（分析化学专业论文）蛋白质与荧光探针的作用及其分析应用研究.pdf

摘要 蛋白质是生命最重要的物质基础之一，其定量测量是化学、生物化学、医学等研究 领域的重要课题。近年来荧光探针染料与蛋白质结合后的荧光特性、动力学特征和电化 学特征等受到关注，并以此为基础建立分析方法。荧光探针技术最大的特点是具有高度 的灵敏性和极宽的动态响应范围，进一步建立高灵敏度、低检测限的荧光探针定量测定 蛋白质的方法具有重要意义。 本论文主要包括以下两个方面的内容： 1 概述蛋白质的化学基础，综述了蛋白质定量分析的一些主要方法及其在生物化学、药 学、食品和临床医学等方面的应用，引用文献1 1 2 篇； 2 寻找探索新的性能优良的荧光探针 ( 1 ) 荧光染料探针：研究发现，荧光桃红b 在p h = 2 8 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲介 质中能与血清蛋白形成复合物，蛋白质可使荧光桃红b 的荧光强度减弱，并且其减弱 程度对人血清白蛋白( h s a ) 的线性范围是0 0 2 o 2 4m g l ，检测限为8 3 t t g l ，对0 1 m g l 的h s a 的1 1 次平行测定的标准偏差为2 3 ，回收率为9 2 6 - - 9 6 2 ，说明本 方法准确可靠。 ( 2 ) 二聚体荧光染料探针：研究发现，中性介质中钙黄绿素在表面活性剂c t m a b 的作用下形成二聚体，体系荧光强度减弱，而加入蛋白质后体系荧光强度增强，且增强 程度与体系中的蛋白质的量呈线性关系，此方法对h s a 的线性范围为o 4 8m g l ，检 出限为3 4 9 9 l ，对牛血清白蛋白( b s a ) 的线性范围为o 8 1 0 m g l ，检出限为3 2 t t g l ， 对卵蛋白( a l b ) 的线性范围为l 1 6 m g l ，检出限为4 7 k t g l ：碱性介质中，水溶性荧 光素( s f ) 二聚体可作为测定人血清总蛋白的荧光探针，方法的线性范围为o 3 6 m g l ， 检出限为6 9 9 9 l ，对3m g l 的h s a 的1 1 次平行测定的标准偏差为0 9 6 。中性介质 中，水杨基荧光酮二聚体可作为测定人血清总蛋白，方法的线性范围为o 8 1 2 m g l ， 检出限为8 0 p g l ，对含量为2m g l h s a 的1 1 次测定的相对标准偏差为1 1 。将以上 方法直接应用于人血清的测定，与经典的考马斯亮蓝法测定的结果相吻合，结果令人满 意。 3 深入开展蛋白质与染料探针相互作用机理研究 研究了染料与蛋白质以及染料、表面活性剂和蛋白质的荧光光谱和紫外光谱，对其 反应机理进行深入的研究。深入开展蛋白质与燃料探针的相互作用的理论研究不仅对于 改进蛋白质分析方法有实际意义，而且有助于阐明生物大分子与小分子配体相互作用的 化学本质。因而在生命科学中有重要意义。 关键词：蛋白质，荧光探针，染料二聚体，表面活性剂 i i a b s t r a c t p r o t e i ni so n eo f t h em o s ti m p o r t a n ts u b s t a n c e so fl i f e t h u st h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n i sav i t a l s u b j e c ti nt h ef i e l d so fc h e m i s t r y , b i o c h e m i s t r ya n di a t r o l o g yf i e l d i nr e c e n ty e a r s ，t h e f l u o r e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i c ，k i n e t i c sc h a r a c t e r i s t i ca n de l e c t r o c h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i co fi th a sb e e n r e s e a r c h e da f t e rf l u o r e s c e n c ed y ep r o b eb i n dt op r o t e i n a n db a s e do nt h i s ，s o m en e wa n a l y t i c a lm e t h o d s w e r em a d e t h ed i s t i n c tc h a r a c t e r so ff l u o r e s c e n c ep r o b ei si th i g hs e m i t i v i t ya n dg o o dl i n e a r i t y s oi ti s v e r yi m p o r t a n tt of i n dn e wf l u o r e s c e n c ep r o b ew i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n dl o wd e t e c t i o nl