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摘要 二氧化锆整体柱的制备及表征 摘要 硅胶作为目前色谱分离科学中最常使用的柱填料，但其化学稳定 性不高的缺陷使其应用受到限制。二氧化锆整体柱既具有硅胶整体柱 的色谱性能，又具有优良的化学和机械稳定性，使整体柱在色谱分离 中的应用领域得到拓展。 目前，二氧化锆柱填料主要是通过聚合诱导胶体凝聚法( p i c a ) 和油乳法( o e m ) 制备球形颗粒填料。本课题则是利用溶胶凝胶方法 直接合成二氧化锆整体柱；具体操作是以氧氯化锆为原料，先用氨水 中和得n - - 氧化锆水溶胶，加入聚乙烯醇作为致孔剂，再利用六次甲 基四胺加热易分解的特性，从而使二氧化锆水溶胶凝聚成凝胶，再经 烧结即可得到具有均匀多孔结构的二氧化锆整体柱。对二氧化锆水溶 胶的制备条件、凝胶条件以及二氧化锆整体柱的烧结条件进行了探 讨。同时，通过电子显微镜对二氧化锆凝胶和二氧化锆整体柱的孔结 构进行表征，优化了二氧化锆整体柱的制备条件。通过扫描电镜( s e m ) 的微观观测，二氧化锆整体柱的孔结构是由2 1 m 左右的通孔和表面具 有微孔结构的突起组成，达到了作为色谱柱填料的要求；试验表明这 种方法制备的二氧化锆整体柱是完全可行的。 关键词：整体柱，二氧化锆，溶胶凝胶，孔结构 北京化工大学硕士学位论文 p r e p a r a t i o na n de v a l u t i o no fz i r c o n i am o n o l i t h i c c o l u m n a b s t r a ct a st h em o s tp o p u l a rp a c k i n gm a t e r i a l s ，s i l i c a g e lp l a y sap i v o t a lr o l e i ns e p a r a t i o ns c i e n c eo w i n gt oi t ss u r f a c ep o r es t r u c t u r e h o w e v e r , t h e c h e m i c a l i n s t a b i l i t y o fs i l i c a g e ll i m i t e di t s a p p l i c a t i o n z i r c o n i a m o n o l i t h i cc o l u m nw i t hs i l i c a g e ls e p a r a t i o nc h a r a c t e r i s t i e s ，h a se x c e l l e n t c h e m i c a la n dm e c h a n i c a ls t a b i l i t y , a n dm a k e st h em o n o l i t h i ca p p l i c a t i o n i nt h ec h r o m a t o g r a p h i cf i e l d st ob ee x p a n d e d a tp r e s e n t ，t h ez i r c o n i as p h e r ep a c k i n gm a t e r i a l sw e r ep r e p a r e d m a i n l yb yp o l y m e r i z a t i o ni n d u c e dc o l l o i da g g r e g a t i o nm e t h o d ( p i c a ) a n do i le m u l s i o nm e t h o d ( o e m ) t h i si s s u ci sd i r e c t l ys y n t h e s i z e db y s 0 1 g e l z i r c o n i a m o n o l i t h ：s p e c i f i co p e r a t i o n s b a s e do nz i r c o n i u m o x y c h l o r i d ea sr a wm a t e r i a l ，f i r s tw i t ha m m o n i aa n dw a t e rz i r c o n i as o l o b t a i n e d b ya d d i n gp o l y v i n y l a l c o h o l a s p o r o g e n r e - u s eo f h e x a m e t h y l e n e t e t r a m i n eh e a tl a b i l ep r o p e r t i e s ，s ot h a tc o n d e n s e di n t oa z i r c o n i as 0 1 g e lw a t e r , a n dt h e nb ys i n t e r i n gc a nb eo b t a i n e dw i t ht h