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上海第 二医 科大学硬 士 论文 h v e g f 基因工程生物膜的制备和鉴定 中文摘要 创伤愈合中最关键的过程是创面新生血管的生长，新生的血管床 将为创面修复提供各种营养物质和细胞因子。加快创伤早期新生血管 的生长对减少瘢痕组织形成和感染的发生有重大意义，并将最终影响 到预后外观和肢体功能恢复。 沁e g f ( 血管内皮细胞生长因子) 是特异作用于血管内皮细胞的因 子，其最直接的作用就是通过加快血管内皮细胞的增殖和迁移而促进 微血管形成。包括v e g f 在内的许多细胞因子具有促进创伤愈合的作 用，这些因子的基因工程产品有些已经试用于，临床，也显示出一定的 效果。但是，由于它们的半衰期短，同时伤口存在大量的蛋白水解酶， 使得难以在创面上维持一个相对稳定有效的剂量，限制了应用：力 本实验用基因工程方法改造成纤维细胞，筛选出能够持续分泌 h v e g f ( 人血管内皮细胞生长因子) 的细胞株，将该细胞种植于合适 的细胞栽体，制成基因工程生物膜，为难于愈合创面( 如糖尿病性慢 性溃疡) 的治疗提供了有效方法。 本实验将含有h v e g f 的穿梭质粒p c d n a 3 一h v e g f 导2 l n i h 3 t 3 细胞，使用g 一4 1 8 根据极限稀释法筛选出7 个单克隆细胞株。从中挑 选出整合有h v e g f 基因且表达h v e g f 最高的一个细胞克隆在d n a 水平，m r n a 水平和蛋白质的表达水平进行鉴定，同时使用m t t ， 鸡胚实验检测表达产物的生物学活性。结果显示：p c r 和s o u t h e m 上海第 二 医科大学硕士论文 b l o t 证明h v e g f 基因已整合入n i h 一3 t 3 细胞基因组，r t - p c r 和 n o r t h e r n b l o t 则表明该细胞株能够表达h v e g f m r n a 。 h v e g f e l i s a 证实在蛋白质水平该细胞株能够持续表达h v e g f 三 一 个月以上，并始终保持非常高的水平3 f m t t 实验显示它具备较强的 促进内皮细胞增殖的功能，而鸡胚实验则表明该工程细胞有很强的促 进胚胎血管生成的作用。以上结果均说明该细胞可以作为下一步的创 、 伤基因治疗实验的种子细胞并在此基础上，将该细胞种植于三种生物 j 膜( 甲壳素，丝素膜和b i o b r a n e ) ，并比较其在此三种生物膜上的生 长情况。结果显示：b i o b r a n e 为最适支持物。进一步检测发现：该工 程细胞不仅可以在b i o b r a n e 上良好生长，而且仍旧能够表达高水平的 h v e g f 。同时绘制了该细胞在b i o b r a n e 上的生长曲线，得到它在 b i o b r a n e 上生长状况的定量指标，如单位面积b i o b r a n e 上细胞数为5 1 0 5 1 1 0 6 1 7 7 c m 2 时生长状态最佳，单位面积b i o b r a n e 所能容纳 的最大细胞数( ) 等等，这些工作为今后应用于临床提供了理论依据。 关键词：h v e g f 单克隆工程细胞b i o b r a n e 上海第 二 医科大学硕士论文 p r e p a r a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o no fh v e g fm o d i f i e d g e n e t i c a l l ye n g i n e e r i n g m e m b r a n e a b s t r a c t i ti st h em o s t i m p o r t a n tp h a s e i nw o u n dh e a l i n gt h a tr e n a s c e n t c a p i l l a r yv e s s e l sg r o wi n t ot h ew o u n d e da r e a t h o s er e n a s c e n tv e s s e l s c a l l b r i n g a b o u td i v e r s i f i e dn u t r i e n ta n d c y t o k i n e s a c c e l e r a t i n g a n g i o g e n e s i s i nw o u n di s e x p e c t e d t o e x p e d i t eh e a l i n g a n dr e b e c i n f e c t i o na n ds c a r m a n yc y t o k i n e sc a np r o m o t ew o u n dh e a l i n g b u tt h e i rh a l f - l i v e s a r e v e r ys h o r ta n d t h e r ea r em a n y p r o t e a s e si nt h ee x u d a t e s o