l 径。 采用盐酸和硝酸的混合酸溶液可将金纳米通道膜表面的大部分金颗粒去掉，并用 扫描电子显微镜和原子力显微镜为观察工具对金纳米通道膜的孔径以及表面金颗 粒处理后的金纳米通道膜进行了表征。 2 在金纳米通道膜内壁修饰探针d n a ，d n a 的存在对电解质离子在通道内 的迁移产生一定的阻碍。当待测液中存在目标d n a 的时候，目标d n a 与通道内 探针杂交，电解质离子在通道内的迁移进一步受阻，电解质离予在不同状态的通 道内的迁移特性可通过交流阻抗信号表现出来，借此实现对目标d n a 的检测。 3 采用戊二醛交链的方法在金纳米通道膜内修饰抗原，在u 型流通池的进样 池中加入特异性抗体和其他结构相似的抗体，在合适的通道孔径以及离子强度下， 对抗体进行选择性分离。当通道孔径相对抗体尺寸较大时。不同抗体主要依靠浓 度梯度作用实现在通道内的迁移，因而其迁移速率相差较小。当通道孔径相对抗 体尺寸较小时，特异性抗体在通道内主要依靠与抗原之间的特异性相互作用进行 迁移，而其它抗体则主要依靠浓度梯度的作用进行迁移，但迁移受阻比较明显， 因而特异性抗体在通道内的迁移速率要比其他抗体的迁移要快，从而实现特异性 抗体和其他抗体的选择性分离。 关键词：金纳米通道：d n a 蛋白质：分离：检测 金纳米通道用于d n a 的检测和蛋白质分离的研究 a b s t r a c t n a n o t u b u l et e c h n o l o g y , a san e w l yd e v e l o p e dm e t h o da n do n eo ft h e e m b r a n c h m e n t so ft h en a n o t e c h n o l o g y ，p r o v i d e san e ww a yf o rs e p a r a t i o na n d d e t e c t i o no ft h eb i o m a t e r i a l s t h ea un a n o t u b u l em e m b r a n ew i t hh u g es u r f a c ea r e a a n dc o n t r o l l a b l es i z eh a sb e e ne x t e n s i v e l yu s e di nt h ef i e l do fs e p a r a t i o na n d d e t e c t i o n m a n yp a p e r s o nt h e s e p a r a t i o n o fs m a l lm o l e c u l eb a s e do nt h ea u n a n o t u b u l em e m b r a n eh a sb e e nr e p o r t e d h o w e v e r ，t h e r ea r ef e wr e p o r t so nt h e d e t e c t i o no fd n aa n ds e p a r a t i o no fp r o t e i n s m a i nw o r ki nt h ep r e s e n tt h e s i sa r e s h o w na sf o l l o w s ： 1a uw a sd e p o s i t e dw i t h i nt h ep o r e so ft h ep o l y c a r b o n a t et e m p l a t em e m b r a n e u s i n ga ne l e c t r o l e s sd e p o s i t i o nm e t h o d t h es i z eo ft h en a n o p o r ec a nb ec o n t r o l l e d b yc h a n g i n gt h ec o n d i t i o no ft h ed e p o s i t i o n a ls o l u t i o n a n dt h ea un a n o p a r t i c a l so n t h es u r f a c eo ft h em e m b r a n ec a nb er e m o v e db ym i x e da c i do ft h eh y d r o c h l o r i ca c i d a n dn i t r i ca c i d s e ma n da f mw e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h ep o r es i z ea n dt h es u r f a c e a p p e a r a n c e - 2t h ep r o b ed n aw a sm o d i f i e do n t ot h ew a l lo ft h ea un a n o