（植物学专业论文）欧李（prunus+humilis+bunge）自交不亲和性及s基因的克隆.pdf

英文缩写 a m p a 量p c r b p c d n a c t a b d d h 2 0 d n t p d n a e l e 2 e 3 e b e d t a l b g s i h v k b p c r p v p r p m s d s s i s c s s i s p l l s c r s r k 英文名 a m p i c i l l i e 英文缩略表 a 1 l e l es p e c i f i cp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d i s t i l i e da n dd i m o n i z e dw a t e r d e o x v r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s h a t d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d u b i q u i t i n a c t i v a t i o n ge n z y m e u b i q u i t i n c o n j u g a t i o ne n z y m e o b i q u i t i n1 i g a s e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d l u r i a b e r t a n im e d i u m g a m e t o p h y t i es e l f - i n c o m p a t i b i l i t y h y p e r v i a b l er e g i o n k ii o b a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p l t y v i n y p y r r o t i d o n e r e v o l u t i o np e rm i n u t e s o d i u md o d e c y s u l f a t e s e l f i n c o m p a t i b i l i t y s e l f c o m p a t i b i l i t y s p o r o p h y t i cs e l f i n c o m p a t i b i l i t y 岛1 0 c a s s - l o c u s s - l o c u s p r o t e i n 一1 1 c y s t e i n e r i c hp r o t e i n r e c e p t o rk i n a s e 中文名 氨苄青霉素 特异等位基因p c r 碱基对 互补d n a 十六烷基溴化胺 重蒸永 脱氧核糖核苷三磷脂 脱氧核糖核苷酸 泛素话化酶 泛素结合酶 泛素连接酶 溴化乙锭 已二胺四乙酸 l b 培养基 配子体自交不亲和 高变区 千碱基 聚合酶链式反应 聚乙烯毗咯烷酮 转分 十二烷基硫酸钠 自交不亲和 自交亲和 孢子体自交不亲和 量基因座蛋白一1 1 璺基因座富含组氨酸蛋白 鼻基因座受体激酶 s f b s l f t a e t r i s x g a i sh a p l o t y p e s p e c i f i cf - b o xp r o t e i ng e n e量单元型特异f - b o x 蛋白基因 s - l o c u sf - b o xg e n e t r i s 一 l c l 一e d t ab u f f e r t r i s h y d r y x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e s 基因座f - b o x 基因 t r i s 一乙酸- e d t a 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l 一8 一d - g a l a c t o s i d e5 - 溴一4 一氯一3 一吲哚一b d - 半乳糖苷 v i 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律结果由本人承担。 学位论文作者签名：事表 剞1 氏 日期：h 帕6 年r 月玎日 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家 主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并 允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论 文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文储签名：沈 翻】民 日期：加年f 月布日 摘要 自交不亲和性是被子植物预防近亲繁殖和保持遗传变异的一种重要机制，这一机制在 植物界中普遍存在。许多果树如苹果、梨、杏、樱桃等都存在自交不亲和现象。