e u n i f o r n lp o r o u ss t r u c t u r eo fz i r c o n i am o n o l i t h i cc o l u m n z i r c o n i a m d i o x i d eh y d r o s o lp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n s ，t h eg e lc o n d i t i o n sa n dt h e o v e r a l lc o l u m nz i r c o n i as i n t e r i n gc o n d i t i o n sw e r ed i s c u s s e d m e a n w h i l e ， e l e c t r o nm i c r o s c o p ef i n i s h e dz i r c o n i ag e lm i c r o p o r es t r u c t u r es t u d i e st o e n a b l et h e mt oa c h i e v eb e t t e rs e p a r a t i o n b ys c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) m i c r o o b s e r v a t i o n ，z i r c o n i am o n o l i t hp o r es t r u c t u r e s c o m p o s ea b o u t2 p a lt h r o u g hh o l e sw i t hm i c r o p o r o u sp r o t r u d i n go ni t s s u r f a c e ，t oa c h i e v et h er e q u i r e m e n t sa sac o l u m np a c k i n g ；t e s t ss h o wt h a t t h ep r e p a r a t i o no fz i r c o n i am o n o l i t h i cc o l u m ni se n t i r e l yf e a s i b l e k e y w o r d s ：m o n o l i t h i cc o l u m n ，z i r c o n i a ，s o l g e l ，p o r es t r u c t u r e 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：垫：窒整 日期： 丝丝：篁：塑 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 作者签名：出蛩蓿期： 导师签名：二篮幽，日期： 知阳，o ，扣加 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 近几十年来，随着以人类健康、生物工程为核心的生命科学、环境科学以及 制药、合成化学的突飞猛进的发展，高效液相色谱凭借其高效、快速、分离条件 温和、应用范围广等优越性而越来越受到人们的关注，也是目前使用最为广泛的 分析分离方法之一【l 捌。从上个世纪七十年代现代液相色谱出现至今，在短短的 几十年的时间里便得到了迅速发展和广泛的应用。这种技术不仅满足了不同组分 混合物的分离和制备，而且提供了同时定性和定量分析。据统计，在药物学、生 物医学、生物化学和环境分析等领域，大约8 0 的分离可以通过这种技术来实现 闱 。 在最近的十年，整体柱结构已经被广泛的应用于色谱分离中。这种设计与填 充床色谱柱相比在不损失柱效的情况下降低了柱压降。这种整体柱结构对于微柱 技术也同样有效。对于电色谱和微型液相色谱的应用，整体柱结构避免了在毛细 管填充柱柱端制作柱塞的问题，这是因为连续柱床在毛细管中的原位合成。高线 性速率更容易获得，实现了快速分离和高通量分析。整体柱的优点包括：可以原 位制备，省去制备填料和装柱，也可以同法制成聚合物颗粒后再装柱；聚合物易 于制备，柱子的长度和直径在一定程度上不受限制；聚合反应混合物中的单体可 以灵活选择以得到合适的基质和性质；易于在柱衍生化，以得到具有合适性质的 色谱柱；通过控制聚合反应的条件可以优化孔的性状【5 ，6 】。目前制备的整体柱分 为无机和有机两大类：前者主要是将硅氧化物直接烧结在柱内或者用溶胶凝胶 法在柱中反应得到，后者则是有机聚合单体在柱管内原位聚合得到的【7 1 。用作整 体柱分离介质的多孔高聚物必须考虑其表面的化学性质、对溶剂和溶质的保留、 孔隙率、孔径分布和硬度这几方面的要求。整体柱可以用作高效液相色谱柱和毛 细管电色谱柱，本文主要讨论一种高效液相色谱整体柱的制备【8 】。高效液相色谱 ( h p l c ) 在科学和生产领域都有广泛应用，如石油、化工、医药、环境等学科中 的分析任务。大部分可以用h p l c 完成：而在生物技术下游产品的纯化工艺中，往 往是先用膜分离作为前级处理，然后再用h p l c 作高分辨分离【9 , 1 0 。