t u b u l e t h e t r a n s p o r to ft h ee l e c t r o l y t et h r o u g ht h en a n o t u b u l e sw o u l db ei m p e d e db yt h ep r o b e d n a w h e nt h et a r g e td n aw a sa d d e di nt h et e s ts o l u t i o n ，t h et r a n s p o r tp r o p e r t i e so f t h em e m b r a n ew o u l db ec h a n g e db e c a u s eo ft h eh y b r i d i z a t i o no ft a r g e ta n dp r o b e d n a i nt h ec a s eo fm i s m a t c h e dd n a ，t h et r a n s p o r tp r o p e r t i e so ft h em e m b r a n ew i l l n o tb ec h a n g e db e c a u s ei tw i l lb ew a s h e da w a yd u et on oh y b r i d i z a t i o no nt h e m e m b r a n e t h et r a n s p o r tp r o p e r t i e so ft h em e m b r a n ec a nb ec o n f i r m e db yt e s t i n gt h e e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) o ft h em e m b r a n e 3t h ea n t i g e nw a sm o d i f i e do n t ot h ei n n e rw a l lo fa un a n o t u b u l e sb y g l u t a r a l d e h y d ei n t e r l i n k i n gm e t h o d t h ea n t i b o d ya n dt h eo t h e rp r o t e i n sw e r ea d d e d i n t ot h er e s e r v o i ra n dt r a n s p o r t e dt h r o u g ht h en a n o t u b u l e sm o d i f i e dw i t ha n t i g e n w h e nt h ed i a m e t e ro ft h en a n o t u b u l ew a sl a r g ec o m p a r e dt ot h es i z eo ft h ea n t i b o d i e s ， t h et r a n s p o r ts p e e do ft h ep r o t e i n sw e r es i m i l a rt oe a c ho t h e r w h e nt h ed i a m e t e ro f t h en a n o t u b u l ew a ss m a l l ，t h et r a n s f e rs p e e do ft h ea n t i b o d yw i l lb ef a s t e rt h a no t h e r p r o t e i n sb e c a u s eo ft h et h ei n t e r a c t i o no ft h ea n t i g e n - a n t i b o d y s ot h ep r o t e i n sc a nb e s e p a r a t e db yu s i n gt h ea un a n o t u b u l em e m b r a n e k e yw o r d s ：g o l dn a n o t u b u l e ，d n a ，p r o t e i n ，s e p a r a t i o n ，d e t e c t i o n - i v - 硕士学位论文 常用英文缩略词表 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 审鳓 日期：妇6 年明幽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段可汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：事刍芳 t 导师签名： 域 日期：j w 二年泸月凶日 日期：& 幻年够月咖日配幻bp “刀 硕士学位论文 第1 章绪论 生物纳米技术已成为当前多学科交叉的前沿领域之一，目前美国、日本、4 德 国等科技强国已将纳米技术研究列入其国家重点发展领域。