由于自交 不亲和是植物生殖过程中的一个重要现象，因此它已成为果树及其它植物研究的热点。欧 李属蔷薇科樱桃属，为我国所特有植物，有巨大的应用价值。目前，欧李的研究主要集中在 栽培、选种、果实营养特性分析等方面，雨有关其育性问题的研究鲜有报道。本论文以5 0 株野生欧李为试材，先对其育性问题进行了研究，确定其为自交不亲和；证明了欧李白交 不亲和性是受s 基因控制的：同时克隆鉴定出了与其相关的自交不亲和基因：发现并鉴定 了欧李的四种s 基因型。具体结果如下： 1 以坐果率作为自交亲和与否的指标，用传统田间自交授粉的方法对5 0 株野生欧李 试材进行自交授粉实验。调查结果显示，所研究的5 0 株野生欧李的自交座果率( 3 7 2 ) 远远低于欧李杂交座果率( 3 0 以上) ，由此确定欧李为自交不亲和。 2 以坐果率作为杂交亲和与否的指标，用传统田问杂交授粉的方法确定了欧李自交 不亲和是受s 基因控制的。 3 根据核果类s - r n a s e 的结构特点在c 1 区上游和( 3 2 区设计通用引物以5 0 株野生 欧李的亲本，即1 2 株野生欧李为试材，对其基因组d n a 进行p c r 扩增，首次得到了欧 李的7 条s 基因的部分序列( 包括c 1 、c 2 保守区) ，将其分别命名为肌，龆彤、尉、 跖、靳和s 7 。为了得s 基因全序列，我们根据这6 条s 基因的核苷酸序列( s s 除外1 分别设 计一条正向特异引物，与在c 5 保守区设计的一条反向通用引物f s f p 7 4 ) 构成对特异扩增 引物，进行p c r 扩增，经克隆测序晟终得到了3 条s 基因( s ，船和田) 的全序列( 除 3 - 和5 一端) 。其余4 条s 基因( 田，骶、跖和s 7 ) 的克隆没能成功，这可能是由于序列较 长或其= 级结构较复杂造成的。 4 根据已获得的欧李s 基因，对1 2 株野生欧李中的s 基因型进行了鉴定，得到了欧 李的四种s 基因型分为四类：$ l s 2 、$ 6 s 7 、$ 4 s 5 和$ 3 s 7 。 关键词；欧李白交不亲和s 基因s 基因型a s - p c r a b s t r a c t g a m e t e p h y t i cs a i l - i n c o m p a t i b i l i t y ( o s z ) i saw i d e s p r e a dm e c h a n i s mi nf l o w e r i n gp l a n t s ， w h i c hp r e v e n t ss e l f - f e r t i l i z a t i o na n dp r o m o t e so u t c r o s s i n g m a n yf r u i tf r e e s ，s u c ha sa p p l e ，p e a r , c h e r r y , a i e r o t ，a l ld i s p l a yt h em o n o f a n t o r l a lg a m e t o p h y t i cs e l f - i n c o m p a t i b i l i t ys y s t e m c h i n e s e p l u m - c h e r r yf 胁m s h u m i l i sb t m g o , r o s a e e a e ) i san a t i v eo fc h i n a , w h i c hh a v em u c hv a l u e h o w e v e r , r e s e a r c h e so nc h i n e s ep l u m - c h e r r ya r es t i l lp r e l i m i n a r y e s p e c i a l l yo nt h es t u d ya b o u t w h e t h e r c h i n e s ep l u m - c h e r r yi ss d f - i n c o m p a t i b i l i t yo rn o t ，r e s e a r c ho u t c o m e sh a v es e l d o mb e e n g o tn op u b h s h e dj o u r n a l su pt o d a t e i nt h i sw o r k , w ec o n f i r m e dc h i n e s ep l u m - c h e r r y s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , i d e n t i f i e da ss - a l l e l e so fc h i n e s ep l u m - c h e r r y a l lr e s u l t sw e r es u m m a r i e d a sf o l l o w s ： 1 f i e l dp o l l i n a t i o nt e s tw a sb e e nd o n eo nf i f t yw i l dc h i n e s ep l u m c h e a r i e s t h er e s u l t s s h o w e dt