（植物学专业论文）malditof质谱联合nmr及hplc分析植物单宁结构及抗氧化能力研究.pdf

中文摘要 中文摘要 对植物单宁化学结构进行快速、准确的分析测定是筛选和开发有重大应用价 值的植物单宁资源的前提。本文利用现代仪器分析技术对我国南方几种经济植物 单宁的化学结构和抗氧化能力进行了系统研究，主要研究内容及结果有： 1 首次利用高效液相色谱一二极管阵列检测法( h p l c d a d ) 研究了不同反 应条件对木榄花萼原花色素降解( 正丁醇h c i 法) 产物花青定及反应副产物的 影响。经h p l c - d a d 检测分析发现反应体系含水量对红树植物木榄花萼原花色 素降解产物及副产物影响较大。当反应体系含水量在5 - - 1 5 的条件下，转化 产物随着反应体系含水量的增加，花青定的转化率也随之增加，副产物的转化率 却随之减少，总转化率( 即花青定加上副产物的总转化量) 呈增加趋势：在反应 体系含水量1 5 以上，随含水量的增加，转化产物含量呈现下降的趋势；增加 反应体系中原花色素样品含量并没有明显增加转化产物的转化率，副产物的转化 率相对稳定；不同反应时间处理得到的转化产物经h p l c d a d 检测分析并未发 现转化产物花青定和副产物表现出明显的变化规律，总转化率相对稳定。研究表 明h p l c d a d 技术能够准确地分析测定植物样品中原花色素含量及原花色素结 构单元组成类型。 2 利用基质辅助激光解析电离飞行时间( m a l d i t o f ) 质谱分析测定了木 榄花萼中原花色素的结构单元组成类型、平均聚合度和平均相对分子质量，首次 报道了以木榄花萼原花色素为原料，通过正丁醇h c l 法酸解反应制备了花青定 粗产品，测定了花青定粗产品对二苯基苦基肼自由基( d p p h ) 的清除能力及铁 离子还原，抗氧化能力( f r a p ) 。木榄花萼中所含原花色素结构单元组成类型主 要为儿茶素和表儿茶素( 原花青素的结构单元) 。平均聚合度为7 5 ，平均相对 分子质量为2 0 8 1 。6 0 ；花青定粗产品具有很强的清除自由基能力( 半抑制率浓度 i c s o 为4 3 8 9p g l ) ，及较高的f r a p 抗氧化能力( 7 7 2m m o la a e g ) 。创新 性地建立了一种利用自然界广泛存在的原花色素资源通过酸解转化制备花青定 等花色素的新途径。 3 利用m a l d i - t o f 质谱联合n m r 及h p l c 分析测定了李子果肉、海南蒲 桃果实及橄榄各部分中所含单宁的化学结构及其抗氧化活性。( 1 ) 李子果肉中总 i i 中文摘要 酚含量为8 2 8 9 1 3 1 2m g g ，可溶缩合单宁含量为1 4 3 1 9 2 7m g g ；构成 李子果肉单宁的黄烷3 一醇结构单元主要是表儿茶素，在化学结构上属于原花青 素类型，且大部分聚合物的结构单元之间存在a 型和b 型2 种连接方式，平均 聚合度为5 3 ，平均相对分子质量为1 5 8 3 7 。经d p p h 法测定发现李子果肉单 宁具有较高的自由基清除能力( i c 5 0 为5 7 9 8i j g m l ) 。( 2 ) 海南蒲桃果实核中 所含单宁类型为鞣花单宁，其结构为葡萄糖核、没食子酸酯、鞣花酸及其衍生物 构成。海南蒲桃果实皮中所含单宁类型为缩合单宁，缩合单宁黄烷3 醇结构单 元主要为表阿福豆素通过b 型连接而形成的低聚物，即在结构上属于天竺葵色 素类型，m a l d i t o f 质谱图中最多可观n - n 十一聚体的存在。经d p p h 和f r a p 两种体外抗氧化模型检测发现，海南蒲桃果实单宁提取物具有很强的自由基清除 作用和抗氧化能力。海南蒲桃果实是一种值得大力开发的天然抗氧化剂资源。( 3 ) 橄榄茎皮缩合单宁属于原花青素和原翠雀素类型，其黄烷一3 醇结构单元在空间 立体结构上属于2 ，3 一反式结构。并在原花青素和原翠雀素的结构单元表儿茶素和 表桔儿茶素中发现有没食予酸酯的存在。橄榄茎皮缩合单宁平均聚合度为5 3 ， 平均相对分子质量为1 5 7 8 2 5 。m a l d i t o f 质谱、h p l c 及n m r 技术是分析 多分散的植物单宁聚合物的理想工具。经d p p h 和f r a p 体外抗氧化模型检测 发现橄榄叶片、小枝及茎皮中所含单宁组分均表现出较强的自由基清除作用 ( i c 5 0 5 6 8 6 ，6 2 3 1 和5 4 8 0p g m l ) 和抗氧化能力( 4 2 8 ，3 7 4 和4 4 9m m o l a a f _ g ) 。 