i m i t t h ec o n t e n to f t h i sp a p e ri n c l u d e st w op a r t s ： 1 i nt h ep a p e r , p r o t e i nc h e m i s t r yb a s ew a ss u m m a r i z e d ，a n ds o m em a j o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sm e t h o d so f p r o t e i na n dt h e i ra p p l i c a t i o ni nt h ef i e l d so fb i o c h e m i s t r y , m e d i c i n e ，f o o da n dc l i n i c a lm e d i c i n ew e r e r e v i e w e di nd e t a i l s 11 2r e f e r e n c e sw e r ec i t e di nt h i sp a p e r 2 s e a r c hf o rt h en e wf l u o r e s c e n c ep r o b e ( 1 ) f l u o r e s c e n c ed y ep r o b e ：p h l o x i n eb ( p b ) c a nb i n dt op r o t e i nt of o r mac o l o rc o m p l e xi np h 2 8 b r i t t o n - r o b i n s o nb u f f e rm e d i u m b y i n gd e t e r m i n i n gt h ec h a n g eo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fp ba n dt h e c o m p l e xo fp ba n dp r o t e i n , w ef o u n dt h a ta d d i n gp r o t e i nc a r lm a k et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fp b w e a k e n , m o r e o v e rt h ed e c r e a s ee x t e n ti sg o o dp r o p o r t i o n a lt ot h eh u m a ns e r u ma l b u m i nf h s a ) c o n t e n ta t t h er a n g eo f 0 0 2 - o 2 4m g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i to f8 3 鹏几t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o f 1 1p a r a l l e ld e t e r m i n a t i o n sw i t ho 1m g1 1h s ai s2 4 a n dr e c o v e r i e si si nt h er a n g eo f 9 2 6 - 9 6 7 i t i ss h o w e dt h a tt h i sm e t h o di sr e l i a b l e ( 2 ) t h ed i m e ro f f l u o r e s c e n c ed y ep r o b e ：i nt h ep r e s e n c eo f a p p r o p r i a t ea m o u n t so f c a t i o n i cs u r f a c t e n t o fc e t y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ( c t m a b ) ，t h ea n i o n i cd y ec a l c e i ni sd i m e r i z e da n dt h ew e a k l l i f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f c a l e e i nd i m e rc a nb ee n h a n c e db ya d d i n gp r o t e i n si nt h em e d i u ma tp h6 - 8 t h e e n h a n c e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i n si nt h er a n g e0 4 8m g lf o r h u m a ns e r u ma l b u m i n ( i s a ) ，0 8 1 0m g lf o rb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n d1 - 1 6m g lf o ra l b u m