（分析化学专业论文）分子印迹磁性微球在生物样品分析中的应用.pdf

分子印迹磁性微球在生物样品分析中的应用 专业： 学位申请人： 指导老师： 分析化学 李苑雯 胡玉玲副教授 摘要 分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , m 口) 具有构效预定性、特异 识别性、良好的化学稳定性等特点，在固相萃取、色谱分离、膜分离等方面得 到日益广泛的应用。分子印迹磁性微球结合了分子印迹技术和磁分离技术的优 点，具有特异性吸附能力，形状均匀可控，在外加磁场下实现磁分离，简化样 品前处理的操作。本文建立了真空微波辅助萃取鹏l 哚乙酸m p 磁性微球富集- 高效液相色谱( 1 1 i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 方法在植物生长素 分离分析中的应用，并初步研究了植物外源激素溶液浸种和清水浸种后豌豆、 水稻种子萌芽过程中生长素的含量变化。制备了莱克多巴胺m 口磁性微球，研 究其结构性质和萃取性能，并应用于猪肉和猪肝加标样品的分离富集。本文主 要研究内容如下： ( 1 ) 概述了分子印迹聚合物微球的合成和表征方法，其中重点介绍了分子 印迹磁性微球的研究进展。概述了分子印迹聚合物在生物样品前处理中的应用。 ( 2 ) 建立了真空微波辅助萃取弓l 哚乙酸m 口磁性微球富集h p l c 测定豌 豆和水稻中吲哚乙酸和吲哚丁酸2 种植物生长素的分离分析方法。研究表明， 与室温浸提法、2 0 c 过夜浸提法比较，真空微波辅助萃取具有更好的提取效果， 并缩短了提取时间。吲哚乙酸m p 磁性微球能有效消除基体干扰，选择性萃取 和富集豌豆和水稻中的生长素。吲哚乙酸和吲哚丁酸的检出限分别为1 9p l 和6 8 “l ，加标回收率分别为7 4 1 8 5 6 和6 9 6 8 3 2 。采用该方法初步 研究了植物外源激素赤霉酸( g i b b e r e l l i ea c i d ，g a 3 ) 溶液浸种和清水浸种后豌豆、 水稻种子萌芽过程中生长素的含量变化。 ( 3 ) 采用微波辐射法制备了莱克多巴胺m i p 磁性微球，研究其结构性能和 萃取性能，并应用于猪肉和猪肝加标样品中争兴奋剂的分离富集。采用扫描电 子显微镜、红外吸收光谱、热重分析方法、磁学性质测量和激光粒度分析表征 莱克多巴胺m m 磁性微球的表观形貌和结构特征。莱克多巴胺m p 磁性微球呈 均匀球形，表面疏松多孔，粒径主要分布在8 0 1 0 0l a i n ，具有良好的热稳定性 和超顺磁性。采用f r e u n d l i e h 方程拟合实验所得吸附等温线数据，结果表明莱 克多巴胺m p 磁性微球识别位点具有非均一性。对比其他结构类似物和对照物， 莱克多巴胺m i p 磁性微球对模板分子有较高的结合百分率，表明了其对模板分 子的特异性识别作用。建立了莱克多巴胺m i p 磁性微球富集h p l c 方法测定3 种d 兴奋剂的分离分析方法，方法的检出限为o 5 1 0l a g l 。该方法应用于猪肉 和猪肝加标样品中的3 种p 兴奋剂的分析，回收率分别为8 2 o 一8 9 6 和 8 0 4 8 6 8 ，r s d 为在6 以内，满足复杂基体样品中痕量p 兴奋剂分析的要 求。 关键词：分子印迹磁性微球，植物生长素，p 兴奋剂，高效液相色谱，生 物样品 u t h e a p p l i c a t i o no fm a g n e f l cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d s i nb i o l o g i c a ls a m p l e s m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y n a m e ：l iy u a n w e n s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rh uy u l i n g a b s t r a c t m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p ) a r e c h a r a c t e r i z e d b ys p e c i f i c r e c o g n i t i o np r o p e r t i e st o w a r d st h et e m p l a t em o l e c u l e s t h es t a b i l i t ya n dl o wc o s to f m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r sm a k et h e ma d v a n t a g e o u sf o ru s ei na n a l y s i s m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r sh a v eb e e na p p l i e di na ni n c r e a s i n gn u m b e ro f a p p l i