关键词：木榄；橄榄；海南蒲桃；基质辅助激光解析电离飞行时间( m a l d i t o f ) 质谱；核磁共振( n m r ) ；高效液相色谱( h p l c ) ；缩合单宁；抗氧化活性 i i i a b s t r a c t i no r d e rt os c r e e na n de x p l o i tv e g e t a b l et a n n i n sw h i c hh a v ei m p o r t a n t p r o p e r t i e s i n p r a c t i c a la p p l i c a t i o n ，c o n v e n i e n ta n dr e l i a b l e m e t h o d sa r e r e q u i r e dt od e t e r m i n ev e g e t a b l et a n n i n ss t r u c t u r e i nt h ep r e s e n ts t u d y , w e h a v es t u d i e dt h ef o l l o w i n gs e v e r a la s p e c t so nt h ec h e m i c a ls t r u c t u r ea n d a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fv e g e t a b l et a n n i n sf r o ms e v e r a lp l a n t si ns o u t hc h i n a ： 1 t h ee f f e c to fd i f f e r e n tr e a c t i o nc o n d i t i o n so nc y a n i d i nf r o md e g r a d a t i o no f p r o a n t h o c y a n i d i ne x t r a c t e df r o mb r u g u i e r ag y m n o r r h i z ac a l y c e sa n ds i d e p r o d u c t sw e r es t u d i e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y d i o d ea r r a y d e t e c t o r ( h p l c - d a d ) f o rt h ef i r s tt i m e t h ec y a n i d i na n dc o r r e s p o n d i n gs i d e p r o d u c tf o r m e dd u r i n gb u t a n o l h c ih y d r o l y s i sw e r es e p a r a t e da n dq u a n t i f i e d b yh p l c d a d t h ed e g r a d a t i o np r o d u c t so fp r o a n t h o c y a n i d i nw e r ee f f e c t g r e a t l yb yw a t e rc o n t e n to fr e a c t i o ns o l v e n t s t h ey i e l do fc y a n i d i ni n c r e a s e d w i t ht h ei n c r e a s i n gt h ew a t e rc o n t e n t ( f r o m5 t o15 ) o fr e a c t i o ns o l v e n t s ， b u t t h ey i e l do fs i d ep r o d u c t sd e c l i n e d t h ey i e l do fc y a n i d i na n ds i d ep r o d u c t s d e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gt h ew a t e rc o n t e n tw h e nt h ew a t e rc o n t e n tw a s a b o v e15 h o w e v e r , t h e r ei sn og r e a te f f e c to fp r o a n t h o c y a n i d i n c o n c e n t r a t i o na n dr e a c t i o nt i m eo nt h ey i e l do fc y a n i d i na n ds i d ep r o d u c t s hp l c - d a di sap o w e r f u lm e t h o df o rt h ea n a l y s i so ft h ec o n t e n ta n ds t r u c t u r e u n i to fp r o a n t h o c y a n i d i n 2 t y p e s o f s t r u c t u r a l u n i t s ，d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o na n dt h em e a n m o l e c u l a rw e i g h to fp r o a n t h o c y a n i d