f w o u n d ，t h o s e f a c t o r sc a n n o tb ee f f e c t i v e l yu s e da s t r e a t m e n tf o rt h ew o u n dt h a ti s d i m c u l tt oc o a l e s c e t h e s p e c i f i ca c t i o n o f v e g f ( v a s c u l a r e n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o oi st o a c c e l e r a t e a n g i o g e n e s i sb yq u i c k e n i n g t h e p r o l i f e r a t i o n a n dm o v eo f e n d o t h e l i a lc e l l s i nt h i se x p e r i m e n t ，m o n o c l o n a lc e l l s t h a t i n t e g r a t e d w i t hh v e g fg e n ew e r ep r e p a r e da n dp l a n t e d i ns u i t a b l e b i o l o g i c a l m e m b r a n et op r o d u c eg e n e t i c a l l ye n g i n e e r i n gm e m b r a n ew h i c hc a nb e u s e di ng e n e t h e r a p y f o rw o u n d i nt h i s e x p e r i m e n t ，p c d n a 3 一v e g f ( ap l a s m i dc o n t a i n i n g v e g f c o d i n gs e q u e n c e ) w a s t r a n s f e c t e di n t on i h 3 t 3c e l l sm e d i a t e db yc a t i o n i c l i p o s o m e ，t h e n7h v e g f - i n t e g r a t e dc e l l c l o n e sw e r es c r e e n e db yu s i n g 上海第 二 鞋辩大学硕士论文 g 一418 o n ec e l lc l o n ew h i c hc a ne x p r e s sh v e g fi nt h eh i g h e s tl e v e lw a s s e l e c t e da n dv e r i f i e db yp c r ，s o u t h e r nb l o t 。m e a n w h i l ei t se x p r e s s i o no f h v e g fw a sa n a l y s i z e db yt h em e t h o d so fr t p c r 、n o r t h e r nb l o t 、 a n dh v e g f - e l i s a i t s b i o l o g i c a la c t i v i t i e sw e r e m e a s u r e db ym t ta n d c a ma s s a yf o r a n g i o g e n e s i s i nc h i c k e m b r y o a f t e r c o n s c i e n t i o u s c o m p a r i s o na n ds e l e c t i o n ，b i o b r a n e w a sc h o s e nf r o mt h r e ek i n d so f b i o l o g i c a lm e m b r a n e a n dc u l t i v a t e dt h em o n o c l o n a lc e i l sw e r ec u l t i v a t e d o nt h en y l o nm e s h e so fb i o b r a n es u c c e s s f u l l y t h em o n o c l o n a lc e l l sc a n g r o wv e r yw e l l i nb i o b r a n ea n ds t i l l e x p r e s sh i g h l e v e l h v e g f t h e g r o w t h c u r v eo ft h em o n o c l o n a lc e l l si nb i o b r a n ew a sd r a w na n ds e v e r a l i m p o r t a n tp a r a m e t e r s w e r ed e r i v e df r o mt h ec u r