当前，柱径 达数十厘米的制备柱在许多高技术企业中已代替经典的分离操作，其效能之高经 典工艺无可比拟。柱填料始终是制约h p l c 技术的关键之，它决定其适用范围、 北京化工大学硕士学位论文 分离效能、分离机理、流动相组成，甚至检测方法。而当前广泛使用的硅胶基质 柱填料，由于仅能在p h = 2 一- 8 范围使用，以及残存硅轻基的第二效应，使其应用 受到限制，或者只能在牺牲柱寿命条件下勉强使用，这在生命科学领域尤为突出， 例如为清洗蛋白质对固定相的污染，不得不频萦地用氢氧化钠溶液淋洗，这样就 使硅胶基质柱的寿命大大缩短。研究表明，锆胶( z r 0 9 几乎可在全p h 值范围使用， 并且表面显碱性，它们被认为是最有可能克服硅胶基质弊端的材料【1 1 , 1 2 。鉴于此， 我们展开了本课题。 1 2 色谱填料 作为色谱仪的心脏色谱柱和色谱填料，不仅反映色谱方法的水平，而且 也是一个量大面广的消耗品。目前，国产填料在性能和品种上与国外发达国家有 较大的差距，主要体现在：( 1 ) 制备方法落后，沿用的基本上是7 0 年代末的以 硅溶胶为原料的制备方法，后来尽管有些专利对这一技术有所改进，但停留在 研究阶段，未投入实际生产；( 2 ) 填料性能欠佳。近年来，均匀粒度、均匀孔 径、超纯硅质微球在国外已逐渐盛行，如：美国的z o r b a x 公司、德国的m e r c k 公 司1 9 9 7 年推出的高纯硅胶微球p u r o s p h e r 系列填料等。随着h p l c 技术的不断发 展，使用于不同领域以及针对不同分离对象所建立起的填料系统不断的更新、改 进。一次成型柱填料技术将在不远的将来为h p l c 的发展赋予新的含义【”d 6 】。 直接制备出粒度单分散的硅胶微球，是色谱工作者追求的目标之一。据统计， 硅质填料在填料家族的应用面占8 0 左右【l 7 1 ，尤其近年来国外一些产品，如：德 国的l u n a 、美国的w a t e r s 以及英国的h y p e r s i l 等生产的为满足高效液相色谱 ( h p l c ) 及超临界流体色谱( s f c ) 而设计的高性能球形硅胶，具有优化的表 面性质和规则的孔结构。作为硅质填料一般只能在p h = 2 , - 7 5 的流动相条件下 使用。碱度过大，特别是当季铵离子存在时，硅胶易于粉碎溶解；酸度过大，连 接有机基团的化学键容易断裂博l 圳。 目前，在液相色谱柱操作方法的统计中，各种类型的化学键合固定相占了将 近7 8 ，传统的液一液分配色谱几乎全部被键合相所取代。这就是说，在高效液 相色谱中，广泛地、大量地使用不能被溶剂抽提的各种硅胶化学键合固定相，是 近代液相色谱填料的又一特点。分析分离追求的是高效分离和高灵敏度检测，而 制备分离则既要考虑分离效率，也要考虑保证一定纯度的分离所付出的代价，即 力争达到最好的性能价格比。不同的分离目的需要不同的分离材料。 随着色谱分离体系的日趋复杂，对色谱柱的性能要求也越来越高。理想的柱 2 第一章绪论 填料应具有狭窄的粒径分布，较高的比表面积及合适的孔结构，并具有稳定的化 学性能和机械强度 2 0 2 3 1 。其中孔径是影响色谱填料分离效果的关键因素，孔径的 大小决定了色谱填料的比表面积：填料的比表面积随孔径增大而减小，而分离效 率随孔径减小而提高；但不同大小的孔径满足相应的分离要求，如生物大分子必 须使用大孔径填料。通过对色谱填料的孔结构研究，可以指导我们改善色谱填料 的合成技术和焙烧方法，制备出更加满足不同分离要求的色谱填料 2 4 - 2 7 。因此， 研究填料微观结构和形态，对推动色谱填料的制备和应用有着至关重要的意义。 1 3 液相色谱的分离机理 液相色谱按其分离机理可分为： ( a ) 正相液相色谱( n p l c ) ，色谱体系中的固定相的极性大于流动相的极 性( 即固定相常为未改性的无机吸附剂、键合或包覆极性配体的柱填料，流动相 常常是非水的、非极性的或中等极性的化合物) ； ( b ) 反相液相色谱( r p l c ) 2 s , 2 9 1 ，色谱体系中固定相的极性小于流动相的 极性( 即固定相常为非极性有机物改性的无机载体柱填料，流动相常常是极性的 或弱极性的化合物) 。它是色谱方法的主力军，这种色谱柱的高效能及再现性等 许多问题虽然业已解决，但仍然存在许多问题，如色谱柱平衡问题、残余硅羟基、 柱稳定性以及相传质过程中的热动力学问题； ( c ) 离子色谱( i c ) 【3 0 】，它基于离子交换树脂的分离原理，是选择性好、效 能高、应用范围宽的分析方法之一。由于新型固定相的合成，使其成为生命科学 研究中的最有利的分析工具。离子色谱的发展包括新型固定相的设计和合成、保 留机理的解释、优化流动相体系以及开发新的测定技术； ( d ) 亲和色谱( a c ) 3 1 - 3 3 】，它是根据固定相与被吸附溶质问的特殊亲和力， 使亲和色谱只对一种或一类化合物分子的吸附具有高效选择性，而对其它组分不 保留。根据l o w e 的观点【l9 】，亲和色谱的研究方向是开发新型色谱柱填料使其能 承受相对苛刻的化学环境。