c a t i o n s m a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d sc o m b i n et h ea d v a n t a g e so f m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dt e c h n o l o g ya n dm a g n e t i ct e c h n o l o g y m a g n e t i cm o l e c u l a r l y i m p r i n t e db e a d sc a nb ec o n t r o l l e di nr e g u l a rs i z ea n ds p h e r i c a ls h a p ea n dc a l lb e e a s i l ys e p a r a t e db ye x t e r n a lm a g n e t i cf i e l d s t h i ss t u d yd e v e l o p e das a m p l e p r e p a r a t i o nm e t h o di n c l u d i n gt h ev a c u u mm i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o n ( v m a e ) a n dm a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d si m p r i n t e db yi n d o l e a c e t i ca c i d ( t a a ) t o t h es e p a r a t i o no fa u x i nf r o mt h ep e a sa n dr i c ew h i c hg r e w 、加mo rw i t h o u tt h ep l a n t g r o w t hr e g u l a t o r t h er a c t o p a m i n em a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d sw e r e p r e p a r e da n de v a l u a t e d t h eb e a d sw e r ea p p l i e dt ot h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f 1 3 - a g o n i s t si nt h ep o r ka n dp i gl i v e r t h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h es y n t h e s i s a n dc h a r a c t e r i z a t i o nm e t h o d sa b o u tt h e m o l e c u l a r l y i m p r i n t e db e a d sw e r es u m m a r i z e d ，m a i n l ya b o u tt h em a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e d b e a d s 1 1 1 ea p p l i c a t i o no fm i pi nb i o l o g i c a ls a m p l e sw a sr e v i e w e d ( 2 ) am e t h o df o re x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no fi n d o l e a c e t i c a c i da n di n d o l c b u t a n o i c a c i d ( 1 1 3 a ) i np e a sa n dr i c ew a sd e v e l o p e db y v m a e i n d o l e a c e t i ca c i dm a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d se x t r a c t i o nc o u p l e d w i t hh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) 1 1 1 er e l a t i v e l yh i g h e ry i e l d n i o fi a aa n ds h o r t e re x t r a c t i o nt i m eb yu s i n gt h ev m a e p r o v e dt h a tt h i sm e t h o dw a s m o r ee f f i c i e n tc o m p a r e dt ot h ee x t r a c t i o na tt