i n ， w i t hd e t e c t i o nl i m i t so f 3 4 l _ t g l ，3 2 p g la n d4 7 p g lr e s p e c t i v e l y ；i na l k a l i n eb u f f e r , s o l u b l ef l u o r e s c o i n ( s f ) d i m e rc a nb e e nu s e dt od e t e r m i n eh s ai nt h er a n g eo fo 3 - 6 m g l ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tf o u n dw a s 6 9 “g l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o f1 1p a r a l l e ld e t e r m i n a t i o n sw i t h3m g1 一h s ai s0 9 6 i nt h en e u r a lm e d i u ms a l i c y l f l u o r o n e ( s a f ) d i m e rc a nb e e nu s e dt od e t e r m i n eh s ai nt h er a n g eo f 0 8 1 2 m g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i tf o u n dw a s8 0 “g l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n 限s d ) o fl1p a r a l l e l d e t e r m i n a t i o n sw i t h2m g1 lh s ai s1 1 t h ed e t e r m i n a t i o nr e s u l t so f a b o v em e t h o d sa r es a t i s f a c t o r yb y c o m p a r i n gw i t ht h ec o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg - 2 5 0 ( c b bg - 2 5 0 ) m e t h o d 3 f u r t h e rd e v e l o pf o rt h ei n t e r a c t i o nt h e o r yb e t w e e np r o t e i na n dd y ep r o b e t h ef l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r aa n dt h ea b s o r p t i o ns p e c t r ao fd y e ，t h ec o m p l e xo fd y ea n d p r o t e i na n dt h ec o m p l e xo fd y e ，s u r f a c t a n ta n dp r o t e i nw e r es t u d i e d t h er e a c t i o nm e c h a n i s m so ft h e m w e r ea n a l y z e d i tw a sv e r yi m p o r t a n tn o to n l yf o ri m p r o v i n gt h ea n a l y s i sm e t h o do fp r o t e i n s , b u ta l s o b e i n gp r o p “i o n st oi l l u m i n a t ec h e m i s t r ye s s e n c eo f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb i gb i o l o g ym o l e c u l ea n ds m a l l l i g a n dm o l e c u l e s oi tw a sv e r yi m p o r t a n tf o rt h el i f es c i e n c e k e y w o r d s ：p r o t e i n , f l u o r e s c e n c ep r o b e ，d y ed i m e r , s u r f a c t a n t 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河 南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 日期：坌! 巫16 ，垒 第一章绪论 第一章绪论 1 1 课题背景、目的和意义 蛋白质是人体中重要的生物大分子，它不仅对于维持生命是十分重要和必不可少 的，同时，它对于生命遗传密码的翻译、信息的转录、d n a 的复制等都有密切关系。 