i ne x t r a c t e df r o mb g y m n o r r h i z ac a l y x w e r ec h a r a c t e r i z e db ym a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n ，i o n i z a t i o nt i m e o f i f l i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y ( m a l d i - t o fm s ) c r u d ec y a n i d i np r o d u c t sw e r ep r e p a r e d f r o mp r o a n t h o c y a n i d i no fb g y m n o r r h i z ab ym e a n so fb u t a n o l h c ir e a c t i o nf o r t h ef i r s tt i m e 1 na d d i t i o n 。t h ee f f e c t so fc r u d ec y a n i d i np r o d u c t so nf r e e r a d i c a l s c a v e n g i n g a n da n t i o x i d a n t a c t i v i t y w e r ed e t e r m i n e d b yu s i n g 1 ，1 - d i p h e n y l - 2 - p i c r y h y d r a z y lr a d i c a l ( d p p h 。) s c a v e n g i n ga c t i v i t ya n df e r r i c i v 陀d u c i n g a n t i o x i d a n tp o w e r ( f r a p ) m o d e ls y s t e m s - c a t e c h i n e p i c a t e c h n ( p r o c y a n i d i n ) w a st h eb a s i cu n i to c c u r r i n g i np r o c y a n i d i no fb g y m n o r n l l z a t h ea v e r a g ed e g r e eo fp o l y m e r i z a t i o nw a s 7 5 ，a n dm e a nm o l e c u l a rm a s s w a s 2 0 8 1 6 0 c r u d ec y a n i d i np r o d u c t s s h o w e dav e r yg o o d d p p hr a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t y ( i c 5 0 ，t h eh a l f - i n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s 4 3 8 9p g l ) a n d f e r r i cr e d u c i n g a n t i o x i d a n tp o w e r ( 7 7 2 m m o la a f _ g ) an e wm e t h o d f 0 p r e p a r i n gc y a n i d i na n da n t h o c y a n i d i nf r o me a s i l ya v a i l a b l ep r o a n t h o c y a n i d l n b ym e a n s o fb u t a n o l h c ir e a c t i o nw a se s t a b l i s h e d 3 t a n n i n sf r o m 只俐门姻s a l i c i n a ，s y z y g i u mc u m i n i ca n dc a n a r i u ma l b u m w e r ec h a r a c t e r e du s i n gm a l d i - t o fm sc o m b i n e dw i t h n m ra n dh p l c a n a l y s i sf o rt h ef i r s tt i m e ( 1 ) t h ec o n t e n t o ft o t a lp h e n o l i c sa n d 嘲r a c t a b i e c o n d e n s e dt a n n i n si n p s a l i c i n af r u i tw e r e8 2 8 9 1 3 12m g ga n d14 3 1 9 2 7m g gr e s p e c t i v e l y e p i c a t e c h i nw a s