h ea v e r a g ef r u i ts e t ( 3 7 2 ) o fs e l f l n gw 镕m u c hl o w e rt h a nt h a to fc r o s s ( 3 0 ) ， t h e r e f o r e ，c h i n e s ep l u m c h e r r yd i s p l a y ss e l f - i n c o m p a t i b i l i t y 2 s io fc h i n e s ep l u m - c h e r r yc o n t r o l l e db ys - g e n e sw a sc o n f i r m e db yf i e l dp o l l i n a t i o nc r o s s t e s t 3 t w op i e s e so fc o n s e n s u sp r i m e r s ，b f p9 3a n db f p9 4 - 1 ，d e s i g n e df r o mc ia n dc 2o f p r u n u ss - r n a s c w c l eu s e dw i t hp c ri nt w e l v ew i l dc h i n e s ep l u m c h e r r i e s a f t e r s e q u e n c e d , t h en u c l e i o a c i do fs e v e rs - g a n e sw e r eg o t ，w h i c hw e r en a m e ds 1 , s 2 , s 3 , 掰 s s , 跖a n ds zr e s p e c t i v e l y t h e n ，a l l e l e - s p e c i f i cp c rw e r ed o n ew i t ho n es p e c i f i c - a l l e l e p f i m e ma n do n ec o n s e n s u sp r i m e rb f p7 4 t h ep r o d u c t so fa s - p c rw e r ec l o n e da n dt h e f u l ln u e l e i o a c i ds e q u e n c e so ft h r e es - g e n e s ( s l ，s 2a n ds 3 ) w e r eo b s t m n e ds u c c e s s f u l l y a sf o u rs - g e n e s ，s 4 s 5 、s 6a n ds t , h a v ec o m p l i c a t e ds e c o n d a r ys t r u c t u r ea n dl o n g n u c l e i o - a c i ds e q u e n c e ，t h e yd i d tb e e na m p l i f i e da n dc l o n e ds u c c e s s f u l l y 4 f o u r s - g a n o t y p e so f t w e l v e w i l d c h i n e s e p l u m - c h e r r i e s h a d b e e n i d e n t i f i e do n t h eb a s i s o f s e v e ns - g e n e s ，s z s e , s 4 s 5 $ 6 s 7a n d $ 3 s 7 k e y w o r d s ：c h i n e s ep l u m - c h e r r y , s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , s - g e n e ，s - g a n o t y p e ，a s - p c r 引言 植物自交不亲和的研究是当前国际植物分子生物学研究的热点之一，尤其是近几年， 随着分子生物学技术广泛应用到植物自交不亲和的研究上使得这方面的研究进展的更快。 从在茄科中分离到与配子体自交不亲和相关的花柱糖蛋白开始到后来在玄参科、蔷薇科和 茄科植物中发现了花粉决定子基因( 轧脚) ，人们对自交不亲和机理有了更为深刻的认 识。加深对果树自交不亲和的研究不仅有助于更好的认识这一特殊生命现象，也有助于在 果树育种和生产上加以控制与利用这一机制，在此本文对高等植物自交不亲和性分子与生 理机制的研究进展做一简要综述。 1 植物自交不亲和性( s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , s d 植物不亲和性包括种间不亲和性( i n t e r - s p e c i f i ci n c o m p a t i b i l i t y ) 和种内不亲和性 ( m t r a s p e c i f i ci n c o m p a t i b i l i t y ) 。客观上，种间不亲和性有利于保持物种的稳定性，种内自交 不亲和性则可促进种内的遗传变异。