中国也将生物纳米技 术列入重点研究领域，国家“十五规划”、“8 6 3 计划”、“9 7 3 计划”和自然科 学基金均设立了纳米生物技术主题和重大项目。 在人类基因组探索过程中，采用了两种不同的测序和分析的方法：“霰弹法” 和“克隆法”。霰弹法是一个高度计算机化的方法，它是先把基因组随机分成 已知长度( 2 0 0 0 个碱基对、l 万个碱基对、5 万个碱基对) 的片段，然后用数学 算法将这些片段组装成毗邻的大段，并确定它们在基因组上的正确位景。其特点 是测序速度快，但后期需要大量的计算。而克隆法是先复制更大段的人类基因序 列，然后将它们绘制到基因组的适当区域，这种方法在早期集中了较多的时间和 精力放在克隆和绘制草图上“1 。 因此，如何快速、方便、准确可靠地获得有用的生物信息和数据，揭开生物 系统复杂性的面纱，是当今生命科学中的一个根本性问题。纳米通道的生物传感 技术是开展生物纳米技术研究的重要内容之一和新的生长点，也是解决这一问题 的有效方法之一。 纳米通道是指孔径为0 1 1 0 0 n m 的孔或管道结构( n a n o p o r e ，n a n o c h a n n e l ， n a n o t u b e 或n a n o t u b u l e ) 。由于这种纳米级结构的尺寸效应、高比表面积效应及管 道内外的特殊的物理化学性质，化学、材料学、生物医学等领域都将纳米通道作 为新的重要研究对象。在生物物质、化学小分子及手性分子的分离与检测、药物 输送、仿生离子通道开关的模拟等领域的研究过程中，纳米通道技术体现了巨大 的优越性及乐观的前景。 目前，涉及纳米通道技术的研究主要有：( 1 ) 生物性纳米通道，如细胞膜离 子通道、a 溶血素离子通道以及由核酸、多肽等自组装形成的跨膜离子通道等； ( 2 ) 材料性纳米通道，如碳纳米管、氧化铝纳米通道、聚合物纳米管和金纳米通 道等。研究的内容涉及通道的形成、理化性质、物质在通道内的传输规律、通道 状态的控制等相关的理论及应用。 1 1 生物性纳米通道 1 1 1 细胞膜离子通道 人们已经知道，大多数对生命具有重要意义的物质都是水溶性的，如各种离 子、糖类等，它们需要进入细胞，而生命活动中产生的水溶性废物也要离开细胞， 金纳米通道膜用于d n a 的检测和蛋白质分离的研究 它们出入的通道就是细胞膜上的离子通道。细胞膜离子通道的形成是：细胞膜是 由双层酯质膜构成，膜的细胞外与细胞内两侧均为亲水性，膜中间为疏水性。因此 亲水性离子不能自由通过细胞膜而进入细胞。细胞膜上的通道蛋白形成有选择性 开关的多次跨膜通道，这些通道蛋白几乎都与离子的转运有关，所以又称为离子 通道“3 。通道蛋白所介导的被动运输不需要与溶质分子结合，横跨膜形成亲水通 道，允许适宜大小的分子和带电荷的离子通过。 离子通道对被转运离子的大小与电荷具有高度的选择性，而且转运速率高，可 达1 0 6 个离子秒，其速率是己知任何一种载体蛋白的最快速率的1 0 0 0 倍以上“1 。 同时，离予通道的活性由通道开关两种构象所调节，并通过通道开关应答于适当的 信号。根据应答信号的差异，离子通道又分为电压门通道( v o l t a g e g a t e dc h a n n e l ) ， 其特点是细胞内或细胞外特异离子浓度或电位发生变化时其构象发生变化，“门” 打开；配体门通道( 1 i g a n d - g a t e dc h a n n e l ) ，特点是受体与细胞外的配体结合，引 起门通道蛋白发生构象变化，“门”打开：压力激活通道( s t r e s s a c t i v a t e dc h a n n e l ) “1 ，特点是细胞感受压力、摩擦力或剪切力等刺激，将信号转化为电化学信号， 引起细胞反应，“门”打开( 如图1 1 ) 。离子通道在神经元与肌细胞冲动传递过 程中起重要作用。如含羞革的闭叶反应，草履虫的快速转向运动，内耳听觉的感 应等都与离子通道有关u ，。 钾泄漏通道 k + l e a k i n g c h a n n e l 电压门控型通道 胞外配体门 v o l t a g e - g a t e d 控型通道 c h a n n e l e x t r a c e l l u l a r l i g a n d - g a t e d e h a n n e l 胞内配体门 控型通道 i n t r a c e l l u l a r l i g a n d - g a t e d c h a n n e l 压力激活 型通道 s t r e s s a c t i v a t e d c h a n n e l 图1 1 离子通道的几种类型 f i g 1 1t h es t y l e so ft h ei o n - c h a n n e l 膜片钳单通道记录技术通过分析通道离子电流的变化来研究离子通道已经被 广泛使用。1 9 7 6 年n e t h e r 和s a k m a n n ”3 采用膜片钳的单通道记录技术直接从生物 膜上记录了离子单通道电流。