而新型固定相的问世，亲和色谱成为了生物大分子最 有效的纯化方法之一； ( e ) 毛细管电色谱( c e c ) 3 4 , 3 5 ，它是毛细管微径液相色谱和毛细管电泳的 结合。毛细管电泳( c e ) 分离中性物质有不足，而微型液相色谱对离子分离不 理想。它用h p l c 的填充柱和用c e 作动力来进行分离，新型柱填料的研制也是该 色谱领域研究的焦点； ( f ) 超临界流体色谱( s f c ) 3 6 , 3 7 ，流动相为超临界流体，而固定相则为填 料柱。其优点是分析速度快、效能高和选择性强而且应用广泛； 北京化工大学硕士学位论文 ( 曲体积一排阻色谱( s e c ) d s - 4 0 l ，主要靠体积大小不同的溶质分子在不同 的孔径填料上有不同的保留达到分离。有机溶剂作流动相的s e c ，又叫凝胶渗透 色谱( g p c ) ；水为流动相时的s e c ，又称凝胶过滤色谱( g f c ) 。 h p l c 的分离机理是依据流动相、分离物和柱填料表面的特殊相互作用和非 特殊相互作用，这种相互作用对分离选择性有重要影响。通过变化流动相的组成 或类型经常难以达到理想的分离效果，这时就不得不通过变化柱填料来调节。归 类于“固定相研究”的文章远远多远远多于“流动相研究”的文章，这就表明与 特殊烷基结构相联系的保留过程的复杂性以及可获得多种多样的柱填料。 h p l c 是一种高效分离技术，而柱填料则是此方法的瓶颈技术，在h p l c 的 发展过程中，始终伴随着高效液相色谱填料的不断改进和发展。各种各样的色谱 填料分别用于不同的分离对象和分离模式，但毋庸置疑，硅胶仍是目前应用最为 广泛的高效液相色谱填料。这是由于硅胶除了具有良好的机械强度、容易控制的 孔结构和比表面积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专一的表面化学反应等优 点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基，这是硅胶可以迸行表 面化学键合或改性的基础。我国当前使用的h p l c 柱填料大部分依赖进口，其中 高性能柱填料更是1 0 0 舶来品。所以研究色谱填料一硅胶的制备技术具有重要 理论和实际意义，不仅推动色谱技术的发展而且填补了国内此项技术不成熟的空 白。 1 4 整体柱 对于传统的色谱填充柱，人们为了提高柱效使用越来越小的填料。对高效液 相色谱( h p l c ) 而言，柱压降随填料粒径的减小而急剧上升。l 2l u n 的填料虽 已出现，但由于柱压降的限制，目前，广泛使用的仍为3 5 岬的填料。对于 毛细管电色谱( c e c ) 填充柱，虽不存在柱压降的问题，但柱子填充和封口制作十 分繁琐，毛细管的封口会引起气泡形成、基线噪音增大、甚至电流中断等问题。 因此，综合柱效和分离速度两方面因素，较为折中的5 岬填料被广泛使用。换 句话讲，传统的高效液相色谱( h p l c ) 填充柱对分离对象很难同时实现既高效又 快速的分离【4 l 4 2 j 。 色谱填料的性能直接影响着高效液相色谱( h p l c ) 的分析精度及准确率， 色谱填料的机械强度，化学及物理性质以及热稳定性对色谱的分离起决定性作 用，而柱填料的色谱性能又与填料的粒径和孔结构密切联系的。在高效液相色谱 研究领域中，已有各种各样的色谱填料分别应用于不同的分离对象和分离模式， 4 第一章绪论 除了硅胶以外逐渐发展起来的其它类型填料如有机高分子，石墨化碳、氧化铝、 氧化钛和氧化锆等无机氧化物【l 】，都不同程度的改进了某些色谱性能。但硅胶仍 是目前应用最为广泛的高效液相色谱填料m 】。这是由于硅胶除了具有良好的机 械强度，容易控制的孔结构和比表面积，较好的化学稳定性和热稳定性以及专一 的表面化学反应等有点以外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟 基，这是硅胶可以进行表面化学键合或改性的基础。作为分离材料基质的硅胶， 需要有规则的几何形状，即球型。球形硅胶更有理于获得均匀的填充床，且使色 谱柱的操作压力较低，其中均匀粒度和孔径控制是非常棘手的问题m 。 整体柱( m o n o l i t h i cc o l m n n ) ，又称整体固定相( m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e ) 、棒 柱( r o d ) 、连续床层( c o n t i n u o u sb e d ) 等。整体柱主要分为两大类，即有机聚合物 整体柱和无机硅胶整体柱。 目前，新型色谱填充材料发展很快，但传统的高效液相色谱( h p l c ) 颗粒型 填充柱存在缺陷，难以实现既高效又快速的分离。m i n a k u c h i 等制备了连续的硅 胶整体柱，该柱同时具有通孔和中孔双孔结构，孔容量大大高于填充柱因此， 该柱具有高速、低压、高效、适于溶剂及流速梯度洗脱等优点，适合高通量分析 和快速分离，利于组合化学筛选和l c m s 应用。 整体柱作为一种新型的色谱柱，有入将其誉为是继多聚糖、交联与涂渍、单分散 之后的第4 代分离介质，具有极好的发展前景；其整体介质构具有通透性高、多 孔结构和大比表面积等优点，这些特点使其在分离分析工作中能够达到高效快 速、高通量、低背压等要求。