t h eb a s i cu n i t so c c u r r i n gi np s a 酌n a f r u i tc o n d e n s e dt a n n i n s a t y p ea n db - t y p el i n k a g ew e r e m o s tc o m m o n l y b e t w e e nt h e s t r u c t u r a l u n i t so fp o l y m e r s t h ea v e r a g ed e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n ( d p ) o f c o n d e n s e dt a n n i n sw a s5 3 ta n dt h em e a nm o l e c u i a w e g h tw a s15 8 3 7 t h ee f f e c t s o ft a n n i n sf r o mp s a l i c i n af r u i to nf e e r a d i c a l s c a v e n g i n gw e r ed e t e r m i n e db yd p p h r a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t ya n d t h ei c v a l u ew a s5 7 9 8p g m l ( 2 ) h y d r o l y s a b l et a n n i n s i ns c u m i n i cf r u i t s t o n ew e r ei n d e n t i f i e da se l l a g i t a n n i n st h a tw e r ec o m p o s e d o fg a l l i ca c i da n d e i l a g i ca c i d ，l i n k e dt oas u g a rm o i e t y c o n d e n s e dt a n n i n s i ns c u m i n ，cf r u i t s k i nw e r ei d e n t i f i e da sb - t y p eo l i g o m e r s o fe p i a f z e l e c h i n ( p r o p e l a r g o n i d i n ) w i t h ad e g r e eo fp o l y m e r i z a t i o nu pt oe l e v e n t h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t y ，m e a s u r e db y t v v ov i t r o m o d e l s ：d p p h r a d i c a l s c a v e n g i n g a c t i v i t y a n df e f f 。c r e d u c i n g a n t i o x i d a n tp o w e r t a n n i n se x t r a c t e df r o ms c u m i n if r u i t s h o w e da v e r yg o o dd p p hr a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t y a n df e r r i cr e d u c i n g a n t i o x d a n t p a w er t h er e s u l t si n d i c a t ep r o m i s i n gt h e f r u i to fs c u m i n if o rt h eu t i l i z a t i o na s s i g n i f i c a n ts o u r c eo f n a t u r a la n t i o x i d a n t ( 3 ) t h ep r e d o m i n a n c eo fs i g n a i s r e p r e s e n t a t i v e o f p r o c y a n i d i n s a n d p r o d e l p h i n i d i n s w i t h2 , 3 一c s s t e r e o c h e m i g 时o fc o n d e n s e dt a n n i n sw a sd e t e r m i n e di nt h es t e m b a r ko fc v a b s t r a c t a l b u m i na d d i t i o n te p i c a t e c h i na n de p i g a l l o c a t e c h i np o l y m e r sw i t hg a l l o