他们将玻璃微吸管与仅含几个通道、面积为平方微 米的蛙去神经肌膜封接起来，记录出p a 级的乙酰胆碱受体通道电流。1 9 8 7 年他们 改进的1 0 亿欧姆的高阻封接技术，大大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度，可 硕士学位论文 以测到l p a 的电流，1 “m 空间的分辨率“。 1 1 2 以溶血素离子通道 n 溶血素( a h l ) 是金黄色葡萄球菌分泌的一种毒素，人红细胞、血小板和 单核细胞等的细胞膜能结合a h l 水溶性单体，通过组装形成七聚体的跨膜通道。 1 9 9 9 年由美国加州大学的d e a m e r 和哈佛大学的b r a n t o n 所领导的研究小组共同提 出：七聚体的a h l 在磷酯双分子层上可形成直径在1 5 2 6 n m 左右的跨膜通道 ( n a n o p o r e ) 。口h l 通道形状类似于蘑菇( 见图1 2 ”6 3 ) 。 图1 2 植入在磷酯双层膜内的单个n 溶血素 f i g1 2 as i n g l eo t h lc h a n n e le m b e d d e di nal i p i db i l a y e r 卵h l 通道轴向长度为1 0 n m ，直径变化范围在1 5 - 4 6 n m 之间，通道口为2 6 n m ， 它通向较大的内腔，通道跨膜区是由1 4 条反向所叠链形成的圆筒，内部亲水，外 部疏水0 3 ，双链d n a 分子只能进入通道口，而直径为1 5 n m 的限制孔仅容许单链 d n a 通过。 舡h l 可在细胞膜和人工合成的脂膜上组装成跨膜通道，通道内由水溶液填 充，在中性p h 和高离子强度下保持开放。在中性p h 溶液中，在限制孔内有许多带 正电荷的赖氨酸环( k 1 4 7 ) 和带负电荷的谷氨酸( e 1 1 1 ) 环的带电残基，因而在 电解质溶液中伍h l 通道显示了欧姆特性，电导率与电解质离子浓度呈线性关系， 经校正，其电压和电流呈直线关系，且对阴离子具有较好的选择性“1 。在1m o l l k c l 溶液中，从反面( t r a n 8 ) 至顺面( c i s ) ( 图1 2 ) 施加1 2 0m v 的电压可产生1 2 0 p a 的稳定电流，而倒过来施加相同电压可产生约9 0 m a 的电流，远远大于相同条 件下只有几个p a 的其他生物通道。通道电流噪声的大小随溶液p h 值的变化而变 化， 这可能是由于通道孔内残基的可逆质子化作用使得通道的有效尺寸发生改 变，从而改变了溶液的电导。 金纳米通道膜用于d n a 的检测和蛋白质分离的研究 k a s i a n o w i c z 等”最早对多聚核苷酸分子通过抗- h l 通道的生物物理学特性 进行了研究，发现电场可以驱动单链d n a 和r n a 分子通过脂双层膜上直径为 2 6 n m 的离子通道，穿膜时形成延伸单链可部分阻断通道，造成离子电流的短暂下 降，而且其持续时间与多聚分子长度呈正比。研究证明这种纳米通道可用于快速区 分r n a 分子中的嘧啶和嘌呤部分”1 ”以及低拷贝长度和组成相似仅有序列差异的 无标记d n a 分子。1 将纳米通道和支持矢量机器( s u p p o r tv e c t o rm a c h i n e ) 相结合 可在毫秒级时间内分析d n a 发夹分子的特性，包括双链长度、单碱基错配和l o o p 环长度，如图1 3 “。 图1 3 发夹状d n a 分子对a - h l 的阻碍a ) 表示6 b p 的发夹状d n a 穿过q h l 时形成的电 流阻碍；b ) 为发夹状d n a 穿过c t - h l 时的分子模型 f i g t 3b l o c k a g eo f t h ea l p h a - h ln a n o p o r eb yad n ah a i r p i n t h eu p p e rp a n e l ( a ) s h o w sa c u r r e n tt r a c ec a u s e db yc a p t u r ea n dt r a n s l o c a t i o no fa6b pd n a h a i r p i nt h r o u g ht h ep o r e t h e l o w e rp a n e l ( b ) s h o w sam o l e c u l a rm o d e lo ft h e s ee v e n t s a h l 蛋白的内孔可以通过改变氨基酸顺序来进行修饰，或在内孔通过共价键 合和诱捕等方法进行功能基团的修饰。通过修饰，可以改变孔内部的几何、化学 硕士学位论文 或静电性质，从而更加灵敏地提供某些特殊分析物( 如核酸) 的传输机制。单链 d n a 片断经巯基化后可以键合到一h l 孔的内部来检测与之互补的靶d n a ”1 ， 由于修饰了短链单寡核苷酸基团，通道电流比未修饰时下降了3 0 “”。