h er o o mt e m p e r a t u r ea n dt h ee x t r a c t i o n a t - 2 0 o v e r n i g h t t h em a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d se x h i b i t e dg o o d s e l e c t i v i t yr e c o g n i t i o nf o rt h el 蛆t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h em e t h o dw a s1 9 “l f o rl 执a n d6 8 r t g lf o ri b a t h er e c o v e r i e so b t a i n e df r o mt h ep e as a m p l e sa n d r i c es a m p l e sr a n g e df r o m7 4 1 t o8 5 6 f o r 认aa n df r o m6 9 6 t o8 3 2 f o r i b a t h em e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ep e a sa n dr i c ei nt h eg e r m i n a t i o np e r i o dw i t ho r w i t h o u tt h e p l a n tg r o w t hr e g u l a t o rt od e t e r m i n et h ec h a n g eo f a u x i n ( 3 ) t h em a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d sw e r ep r e p a r e du t i l i z i n g r a c t o p a m i n ea st h et e m p l a t em o l e c u l eb ym i c r o w a v ei r r a d i a t i o n t h es t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c sa n de x t r a c t i o np e r f o r m a n c eo ft h er a c t o p a m i n em a g n e t i cm o l e c u l a r l y i m p r i n t e db e a d sw e r ei n v e s t i g a t e dt h ei m p r i n t e db e a d sw e r ec h a r a c t e r i z e db y s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y f i t - m ) ，t h e r m o g r a v i m e t r i ca n a l y s i s ，v i b r a t i n gs a m p l em a g n e t o m e t e r ( v s m ) a n d l a s e rg r a n u l o m e t e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei m p r i n t e db e a d sw e r ei ns p h e r i c a l s h a p ew i t hd i a m e t e rf r o m8 0t o 12 0 肛ma n dt h es u r f a c ew a sp o r o u sa n dr o u g h f r e u n d l i c hi s o t h e r mw a sa p p l i e dt oc a l c u l a t et h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m a l t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h er a c t o p a m i n em a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d sp o s s e s s e da h e t e r o g e n e o u sb i n d i n g s i t ed i s t r i b u t i o n t h er a c t o p a m i n em a g n e t i cm o l e c u l a r l y i m p r i n t e db e a d sp o s s e s s e dt h eb e s tr e c o g n i t i o np r o p e r t i e st o w a r d s t h et e m p l a t e