y l a t e d p r o c y a n i d i no rp r o d e l p h i n i d i nw e r ea l s oo b s e r v e d t h ea v e r a g ed pa n dt h e a v e r a g e m o l e c u l a rw e i g h tw e r e5 3a n d15 7 8 2 5 ，r e s p e c t i v e l y t h e m a l d i t o fm s ，n m ra n dh p l cp r o v i d et h er a p i da n di d e a lm e t h o df o r c h a r a c t e r i z a t i o no fp o l y d i s p e r s e dv e g e t a b l et a n n i n s t a n n i n se x t r a c t e df r o m l e a v e s ，t w i g sa n ds t e mb a r ka l ls h o w e dv e r yg o o dd p p hr a d i c a ls c a v e n g i n g a c t i v i t y ( i c 5 0o f5 6 8 6 ，6 2 3 1a n d5 4 8 0i j g m l ) a n df e r r i cr e d u c i n gp o w e r ( 4 2 8 ， 3 7 4a n d4 4 9m m o ia a f _ gd r i e dt a n n i n s ) k e y w o r d s ：m a l d i - t o fm s ；n m r ；h p l c ；c o n d e n s e dt a n n i n s ；a n t i o x i d a n t a c t i v i t y v i 缩略符号说明 p a p c p d b h a a a c e c g c e g c i c s o h p l c h p l c d a d m a l d i t o fm s n m r e s i m s f a b m s l c m s l c n m r l c i r d p p h f r a p v e g f p d g f ( a b ) a b t s 缩略符号说明 原花色素 原花青素 原翠雀素 丁基羟基茴香醚 抗坏血酸 儿茶素 表儿茶素 桔儿茶素 表桔儿茶素 半抑制率 高效液相色谱 高效液相色谱一二极管阵列检测 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 核磁共振 电喷雾电离质谱 快原子轰击质谱 液相色谱质谱仪联用 液相色谱核磁共振仪联用 液相色谱红外光谱仪联用 二苯基苦基肼自由基 铁离子还原，抗氧化能力 血管表皮生长因子 血小板源生长因子a b 2 ，2 连氮基双( 3 - 7 , 基苯并二氢噻唑啉一6 一磺 酸) 二铵盐 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导f ，独立冤成的研冤成 果。本人在论文写作中参考真他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 口 1 另外，该学位论文为( 井捶筘件时 ) 课题( 组) ii 1 tr 、， 的研究成果，获得( 夥唧习 ) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 斟经叼 ) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签孙破锦 吖年期z 7 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦f l ；k 学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人c 签孙多次乞毛 叶岁月z 7 日 前言 第一章前言 1 1 植物单宁的研究进展 1 1 1 植物单宁的概念与分类 植物单宁( v e g e t a b l et a n n i n s ) ，又称植物多酚，是一类广泛存在于植物体 内的天然多酚类活性物质。除了幼嫩的分生组织外，几乎所有的植物组织中都含 有单宁。许多植物的叶、维管组织、树皮、未成熟的果实、种皮、染病组织和其 它各种伤残部位都含有丰富的单宁。植物单宁是植物次生代谢产物，属于天然有 机化合物。1 9 6 2 年b a t e - s m i t h 给单宁提出的定义是：能沉淀生物碱、明胶及其 它蛋白质，相对分子质量为5 0 0 3 0 0 0 的水溶性多酚化合物【1 1 。因为相对分子 质量小于5 0 0 的植物多酚几乎不能在皮胶原纤维间产生有效的交联作用：相对 分子质量大于3 0 0 0 的植物多酚又难于渗透到皮纤维中。可见单宁作为一个功能 性的名词，反映了物质的一种属性。