这两种不亲和性的发生涉及许多复杂的受遗传控制的 相互作用，如细胞间的相互识别、细胞内和细胞间的信号传导及其他许多相关的影响因子， 其中任一过程受阻都可导致不亲和性的发生。种内不亲和性中以自交不亲和性最为典型， 表现为植物正常的雌雄配子之间自交不结实或结实率很低，是生殖过程的一种非常重要的 现象，能防止近交，促进异型杂交，是植物保持遗传变异的一种重要机制。 在商等植物中，表现自交不亲和性的种类非常普遍。b r e w b a k e r ( 1 9 5 9 ) 调查了7 1 科6 0 0 属的植物，发现有2 5 0 属以上存在自交不亲和的现象；在显花植物中有1 3 1 2 的科表现出 自交不亲和的现象。1 7 6 3 年，k o l r e u t e r 从紫毛蕊花( v e r b a s c u m 砌o e n i c e u m ) 中发现自交 不亲和现象是有关s i 最早的记载。进入2 0 世纪，孟德尔遗传理论阐明了许多植物自交不 亲和的遗传基础，促进了这一领域的深入研究。血清学和同工酶分析，使人们加深了对自 交不亲和生化基础的了解，尤其是近年来随着分子生物学方法的引入，极大地推动了人们 对这一机制的深入理解。 2 自交不亲和的分类 绝大多数植物的s i 遗传上受具有复等位基因的单一位点( sl o c u s ) 控制，即单因子自 交不亲和性( m o n o - f a c t o r i a ls 1 ) ，此外还有双因子( b i f a c t o r i a l ) 和多因子( m u l t i f a c t o r i a l ) 张利民：欧季目雯小录和性发s 基崮的克陲 自交不亲和性。 单因子s i 又可根据花粉的不亲和表型分为两类，一种是配子体自交不亲和性 ( g a m e t o p h y t i cs e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ，g s i ) ，绝大多数植物属于此类。配子体型的5 基因在 减数分裂后才有活性，其自交不亲和性取决于单倍体花粉的s 基因型。花粉管生长的抑制 发生在花柱的传递组织中( n a s r a l l a hj be ta 1 ，1 9 9 3 ) 。另一种是孢子体型自交不亲性 f s p o r o p h y t i cs e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , s s 0 ，即花粉表型由产生花粉的植株即孢子体基因型决定， 并根据母体植株其两个等位s 基因的相互作用方式分为显性、隐性和共显性三种 其仅在十字花科、旋花科和菊科中发现，如油菜、白菜属于这一类。一般认为孢子体s 基 因首先在花药中表达，然后基因产物转移到花粉上，因此花粉的自交不亲和类型取决于花 粉的二倍体亲本，花粉生长的抑制发生在柱头表面( n a s r a l l a hj be ta 1 ，1 9 8 9 ) 。配子体型自交 不亲和和孢子体型自交不亲和的作用方式如m ( r n ot e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 ，s 2b e e t l e g a n i t c n p h y t i c v t h 配予体型白空不豪和 ，i 尊2 啊舳 - 赫t - 函0 t ki r i s t i m 孢予体型自交不亲和 事实上，自交不亲和的遗传机制相当复杂，如十字花科作物的s 等位基因间存在独立显隐 性、竞争减弱、显性颠倒等关系：自交不亲和性只在花期存在，丽蕾期能表现自交亲和，分 子水平的研究可能深入解释这一现象的机制。 这两种机制间的差异被认为是由s 基因表达时间的差异决定的。s s i 的s 基因产物在减 数分裂前合成，并均匀分布在两种不同s 基因型的单倍体花粉上，而g s i 的s 基因产物在 减数分裂后才合成，只位于各自的花粉o p ( n e w b i g i nee ta 1 1 9 9 3 ) 。 在禾本科、藜科和花茛科等植物中，存在由两个或多个位点控制的s i 机制。比如禾本 科的s i 控制涉及两个互不连锁的遗传位点s 和z ，只有当花粉和花柱的s 和z 的等位基因 都相同时，才表现为自交不亲和( h i s c o c ks je ta 1 ，1 9 9 6 ) 。显然这种s i 控制效率很低。一般 4 认为，多因子s i 是进化的原始形式，单因子s i 相对高级一些，并由该单一位点外的其他 位点逐渐纯化而形成( l e w i s ，1 9 5 1 ) 。 3 配子体自交不亲和的分子基础 大多数s i 植物表现为g s i ，目前研究较深入的有茄科、蔷薇科、玄参科和罂粟科植物。 其中茄科、蔷薇科、玄参科这三个科使用相同的g s i 机制，即为茄科型g s i 机制，通常表 现为不亲和花粉的花粉管进入柱头后生长受到抑制。而罂粟科植物则显示另一种g s i 机制， 这种机制表现为不亲和花粉在柱头表面萌发便受到抑制。 早在1 9 5 2 年，l e w i s 在月见草( o e n o t h e r ao r g a n e s i s ) 中分离了与特定s 等位基因相关的 蛋白质，这是g s l 分子水平研究的开端。从7 0 年代末期开始，开展了一系列有关分离控 制g s i 反应的s 位点基因的研究工作。