m o l e c u l a r t h er a c t o p a m i n em a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d sw e r ec o u p l e d w i t hh p l cf o rt h ea n a l y s i so ft h r e e1 3 - a g o n i s t s t h ep r o p o s e dm e t h o dp r e s e n t e d g o o dl i n e a r i t ya n dt h ed e t e c t i o nl i m i t sw a s0 5 - 1 0l x g l t h i sm e t h o dw a su s e dt o t h es i m u l t a n e o u sq u a n t i f i c a t i o no ft h r e e1 3 - a g o n i s t si np o r ka n dp i gl i v e r t h e r e c o v e r i e sw e r ef r o m8 2 0 t o8 9 6 a n df r o m8 0 4 t o8 6 8 f o rt h es p i k e dp o r k a n dp i gl i v e rr e s p e c t i v e l y , 丽mt h er s do f5 8 - 10 o ， k e yw o r d s ：m a g n e t i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e db e a d s ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , a u x i n , 1 3 - a g o n i s t s ，b i o l o g i c a ls a m p l e s i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在 导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名：吾茺耋 日期：b f c 7 年毛月亨e l 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本 人在导师指导下完成的成果，该成果属于中山大学化 学与化学工程学院，受国家知识产权法保护。在学期 间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专利，均 需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本 人不得以任何方式，以任何其它单位作全部和局部署 名公布学位论文成果。本人完全意识到本声明的法律 责任由本人承担。 学位论文作者签名李苑重 e i 势j - b f 。年月箩日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的 规定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或 其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论 文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书 馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有 关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保 存学位论文。 学位论文作者签名：戤雯 翩签名：嘲2 诊 日期：l ) 年毛月岁日 日期：z 汐f 睥易月夕日 第l 章绪论 第1 章绪论 样品前处理技术一直处于滞后状态且制约着分析化学的发展。在一个完整的 样品分析过程中，样品前处理所需要的时间往往最长，所使用的溶剂、装置等技 术问题，关乎到所建立的分析方法是否符合环保、自动化等要求。因而建立出一 种简便、快速、有效的样品前处理技术十分重要i l l 。分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l y i m p r i n t e dp o l y m e r , m i p ) 具有选择性高、稳定性好和制备简单的优点，可用于生物、 环境样品等复杂基体中痕量物质的分离富集，在样品前处理中的应用具有广阔的 前景。 1 1 分子印迹技术原理 分子印迹技术( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dt e c h n i q u e ，m i t ) 是基于分子识别，即模拟 生物体内的生物活性物质抗体和酶的识别机制，利用空间互补、共价和非共价作 用力来达到对分子的识别2 ，3 ，引，它最早可以追遇到f i s c h e r 的锁匙 理论i 研。 但直到2 0 世纪七八十年代，这一技术才真正有所突破。