也可以在 小h l 孔内修饰其它基团。如将生物素分子通过一个共价键合在单体半胱氨酸1 0 6 基团上的3 4k d a 聚乙二醇( p e g ) 分子与a h l 孔门廊深处连接，修饰后的离子 电流下降约1 5 ”。 1 1 3由核酸、多肽等自组装形成的跨膜离子通道 直接利用核酸、多肽等进行自组装，可以模拟生物体系的结构与功能。1 9 9 3 年，美国s c r i p p s 研究所的g h a d i r i 教授“”合成了由d 和l 氨基酸组成的环八肽 c y c l o - ( l g i n - d - a l a l g l u - d a l a ) 2 - 】，并通过电镜观察到在结晶状态下形成的空 心管道结构，内径约为7a 。g h a d i r i 通过低温电镜( c r y o e l e c t r o nm i c r o s c o p y ) 和 电子衍射( e l e c t r o nd i f f r a c t i o n ) 分析还发现几种不带电荷的环肽，在结晶状态下 也能形成纳米管状组装体( n a n o t u b u l a ra s s e m b l i e s ) ，并观察到其环肽之间的距离 仅为4 8a 。通过荧光猝灭试验，n a s h l u n dj 等“钉发现这类环肽之间即使在水溶液 中也能形成氢键。与其它材料相比，环肽化合物易通过d 或l 氨基酸的侧链及其 数目的改变来调节纳米管的外表面性质和孔径大小。因此，选择适当的疏水侧链， 这类环肽能嵌入非极性的脂双层膜中进行自组装，形成跨膜离子通道。事实上， 这类环肽纳米管对k + 和n a + 离子的传输活性大于1 0 7 ( i o n s “) ，可与天然的短 杆菌肽( g r a m i c i d i n ) a 相比。同时，通过设计适当内径大小的环肽，可有效地传 输有机小分子，如葡萄糖和l 谷氨酸“”。因此，此类环肽有机纳米管有望在输送 药物分子中得到应用。 由于此类环肽纳米管在生物传感器( b i o s e n s o r ) 、光响应( p h o t o r e s p o n s i v e ) 和生物材料、药物缓释材料以及抗生素等领域有潜在的应用前景。因此，对结构 多样的环肽纳米管的研究也异常活跃。1 9 9 7 年苏黎士联邦高工的s e e b a c h 教授“6 合成了几类由b 氨基酸构成的环肽，并通过x 粉末衍射测定了晶体结构，发现它 们能自组装形成空心的纳米管。1 9 9 8 年g h a d i r i 等“”也合成了含色氨酸侧链的环 b 四肽，单通道电导测定表明其对k + 离子的传输率也能达到1 9 x 1 0 7 ( i o n s s o ) 。 另外，对含刚性双键的6 氨基酸形成的环三肽的晶体结构分析也表明能形成规整 的纳米管。有趣的是，大环多聚脲也能形成纳米管道。另外，由顺3 氨基酸环己 甲酸缩合而成的环六肽“”，其碳骨架在同一平面上，且酰胺的羰基和n h 键垂直 于大环平面。这些结构特征表明：此类环肽有望形成大孔径的有机纳米管道。最 近，有文献报道“”7 氨基酸与l 氨基酸能交替形成环六肽二聚体，并且此类t 氨 基酸组成的环肽具有自组装形成有机纳米管的倾向。 金纳米通道膜用于d n a 的检测和蛋白质分离的研究 1 2 材料性纳米通道 材料性纳米通道主要指在模板结构中沉积而得到的纳米管阵列。每一个纳米 管都是一个单通道，因此相对于生物性单通道，材料性纳米通道的选择能力大大 增强；另一方面，材料性纳米通道的刚性比单通道大，更适合于实际环境下的应 用；而且，材料性纳米通道修饰简单。因此，材料性纳米通道研究工作的开展具 有重要的实际意义。 i 2 1 碳纳米管 早在1 9 7 0 年，法国奥林大学( u n i v e r s i t yo fo r l e a n s ) 的e n d o 首次用气相生长 技术制成了直径为7 r i m 的碳纤维，但并没有对这些碳纤维的结构进行细致地评估 和表征。直到1 9 9 1 年，美国海军实验室预计了一种碳纳米管的电子结构，但当时 认为近期内不可能合成碳纳米管，因此文章未能发表。同年1 月，日本筑波的n e c 实验室的饭岛首次用高分辨电镜观察到了碳纳米管( c n t ) ，这些碳纳米管是多层 同轴管，也叫巴基管( b u e k yt u b e ) 。几乎同时，莫斯科化学物理研究所的研究人员 独立地发现了碳纳米管和纳米管束，但这些碳纳米管的纵横比很小。单壁碳纳米 管是由美国加利福尼亚地i b ma l m a d e n 公司实验室b e t h u n e 等人首次发现的。 1 9 9 6 年，美国著名的诺贝尔奖获得者斯莫利( s m a l l e y ) 等合成了成行排列的单壁碳 纳米管束，每一束中含有许多碳纳米管，这些碳纳米管的直径分布很窄。我国中 科院物理研究所解思深等人。们实现了碳纳米管的定向生长，并成功合成了超长 ( 毫米级) 纳米碳管。用高分辨电镜技术对碳纳米管的结构研究证明，多层纳米 碳管一般由几个到几十个单壁碳纳米管同轴构成，管间距为0 3 4 n m 左右。