蛋白质的功能很多，它与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质的逆转、遗传、 生命的起源和生物进化等有密切的联系，它是生命现象的物质基础。正是由于蛋白质本 身的重要性，所以对它的研究一直受到人们的重视。其定量测量是化学、生物化学、医 学等研究领域的重要课题。 荧光分析法由于其灵敏度高、选择性好、检测限低，分析方法简便等优点而使其在 生物大分子定量测定中备受青睐。近年来荧光探针染料与蛋白质结合后的荧光特性、动 力学特征和电化学特征等受到关注，并以此为基础建立分析方法。荧光探针技术最大的 特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围，为进一步建立高灵敏度、低检测限的 荧光探针定量测定蛋白质的方法具有重要意义。其测定机理是根据蛋白质对探针分子荧 光强度的影响，探针分子荧光强度的变化与加入蛋白质的量有明显的线性关系，从而可 以进行定量测定。荧光探针的引入，也可使蛋白质分子发生荧光猝灭或荧光增强现象。 荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的 物理或化学作用过程。荧光猝灭主要分为静态猝灭和动态猝灭两种。前者是由于荧光发 色基团与猝灭剂形成了不发荧光的复合物而发生荧光猝灭，后者则是由于猝灭剂在激发 态寿命时间内扩散或插入到蛋白质的荧光发色基团中，使之不发射光子而直接返回到激 发态。近年来，二聚体荧光染料作为一类新的荧光探针引起了人们的极大兴趣。许多有 机分子，尤其是荧光染料在水溶液中浓度较大时或在极性较大的有机溶剂中能够形成二 聚体，二聚体的形成目前主要有两种方式：人工合成和现场形成。文献资料表明【l “，荧 光染料二聚体作为荧光探针已用于d n a 的定量测定，具有灵敏度高、线性范围宽的特 点。蛋白质和d n a 都是生物大分子，荧光染料二聚体作为测定蛋白质的荧光探针也有 一些报道睁引，以染料二聚体作为荧光探针，建立蛋白质定量测定的新方法具有一定的 实用价值。 第一章绪论 1 2 蛋白质化学基础 蛋白质是一切生命之源，各种生命活动主要是通过蛋白质来体现的。它不仅是构成 机体组织器官的基本成分，而且它的不断合成和分解，推动生命活动，调节正常生理功 能，保证机体的生长、发育、繁殖、遗传及修补损伤的组织。蛋白质是生命的基础，被 誉为“人体的建筑材料”、“生命之砖”。在正常人体机体中，蛋白质占1 8 ，在人体除 掉水分后的干物质中大约占5 0 ，人体的皮肤、肌肉、血液、内脏主体为蛋白质，毛 发、骨骼、指甲及体内各种激素、抗体、酶均是蛋白质p j 。 对人体而言，每种蛋白质各有其特殊功能，一种蛋白质不能代替另一种蛋白质。归 纳起来，蛋白质主要有以下几种作用。形成新的组织：人体的生长发育均依赖于蛋白 质的合成，损伤组织的修复需要合成新的蛋白质，妊娠期间乳房、子宫等均需要额外的 蛋白质合成；调节功能：细胞和体液中的蛋白质均有调节功能，许多调节人体生理 功能的激素，如胰岛素、生长激素和消化道激素，以及人体抗御病源侵袭的抗体等都是 蛋白质，水平衡和渗透压都受血浆蛋白质的调节；维持平衡：人体内的蛋白质常处 于动态平衡之中，如血细胞和肠细胞的更新，人体的汗液、头发、手指、皮肤、尿和粪 可损失蛋白质；产生能量：食物蛋白质进入人体分解代谢为氨基酸，氨基酸的分解 作用可产生能量，每克蛋白质大约可产生4 千卡热量，故进食首先考虑机体的能量需要， 而膳食和组织蛋白将用于机体建造和修补过程中蛋白质的消耗；其他：人奶也是由 蛋白质生成的，妇女在哺乳期间需要从饮食中补充的蛋白质至少于分泌奶中的蛋白质相 当，这样方可保证供给机体充足的蛋白质【5 】。 1 2 1 蛋白质的化学组成 蛋白质是以氨基酸为基本单位的生物大分子，其分子量变化很大，从大约6 0 0 0 到 1 ，0 0 0 ，0 0 0 道尔顿( d a l t o n ) 或更大一些，含碳5 0 5 5 、氢6 8 、氧1 9 2 4 、 氮1 3 1 9 。除此四种元素之外，大多数蛋白质还含有少量硫，有的还含有少量的磷、 碘或金属元素铁、铜、锰和锌等。大多数蛋白质含氮量比较接近而恒定，平均为1 6 ， 这是蛋白质元素组成的一个重要特点，也是凯氏( k j e d a h l ) 定氮法测定蛋白质含量的计 算基础：蛋白质含量= 蛋白氮o 1 6 。 1 2 2 蛋白质的结构 2 第一章绪论 ( 1 ) 蛋白质结构的基本单位氨基酸( a m i n oa c i d ) 蛋白质是高分子有机化合物，结构复杂，种类繁多，但其水解的最终产物都是氨基 酸。因此把氨基酸称为蛋白质结构的基本单位。天然存在的氨基酸约1 8 0 多种，但参与 蛋白质组成的常见氨基酸只有2 0 种。在蛋白质的生物合成中这些氨基酸依照不同的基 因密码连接成不同顺序的肽链。这些氨基酸称为基本氨基酸。除脯氨基酸外，这2 0 种 氨基酸在结构上的共同点是与羧基相邻的a 碳原子上都有一个氨基，因而称为a 氨基 酸。各种c t 氨基酸的区别在于侧链r 基的不同。按r 基的化学结构，2 0 种氨基酸可以 分为脂肪族、芳香族和杂环族三类，其中以脂肪族氨基酸为最多( 1 5 种) 。但从光学性 质来看，以芳香族的苯丙氨酸p h e 、酪氨酸t y r 和杂环族的色氨酸t r p 最为重要，这三 种氨基酸在紫外区有吸收而且能发射荧光。 