19 7 2 年w u l f f 等1 6 ，7 1 首 次成功制备出对糖类化合物有较高选择的共价型分子印迹聚合物。8 0 年代 m o s b a c h 等1 8 i 在n a t u r e 上发表了制备茶碱的非共价型m 口。随着w u l f f 和m o s b a e h 的开拓性工作，分子印迹技术得到迅速发展。由于分子印迹聚合物兼备了生物识 别体系和化学识别体系的优点，稳定性好、机械强度高、制各简单、可选择性识 别富集复杂样品中的目标物，大量关于m p 的设计、应用和进展的文献被发表i 引。 m d 被广泛应用于固相萃取、色谱分离、膜分离等方面的样品前处理技术【1 0 ，1 1 1 ， 显示出广泛的应用前景。 分子印迹是在合成的聚合物中建立对应于模板分子的选择性位点，模板分子 ( 包括原子、离子、分子、复合物或微生物) 加入到合成过程中，通过聚合或缩合 形成结合位点。 分子印迹技术包括以下的内容1 9 1 2 i ，原理可见图1 - 1 ： ( 1 ) 在适当的介质中，具有适当功能基的功能单体与模板分子之间发生相互 作用并聚集在模板分子周围，两者发生互补反应，形成单体模板分子复合物。 中m 人学硎i ：学位论分子印迹m 性馓球枉生物栉日分析中的a 用 功能单体与模板分子之间的相互作用类型包括以下一种或几种。见图1 - 1 示意图 的a 至e 表示：( a ) 和( b ) 为共价键；( c ) 离子键、( d ) 氢键或者范德华相互作用和 ( e ) 金属配位键为可逆共价键。 ( 2 ) 在致孔剂的存在下，在单体一模板分子复合物周围，功能单体与过量的交 联剂形成聚合物，从而使功能单体的功能基在特定的空间取向上固定下来。 f 3 1 以一定的物理或化学方法去除模板分子。聚合物去除模板分子后，留下 与模板分子在空间结构上匹配、与模板分子具有特异性结合功能基的三维空穴和 结合位点( b i n d i n gs i t e s ) 。这些空间结构和结合位点可以选择性地重新与模板分子 结合，即对模板分子具有专一性识别作用。 冷 ：凤 f 呵 2 0 图1 - i 分子印迹技术原理 国 蔑 根据模板分子和功能单体形成复合物时作用力的不同，分子印迹聚合物可以 分为共价型、非共价型和半共价型3 种不同类型。 共价型m i p 是由预组织法( p r e o r g a n i n a t i o 神制备，该法又称共价法。共价结 合型m 口最早由w u l f f 等i ”i 提出。该法制各的m i p 是由可逆共价键与单体结合 得到单体模板分子复合物，交联聚合后通过化学途径断裂共价键取出模板分子。 该方法得到的m m 能获得排列精确固定的结合基团，对模板分子的选择性好， 但t 别过程的结合和解离速度慢。 簿 第1 章绪论 非共价型m m 的研究和应用较多【1 4 l 。m o s b a c h 等1 1 5 1 首次制备了非共价结合 型m d 。该类型m 口的反应步骤远比共价印迹简单，还可应用于范围较宽的模 板种类。其中以氢键作用力最适宜于作精确的分子识别。这是由于氢键联结强烈 地依赖于单体和模板两者间的距离和方向。因此，对与模板相作用的不同单体， 必须带有能互补的功能基团( 如羧基，胺基，羟基及酰胺基等) 。模板分子中所带 的极性基团也是非共价相互作用所需要的1 1 6 l 。 半共价型m i p 兼备共价和非共价结合作用的特点，由s e l l e r g r e n 等l ”l 首次 报道。依靠单体和模板分子之间的共价结合作用形成聚合物，而当洗脱聚合物中 的模板分子后，在分子中依靠非共价作用识别或结合模板分子i l s l 。 1 2 分子印迹聚合物微球的研究进展 m 口的形态有聚合物块、珠、薄膜、表面印迹以及在固定容器内的就地聚合 等。采用本体聚合法制备整块聚合物是被应用最广的m p 制备方法。整块聚合 物粉碎过筛，获得不同粒径的颗粒。这种方法制备相对简单，反应条件也容易控 制，但是所得的m i p 形状和大小不规则、分散性差，应用于色谱分离往往效果 不理想。而且过程费时和产率低，研磨过程中可能会使m i p 的分子识别和选择 性下降，因而限制了本体聚合m i p 在分析中的应用i 例。为了克服本体聚合的不 足，把m i p 制各成为预想粒径的球形微粒。单分散性好的球形分子印迹聚合物， 不仅分子识别效率高、便于功能设计，而且制备和应用也更加方便，尤其适用于 作为固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n , s p e ) 、色谱和其他流经模式的应用中。 1 2 1 分子印迹聚合物微球的合成方法 1 2 1 1 悬浮聚合法 悬浮聚合法是一种简单常用的合成m m 微球的方法。m a y e s 等i ：o l 首先采用悬 浮聚合在全氟化碳溶液中制各分子印迹聚合物微球。传统悬浮聚合法包括了在水 中或者全氟化碳溶液中悬浮聚合，两种方法都可以得到高质量的m i p 微球，粒 径在5 - 5 0p r n 。非共价分子印迹聚合物的模板分子、单体和交联剂的自组装通常 中山大学硕：f ：学位论文 分子印迹磁性微球在生物样品分析中的应用 是以氢键和其他极性的相互作用，但是水相介质会弱化模板与功能单体之间的非 共价键，因此早期都是用全氟化碳溶液为分散介质来制备球形分子印迹聚合物。 