8 0 年代初期( b r o o t h a e r t se ta 1 ，1 9 9 0 ；k a m b o je ta 1 ， 1 9 8 6 ；k i r c he ta 1 ，1 9 8 9 ) ，g s i 研究取得了突破性的进展。b r e d e m c i j e r 和b l a s s ( 1 9 8 1 ) 在花烟 草( n i c o t i a n aa l a t a ) r 9 发现了含量丰富并与s 位点共分离的雌蕊蛋白质。它们属于糖蛋白， 最初被称为p 蛋白质，孓蛋白质的发现成就了第一个璺位点编码的花柱c d n a 的克隆。通 过设计与这些糖蛋白n 端序列同源的寡核苷酸和分子杂交的方法，a n d e r s o n 等( 1 9 8 6 ) 从花 烟草中第一次分离到与g s i 相关的花柱蛋白的c d n a s 2c d n a ，此后又分离到s 3 和s 6 位 点的花柱糖蛋白的c d n a ( a n d e r s o ne ta 1 ，1 9 8 9o 根据d n a 序列的分析比较，发现其编码 的蛋白产物与真菌的r n a s er h 和r n a s et 2 具有同源性( k a w a t ae ta 1 ，1 9 8 8 ) ，且含相同的 活性部位，因此具有核酸酶活性，故而常称为孓核酸酶( s - r n a s e ) ( m c c l u r ee ta 1 ，1 9 8 9 ； n e w b i g i ne t a l ，1 9 9 3 ) 。到目前为止，已从茄科、蔷薇科、玄参科等多种植物中分离出近百 个s - r n a s e 基l 再 ( a n d e r s o n ，1 9 8 9 ；a i ，1 9 9 0 ；k a u f m a n a n n ，1 9 9 1 ；b r o o t h a e r t e s ，1 9 9 5 ；s a s s a ， 1 9 9 6 ；x u e ，1 9 9 6 ) 。 s - r n a s e 与d 位点共分离本身并不能证明它一定就是s 基因产物，因为其可能是与s 基因紧密连锁基因的表达产物。但是，目前己有的证据有力证明了s - r n a s e 就是s 位点在 花柱中的产物。 首先，s - r n a s e 为一类分泌型糖蛋白，它在雌蕊中特异表达，主要分布在花柱传递组 织的细胞间隙中，在花柱1 3 以上的部位浓度最高，该部位正是自交不亲和花粉生长受到 强烈抑制的区域( a n d e r s o ne ta 1 ，1 9 8 6 ；c o r n i s he ta 1 ，1 9 8 7 ) ，在包围胚珠的胎座表皮细胞中 检测到了低水平的s - r n a s e 的表达由此可见，在花粉管进入胚珠必须通过的组织内，均有 s - r n a s e 的表达，它的分布位置是与花粉管伸长的部位以及花粉管伸长的途径相一致。最 张利民：欧李自交水亲和性及s 基因的克隆 近，用激光共聚焦( c o n f o c a l ) 技术观察苹果的花粉管通路中s - r n a s e 的表达情况也证实了 这一点( c e r t a le ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 第二，s - 蛋白总量的快速增长与花发育过程相一致，即蕾期可以自交亲和而成熟花则 自交不亲和。蕾期，s - m r n a 和孓蛋白的表达量很低，在花蕾开放时其表达量显著提高， 并且在蕾期不成熟的花蕾完全可以接受自己的花粉，但当它f f l j s - m r n a 和娶蛋白量增加时， 原来可以接受自己的花粉的花蕾却不能接受自己的花粉，即由自交亲和变为自交不亲和， 表明由自交亲和变成自交不亲和与s - m r n a 的量和蛋白总量有关，这个观点在矮牵牛 ( c l a r ke ta 1 ，1 9 9 0 ) 和烟草( k h e y r - p o u re ta 1 ，1 9 9 0 ) 上也得到了证实。 第三，娶蛋白序列表现出高度的差异性，这种序列多态性为分子识别提供了可能( t s a ie t a 1 ，1 9 9 2 ) 。s - r n a s e 一般为2 5 0 个氨基酸左右，分为保守区和高度变异区两个部分( 1 0 e r g e r e ta 1 ，1 9 9 0 ；t s a ie ta 1 ，1 9 9 2 ) 。根据茄科s - r n a s e 结构，将保守区分为c 1 至c 5 五个区域， 其中c 1 ，c 4 ，c 5 是疏水区，与其三维结构有关：c 2 ，c 3 为亲水区，可能为酶的活性部位。 c 2 ，c 3 区的两个区域中都有一个保守的组氨酸，这与真菌中两个核糖核酸酶f r n a s et 2 和 r n a s er h l 和其它植物s - l i k e 核糖核酸酶相同，而且两个组氨酸对真菌核糖核酸酶的催化作 用是必需的( k a w a t ae ta 1 ，1 9 9 0 ；o h g ie ta 1 ，1 9 9 2 ) 。