按r 基的结构和性质，2 0 种氨基酸可以分成四组：1 非极性r 基氨基酸：2 极性不 解离r 基氨基酸；3 酸性r 基氨基酸；4 碱性r 基氨基酸。其中，碱性r 基氨基酸值 得注意。这类氨基酸包括赖氨酸l y s 、精氨酸a r g 和组氨酸h i s 三种氨基酸。赖氨酸脂 肪链的位上有一个氨基；精氨酸含有一个带正电荷的胍基；组氨酸有一个弱碱性的咪 唑基。在p h 低于7 的酸性溶液中，这三种氨基酸的r 基质子化，从而使蛋白质带净正 电荷。当某些染料分子( 酸碱指示剂) 与带正电荷的蛋白质靠近时，可发生质子离解作 用而使染料的颜色发生变化，从而可用于蛋白质的分析。 ( 2 ) 多肽 在生物体中的蛋白质处于动态变化之中，一方面不断的进行合成，另一方面也不断 地分解。人体从体外摄入的食物蛋白质，在口腔中不受酶素的影响，仅于咀嚼后咽入胃 中，经过胃蛋白作用，借助胃液中的胃酸，使蛋白水解为多肽，寡肽等。一个氨基酸的 氨基同另一个氨基酸的羧基相连接脱水可以使氨基酸相互反应形成肽。氨基酸通过肽键 相连，由两个氨基酸组成的肽，成为二肽，三个氨基酸组成的肽成为三肽，依此类推。 一般把十个氨基酸一下组成的肽，成为寡肽，十个氨基酸以上组成的肽，称为多肽或多 肽链。多肽链中的氨基酸由于参与肽键的形成，以非原来完整的分子，成为氨基酸残基。 氨基酸( 6 3 0 个残基) 通过肽键连接形成的短链称为多肽。通常将分子量低于一 万者称为多肽，高于一万者称为蛋白质，但这种界限不是很严格。一般认为，多肽和蛋 白质的根本区别在于蛋白质一般含有弘螺旋结构，这种结构的主要功能是稳定蛋白质的 总的构象；多肽一般没有a 螺旋，其构象有很大的可变性和可塑性。 第一章绪论 蛋白质和多肽是构象、性质和功能都不同的两类物质。蛋白质是生物体的功能大分 子，负责完成生物体所需的各种功能，如氧的运输、生化反应的催化、肌肉收缩、免疫 反应、血液凝固等；而生物体内的活性多肽则属于体内的化学信息传递物质，如生长、 发育、生殖以及兴奋等生命现象，都需要多肽激素( 信息分子) 发挥作用。 ( 3 ) 蛋白质的分子结构 蛋白质是具有三维空间结构的高分子物质，根据蛋白质肽链折叠的方式与与复杂程 度，将蛋白质的分子结构分为一、二、三、四级，即一级结构和空间结构( 包括二、三、 四级结构) 。蛋白质的一级结构是基础，它决定蛋白质的空间结构，其概念可小结如下： 蛋白质是由不同的氨基酸种类、数量和排列顺序，通过肽键而构成的高分子有机含氮化 合物。它是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性的和生物学功能多样性的基础。多 肽链的一级结构存在有三种形式，即无分支的开链多肽、分支开链多肽和环状多肽；蛋 白质的二级结构是指多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并 以氢键为主要的的次级键二形成有规则的构象，如q 螺旋、p 折叠和p 转角等。蛋白质 的结构一般不涉及氨基酸残基侧链的构象；超二级结构是指在多肽内顺序上相邻的二级 结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。目前发现 的超二级结构有三种基本形式：a 螺旋组合( n a ) 、p 折叠组合( p 郎) 和a 螺旋p 折叠 组合( 陋1 3 ) ，其中以p a p 较为常见；结构域是位于超二级结构和二级结构之间的一个层 次，在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形 成一个或多个相对独立的致密的三维实体，即结构域；具有二级结构、超二级结构或结 构域的一条多肽链，由于其序列上相隔较远的氨基酸残基侧链的相互作用，二进行范围 更广泛的盘曲与折叠，形成包括主、侧链在内的空间排列，这种在一条多肽链中所有原 子或基团在三维空间的整体排列称为三级结构，三级结构中多肽链的盘曲方式由氨基酸 残基的排列顺序决定；蛋白质的每条肽链被称为一个亚基，由两个或两个以上的亚基之 间彼此以非共价键相连而形成更复杂的构象，称为蛋白质的四级结构【6 】。 1 2 3 蛋白质的性质 ( 1 ) 蛋白质的高分子特性 蛋白质是一类高分子化合物，高分子特性是蛋白质的重要性质，也是蛋白质胶体性、 变性和免疫学性质的基础。分子量一般为l 1 0 4 1 x 1 0 6 d 或更高，例如，牛胰岛素的分 4 第一章绪论 子量为5 , 7 3 3 d ，而牛肝谷氨酸脱氢酶则为l ，0 0 0 ，0 0 0 d ，分子量相差很大。 ( 2 ) 蛋白质的变性 某些物理和化学的因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性 的丧失和一些理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用。蛋白质变性作用的本 质使形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键从而导致蛋白质分子空间构象的改变和 破坏，而不涉及一级结构的改变或肽键的断裂，生物活性的丧失是变性的主要表现，构 象的破坏是蛋白质变性的结构基础。蛋白质构象可恢复者称可逆变性，构象不能恢复者 称不可逆变性。多数蛋白质的变性属于不可逆变性。例如生活中比较常见的鸡蛋清能够 溶于水，但是加热后它就凝固而不溶了，这种变性为不可逆变性。