随着人们对单宁化学结构和性质的逐步认识， 以及其应用范围逐渐扩大到医药、食品、日用化工等领域，单宁这一名词应用范 围逐渐扩大。有研究者从化学角度出发，把植物单宁也称为植物多酚或复杂酚【2 1 。 新的名称有利于从分子水平上研究这类化合物的性质和特征。根据化学结构的不 同，植物单宁通常分为水解单宁( 桔酸酯类多酚) 和缩合单宁( 聚黄烷醇类多酚 或原花色素) 【3 一。 ，取一 制咖急没食子单宁 e l l a g i t a n n i n s 鞣花单宁 ( 4 ) 一z 洲 g a l l i ca c i d 没食子酸 ( 3 ) h 。焱。h ；。h 。：封o h h e x a h y d r o x y d i p h e n i ca c i d 入弪基联苯二峰| 酸 ( 5 ) e l l a g i ca c i d 鞣饱酸 ( 6 ) 图1 1 水解单宁和鞣花单宁( g a l v e z 等，1 9 9 7 ) 嘲 f i g u r e1 1h y d r o l y s a b l et a n n i n sa n de l l a g i t a n n i n s ( g a i v e ze ta 1 ，19 9 7 ) i s ( 洲 锄刚化 匙多 前言 图1 - 2 缩合单宁的结构单元及其连接方式 f i g u r e1 - 2t h ec o n s t r u c t i o nu n i ta n ds t r u c t u r eo fc o n d e n s e dt a n n i n s 不同植物以及同种植物不同器官中的单宁因其化学结构不同用途也各不相 同。水解类单宁( 图1 1 ) 【5 】，是由酸及其衍生物与葡萄糖或多元醇主要通过酯 键形成的化合物，其容易被酸( 或酶) 水解为糖( 1 ) ，多元醇和酚性羧酸。根据 酚性羧酸的化学结构不同，水解单宁通常又分为没食子单宁( 桔单宁) ( 2 ) 和鞣 花单宁( 4 ) 。没食子单宁水解产生没食子酸( 3 ) ，鞣花单宁的水解产物为六羟 基联苯二甲酸( 5 ) 和鞣花酸( 6 ) 。水解单宁生物活性较强，在医药、食品、化 工等领域应用广泛。缩合单宁( 原花色素) ( 图1 2 ) 通常是一类由黄烷3 一醇结 构单元通过4 8 ( 或4 _ 6 ) c c 键缩合而形成的寡聚或多聚物( b 型) ，其在 热的醇一酸溶液中能酸解生成花色素，如黑荆树皮单宁、落叶松树皮单宁以及茶 叶中所含单宁，表现出不同于水解类单宁的特征。自然界存在的缩合单宁除了单 体间主要以c c 键相连外，有些植物单宁结构中还具有一定数量的双连接键( a 型) 4 , 6 - 1 0 | ( 图1 2 ) 。黄烷3 醇及黄烷3 ，4 二醇是缩合单宁的前体，经缩合成为 缩合单宁。黄烷3 - 醇在热的酸处理下不产生花色素( a n t h o c y a n i d i n ) ，不属于原 花色素( p r o a n t h o c y a n i d i n ) ，但它是原花色素的重要前体。原花色素具有多种 2 刖吾 生理活性”1 7 1 ，在医药上止血愈伤，抑菌抗过敏，尤其具有抗氧化、抗癌变、防 止心脑血管疾病的功效，成为近年来植物多酚类物质研究的热点之一。根据黄烷 醇a 环和b 环的羟基取代形成的差异，黄烷一3 - 醇可分为儿茶素、桔儿茶素、阿 福豆素、刺槐亭醇、菲瑟亭醇和牧豆素( 表1 1 ) f 侧，结构式见图1 3 。 表1 1 黄烷3 醇的类型( 时国庆，2 0 0 4 ) 【明 r a b l e1 tt y p e so ff l a v a n 3 - o l s ( s h iq u o q i n ，2 0 0 4 ) 4 卅 rm h o h o h o 儿茶素c a t e c h i n 梧儿茶素g a l l o c a t e c h i n o h h 。匿：掰o 。h 爿。 阿福豆素a f z e l e c h i n o h 刺槐亭醇r o b i n e t i n i d o l菲瑟亭醇f i s e t i n i d o l 牧豆素p r o s o p i n 图1 - 3 黄烷- 3 - 醇的化学结构 f i g u r e1 - 3c h e m i c a ls t r u c t u r e so ff l a v a n - 3 - o l s h h 我国植物单宁资源丰富，品种繁多，如红树、落叶松、黑荆树、杨梅、油柑、 厚皮香树皮、五桔子等3 t4 俘2 刁。栲胶的最高年总产量曾达5 0 3 万t ，是我国林产 化学工业的主要产品之一，也是我国国民经济中不可或缺的产品。目前世界栲胶 年产量约为5 0 6 0 万t ，其应用涉及制革、森工、纺织、矿业、建材、食品、医 药、农业、石油、化工、环保、水处理等许多行业。单宁作为可再生的结构多样 3 刖吾 的天然聚合物，有活泼的化学性质，其潜在的用途还十分广阔，因此植物单宁受 到各个研究机构和团队的密切关注，得到了深入研究。 1 1 2 植物单宁的化学反应活性 植物单宁分子结构中具有的多个反应活性基团和活性部位，使其可以发生多 种化学反应，酚羟基是其最具特征性的活性基团。它与金属盐发生的多种特征显 色反应常被用于植物单宁的定性检验，也可在分光光度计法中用于单宁的定量分 析。