因此，整体柱制备技术是目前发展最为迅速的柱技 术【4 5 1 。 1 5 整体柱的制备 整体柱是通过在柱管内原位聚合或固化的方法制备得到的具有多孔结构的 整体棒状固定相，与传统的填充柱相比，具有通透性好、传质速率快、容易制备 等优点，因此在分离分析领域特别是生物分离分析中发挥的作用日益增大。整 体柱的制备及应用近年来也得到了快速发展，层出不穷的新型整体柱已被广泛用 于色谱高效分离分析、固相萃取及酶反应器等方面，大大推动了分离分析科学的 发展。目前，通用的色谱柱是由颗粒状的硅胶或其它填料通过匀浆工艺装填得到 的。由于这种填料硅胶的颗粒很小，当将这些小颗粒紧密填充到液相色谱柱中的 时候，它们会对流动相的流动产生很大的阻力，这样就大大限制了样品分离分析 的通量。然而，随着科技的迅猛发展，尤其是大批量药物的分离和分析，迫切需 5 北京化工大学硕士学位论文 要开发既高效又快速的色谱填充材料。 整体柱又称连续床，自上世纪8 0 年代末出现以来，因其与填充柱相比具有制 备简单、通透性好、传质快等诸多优点而被广泛应用于电色谱、液相色谱及固相 萃取等众多方面m 郴】。此外，对细内径的色谱柱而言，整体柱在制备过程及重现 性方面都优于相同尺寸的填充柱；在液相色谱应用方面，整体柱的理论塔板高度 随流速增长的速率要远低于填充柱，这使得它特别适合于快速分离分析；在分析 复杂样品时，整体柱的抗污染能力要明显强于填充柱【4 9 】。近年来，随着生命科 学的发展，对生物分离分析技术提出了越来越高的要求。而越来越复杂的生物样 品，如人的血样、尿样、组织样品等，对分析系统的分离能力及检测灵敏度都是 严峻的挑战。根据整体柱固有的诸多优点，通过合成不同种类的整体柱固定相及 在固定相上做不同功能的衍生，整体柱已经被广泛应用于生物分离分析中【删。 硅胶整体柱是近几年才出现的新型色谱柱，它克服了颗粒型填充柱的诸多 缺点，因此很快引起色谱界的重视。硅胶整体柱具有纯度高、对碱性化合物和金 属螯合物非特异吸附小、机械强度高、化学稳定性好等特点，尤其是这种整体柱 同时具有大孔( 亦称通孔) 和中孔结构，空隙率 8 0 ，其结构已接近贯注色谱 的填料，即使在较高流速下使用，也不会有太大的阻力。因此它具有高速、低压、 高效、适于极性及流速梯度洗脱等优异特性非常适合于生物大分子的高效快速 分离。 作为分离材料的硅胶，其颗粒的形状大小、孔的结构、孔径及其分布、总孔 容、比表面及机械强度等，均是重要的参数。目前，通用的分析型硅胶基质的直 径为5 1 0 1 x r n ，且其化学键合相硅胶己有商品出售，而高效制备型所用的硅胶， 其直径多在2 0 - 4 0 1 x m 之间。多孔材料的另一个重要物理性质是孔度，即总孔容 与总体积之比【5 1 1 。在用作凝胶色谱填料时，孔度是非常重要的参数，直接关系 到样品在色谱柱上的保留体积和分辨率。但另一方面，孔度过大，势必影响材料 的机械强度，这需要综合加以考虑才行。 硅胶整体柱是以烷氧基硅烷为主要原料，采用溶胶一凝胶工艺制备而成的无 机整体柱。目前商品化的硅胶整体柱主要有s i l i c a r o d 和c h r o m o l i t h 。早在1 9 9 1 年，n a k a n i s h i 等【5 2 j 报道了多孔硅胶整体材料的制备技术，在水溶性有机聚合 物苯乙烯磺酸钠存在的条件下，四甲氧基硅烷在硝酸的催化作用下形成拥有不 同形态结构的硅胶，其中包括具有微米级通孔的整体硅胶材料，并考察了不同条 件对硅胶结构的影响。后来，他们又利用烷氧基硅烷在有机聚合物聚丙烯酸或 聚环氧乙烷存在下，以硝酸为催化剂，采用溶胶一凝胶技术制备硅胶整体材料， 并对其制备机理、制备条件做了深入的探讨。这些研究工作为硅胶整体材料应用 6 第一章绪论 于i - i p l c 奠定了基础。 1 5 1 整体柱的分类及比较 基于材质的不同，可将整体柱大体分为3 类：有机聚合物整体柱、硅胶整体 柱及杂化整体柱。有机聚合物整体柱出现的相对较早，s v e c 及f r e c h e t 等在早期做 了诸多工作，推动了有机聚合物整体柱的发展【5 3 1 。该类整体柱的主要特点是制 备过程简单，其通透性及孔径可通过调整致孔剂的配比来改变，生物相容性好， p h 使用范围宽。此外，可供选择的单体非常丰富，种类上基本不受限制，可根 据不同的需要选用相应的有机功能单体，还可在基质的表面进一步修饰或衍生以 满足不同的分离分析需求。基于这些因素，目前关于有机聚合物整体柱制备及应 用的研究占据了整体柱研究的主要位置。但其与硅胶整体柱相比，还存在易发生 溶胀、机械强度差及受热易变形等缺点【蚓。硅胶整体柱由a k a 研究组首先制备 得到，他们在硅胶整体柱的制各及应用方面做了很多基础性的工作，并率先将硅 胶整体柱商品化。硅胶整体柱的特点主要是机械强度高，通透性好，骨架分布均 匀，其通孔与介孔可分步处理，柱效高。但制备过程复杂，周期较长，后续的表 面衍生工作也较为繁琐，目前仅少数几个课题组能制备出高柱效的硅胶整体柱。 有机一硅胶杂化整体柱出现的相对较晚，h a y e s 和m a l i k 在2 0 0 0 年报道了溶胶一凝胶 制备杂化整体柱的方法。