碳纳 米管的直径为零点几个纳米至几十纳米，每个单壁管侧面由碳原子六边形组成， 长度一般为几十纳米至微米级，两端由碳原子的五边形封顶。 碳纳米管的制备方法很多，如用碳棒作电极进行直流电弧放电法。”2 ”、碳氢 化合物热解法等口”1 。比利时的i v a n o v 等人扭5 1 通过乙炔在c o 或f e 等催化剂粒子 上热解长出几十纳米长的碳纳米管，有的为线圈形。1 9 9 6 年，瑞斯大学t a n s 和 s m a l l e y 等人“础通过在一个1 2 0 0 的炉中用激光蒸发碳靶；采用c o n i 作催化剂 获得了有序单壁碳纳米管束，由流动的a r 气将这些单壁碳纳米管束载入水冷的 c u 收集器。c h a r l e sr m a r t i n 等用化学气相沉积法在模板上也合成了碳纳米管” 如图1 4 。 硕士学位论文 图1 4 采用化学气相沉积法在模扳合成的碳纳米雷的s e m 成像 f i g 1 4s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p ho fc v dt e m p l a t e s y n t h e s i z e dc a r b o nn a n o t u b e s 碳纳米管( c n t ) 具有独特的电学与力学性质以及与金刚石相同的热导性质， 使得碳纳米管在传感器“3 “、微电极。“”3 、扫描探针显微镜( s p m ) 的针尖以及 复合材料的增强剂等领域都有广泛的应用。 1 2 2 氧化铝纳米通道 w o o d 和0 s u l l i v a n 认为氧化铝的孔型为圆形。”，多孔层的膜胞以六角形紧密 堆积排列，每个膜胞中心都有一个纳米级的微孔，孔大小均匀，彼此平行排布。 氧化物孔壁上存在着羟基，可以与一些有机基团结合而修饰到孔内壁，但h 2 0 、 o h 、h + 的含量 9 9 9 9 ) 为反应材 料，铝箔厚度一般在( o 1 1 ) m m 之间，通过阳极氧化法制得。主要步骤有。”： 高温退火( 可选) 一机械抛光( 可选) 一超声或化学去酯一去除自然氧化层一 化学抛光一阳极氧化一化学腐蚀去除剩余铝基一通孔及扩孔。 目前，利用氧化铝纳米通道膜作模板生长其他纳米材料已经得到了广泛的应 用。和传统的电子束刻蚀技术方法相比，用这种方法获得的纳米材料具有非常高 的纵横比，纳米材料的尺寸可控性以及很好的热稳定性，方法简单有效。以氧化 铝膜为模板，可以成功制备具有均一直径的金属臼“圳、金属合金口“、金属氧化物 ”“”1 、半导体h “1 和聚合物“”等纳米纤维、纳米棒、纳米线或纳米管。同时还可 以用氧化铝纳米通道膜为模板合成d n a 及蛋白质纳米通道“1 。 氧化铝纳米通道的纳米级孔径和直管状规则排列的特殊结构使其在分离方面 金纳米通道嚷用于d n a 的检测和蛋白质分离的研究 也有广阔的应用。例如在氧化铝纳米通道内修饰抗体蛋白，在p h 为8 0 的p b s 中加 入1 0 的二甲基亚砜( d m s o ) 作调节剂，利用抗体与药物4 - 【3 - ( 4 f l u o r o p h e n y l ) - 2 - h y d r o x y - 1 - i 1 ，2 ，4 】t r i a z o l - 1 y l p r o p y l - b e n z o n i t r i l e 的r s 型结构的特异性结合作用， 实现r s 型与s r 型分子的特异性分离( 图i 5 h 盯) ，当氧化铝纳米通道膜内径为3 5 r i m 时，分离系数为2 6 ，当内径减小至2 0 n m 时，分离系数可达4 5 。 图1 5 a ) 为手性药物的三维结构图，左边为r s 型对应异构体，右边为s r 型对应异构体”； b ) l i l 径为3 5 n m 的氧化铝基底膜表面的扫描电子显微镜成像 f i g 1 5a ) t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e so ft h ed r u ge n a n t i o m e r s ：r se n a n t i o m e r ( 1 e f t ) a n ds r e n a n t i o m e r ( r i g h t ) ；( b ) s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p ho ft h es u r f a c eo ft h ea l u m i n am e m b r a n e w i t hp o r e s3 5 n mi nd i a m e t e rb e f o r es o l g e ls y n t h e s i so ft h es i l i c an a n o t u b e s 另外，利用阳极氧化铝膜进行蛋白质及血液分离，大肠杆菌的截留，葡萄糖 的过滤等都有良好的效果。 