能够引起蛋白质变化 的因素有很多，一，化学物理因素，比如，高温、紫外线、x 一射线和超声波等；二， 化学因素，比如强酸、强碱、重金属和有机物等等 ( 3 ) 蛋白质的胶体性质 由于蛋白质分子量大，在溶液中所形成的质点大小约为1 1 0 0 n m ，达到胶体质点 的范围，所以蛋白质具有胶体的性质。如，布朗运动、光散射现象、不能透过半透膜以 及具有吸附能力等胶体溶液的一般特征。 ( 4 ) 蛋白质的两性电离与等电点 蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸是两性电解质。蛋白质分子中许多氨基酸残基的侧 链上尚有不少可解离的基团，如一n 1 t 2 、- - c o o h 、一0 h 等，所以蛋白质也是两性物 质。蛋白质在溶液中的带电情况主要取决于溶液的p h 。使蛋白质所带正负电荷相等， 净电荷为零时溶液的p h ，称为蛋白质的等电点( p i ) 。各种蛋白质具有特定的等电点，当 溶液的p h p i 时，蛋白质带负电荷；p h p l 时，则带正电荷。体内多数蛋白质的等电 点为5 左右，所以在生理条件下( p h 为7 4 ) ，它们多以负离子形式存在。 ( 5 ) 蛋白质的沉淀反应 蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。蛋白质的沉淀可能是 变性的也可能是未变性的，这取决于沉淀的方法和条件。常用的沉淀方法有中性盐沉淀 反应，本法的主要特点是沉淀出的蛋白质不变性，因此本法常用于酶、激素等具有生物 活性蛋白质的分离；有机溶剂沉淀反应，在等电点时加入有机试剂更易使蛋白质沉淀， 但是，本法有时可引起蛋白质变性，因此，用此法分离制备有生物活性的蛋白质时，应 注意控制可引起变性的因素；加热沉淀反应是变性沉淀，且在等电点时最易沉淀；重金 第一章绪论 属盐沉淀反应，蛋白质在p h p l 的溶液中呈负离子，可与重金属离子结合成不溶性蛋 白盐而沉淀。临床上抢救重金属盐中毒的病人就是利用这个反应；生物碱试剂的沉淀反 应，蛋白质在p h p i 时带正电荷，可与一些生物碱试剂结合成不溶性蛋白盐而沉淀。 ( 6 ) 蛋白质的颜色反应 蛋白质中氨基酸的一些基团以及肽键等与一定的试剂所产生化学反应导致其颜色 发生变化，这叫做颜色反应，非蛋白质的特异反应，所以此反应必须结合蛋白质的其他 特性加以分析才可以用来鉴定蛋白质。蛋白质的颜色反应主要有以下几种：茚三酮反应， 在p h5 7 时，蛋白质与茚三酮丙酮液加热可产生蓝紫色。凡具有氨基能放出氨的化合 物几乎都有此反应；双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中可与c u 2 + 产生紫红色反应，蛋白 质中的肽键起关键作用，氨基酸无此作用；酚试剂反应，碱性条件下，蛋白质可与酚试 剂形成蓝色化合物，蓝色的强度与蛋白质的量成正比，可用来定量测定蛋白。 ( 7 ) 蛋白质的免疫学性质 凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应的抗体和( 或) 淋巴细胞受体发 生特异性结合的物质，统称为抗原。抗原刺激机体产生与相应抗原特异结合并具有免疫 功能的免疫球蛋白，称为抗体。抗原与抗体结合所引起反应，成未免疫反应。蛋白质是 分子物质，异体蛋白具有强的的抗原性，是主要抗原物质。蛋白质的免疫学性质可用于 疚病的免疫预防，例如，卡介苗、乙肝的基因工程疫苗等；还可用于疾病的免疫诊断， 例如，血型、h b s a g 检测等；也可用于疾病的免疫治疗，如破伤风抗毒素、抗蛇毒抗毒 素；还可用于免疫分析和免疫分析纯化等。 1 3 蛋白质定量分析研究进展 蛋白质是生命体中重要的物质之一，对于维持生命是十分重要和必不可少的。所以 对它的研究一直受到人们的重视。人们对蛋白质的研究，主要集中在蛋白质定量分析和 作用机理两个方面。研究蛋白质与蛋白质探针的相互作用机理，能够间接地认识和探索 生物大分子的结构、性质和行为。蛋白质的定量分析是生物化学、药学、食品及临床分 析中常涉及的内容，也是临床诊断疾病及检验疾病治疗后的健康状况的重要指标。近年 来，对蛋白质分离和分析方法的研究日益增多，引起了科学工作者的兴趣和广泛关注； 同时用于定量测定蛋白质的一些新的分析技术的出现，又促进了生命科学的不断发展， 所以蛋白质定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃。测定蛋白质含量的方法很多， 6 第一章绪论 应用蛋白质内源光谱性质的分析方法只有紫外光谱法和荧光光谱法，两种方法在检测灵 敏度方面常常不能满足要求，为此，人们发展了各种光谱探针和荧光探针分析法。 为了满足蛋白质对高灵敏度的分析要求，高效液相色谱技术也不断得到改进，分离 柱向微型化发展，也出现了毛细管电泳技术连用二维液相和多维液相的分离分析技术。 尽管c e 技术还有不足之处，存在一些需待解决的理论与实际问题，但它已受到世人的瞩 目，成为近年来在蛋白质等生物大分子的分离分析中发展最快的新技术。2 1 世纪功能基 因的分离、检测，功能蛋白质的分离、测定对c e 提出了更高的期望和新的发展机遇。 1 3 1 凯氏定氮法州 该方法是丹麦化学家凯道尔提出的，其依据是蛋白质中含氮量大体上一致( 1 4 一1 9 ) 。