该方法将有机功能单体在硅胶整体柱形成过程中引入到 硅胶基质上，免去了硅胶整体柱的后修饰步骤。该类整体柱有望能结合有机聚合 物整体柱与硅胶整体柱的优点，近年来也受到了广泛的关注。 1 5 2 有机聚合物整体柱的制备 有机聚合物整体柱主要包括聚苯乙烯类、聚丙烯酰胺类、聚丙烯酸酯类等三 大类整体柱，制备过程主要分为如下几个步骤：( 1 ) 毛细管内壁的预处理；( 2 ) 将 含有单体、交联剂、致孔剂及引发剂的预聚合液引入到毛细管中并在合适的条件 下聚合；( 3 ) 冲洗毛细管柱后备用。不同的有机聚合物整体柱的差异主要集中在 第2 步，在制备方面的进展也主要体现在选用了不同的单体、交联剂及致孔剂体 系。在聚合引发的方式上仍然是以热引发和光引发为主，少数场合用到了其他的 引发方式如微波或y 一射线引发等。分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r ，m i p ) 的制备有其自身的一些特点，可参考近期的相关综述【舛5 7 1 ，本文不 再赘述。 7 北京化工大学硕士学位论文 1 5 3 硅胶整体柱的制备 硅胶整体柱在t a n a k a 等的推动下得到了重大发展，目前商品化的硅胶整体柱 已经涵盖了常规尺寸的色谱柱( 内径4 6m m ，长度1 l o c m ) 、毛细管柱( 内径5 0 - 2 0 0 i tm ，长度1 5 - 一3 0 c m ) 及制备柱( 内径2 5 m m ，长度l o c m ) p 引。它与有机聚合物 整体柱相比，制备过程要复杂得多，但因其介孔可分步处理，并具有更高的比表 面积，其色谱分离性能也普遍优于有机聚合物整体柱。硅胶整体柱具有良好的通 透性，因而可制备超长的毛细管分离柱【5 9 1 。硅胶整体柱一般不能直接用于分离， 需经衍生使其表面带上相应的功能基团后才能用于分离。其表面带有硅羟基使得 化学修饰相对较为方便。在衍生方法上，一般是利用带有机功能单体的硅烷试剂 经一步硅烷化反应后制得。在分离复杂样品时通常还需要对残余硅羟基进行封尾 处理，以减少其非特异性吸附。此外，也可利用有机功能单体进行化学修饰，即 先利用带功能基团的硅烷试剂在硅胶整体柱表面引入可进一步反应的功能基团， 然后加入有机功能单体反应即可得到相应功能的整体柱。该化学修饰虽操作过程 相对复杂，但因可选用的有机单体丰富，特别是用聚合反应衍生时，因聚合物表 面覆盖率较高，通常可省去对残余硅羟基的封尾处理而被广泛采用【6 1 6 2 】。硅胶整 体柱经衍生后也可制备成手性固定相，如经万古霉素衍生后可用于手性分离。 硅胶整体柱的柱效主要取决于硅胶基质的性质，目前t a n a k a 等对硅胶整体柱 的制备研究最为充分，报道的柱效可达至w j l 0 0 0 0 0 塔板m 以上；并通过将3 根毛 细管硅胶整体柱串联的方法，在柱长为1 1 3 0 一- , 1 2 4 0 c r n 时获得了1 0 0 0 0 0 0 理论塔板 数的超高柱效。 1 5 3 1 溶胶一凝胶整体柱 溶胶一凝胶整体柱是以烷氧基硅烷为主要原料，在催化剂、致孔剂存在下， 通过水解、缩聚反应实现溶胶凝胶化而形成的具有双孔结构的整体床层。随着溶 胶一凝胶技术的不断成熟以及超纯a l c o x y - s i l i c a 制备技术的建立，溶胶一凝胶整 体柱的研究也得到相应的发展。 硅胶整体柱可直接作为固定相或再进行衍生化，在制备过程中通过改变反应 物配比，可独立地控制大孔和中孔孔径，但制成的连续床层在于燥和老化过程中 易开裂，严重影响性效，并且制备过程较为复杂。同时，硅胶基质分离介质对极 性溶质，特别是对碱性溶质具有强非特异性吸附作用，以及导致生物大分子变性、 失活、化学稳定性相对较差等问题一直困扰着广大的分析工作者，其主要原因来 第一章绪论 源于硅胶中所含的杂质金属离子，以及在化学修饰或键合时因位阻等原因而导致 的在硅胶表面上残存的、或新生的硅羟基。 根据两性金属氧化物可以减弱碱性化合物与色谱柱内壁的作用力，研究者将 焦点集中在两性金属氧化物( 如二氧化钛、二氧化锆等) 包覆硅胶整体柱上，以解 决碱性化合物分离过程中的拖尾问题，s h i z - g 等用二氧化锆包覆硅胶整体柱 然后用磷酸盐和十八烷基磷酸修饰，在c e c 模式下成功分离了对二氨基联苯的 碱性化合物【6 3 朋。 1 5 3 2 以填充为基础的硅胶整体柱 以填充柱为基础的连续床层柱的制备方法是先将填料填充到毛细管中，再 通过溶胶一凝胶技术、聚合或高温烧结形成连续床层色谱柱。 烧结法是将普通的硅胶柱进行热处理，使硅胶粒子表面熔融，各个粒子相 互联结，进而形成连续床。h o r v a t h 等采用匀浆法制成6i imo d s 填充柱、经过 一系列处理后分别在1 2 0 和3 6 0 下进行热处理，填料表面因熔融而相互联结 在一起，然后键合c 1 8 。与普通填充柱相比，该方法制成的整体柱的机械强度、 稳定性都得到改善。在c e c 和h p l c 模式下对柱效进行了考察，其柱效与新填 充的普通填充柱的柱效类似。但该方法仍需柱子填充，并且高温烧结破坏了已键 合的c 1 3 固定相，需重新键合，与溶胶凝胶法相比，柱子制备相对复杂，因此 报道不多。 