1 2 3 聚合物纳米管 聚合物纳米管包括有导电聚合物纳米管和绝缘高分子聚合物纳米管。导电高 聚物纳米管和分子导线的合成与制备是制约实现纳米器件和分子器件的关键。“模 板合成”方法( t e m p l a t e s y n t h e s i sm e t h o d ) 是国际上制备导电高聚物纳米管和分 子导线的常用和有效的方法。利用电化学沉积可以在模板膜的孔内合成导电聚合 物，如聚吡咯、聚苯胺或聚3 甲基噻吩等“”。m a r t i n 等“”用电化学聚合法在模板 上合成了聚吡咯纳米管膜。具体方法是：首先在模板上涂上一层金属薄膜，然后 将其作为电极，浸入到含有吡咯单体和氧化剂的溶液中，使其聚合成为聚吡咯纳 米管膜，这样合成的纳米管膜的壁厚取决于聚合时间。s u k e e r t h i 等“们用类似的成 膜方法制得了聚苯胺纳米管膜。最近，中科院化学所万梅香研究员“们领导的研究 小组在导电高聚物纳米管的研究方面也取得了一系列创新性进展，首次在无外模 板存在条件下，成功地制备出一系列自组装的导电聚苯胺( p a n i ) 和聚吡咯( p p y ) 及其衍生物的微米，纳米管，此法与“模板合成”方法相比，具有简单、廉价等优点， 其研究成果达到国际领先水平，成为拥有自主知识产权的研究成果。中科院胶体 硕士学位论文 与界面重点实验室李峻柏课题组基于聚电解质类化合物优异的柔韧性能，对聚电 解质纳米管制备方法进行改进。“，发展了压力膜模板方法，应用层层组装技术， 在带电模板的孔内形成了三层具有水溶性的聚丙烯氯化铵聚苯乙烯磺酸盐纳米 管。所制得的纳米管排列整齐，管壁厚度可控，具有良好的柔韧性。该研究对于 其他聚电解质和复合组分的纳米管制备具有重要意义。 ： s t e i n h a r t 等“”则用模扳成膜法制成了琵缘高分子纳米管，并使其整齐捧列形 成高分子纳米管膜。但是，所用的具体方法与上面的有所不同。他们是将聚合物 溶解或者使其处于熔融状态，当聚合物溶液或熔体均一稳定后，将其涂在模板上， 形成纳米管膜。可用这种方法得到纳米管膜的聚合物有聚四氟乙烯( p t f e ) 、聚苯 乙烯( p s ) 、聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 等。 1 2 4 金纳米通道 1 2 4 1 圆柱形金纳米通道的制备及应用 ( 1 ) 制备： 2 0 世纪9 0 年代美国佛罗里达大学c h a r l e s r m a r t i n 研究小组就已经开展了金 纳米通道的研究。金纳米通道的制备一般是以多孔聚碳酸酯膜为模板，采用化学 沉积( e l e c t r o l e s sd e p o s i t i o n ) 的方法在纳米通道内沉积一层金纳米颗粒啼“。该方法 不同于电化学沉积法，其待镀表面不需要导电性涂层。其制备过程是先用敏化剂 ( 如s n ”) 处理膜( 孔壁和膜表面) ，敏化剂与膜上的氨基、羰基或羟基等基团 络合而使膜敏化，然后将敏化过的膜暴露于含a g + 的溶液中，a g + 在膜孔壁及膜表 面上被还原成纳米银粒子。最后，将被银覆盖的薄膜浸于含有a u + 和还原剂的镀 金液中，a u + 和膜上的银粒子发生氧化还原，从而得到膜表面和孔壁镀金的复合 材料。 纳米通道膜内金颗粒的大小和金层的形状很大程度上取决于金沉积液的p h 值和溶液温度。图1 6 t s 为不同沉积速度下获得的纳米管形状。 a ) 尹 匕 睦兰 b ) c ) 图1 6在不同沉积速度下获得的纳米通道形状 f i gi 6 n a n o t u b l e so b t a i n e da td i f f e r e n td e p o s i t i o ns p e e d a ) p h ；1 0 ；b ) p h = 1 0 1 2 ；c ) p h z1 2 一1 4 9 龟纳米通道腹用于d n a 的检测和蛋白质分离的研究 当p h 值和温度越高，沉积速度越快，反之则越慢；在较低的沉积速度下， 可形成均一孔径的金纳米通道，当沉积速度较高时，在金纳米通道两端管口沉积 的金颗粒较多，形成中间大管口小的纳米管。运用该技术可以制得 2n l n 的纳米 管，可以用它测定纳米级的氧化还原物质，其还原电流与氧化还原物质的浓度成 线性关系。与电化学沉积法不同。金属纳米线的长度不能调控，但通道的内径可 以通过改变金属沉积时间而任意控制“1 ，通道外径则由模板膜孔道的直径决定。 ( 2 ) 应用： 圆柱形金纳米通道的应用已经涉及到诸多领域： ( 1 ) 用于生物大分子或有机小分子的分离 基于分子尺寸差异分离r u ( b p y ) 3 c 1 2 与m e t h y lv i o l o g e n ；q u i n i n e 与p y r i d i n e ； r h o d a m i n cb 与a n i l i n i u mc h l o r i d e 等大分子与小分予对，分离选择性分别高达 1 5 0 0 、1 5 0 0 0 和1 3 0 0 0 0 3 ； 通过在金纳米通道膜上修饰亲水性或疏水性基团，选择性分离亲水性与疏 水性物质如p y r i d i n e 与t o l u e n e ”“”1 ； d n a 分离：在金纳米通道膜内修饰发夹型d n a ( h a i r p i n d n a ) ，利用d n a 杂交动态平衡原理，能选择性运输与分子信标环部杂交的目标d n a 序列“”。