醚化反应可使单宁的部分或全部酚羟基转化为醚，使单宁的极性减弱，水溶 性降低，脂溶性提高，反应活性降低，稳定性增强，有利于单宁的分离和结构测 定。酰化反应是单宁分离及结构研究中常用的另一种衍生化方法，通常采用酸酐 或酰氯与单宁作用使其酚羟基或醇羟基转化为酚酯。植物单宁中最常见的酰化形 式是其没食子酸酯，没食子酰化可以增加单宁的反应基团，使其水溶性、抗氧化 活性及其它反应活性提高。酚羟基和醇羟基的活泼氢与糖的羟基缩合形成糖苷的 反应称为甙化，糖的引入可使单宁的水溶性和稳定性增强，生物活性发生改型2 1 。 缩合单宁可发牛亲电或亲核取代反应。黄烷3 醇的6 位及8 位为亲核性位置， 能与亲电试剂溴水发生溴化反应( 图1 - 4 ) ，可作为植物单宁的一种定性分析方 法，反应中缩合单宁生成黄色或红色沉淀，而水解单宁则保持澄清1 2 3 1 。 甲基儿茶素 8 溴一甲基儿茶素6 ，8 二溴甲基儿茶素 m e t h y l a t e dc a t e c h i n 8 - b r o m o m e t h y l a t e dc a t e c h i n6 8 - d i b r o m o - m e t h y l a t e dc a t e c h i n 图1 _ 4 几茶素的溴化反应 f i g u r e1 - 4b r o m i n a t i o no fc a t e c h i n 与溴化反应类似，单宁与甲醛发生的酚醛缩合反应，是以a 环的c 6 ，c 8 位为亲核活性中心，通过亚甲基桥键使单宁分子交联，形成大分子【2 1 。对于单体 原花色素黄烷一3 ，4 一二醇来说，其c 4 位具有极强的亲电性，在强酸性条件下可被 氧化生成花色素。当溶液中有其它亲核性物质存在时，c 4 位易受到进攻，形成 加成产物，这个亲核取代反应称为溶剂分解反应。对于聚合原花色素，其单元间 4 前言 的连接键同样是不稳定的，易在酸的作用下断裂，生成黄烷醇单体i z 4 l 。原花色 素的4 - 8 键很不稳定易在酸的作用下打开。下部单元形成( + ) - ) l 茶素，上部 单元成为正碳离子( a ) ，a 失去一个质子成为黄烷一3 一烯- 孓醇( b ) 。在有氧条件 下b 失去c 2 上的氢负离子，被氧化为花青定，反应过程如图1 - 5 所示。因此， 花色素反应和溶剂分解反应不仅是缩合单宁的定性及定量分析方法之一，而且可 对缩合单宁的单体组成、聚合程度、空间构型等进行分析测定。黄烷醇分子中的 吡喃环是结构中的薄弱部位，在亲核试剂亚硫酸盐的进攻下，吡喃杂环的醚键易 被打开，磺酸基结合到c 2 上，使之发生亚硫酸化反应。亚硫酸化引起的开环反 应，减少了醚基的憎水性，增加了原花色素的亲水性和亲核性，此外还具有浅化 颜色、降低粘度、加速渗透等作用，这有利于单宁在某些方面的应用【2 5 ，2 刨。 花青定c y a n i d i n 图1 - 5 原花色素酸解转化反应示意图 f i g u r e1 - 5a c i dh y d r o l y s i sc o n v e r s i o no fp r o a n t h o c y a n i d i n h 自缩合反应是缩合单宁的生成反应，在酸的催化下，黄烷醇单体缩合成单宁 聚合物，单宁缩合成更大分子的红粉，加热条件下反应速度更快。如黑荆定在 0 1m o l l 的盐酸水溶液中( 4 0 ，1 8h 或8 0 ，5m i n ) 发生自缩合，生成两个 二聚的及一个三聚的黄烷一3 ，4 一二醇。酯键的水解是没食子酸酯类单宁的特征反 应，水解的方法按反应条件可分为酸水解、碱水解、加热水解、酶水解、醇解等。 酸水解一般为完全水解，生成多元醇和酚羧酸。碱水解产率高，但需在无氧条件 下进行，以避免单宁的氧化。没食子酰基的酯键被甲醇水解的同时发生酯交换反 前言 应，生成没食予酸甲酯，成为研究聚没食子酸酯化学结构的常用方法。利用没食 子酸酯类单宁与正丙醇的醇解反应制备的没食子酸丙酯，可用作化妆品、饲料和 食品添加剂【4 1 。缩合单宁比水解单宁具有较多的活泼氢，在氧或酶的催化作用下 酚羟基上的氢易被脱去生成苯氧自由基，并与丙烯酸类单体发生接枝共聚。经接 枝共聚而得到的改性单宁与原单宁相比有更大的相对分子质量，其热稳定性、光 吸收特征、溶解性、粘度等性质都会发生较大程度的改变【2 7 2 铷。 1 1 3 植物单宁的提取、分离与纯化 单宁提取时样品的状况如原料贮存、干燥和提取条件都可能导致提取率和单 宁组成结构的变化，从而改变了单宁的化学、物理和生理活性。影响单宁提取的 因素有粉碎度、料剂比、溶剂种类、温度、时间与提取次数等。样品提取前需经 粉碎成粉末。通常较细的粉末有利于提取，但是过细时单宁的提取量反而减小， 这可能是因为粉碎的时间过长，单宁己经氧化变性，最适合的尺寸是1 0 0 目左 右。水是单宁的良好溶剂。有机溶剂和水的复合体系( 有机溶剂占5 0 - - 7 0 ) 使用更为普遍，可选的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等。 