两个高变区n v a 和h v b ，大部分是g 蛋白的亲水区域，这两个区域最可能是口等位基因专一性识别区( m a t t o ne ta 1 ，1 9 9 7 ；h u a n g e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 目前己经获得了与s - r n a s e 同源的真菌r n a s e r h 和r n a s e l e 的晶体结构( k u r i h a r ae t a 1 ，1 9 9 6 ；t a n a k ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ，利用这些相关信息，p a r r y 等( 1 9 9 8 ) 建立了野生蕃茄的一个 s - r n a s e 的三维结构，表明h v a 和h v b 聚集在分子表面的同一区域，进一步支持了二者都 共同参与花粉识别的推测。当然，只有真正获得s - r n a s e 的晶体才能对此问题有更清楚的 认识。 第四，量蛋白具有核糖核酸酶活性( s - r n a s e ) ，这表明它们有可能在抑制花粉管生长方 面发挥作用。 许多试验已经表明量蛋白的r n a s e 活性是雌蕊识别自己花粉所必需的( h u a n ge ta 1 ， 1 9 9 4 ；r o y oe ta 1 ，1 9 9 4 ) ，但s - r n a s e 。参与s i 反应的直接证据来自反义r n a 和功能获得 性转基因实验f l e e e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。在膨大矮牵牛中，将带有韶基因启动子的反义韶c d n a 构建表达载体，转入$ 2 s 3 基因型的植株中，用反义船r n a s e 基因抑制同源的邸r n a s e 的表达，使阳蛋白的表达量降低，不能够拒绝s 3 等位基因产生的花粉，而且，观鼬蛋 白水平也低得不能拒绝犯船等位基因产生的花粉，植株的自交不亲和性发生了改变，原 6 苜都师甄大学坝士掌位啦趸 来自交不亲和的植株变成了自交亲和，可以接受正常的邸花粉。但是，转基因植株产生 的邸花粉却表现出正常的自交不亲和性。相反地，将鼬一r n a s e 基因转入取埴株后，获 得了抑制邸花粉生长的能力。这些实验结果表明可以通过抑制植物自身单一s - r n a s e 的 表达，或转入外源不同的s - r n a s e ，使得植物在雌蕊中丧失或获得该s 基因表型。m u r f e t t 等( 1 9 9 4 ) 在烟草上也证实了单独的反义9 蛋自足以使花柱识别自己的花粉，r n a s e 活力是 识别自己花粉所必需的。 但大量实验证据表明，花粉识别仅有r n a s e 活性是不够的。s - r n a s e 的其它区域也参 与了花粉识别作用( b e e c h e re ta 1 ，1 9 8 9 ；k a oe ta 1 ，1 9 9 7 ；z u r e ke ta 1 ，1 9 9 7 ) 。因此，s - r n a s c 控制s i 反应是通过它的活性部位的酶催化作用和它的识别部位的特异性识别功能共同完 成的。 通过相互置换s - r n a s e 的不同结构区构建嵌合s - r n a s e 表达载体，在花烟草中进行转 基因实验( k a oa n dm c c u b b i n ，1 9 9 7 ；z u r e ke ta 1 ，1 9 9 7 ) 发现，尽管所构建的s - r n a s e 具有酶 活性，但其识别功能丧失，表现为自交亲和，不能抑制任何s 基因型的花粉。m a t t o n 等( 1 9 9 7 ) 利用s o l a n w nc h a c o g n s 中两个高度同源的s 基因s l l 和s 1 3 ( 它们的表达产物只有1 0 个氨 基酸的差异，且有4 个分布在h v a 或h v b 区域) ，将s l l 的高变区置换成与$ 1 3 一致，获 得s 1 1 i v 曲突变体( 消除位于h v a 和h v b 的4 个氨基酸差异) 。转基因实验发现，转基因 植株丧失了抑制s l l 花粉的功能，却获得了抑制s 1 3 花粉的能力，从而很大程度上证实了 s - r n a s e 的高变区使转基因植物拒绝s l l 和s 1 3 的花粉，增加了这一结论的可信度。然而， 是否高变区足以决定s - r n a s e 的特异性，是否还有其他区域也参与特异性的表达，还有待 于进一步的实验证实( v e r i c a ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 随着研究的深入，人们发现g s i 远比人们想象的复杂。当将s i 等位基因通过杂交引入 自交亲和( s e l f - c o m p a 曲i l i t y ，s c ) 植株时，常发现还有其它因素影响s i 反应，这在早期和现 在的实验中都有证实( m a t h e r , 1 9 4 3 ) 。b e r a n t z k y 等( 1 9 9 5 ) 更进一步提出了遗传证据，证明仅 有s - r n a s e 不足以决定雌蕊s 表型。将s - r n a s e 转入同种s c 植株并未使其获得s 基因特 异性花粉拒斥作用，然而当s - r n a s e 在s i 和s c 植株杂交的f 1 代表达时，却可拒斥对应 的s 基因型花粉，显然存在非s - r n a s e 参与柱头中的s i 反应。s c 的n i c o t i a n as y l v e s f r i s 中残存的s - r n a s e 似乎也与此有关( g o l ze ta 1 ，1 9 9 8 ) 。