完 全互补d n a ( p c d n a ) 序列与单碱基错配序列d n a 分离系数( a h p )为3，,pcimm 而完全互补序列与七个碱基错配序列的分离系数( a h p p c t m m ) 为7 ；当在通道内 修饰直链d n a 时，a h p 。p c i i m m = i ，而u h p ，p c t m m = 5 ( 见图1 7 ) 。结果表明：通 道膜内修饰发夹型d n a 时对目标d n a 的分离效果要优于直链d n a 。 苦 蓉 窖 量 芑 e z a 0 8 o o1 0 02 0 03 1 1 n 似l 聃， 1 8 一 t 上f ，2 哗 g 芑 l0 6 = 芒 o0 f e e dc 帅n 仃i 渊l 图i 7a ) 直链d n a 通过固定有发夹状d n a 分子的金纳米通道膜时的摩尔流量随时间的关系； b ) 直链d n a 的摩尔流量与进样池中浓度的关系 f i g 1 7a 1t r a n s p o r tp l o t sf o rp c d n at h r o u g hg o l dn a n o t u b em e m b r a n e sw i t h ( b l u et r i a n g l e s ) a n dw i t h o u t ( r e dc i r c l e s ) t h ei m m o b i l i z e dh a i r p i n d n at r a n s p o r t e r ； b 1f u xv e r s u sf e e dc o n c e n t r a t i o nf o rp c - d n a 硕士学位论文 在金纳米通道膜上修饰c l 离子、外加电场“( 图1 8 ) 或修饰氨基酸等两性 物质“2 ”1 ，通过改变电场方向或控制溶液的p h 值来控制金纳米通道膜带电性质 的变化，从而实现带不同电荷的离子以及具有不同等电点蛋自质的分离。 图1 8 可控的离子选择性金纳米通道膜的示意图当外加负电势时，允许阳离子通过而阻碍 阴离子通过；当外加正电势时，允许阴离子通过而阻碍阳离子通过 f i g 1 8s c h e m a t i co fs w i t c h a b l ei o n s e l e c t i v eg o l dn a n o t u b u l em e m b r a n e an e g a t i v ea p p l i e d p o t e n t i a la l l o w sp a s s a g eo fc a t i o n sb u tb l o c k sa n i o nt r a n s p o r t ap o s i t i v ea p p l i e dp o t e n t i a l w o u l da l l o wp a s s a g eo fa n i o n sb u tb l o c kc a t i o nt r a n s p o r t 分离手性异构体：在聚碳酸酯膜纳米通道内装载a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e a p o e n z y m e ( a p o - a d h ) ，用于分离d 型和l 型氨基酸。他们首先在纳米管膜表面覆上 一层多孔聚合物，使得小分子能通过而蛋白质不能通过，蛋白质可在界面自由移 动，然后将酶固定到膜上，这种酶能识别苯基丙氨酸，可以将d 型和l 型苯基丙氨 酸分开。当纳米通道内径为4 0 0 n m 时，d p h e n y l a l a n i n e 与l p h e n y l a l a n i n e 的分离 系数为3 3 ，当纳米通道内径减小至3 0 n m 时，分离系数可高达4 9 “。 ( 2 ) 仿生离子通道及传感领域的应用 仿生离子通道及传感领域的基本原理是采用电化学研究方法对通道膜内离子 电流进行分析。亲水性空白膜通道内的离子电流较大，当溶液中存在待分析分子 时，通道内离子电流因受阻而减小。相反，疏水性空白膜通道内的离子电流较小， 如果溶液中存在表面活性剂或者药物分子，通道由疏水性转为亲水性时，离子电 流增加( 图1 9 ”“) 。 金纳米通道膜用于d n a 的检测和蛋白质分离的研究 图圈莓inempty c k a n n e l 圈h e 口c h 函 c i 。n t1 kh 1 2 h 盯 聃鬯! d e c “ - _ i y t el nl i _ n e l ：8 1 0 c i l 萨 c h a n n e li sh y d r o p h n b l c c l