但是，全氟化碳溶液价格较贵，所得微球的单分散性较差且需要加入含氟的表面 活性剂以稳定。因此人们尝试用其他液体作为分散介质，例如水溶液1 2 1 ，2 2 , 2 3 i 、 矿物油1 2 4 ，2 s 1 等。 1 2 1 2 种子溶胀悬浮聚合法 种子溶胀悬浮聚合法先用无皂乳液聚合或分散聚合制备小粒径单分散聚合 物微球，然后以此为种球，在单体存在下进行溶胀，使种球长大，再引发聚合制 得粒径为1 1 0 0p m 、单分散性、大粒径且粒径均一的聚合物微球【2 6 i 。种子溶胀 悬浮聚合法是在水相溶液环境下聚合，所得的m m 在极性环境下可以表现出较 好的分离效果和选择性2 7 ，2 8 , 2 9 i 。球形的微粒的分离能力跟本体聚合相近1 3 0 ，3 1 i ， 却可以得到更好的柱效率和峰型。h o s o y a 等【3 2 l 首先提出该方法并发展起来。 h a g i n a k a 课题组以水为分散溶剂用多步溶胀聚合法合成了多种m i p 微球包括使 用( j s ) 萘普生1 3 3 ，3 钔、心得安1 3 蜘、( 两布洛芬1 3 6 l 、d - 扑尔敏1 3 7 i 等作为模板分子。但是 多步溶胀聚合法制备过程较复杂繁琐，近年有报道把方法简化为一步式溶胀悬浮 聚合法p s i 、两步溶胀悬浮聚合法1 3 引。 1 2 1 3 沉淀聚合法 沉淀聚合法是生成的聚合物不溶于单体和溶剂，在聚合过程中形成的聚合物 不断沉淀析出的聚合反应。沉淀聚合法可以在不需要加入任何稳定剂的情况下合 成出聚合物微球1 4 0 4 1 l ，因此合成得到的微球表面洁净，可避免由稳定剂或表面 活性剂对模板分子的非选择性吸附i 铊i 。沉淀聚合法是另外一种简单的合成m i p 微球的方法，该方法一般能得到纳米尺寸的微球，可以用于毛细管电泳、免疫测 试中1 4 3 ，4 4 i 。该方法的优势是不需要表面活化和只需要对合成条件进行较少的优 化，即可以得到高质量高产量的微球。但这种方法的缺点是结合位点是位于微球 内部的网络中，导致对模板分子的萃取率较低。y e 等i 朽i 首次提出该方法。w a n g 等i 觚i 改进了合成方法，以d v b 为单体、在乙腈和甲苯的混合溶液中得到单分散 性和直径为5p m 的茶碱分子印迹聚合物微球，适合于色谱分离和作为s p e 的应 4 第1 章绪论 用。y o s h i m a t s u 等4 7 1 以单体d v b 、t r i m 或同时使用这两种单体合成( 回心得安 为模板分子的分子印迹聚合物微球，通过调整单体的比例，可以控制微球的粒径， 得到直径在1 3 0n i n 至2 4 a n 的微球。赖家平等i 伯1 采用沉淀聚合法合成了左旋甲 基多巴分子印迹聚合物微球。该分子印迹聚合物微球具有缓释药物的效果，把 m i p 应用于给药系统( d r u gd e l i v e r ys y s t e m ，d d s ) 的研究中。 1 2 1 4 表面印迹法 为了改善非共价聚合过程中带来的非均一性位点对m d 造成特异性减弱、 模板分子难以完全洗脱造成的泄露问题，表面印迹法被应用到m p 的合成中。 表面分子印迹技术是把具有识别位点的印迹层结合在基质表面的印迹方法，这种 方法合成的分子印迹材料的形状由基质材料决定。 利用表面印迹技术的一种合成法，是可以把分子印迹聚合物层嫁接在球形载 体材料的表面。应用最广泛的球形载体材料是硅胶球，因为不同大小和孔径的硅 胶球容易购买。这种方法优点是可以利用球形微粒的机械稳定性，并可以通过对 球形微粒本身性能的调节来满足应用的需要。m o s b a c h 等1 4 9 i 首先提出在硅胶的表 面接枝可聚合基团，再实现预聚溶液( 包括模板分子、交联剂和功能单体) 在硅胶 表面的聚合，该方法陆续被采用和继续发展。s u l i t z k y 等i 删将偶氮引发剂先接枝 在硅胶表面，再嫁接上一层以l - p h e n y l a l a n i n ea n i l i d e 为模板分子制备的m 口涂 层，涂层厚度为o 8n m 。该厚度可以控制，从而可以改善m i p 的动力学性质或 者加强m i p 对模板分子的识别性能。后来发展出使用引发转移终止剂( i n i t i a t o r t r a n s f e ra g e n tt e r m i n a t o r ，i n i f e r t e r ) 作为表面键合引发剂队5 2 i 。此外，有报道把模 板分子固定在硅胶球体表面的孔内合成得到m i p 微球1 5 3 5 4 1 。y i l m a z 等1 5 5 1 提出了 以硅胶球的形态作为“模板分子 ，借助硅胶球的多孔性和形状作为模板合成了 m 口微球，是一种可以控制微球尺寸和孔径的合成方法。 表面乳液聚合法是近年出现的一种新方法，微球粒径可以控制在1 0 1 0 0 岬。 但该方法使用的功能单体和乳化剂般需要特殊合成，增加了成本，限制了应用。 y o s h i d a 的课题组在这方面做了较多的工作，利用该法合成得到的z n 2 + m p 微球， 对z n 2 + 的选择性远远高于对c u 2 + 的选择性1 5 6 1 。y o s h i d a 等陆续把该法得到的m i p 应用于稀土金属1 5 7 1 、镧系元素1 5 a l 的研究中。 