通过差异性c d n a 克隆的方法从烟 草花柱中分离到一个s i 相关因子天冬氨酸丰富蛋白i - i t ，反义转基因实验证明，降低该蛋 自表达可侵植株接受原本不亲和的s 基因型花粉( m c c l u r ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。h t 的功能还有待 进步证实，可能与s - r n a s e 形成复合物，或者与s - r n a s e 进入花粉管有关。 7 张利民；欧孚目雯不录和性艘s 垂斟的兑陲 当茄科类型的g s i 中的雌蕊决定子s - r n a s e 被确定后，人们开始鉴定控制雄性特异性 的花粉决定子。直到现在，决定茄科型g s i 花粉决定子基因的真正基因仍没有确定，但普 遍认为，s l f s f b 基因具各花粉决定子基因的特征，是茄科型g s i 花粉决定子基因的最佳 侯选基因。因茄科型g s i 花粉决定子基因与本试验的关系较远，所以本文不作详细论述。 另一种研究较为详细的g s i 植物是罂粟( p a p a v e rr h o e , 2 s ) ，它的自交不亲和反应发生 在柱头乳突细胞，类似于孢子体自交不亲和性。f r a n k l i n 领导的实验室利用已经建立起来 的罂粟花粉管体外生长活性测定系统，分离和鉴定了柱头编码的孓蛋白，发现与其它植物 的娶基因产物和已知的基因产物几乎没有同源性，也没有发现它有任何已知s - r n a s e 活性 或其它催化活性( f o o t ee ta 1 ，1 9 9 4 ；f r a n k l i ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。迸一步的研究表明，孓蛋白能与一 种称为s b p ( s b i n d i n gp r o t e i n ) 的花粉膜蛋白相互作用，以s 等位基因特异的方式抑制花 粉管的生长，主要包括以下主要过程：花粉的譬结合蛋白( s b p ) 和花粉孓受体蛋白与柱 头譬蛋白分剐发生非特异性和特异性结合，诱导花粉管中c a 2 * 浓度升高；高浓度c a 2 + 又激 活依赖c a 2 + 的c a m 激酶，使特异蛋白发生磷酸化，激活有关基因表达，抑制花粉管生长。 模式如下图所示。 掷制花粉管生长 t 基因表达 t p 2 6 磷酸化 t c 妒* c a m 激酶 t o p 升高 t s b ps 受体 量耱蛋白乳突胞壁 柱头乳突细胞 ( j a o r d a ne ta 1 ，1 9 9 9 ；f r a n k l i ne ta 1 ，1 9 9 5 ；k a k e d ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 4 孢子体自交不亲和分子基础 虽然孢子体型不亲和的植物种类比配子体型不亲和的植物种类要少，但其分布于高度 进化的物种中，比如十字花科、石竹科和菊科等。目前大部分分子生物学研究集中于十字 花科芸苔属植物中。其s i 表现为当自体或其他植株产生的花粉与受体花柱孓等位基因中任 何个相同时，花粉的萌发即在柱头表面受到抑制。 8 苜都师范大字坝士学位论文 最早从甘蓝( b r a s s i c ao l e r a c e a ) 中分离鉴定出了第一个s 位点相关的蛋白( n a s r a l l a h a n d w a l l a c e ，1 9 6 7 a ，b ) ，随后，克隆到第一个s 糖蛋白的c d n a s l g ( s l o c u sg l y c o p r o t e i n ) ( n a s r a l l a he ta 1 ，1 9 8 5 ) ，并发现与s l g 部分同源且与s 位点紧密连锁的基因一s r k ( sl o c u s r e c e p t o rk i n a s e ) ( s t e i ne ta 1 1 9 9 1 ) 。最近的突破性进展是克隆了寻找已久的花粉量基因 s c r ( s l o c u s c y s t e i n er i c h ) r s c h o p f e re ra 1 ，1 9 9 9 ；t a k a y a m ae t a l ，2 0 0 0 ) 。到目前为止已发 现的s 位点至少包括六类基因，并以单元型( h a p o t y p e ) 的方式存在( n a s r a l l a h e ta 1 ，1 9 9 3 ) ， 这六类基因分别为s l g 、s r k 、s l a 、s l l l 、s u 上和s c r ( n a s r s l l a he ta 1 ，1 9 8 7 ；b o y e sa n d n a s r a l l a h ，1 9 9 5 ；s t e i ne ta 1 ，1 9 9 1 ；y uc ta 1 ，1 9 9 6 ；c u ie ta 1 ，1 9 9 9 ；c a b r i l l a c c ee ta 1 ，1 9 9 9 ； s c h o p f e re ta 1 ，1 9 9 9 ；s u z u k ie ta 1 ，1 9 9 9 ；t a k a y a m ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ， 由于s l g 在柱头乳突细胞中大量存在，最初认为s i 的分子控制主要依赖于s l g ，但 最近的研究从各方面否定了这种可能性( g a u d ee ta l ，1 9 9 3 ；1 9 9 5 ) 。