1 5 3 3 硅胶整体柱 制备方法通常采用溶胶一凝胶法。 将四烷氧基硅烷、聚环氧乙烷及催化剂在柱内水解缩聚生成凝胶，经干 燥、老化，制成硅胶整体柱。其可直接作为固定相或再进行衍生化。该方法制 成的色谱填料具有两种孑l 结构，分别为微米级的通孑l ( t h r o u g h - p o r e ) 和纳米级的中 孔( m e s o p o r e ) 改变反应物组成的比例，可独立地控制通孔和中孔的孔径，通孔 的存在使得硅胶整体柱具有优异的渗透性。不同的反应条件可使硅胶整体柱具有 两种形貌，分别为颗粒聚集型结构和网络结构。t a n a k a 等研究了两种孔的孔径 及硅骨架的尺寸对分离柱效的影响。发现塔板高度随流速的增幅较小，显示出该 柱在快速分离方面的潜能，并利用该柱对多肽进行了分离。但该方法制成的连续 9 北京化工大学硕士学位论文 床层在干燥和老化过程中易产生开裂，这会对柱效产生严重影响，并且制备过程 较为复杂只有少数几个实验室掌握了这种技术。由于硅胶为紫外透明，因此， 该类柱可以直接采用柱内检测。 1 5 4 杂化整体柱的制备 不论是有机聚合物整体柱还是硅胶整体柱，都有其自身的一些缺点。f 1 2 0 0 0 年h a y e s 及m a 1 i k 首次采用溶胶一凝胶法制备带c l s 的杂化整体柱之后，越来越多 的人将目光投向了杂化整体柱，以期能在一定程度上结合有机聚合物整体柱和硅 胶整体柱的优点，诸如制备简单、机械强度好及适用的p h 范围宽等。杂化整体柱 的制备过程主要是利用四烷氧基硅烷( 如四甲氧基硅烷( t m o s ) 或四乙氧基硅烷 ( t e o s ) ) 与带有机功能基团的三烷氧基硅烷在合适的条件下经水解一缩合反应 后形成带有该有机功能基团的有机一硅胶杂化整体柱。制备方法主要有一步法和 两步法。一步法即在合适的酸碱条件下，硅烷试剂的水解和缩合同时进行，最后 形成多孔的结构。两步法主要是根据在酸性条件下硅烷的水解反应速率远高于硅 羟基问的缩合反应，而在碱性条件下则相反的原理完成制备。具体操作为先在酸 性条件下将硅烷试剂完全水解，然后加入碱性试剂提高体系的p h ，使水解后的 预聚合液在碱性条件下发生缩合反应并形成整体多孔结构。制备的影响因素较 多，如致孔剂、水含量、硅烷试剂的比例、反应温度、p h 等【6 5 1 。目前用该方法 已制备了含有c 8 、c 3 、苯基、氨丙基、烯基、烯丙基、巯基等多种杂化整体柱。 其中一些整体柱还可进一步衍生，如可在氨丙基整体柱上经两步反应键合上胰蛋 白酶，制成酶反应器用于蛋白质的酶解。因为不同的有机硅烷试剂问的性质差异 较大，不同类型的杂化整体柱的制备条件差异也较大，需分别考察。 1 5 5 其他类型的整体柱制备 金属氧化物基质( 诸如氧化铝、氧化钛、氧化锆) 因比硅胶基质具有更好的耐 酸碱、耐高温及耐氧化剂等特点而受到了众多的关注，且在球形色谱填料的制备 上取得了很多成果，有关金属氧化物填料的制备及性质可参考相关综述。h o t h 等制备了多种金属氧化物( 包括氧化铝、氧化铪及氧化锆等) 整体柱。制备氧化铪 整体柱的过程为：将氯化铪、甲酰胺及环氧丙烷的溶液灌入经氢氧化钠处理的毛 细管中，在5 0 c 下缩合反应成胶，经老化后冲洗得到整体柱。但吡唑和咪唑在该 柱上拖尾严重，这可能是由于比表面积不够或是孔结构的不均匀造成的。r a n d o n 1 0 第一章绪论 等报道了用溶胶一凝胶法制各氧化锆整体柱的方法，即将锗醇盐的乙醇溶液与含 有乙酸、聚乙二醇及正丁醇的溶液t 昆合后水解，然后灌人柱管( 常规柱：2 如x 2 3 m m i d ：毛细管：2 5 锄7 5u m i d ) 内，在3 0 下保持2 4h 后升温到 1 5 0 ，再保持6h 。但该柱的径向分布不均匀，影响了柱效。在金属氧化物整 体柱修饰上，困这些基质表面不像硅胶基质那样容易进行化学罄饰，所以应用于 硅胶整体材料表面的修饰方法并不能很好地用于金属氧化物整体柱的修饰，这可 能导致该类基质的整体柱的实际应用受到很大的限制。 1 6 整体柱结构的表征 整体柱结构表征主要有扫描电子显微t ( s e m ) 、压汞法和氮吸附法。 0 0 0 1 9 0 3 g 1 0u m m e i i c k 目e - j 、r 图卜1 典型硅胶整体柱多孔结构扫描电镜图 f i gi - 1s e m p h o t o g r a p h o f e l 峭i c a ls i 0 2 m o n o t l t h i tc o l m a no f v e * i c u l a r $ t i n i g l x t r t 6 形貌观寨 s e m 可直观给出所观察床层截面的形貌及孔径情况，其缺点为只能给出断面 的局部结构信息。