5 中山大学硕士学位论文分子印迹磁性微球在生物样品分析中的应用 1 2 2 分子印迹聚合物微球的表征方法 分子印迹聚合物微球的表征仍采用传统聚合物微球的表征方法以及其他分 子印迹聚合物的表征方法。采用吸附模型对分子印迹聚合物微球的选择性识别进 行测量，也是对其萃取性能表征的一个重要方法，近年来受到越来越多的关注。 1 2 2 1 分子印迹聚合物微球的成分和结构表征方法 分子印迹聚合物微球的化学成分分析沿用传统有机化合物的分析方法，如红 外光谱、热分析、元素分析等。 傅立叶变换红外光谱分析( f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y , f t - i r s p e c t r o s c o p y ) 用来对分子印迹聚合物微球结构中的功能基团进行研究。可以通过 谱图研究分子印迹聚合物的化学组成、对比和空白聚合物( n o n - m o l e c u l a r i m p r i n t i n gp o l y m e r , n i p ) 的差别、对比去除印迹分子后前后印迹孔穴内是否留有 与印迹分子相互作用的官能团5 纠。 热分析是指用热力学参数或物理参数随温度变化的关系进行分析的方法。 最常用的热分析方法有：差( 示) 热分析、热重量法、导数热重量法、差示扫描量 热法、热机械分析和动态热机械分析。热分析技术能快速准确地测定物质的晶 型转变、熔融、升华、吸附、脱水、分解等变化，对无机、有机及高分子材料 的物理及化学性能方面，是重要的测试手段。 分子印迹聚合物微球的结构表征一般从以下几个方面进行：形状、微球体积、 粒径大小和分布和比表面积等。 粒径大小及其分布是描述印迹微球性质最基本的指标，粒径可以用电子显微 镜观察，也可以用光子相关光谱技术0 h o t o nc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y , p c s ) 1 6 0 1 , 激 光粒度分析仪( 1 a s e rl i g h ts e a t t c r i n g 。l l s ) 、静动态光散射仪等光学仪器测试。 常用扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y , s e m ) 对分子印迹聚合物 微球的表观进行表征。 溶胀比( s w e l l i n gr a t i o ，s r ) 表示聚合物吸收一定量溶剂而溶胀的比值，是为了 测定聚合物吸收溶剂的量。通过把聚合物分散置于溶剂中，测得分散在溶剂中的 微球的质量( 所) 和溶剂干燥后的质量( 赐) ，按照以下公式1 1 计算【6 l l 。有文献报 道m m 的溶胀比比n i p 的大，但原因还不清楚，推测是由于m 口由于模板分子 6 第l 章绪论 去除后有更多的孔隙结构。 s r = 塑t ，, ，, r ，( 1 - 1 ) 吸附测量( 例如氮吸附或者汞吸附) 可以用来测量微球的比表面积、孔隙容积 和孔径。例如通过b e t 比表面积进行分析。 1 2 2 2 分子印迹聚合物微球分子识别过程的吸附模型研究 分子印迹聚合物微球的最大性能特征就在于其对印迹分子的选择性识别。因 此，准确测量这些性质十分必要。m 口的分子识别行为可以通过聚合物的亲和力 和特异性，通常是通过在溶液中的平衡结合实验或者色谱、电化学等进行定量分 析1 6 2 l 。应用吸附等温线是评价印迹聚合物亲合特性的主要方法。m i p 的结合特 性可以从相关的实验结合等温线计算得到。这些计算是根据m i p 的结合位点应 用对应的模型和假设i l o l 。 吸附等温线是通过测量聚合物对一系列浓度的分析物的结合效率，以达到吸 附平衡时结合在聚合物上的分析物浓度( 召) 对溶液中游离的分析物浓度( d 作图得 到。通过批量结合实验( b a t c hr e b i n d i n gs t u d i e s ) 来实现。批量结合实验是使用恒量 的聚合物用于平衡吸附一系列浓度的分析物，然后通过使用色谱、光谱等定量测 定n 根据庐阿求的b ，其中z 是加入分析物的浓度。相反地，可以固定分析 物的浓度，通过改变聚合物的用量来完成该实验。 结合模型用以拟合所得的实验结合等温线，表示了吸附平衡时结合在聚合物 上的分析物浓度旧) 对溶液中游离的分析物浓度之间特殊的数学关系。这个数 学关系式基于一个系统内组成的假设，尤其是不同结合位点的种类以及这些位点 的数量。 图1 - 2 m i p 的均一性和非均一性示意图 m i p 表面的识别能力可以分别两种类型：均一性和非均一性，见图1 - 2 所示。 7 中山人学硕： ：学位论文分子印迹磁性微球在生物样品分析中的应用 均一性由于孔穴的大小和形状相同，所有的结合位点都有相同的亲和力和选择 性。相反，非均一性系统由于孔穴的大小和形状各异，导致有多种亲和力和选择 性的位点。非均一性导致m m 有较高的结合位点差异性和较低的平均结合亲和 力，使得m i p 作为固定相的时候出现峰展宽、作为催化剂时降低了选择性i “，吲。 非均一性的存在限制了m 口的进一步发展。非均一性特性尤其存在于非共价方 法合成得到的m i p ，但由于非共价合成法简便廉价等特点，仍然是应用最多的一 种m i p 合成方法。