将蛋白质样品与硫酸强热，蛋白质中的氮元素全部形成铵离子，便于酸碱滴定 法测定氮的含量而得到蛋白质的含量。该方法特别适用于构造及其组成比较复杂的样品 中蛋白质含量的测定。可惜该方法在测定前必须除去与待测物共存的非蛋白态氮化合 物，同时，在构成蛋白质的氨基酸有偏差的情况下，特别是含有大量碱性氨基酸、酰氨 和小分子量氨基酸时，测量误差大，操作繁杂。随后，陆晓滨8 1 等用硒粉作催化剂消化 蛋白质，提高了凯氏定氮法的分析测定速度，对此方法进行了改进。黄建春9 1 应用甲醛 定氮法测定食品中蛋白质的含量，省去了蒸馏过程，直接滴定，结果较为满意”0 1 。 1 3 2 浊度法m 1 利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度比较而定量测得未知蛋白 浓度的定量分析法。磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂。3 0 9 l 磺基水杨酸 作为沉淀剂可沉淀白蛋白、球蛋白及血红蛋白。5 0 9 l - - - 氧乙酸蛋白作沉淀剂，可沉淀 白蛋白和球蛋白。磺基水杨酸法灵敏度与精确度高但干扰物质多。这两种浊度法都受温 度的影响。另外，两种方法所用试剂的浓度、滤光片的波长及反应浓度没有标准化，因 此其结果的准确及精确性较差，但由于操作简单、快速、试剂易购，目前仍为临床常规 检查所用。 1 3 3 吸光光度法 ( 1 ) 双缩脲法1 1 2 i 7 第一章绪论 双缩脲法也是早期使用的蛋白质定量分析方法。在强碱性溶液中，双缩脲与c u ”形 成稳定的紫红色配合物，可用分光光度法测定蛋白质含量。该法灵敏度不高，选择性不 强。陶健等【1 3 】对双缩脲法的试剂和测定条件进行优化，从而使双缩脲法灵敏度提高，准 确度和精密度也显著提高【1 0 1 。 ( 2 ) l o w r y 法1 1 4 l o w r y 法又称f o l i n 酚试剂法。蛋白质或多肽大分子中含有的酪氨酸或色氨酸等芳 香氨基酸能与f o l i n 酚试剂发生氧化一还原反应形成蓝色复合物，它在7 4 5 7 5 0n i t 3 处有 最大吸收，其吸光度值与蛋白质浓度成正比，可根据7 5 0 n t o 吸光度值来计算蛋白质的含 量。该法灵敏度高，操作简便，但选择不强，易受共存物影响。l a r s o n 等【l5 】对f o l i n 一 酚试剂法进行了改进。利用还原剂二硫苏糖醇( d t t ) 加快f o l i n 一酚试剂还原速度，缩短 了分析周期，提高了测定的灵敏度。康建等【1 6 l 也对该法进行了改进，改进后的l o w r y 法 被广泛应用于蛋白质的测定，可惜在该法中使用的d t t 价格昂贵。石磊等【l 刀用连二亚硫 酸钠代替d t t ，可促使四元复合物中结合的f o i n - 酚试剂充分还原，使反应迅速完成， 比d t t 法有更高的显色稳定性，且试剂价格低廉【1 0 1 。 ( 3 ) 考马斯亮蓝法( b r a d f o r d 检测法) i l s l 考马斯亮蓝能与蛋白质分子中的疏水微区相结合，形成蓝色复合物。考马斯亮蓝 g - 2 5 0 随溶液酸度不同而呈现不同颜色。在酸性条件下，用乙醇配成橙黄色的溶液，最 大吸收波长为4 6 5 咖，当与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，最大吸收波长为5 9 5n m ， 反应迅速而稳定。在5 9 5n l n 处的吸光度值与蛋白质浓度成正比，可用来测定蛋白质的含 量。考马斯亮蓝法用于测定蛋白质灵敏度高，耗时短。杨晋【1 9 1 等对这个方法进行了研 究，推荐用此法测定蛋白质的适宜条件为温度不低2 4 ，反应时间不少于3m i n i l o j ( 4 ) 染料结合的光度法 在蛋白质的临床分析中，尤其是血清白蛋白和尿蛋白的测定中，染料结合法具有简 便、快速、经济、准确的特点，受到人们的普遍关注，从而得到广泛的应用。目前，在 染料结合法测定蛋白质的方法中使用最多的染料主要有以下几类：一，酸性三苯甲烷类 染料，例如溴甲酚绿( b r o m c r e s o lg r e e n , b c g 法) 2 0 l 、考马斯亮蓝g 2 5 0 ( c o o m e s s i e b r i l l i a n t b l u eg 2 5 0 ，c b b ) 法和溴酚蓝( b r o m p h o n o lb l u e ，b p b ) 法【2 1 1 等。二，氧杂葱类染料，例如 藻红( e r y t h r o s i nb 。e b ) 法i m l 。三，羟基蒽醌类化合物，在酸性条件下，茜素红与蛋白质 的反应产物在5 4 0 n m 处有最大吸收，且吸光度与蛋白质浓度呈正比，反应时间短，干 8 第一章绪论 扰少，操作简便，特异性强瞄】。四，变色酸双偶氮类化合物，文献报道了变色酸双偶氮 类化合物，如偶氮胂i i i l 2 4 1 和偶氮磺i i i l 2 5 1 。 某些常见的染料测定蛋白质的吸光光度法见表1 1 。 