s t e i n 等( 1 9 9 6 ) 和d e l o r m e 等( 1 9 9 5 ) 己经证实s r k 是通过参与柱头上的磷酸化过程介导了自交不亲和反应，目前有充 分的证据表明s r k 自身便可决定芸苔属植物的雌蕊s 特异性的表型( c u ie ta 1 ，2 0 0 0 ； t a k a s a k ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 s i g 编码一种含量丰富的分泌型糖蛋白，主要分布在柱头乳突细胞的细胞壁和胞问 区，不存在于营养组织如叶和根中，而且也不在花柱、子房或苗中积累。s l g 蛋白的表达 时间与植物表达自交不亲和反应的时间相关。在柱头表达自交不亲和性时，s l g 的含量往 往达柱头总蛋白的5 。在某些自交亲和( s e l f - c o m p a t i b i l i t y ，s c ) 突变体中，s l g 的量显 著降低，这些实验结果表明s l g 主动参与了自交不亲和反应。同时发现s l g 与玉米的一 种受体激酶胞外区同源( w a l k e ra n dz h a n g ，1 9 9 0 ) ，提示它有可能从原有的细胞信号系统 进化而来。最初认为s i 的分子控制主要依赖于s l g ，但最近的研究从各方面否定了这种 可能性，首先发现一s i 植株仅表达较低水平的s l g ，而另一s c 变异株却表达高水平的s l g ( g a u b ee ta 1 ，1 9 9 3 ；1 9 9 5 ) 。后来t a k a s a k i ( 2 0 0 0 ) 等的s l g 转基因实验为否定s l g 在s i 反应中的决定性作用提供了有力的证据。 s r k 编码一种跨膜的蛋白质激酶，主要由两个区域组成，一是与s l g 蛋白有9 0 序列 同源性的n 端外区，另一个是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶同源的c 端区( s t e i ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 这种蛋白激酶也在柱头上特异表达。一般认为s r k 在柱头乳突细胞拒绝不亲和花粉的信号 传递过程中起中心作用，昆虫细胞b a c u l o v i r u s 系统在分子水平研究s r k 功能也支持s r k 定位于柱头乳突细胞膜表面的模式。过去认为在芸薹属自交不亲和反应的过程中，s 位点 可能还包括第3 种基因，即编码拒绝反应的花粉粒配体( n a s r a l l a h ，1 9 9 3 ；d o u g h t y , 1 9 9 3 ) 。 张利民：欧李自交不亲和性及s 磊凼的免陲 对于给定的s 单元型，s 专一配体与s r k 胞外结构域结合，也可能与s l g 结合，改变它 们的构像，使s l g 与s r k 结合形成二聚体，然后使s r k 的丝氨酸和苏氨酸残基发生磷酸 化，导致在乳突细胞中发生信号传递，最终使花粉萌发受抑制。但是最新研究结果表明， s r k 的丝氨酸苏氨酸的自我磷酸化是组成性的，不需加入柱头或花粉提取物，而且s r k 以同寡聚体形式存在( d e l o r m ee ta 1 ，1 9 9 5 ；s t e i ne ta 1 ，1 9 9 6 ；g i r a n t o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这些研究 揭示，s i 反应可能通过修饰先存的s r k 寡聚体所介导，而非配体依赖的s r k 的二聚体化。 s t e i n 等( 1 9 9 6 ) 和d c l o r m e 等( 1 9 9 5 ) 已经证实s r k 是通过参与柱头上的磷酸化过程自 交不亲和反应。目前有充分的证据表明s r k 自身便可决定芸苔属植物的雌蕊s 特异性的 表型，通过分别向s i 的b r a p a 转入s r k 2 8 和s l g 2 8 发现，只转入s r k 2 8 便可使转基因 植株拒绝s 2 8 花粉，而s l g 2 8 却不具备这一功能，而只是促进s i 反应的进行。同时也证 实了s l g 和s r k 与花粉s 表型无关( c u ie ta 1 ，2 0 0 0 ；t a k a s a k ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。n e s i l v a 等在 b n a p u s 以w e s t a r 的s r k 9 1 0 的转基因植株中同样证实s r k _ 9 1 0 足以使植物获得了拒绝 s r k 9 1 0 花粉的能力，而s l g 9 1 0 对自交不亲和能力没有明显的影响。对于s l g 功能上的 这种分歧可能与不同转基因植株s r k 的m r n a 表达水平有关，另外，s l g 2 8 和s r k 2