无法对整根柱子作出全面、综合的评价 北京化i 大学确学位论文 图12 放大的通孔电镜图 f i 9 1 - 2s e m p h o t o g r a p h o f m a g n i f y i n g t h r o u g h - p o m 圈卜3 二氧化胩毛细管f b 镜舶 f i g i - 3s e mp l o t o g r a p h o f s i 0 2e a p i l l a 叫r a m 溺一一 飘麟鬻蒺蒸一 第一章绪论 图卜4 硅胶整体拄骨架单片的中孔结构扫描电镜图 f i 9 1 - 4 s e m p h o ”g r 婶h o f $ i 0 2 m o n o l i t h i c c o l u m n o f f i n a o w o r k m 嚣q o s m m t u m 1 7 孔结构的评价 色谱材料的性能及其微观结构( 特别是孔结构) 有着重要关系，因此填料微 观结构的表征对认识，改善色谱壤抖性能，推动色谱壤料的应用有着重要意义。 如今许多方法已经用于孔径及孔径分布的测定，如扫描和透射电镜法【l q 、压汞 法、气体吸- 脱附法、量热孔度计法、液体驱除法和溶质截去法等嘲。但目前还 没有一种简单方法，既能铡定大孔也能测定中孔和小孔的方法，而是要根据孔大 小的范围( 不同等级的孔) 来选择测定方法。在通常情况下孔越小测定变得更 为困难。 1 7 1 、气体吸附脱附法 这种方法是常见的测定多孔材料中孔径和孔径分布的方法。不同的相对压力 ( p r a t = f p o ，为实际压力与饱和压力之比) 下，铡定一惰性气体在膜中的等温吸附 线和脱附线，根据这两条线的位置、形状和相互关系来确定膜孔的孔径和分布。 1 3 北京化工大学硕士学位论文 如果有适当的实验设备，气体吸附脱附法为一种简单的方法主要问题是采用适 当的模型来表征孔的几何形状，在此基础上才能有等温吸附一脱附线确定孔径及 孔径分布【6 7 郧1 。该方法能测定对传递过程不起作用的死端孔。对陶瓷膜通常能得 到比较好的结果，因为其结构较均匀而且受毛细管力影响小。 1 7 2 、压汞法 压汞法又称为汞孔度计法。汞不能使许多固体物质润湿，在不润湿的情况下， 接触角中大于9 0 0 ( 介于1 3 5 0 1 4 2 0 之间) ，表面张力会阻止液体进入孔中。利用 外加压力可以克服此阻力，孔径越小所需的外加压力也越大。因此，为使汞进入 并充满某一给定的孔，所需的压力就是衡量孔径大小的一种尺度，压汞法就是用 这一原理来测定孔径分布的。该法的一个缺点是对于小孔所需的压力很高，有可 能使膜结构破坏。这种方法能测量包括死端孔在内的所有膜孔。 1 7 3 、量热测孔法 量热测孔法是依据一种物理现象，即固体微核的凝固点降低与固液界面的曲 率半径密切相关，假定冷却时固相的微核在多孔膜的空腔内形成，并且与周围的 液体达到热力学平衡，则固体微核的凝固点降低依赖于固液界面的曲率半径。量 热测孔法就是建立在冷却过程中孔中物质相转变，将孔大小与凝固点降低及放出 热量进行关联的基础上的。 1 7 4 、液体驱逐法 液体驱逐法基本原理：对预先用液体浸润过的膜样品，借助加压的气体把孔 中的液体驱逐出来，通过测量气体的压力和流经膜样品的气体流量，即可计算出 孔径大小，得到孔径分布曲线。因为，对不同的多孔样品，其孔径大小和数量与 流量一压力间的关系曲线有关。液体驱逐法对于管状或片状多孔无机膜孔径 的测定，简单方便且准确可靠。又由于该法与前述的气体吸附脱附法、压汞法及 量热测孔法不同，它测得的是活性孔的孔径分布，即能透过流体的孔，因而更符 合实际。但该法测量范围为0 1 1 0 0 l u n 的孔，更小的孔则须采用其他方法测定。 1 4 第一章绪论 1 7 5 电子显微镜法 电子显微镜法包括扫描电镜法和透射电镜法。扫描电镜能直观地观测到膜顶 层表面形貌及孔径，其分辨本领为1 0 n m ，微滤膜的孔径范围为1 0 0 1 0 0 0 0 r i m ，这 样扫描电镜可以清晰地观察到微滤膜的全部结构，包括膜顶层表面、过滤层和底 层表面的孔大小。 透射电镜是利用透过的电子成像。换言之，成像的电子必须穿过样品。因此， 为了获得清晰的图像，通常要求样品厚度不能超过1 0 1 0 0 0 r i m 范围，样品太厚 电子不能穿透，也就无法成像，因此对样品的制备过程要求严格。 气体吸附脱附法( b e t ) 和压汞法】作为色谱填料结构性能的常规表征方法， 其测得的分析结果只是给出填料孔径的平均值，而得不到填料的孔径形貌和结构 等直观信息，而电子显微镜方法对色谱填料的研究目前还仅限于填料表观形貌的 观察。因此，本文提出采用电子显微学方法表征填料孔径的大小、形状和分布。 具体研究是用环氧树脂对微米级球形硅胶进行包埋，制作出相应的包埋块，经过 对包埋块修整、切削和喷镀等预处理后，进行扫描电子显微镜( s e m ) 分析研究。 此方法可以直接得到色谱填料孔径的形状，与传统方法相比更加直观和准确，是 传统表征方法在填料孔结构研究中的重要补充。 电子显微镜自1 9 3 2 年问世以来，经过半个多世纪的发展，其分辨本领已由 1 0 r i m ( 1 9 3 9 年第一台商用透射电镜) 提高到o 1 o 3 r i m ，不但可以直接分辨分子、 原子，而且还能够对纳米尺度的晶体结构及化学组成进行分析，成为全面评价固 体微观特征的重要的综合性仪器。目前，电子显微镜己广泛地用于聚合材料、无 机填料以及纳米材料的结构和形貌研究，而对色谱填料的研究还仅限于电子显微 镜在其放大倍率下对色谱填料的大小以及形状的研究，关于电子显微镜在高倍率 下对色谱填料内部孔径结构的研