丙酮一水体系对单宁溶解能力最强，能够打开单宁一蛋白质的连接键，减压蒸发 易除去丙酮【4 】，是目前使用最普遍的溶剂体系【2 m 。 单宁粗提物中含有大量的糖、蛋白质、脂类等杂质，加上单宁本身是许多结 构和理化性质十分接近的混合物，需进一步分离纯化。通常采用有机溶剂分步萃 取的方法进行初步纯化，甲醇能使水解单宁中的缩酚酸键发生醇解，乙酸乙酯能 够溶解多种水解单宁及低聚的缩合单宁，乙醚只溶解相对分子质量较小的多元 酚。初步分离还可以采取皮粉法、醋酸铅沉淀法、氯化钠盐析法、渗析法、超滤 法和结晶法等1 4 l 。柱色谱是目前制备纯单宁及有关化合物的最主要方法，可选用 的固定相有硅胶、纤维素、聚酰胺、聚苯乙烯凝胶( 如m c i g e l c h i p - 2 0 ) 、聚乙 烯凝胶、葡聚糖凝胶等，其中又以葡聚糖凝胶s e p h a d e xl h 2 0 最为常用。其它 一些色谱方法如纸色谱、薄层色谱、液滴逆流色谱法、离心分配色谱等也有应用 于单宁提取的报道【4 似5 l 。 1 1 4 植物单宁的应用 植物单宁在自然界分布极广，对植物的性质有着极其重要的影响。从含单宁 的植物性材料中提取的产品可以用作制革鞣剂、木材胶粘剂、泥浆减粘剂、选矿 6 前言 抑制剂、防垢除垢剂、气体脱硫剂、金属络合剂和电池电极添加剂等，而广泛应 用于制革、石油开采、木材加工、采矿、涂料、水处理等行业。随着对单宁生理 活性研究的展开，使其在医药、食品、日用化工等方面的应用更为活跃。 1 1 4 - 1 单宁在医药中的应用 人类利用草药治疗疾病的历史同利用单宁鞣革的历史一样悠久，甚至更早。 药典中记载的富含单宁草药有多种，传统中医常常认为这些草药具有。清热解毒、 逐癖通经、收敛止血、利尿通淋”等功效。随着近2 0 年来植物化学和现代分析技 术的迅速发展，使单宁的生理活性和药学活性研究成为天然产物领域的热点之 一。一方面，传统中药的功效从分子水平得到确认，如甜茶的抗过敏作用经分析 与其特有成分鞣花单宁聚合物有关，与聚合度成正比；长期饮用绿茶和食用果蔬 可有效降低癌症和肿瘤发病率与单宁有关。另一方面，大量具有生理活性的多酚 类化合物被分离和鉴定出来。目前研究者关注的热点有：传统中药和中成药活性 成分的鉴定和药理学研究；从天然来源的植物中制备活性多酚：以多酚的改性产 品或水解产物作为中间体用于药物合成，如利用桔单宁的水解物桔酸合成三甲氧 基苯甲醛等。 1 1 4 2 单宁在食品中的应用 单宁与唾液蛋白的结合是食品涩味的主要来源。另外，单宁活跃的化学特性 使其极大影响植物源食品的色泽。对于茶、葡萄酒、啤酒、果汁、咖啡等来说， 单宁是其风味甚至典型性( 如啤酒的非生物稳定性和风味稳定性) 的重要影响因 素【停s o 。从植物中提取多酚并将之纯化，作为一种天然的食品添加剂，除了可以 调节食品的风味外，还可以起到一种高效、无毒且具有保健性的抗氧化和防腐蚀 作用。相对分子质量低的茶多酚和水解单宁的降解物没食子酸作为天然抗氧化剂 已经大量用于食品保存，作用强而毒性低。关于单宁作为天然食品添加剂的研究 和应用也正在不断展开。含3 0 多酚的乌龙茶提取物“三乌龙”，作为糖果中的防 龋齿原料得到广泛利用，其中有效部分由绿茶中的儿茶酸在乌龙茶生产过程中经 多酚氧化酶等酶作用聚合而成，其中相对分子质量2 0 0 0 左右部分阻碍葡聚糖合 成酶的活性最高。一个名为苹果多酚的未成熟苹果提取精制产品，具有消除活性 氧、抗菌、防龋齿、抑制血压一卜升、降低胆固醇、抑制酪氨酸酶活性、抑制组胺 游离、钝化透明质酸酶活性等作用，作为糖果、甜点、饮料等的添加剂的市场逐 7 前言 渐扩大。以鞣花单宁为活性成分的甜茶多酚因对花粉病等过敏症的抑制作用被用 于饮料、糖果以及作为保健添加剂。 1 1 4 3 单宁在日用化学品中的应用 天然来源的小分子酚类化合物如花青素、儿茶素、栋精、没食子酸、鞣花酸、 熊果甙等在化妆品中已得到广泛应用 3 , 5 1 - 5 5 1 。近年来的研究证明，与小分子酚类 具有密切生源关系并且共生的单宁也可起到类似的抗氧化、抗衰老、抗紫外线、 增白及保湿作用等，可用于护肤品、染发剂、牙膏、祛臭剂等日用化学品中作为 活性成分。单宁所具有的收敛性使化妆品在防水条件下对皮肤有很好的附着能 力，大量的活性酚羟基赋予它很强的生理活性。比如：茶单宁和葡萄单宁具有很 好的美白祛斑作用。 1 1 4 4 单宁在合成材料方面的应用 单宁的酚羟基使其具有一定的亲水性，如将植物单宁与不溶于水的高分子材 料结合在一起，则可充分发挥二者的优势。这种结合主要通过两种方式：一种是 利用多酚与醛的反应，通过醛类物质形成桥键，使多酚与聚合物的相应活性基团 缩合形成高分子多酚树脂，主要用于离子交换及作吸附材料；另一种方式则是把 植物多酚同化到高分子材料底物上，形成同化单宁。固化单宁的同化方式以及选 择合适的固化底物是目前研究的重点之一。常采用的底物有聚乙烯、聚丙烯酸树 脂、纤维素、聚丙烯酞胺等。固化方式可以通过酯键、醚键、甙键、配位键甚至 是硫水键和氢键等，现在采用较多的是通过氧化偶合或辐射引发自由基聚合进行 接枝共聚等方法，把植物多酚与底物高分子以共价键直接相连。固化单宁在很大 程度上保持了植物多酚的化学性质，同时赋予高分子材料许多新的性能，多酚与 高分子底物的协同作用产生了