许多研究试图改善非共价聚合m p 的方法，例如用更低的聚 合温度、更高浓度的模板分子或者交联剂来合成m i p 、选择性地对表面进行化学 改性。眠6 7 , 碍i 。 目前常用的结合模型见图】- 3 ，包括：( a ) l a n g m u i r 模型；c o ) b i - l a n g m u i r 模 型；( c ) f r e u n d l i e h ；( d ) l a n g m u i r - f r e u n d l i c h 模型。b 和f 在每种模型中都有对应的 数学关系，每种模型也会对结合位点有对应的假设。选择结合模型，要根据与实 验得出的等温线的相似程度。模型的本质是反映实验所得的位点分布以得到实际 情况的结合常数。s h i m i z u 等以较多带有非均一性的m i p 为依据，提出非共价印 迹聚合物这些位点的分布是应该是连续的，这个分布称为亲和分布曲线( a f f i n i t y d i s t r i b u t i o n ，a d ) ，表示结合位点数随结合常数( x 3 变化。如图1 - 3 各图中的虚 线部分。这个曲线包括两部分：单峰部分，属于低结合常数k 的范围，是聚合 物达到和接近饱和的状态：指数衰减的形式，属于高结合常数范围，是聚合物在 亚饱和状态。 ( a ) ( c ) ( b ) 畦一娃l l o g l o gj 0 lo口kogk 图1 3 离散分布模型 ”和连续分布模型( c ，d ) 3 第1 章绪论 这些模型被分为离散分布模型和连续分布模型i 谚i 。l a n g m u i r 和b i l a n g m u i r 属于离散型分布模型。这两个模型经常被使用，因为它们很容易根据s c a t c h a r d 分析得到，而且通过这两个模型和容易得到结合位点数目和结合常数k 。离散 分布模型把位点的分布简化为是有限数目的不同类型的结合位点，每种位点的结 合能力不同。l a n g r n u i r 模型和b i l a n g m u i r 模型分别假设聚合物只有一种类型的 位点和只有两种类型的位点存在。而实际上位点的分布是存在一个广泛的范围内 的非均一性，因此离散分布模型存在缺陷。 针对离散分布模型在的缺陷，连续分布模型表示位点的分布是有无限种不同 类型的，从而可以更准确地计算到m 疋在更宽范围的位点分布，以及可以量化 地计算出位点相关的分布和非均一性。f r c u n d l i c h 和l a n g r n u i r - f r c u n d l i c h 模型属 于该类型，近来被更多地应用在m 口相关计算中。 f r e u n d l i c h 等温线( f r e u n d l i c hi s o t h e r m ，f i ) 的应用较简单，见公式1 2 ，是丑 和f 的幂函数关系式。指数a 是用来表征总结合位点数坼和平均亲和力杨。坼 和杨需要进一步的实验和计算得到。m 为非均一性指数，数值范围在0 到l 。 当m = l ，表示聚合物是具有均一性，而o 1 之间则表示聚合物具有非均一性。 f r e u n d l i c h 等温线也常以对数的形式以公式1 3 表示，这种形式表示是f r e u n d l i c h 等温线时会得到一条直线，斜率和y 轴的截距则为m 和l o ga 的值。有报道研究 非共价m 四时，改变模板分子、合成条件和亲和力等，发现1 2 种非共价m i p 中有1 1 种符合f r e u n d l i c h 等温线模型。从公式1 - 4 、公式1 5 和公式1 - 6 中可以 计算得到结合位点数帆“：和平均相关系数g k t k 2 。这两个数值的计算的取值范 围可以是整个测量范围内伍赫至蜀d 的k i - k 2 。f r e u n d l i c h 等温线的局限性在于 不能应用在聚合物饱和状态下的计算，不能计算出总结合位点数坼和平均亲和 力杨。针对这些局限性，l a n g m u i r - f r e u n d l i c h 等温线可以应用在聚合物饱和状态 和亚饱和状态。 b = a f 辨 l o gb = m l o g f + l o g a k = 忐= 亡 9 ( 1 2 ) ( 1 3 ) ( 1 4 ) 中山大学硕士学位论文分子印迹磁性微球在生物样品分析中的应用 心一：= a ( 1 - m 2 ) ( 墨叫- k 2 叫) 聊k 1 1 一一足，1 一辨 = = 一- - 二- - - - - - - - - - - - ：二- 一，l 一1 k l 一- k 2 一” ( 1 - 5 ) ( 1 6 ) l a n g m u i r - f r e u n d l i c h 等温线通过3 个拟合系数坼、a 、和肌来描述在非均一 性系统中吸附平衡时的被结合物结合浓度) 和游离浓度的关系。尽管 l a n g m u i r - f r e u n d l i c h 等温线可以用于m p 在饱和与亚饱和状态下的行为表征，但 是对于大多数的m m 都是用于亚饱和状态下的测量，因此应用f r e u n d l i c h 等温线 已经足够。 两种聚合物的相对的结合能