表卜1 某些染料测定蛋白质的吸光光度法 ( 5 ) 金属离子一染料结合法 1 9 8 4 年f u j i t ay 【帅j 等首次提出利用金属络合物测定蛋白质，其机理为金属离子一般 使用含电荷高、离子外层含有较多空余的瞬间杂化轨道，这样，当其与含有- - o h 或c = o 的有机染料相遇时，氧原子中的孤对电子可顺利进入杂化轨道，形成稳定的配合体系， 9 第一章绪论 在酸性条件下，该体系遇到结构不对称的蛋白质时互相极化产生静电作用而合成新的大 分子团；另外，大分子内部易形成氢键作用，蛋白质分子中的芳香氨基酸残基与有机染 料分子中的芳香结构都具有疏水作用，从而改变了原体系的光谱性能，进而能定量测定 蛋白质的含量。以f u j i t ay 为首的科研小组在1 9 8 9 年还提出了许多新体系。如3 ，4 ，5 ，6 四氯茜素紫一m o ( 、，i ) t r i t o nx - 1 0 0 p v a 在6 4 0 n m 处测定蛋白质】，利用邻苯三酚红 m o ( v i ) 阿拉伯胶体系在6 0 0 n m 处定量测定尿样中总蛋白1 4 2 】，磺基苯基荧光酮n ( v ) 络 合体系m 佣于蛋白质的测定。我国沈含熙先生长期从事这方面的研究，从理论和实践上 解决了许多实际问题，提出了水杨基荧光酮m o ( v i ) j n 乳化剂o p 与蛋白质形成有色配合 物，在5 7 5 n m 处测定蛋白质【删。1 9 8 6 年s a i t ok 等提出使用铬天青s a i ( i i i ) 配合物体系测 定蛋白质，在6 3 0 r i m 处测定人血清白蛋白【4 5 1 。1 9 9 6 年，z h uk 等利用溴邻苯三酚z n ( i i ) 体系用于蛋白质的测定【4 6 】，并引起了人们的关注。 某些常见的染料金属离子探针测定蛋白质的吸光光度法见表1 2 。 1 3 4 共振光技术在蛋白质分析中的应用 近年来，利用染料生色团在生物大分子上的聚集或组装产生增强的共振光散射信 号，建立了测定生物大分子的新技术一共振光散射技术。表1 3 列出2 0 0 0 年以来，共 振光散射技术在蛋白质的定量测定方面的应用。共振光散射技术用于蛋白质分析大大提 高了测定的灵敏度，减少了操作过程，并且拥有更为广阔的探针范围。其原理主要基于 在以静电作用为主的体系中，当溶液的p h 小于蛋白质等电点时，阴离子染料、阴离子表 面活性剂或溶液的p h 大于蛋白质的等电点时，阳离子染料、阳离子表面活性剂与蛋白质 肽链上带相反电荷的基团之间通过静电作用，形成蛋白质一染料或蛋白质一表面活性剂 的复合物，其表现为染料或表面活性剂在蛋白质分子上堆积，产生增强的共振光散射信 号。利用该现象对蛋白质进行定量分析测定。体系共振光散射增强程度与分析物各自的 电荷性质、分析物之间的静电作用强度以及它们结合形成复合物粒子的大小紧密相关。 由于各种蛋白质分子的大小和所带电荷情况不同，因此，用相同的共振光散射探针进行 测定，其共振光散射响应强度不一样，故蛋白质种类不同时，所用的共振光散射探针不 同。目能已经报道用于蛋白质分析的共振光散射探针很多，其主要有染料探针、金属络 合物探针、阴离子表面活性剂探针、纳米粒子探针等。 某些测定蛋白质的共振光散射法见表1 3 。 1 0 第一章绪论 表1 - 2 某些染料一金属络合物测定蛋白质的吸光光度法 1 3 5 毛细管电泳( c e ) 毛细管电泳又叫高效毛细管电泳( h p c e ) ，是2 0 世纪9 0 年代以来发展最快的分析方法 之一，兼有普通电泳和色谱的双重优点，具有高效、快速、运行成本低、信息量大和易 于自动化等特点。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 6 5 1 等首先提出了在7 5 v m 内径毛细管柱内用高电压进 行分离的可能性，创立了现代毛细管电泳。由于c e 极大地满足了以生物工程为代表的生 命科学各领域中多肤、蛋白质( 包括酶、核体、核酸及至脱氧核糖核昔酸( d n a ) ) 甚至单 第一章绪论 细胞的分离分析要求，短短十几年问得到快速发展。c e 是经典电泳技术与现代柱分离技 术的结合。 表1 - 3 某些测定蛋白质的共振光散射法 i - 5 - s t p 为a ，p m 6 - 四卟啉 毛细管电泳与传统的分离分析方法相比，具有其独特优点：一是高灵敏度，常用紫 外检测器的检测限可达1 0 。3 - 1 0 5 m o l ，激光诱导荧光检测器则达1 0 。9 - 1 0 圳m o l ；二是高 分辨率，其每米理论塔板数为几十万，高者可达几百乃至千万。而h p l c 一般约为几千到 几万，三是高速度，最快可在6 0 s 内完成，有2 5 0 s 内分离1 0 万种蛋白质的报道：四是样品 用量少，只需n l ( 1 0 母) 级的进样量；五是成本低，只需少量( 几毫升) 流动相和价格低廉 的毛细管。c e 在分离生物大分子方面的优势使其在蛋白质分离分析中占据日益重要的地 位。 毛细管电泳在蛋白质的分析中有多方面的应用。一，蛋白质肽图的构建与蛋白质鉴 1 2 第一章绪论 定。例如，g r o s s m a n 6 6 】等构建了促红细胞生成素肽谱，用来鉴定不同来源的蛋白质。二， 物化常数分析。用不同的分离模式可测定蛋白质的一些物化常数如等电点、分子量。 a l e x a n d r aw 6 7 1 等测定蛋白质分子量的方法比平板凝胶电泳方法简单，速度快，但精度 并不比s d s p a g e 澳0 得的分子量差。c o l erb 嘲】等中性高分子聚合物涂层毛细管 c e - e s i m s 法分析了肌红蛋白、细胞色素