v e a l lo ft h e s e a c h i e v e m e n t sp r o v i d et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rt h ef u m mr e 5 e o r c h i n g e n et h e r a p yf o r w o u n d k e y w o r d s ：h v e g fm o n o c l o n a le n g i n e e r i n gc e l l b i o b r a n e 上 海第 二医 科大 学硕 士 论文 引言 创伤的愈合是一个非常复杂的过程，不仅有创伤局部的变化，还 有周围组织和器官，甚至全身的改变。综合，临床，病理和生理等方面， 创伤愈合大致可分五个阶段：( 1 ) 凝血，止血( 1 和炎性细胞进入( 2 ( 2 ) 细胞增殖，修补缺损( 3 ，4 ( 3 ) 结缔组织生成( 4 ) 创伤修复组织和部 位收缩( 5 ) 组织重建其完整性”。其中第( 2 ) 阶段是最关键的， 因为在这一阶段中长入创面的新生血管为以后的修复提供了血管床， 从而提供各种必需的营养物质和细胞因子。新生血管形成快慢最终将 决定愈合的早晚，加快这一过程对减少感染的发生和瘢痕组织的形成 有重大意义，并将影响到预后的外观和肢体功能恢复。 近年来在创伤的治疗研究上取得了很多进展，但如何促进大面积 创伤和顽固性溃疡的愈合仍然是一个尚未解决的重大问题。目前临床 上采用的自体或异体的皮肤移植虽有一定疗效，但操作繁琐、成功率 低，而且经常受到皮源不足的限制。所以人们研制开发出了各种能够 模拟部分皮肤功能的“人工皮肤”撕，7 ，鼢，还有人在尝试使用人角质 形成细胞代替自体表皮作为移植供体( 9 m 。但这些方法都面临一个关 键的问题，就是创面的血供。没有充足的血供，各种移植物都难以良 好生长。所以寻找一种能够有效促进创面血管生长的方法，对于愈合 本身和临床治疗都有重大意义。 许多细胞因子具有促进创伤愈合的作用，它们通过自分泌和旁分 泌作t o 于创面细胞( 1 。其中最重要的有血小板衍生生长因子( p d g f ) ， 成纤维细胞生长因子( f g f ) ，转化生长因子( t g f ) 和血管内皮细 上海第二医科大学 碗士论文 胞生长因子( v e g f ) 等。这些因子的作用具有高效性，多效性，一 过性和网络性四大特点。它们对创伤的作用涉及愈合的各个环节和多 种组织，如表皮和上皮细胞的分化增殖，成纤维细胞的趋化增殖和后 期的凋亡，新生血管的形成等。这些因子的基因工程产品有些已经试 用于临床，也显示出一定的效果。但是，由于它们大多属于多肽类的 生长因子，其半衰期很短，而且创伤表面的渗出液中含有大量的蛋白 水解酶，可迅速的降解外源的生长因子( 9 ) ，使得难以在创面上维持一 个相对稳定有效的剂量，限制了它们的应用。 本实验的目的就是尝试建立用基因工程方法改造的能够持续分 泌某种因子的成纤维细胞，并研究其在各种生物膜上的生长情况，选 择最合适的支持物，制备基因工程生物膜。为今后的，临床应用做准备。 h v e g f 是特异作用于血管内皮细胞的因子。它最直接的作用就是通 过加快血管内皮细胞的增殖和迁移而促进微血管形成a 整合了 h v e g f 基因的工程细胞能够持续产生高水平的h v e o f 。本实验将 h v e g f 基因入n i h 3 t 3 细胞，使用g 一4 1 8 筛h v e g f 单克隆细胞。 鉴定后将该细胞种植于b i o b r a n c ，刺备基因工程生物膜并研究其生物 学功能，为今后的临床应用作准备。 上 海第 二 鞋辩大学硕士论文 第一部分h v e g f 单克隆工程细胞的筛选 引言 获得能够表达高水平h v e g f 的工程细胞是本实验的第一步。本 实验的思路是以n i h 3 t 3 细胞作为基因治疗的细胞载体，将含有 h v e g f 的穿梭质粒p c d n a 3 一v e g f 导入n i h 3 t 3 细胞。关于阳离子 脂质体介导的p c d n a 3 - v e g f 对n i h 3 t 3 细胞的转染，研究的已经比 较成熟。不仅能够获得很高的转柒效率，而且所获得的细胞也能表达 高水平的h g f 。但是这种方法有两个缺点，使其不利于今后的基 因治疗研究：( 1 ) 转染所得到的细胞是瞬时表达。虽然能持续表达一 周以上，但它的表达曲线近似于一条抛物线，在第三天左右达到高峰 后将持续下降，一个月后就基本测不出了。表述的不稳定使其不能准 确定量，不符合临床应用的要求。( 2 ) 过于烦琐。每次使用前都要转 染，复杂的操作不仅增大了污染的几率，而且也使偶然误差增多，不 利于准确定量。所以本实验在转染的基础上使用极限稀释法筛选出整 合了h v e g f 基因的单克隆细胞，这种细胞具有稳定持续表达h v e g f 和使用简便等优点，可以作为下一步基因治疗研究的“种子细胞”。 = 圭堕笪三堕型 力学砑士越 足 1 1 材料与方法 1 1 1 材料： 试剂：阳离子脂质体l i p o f e t a m i n e 2 0 0 0 ( g i b c o b r l 公司) 高糖d m e m ( g i b c o b r l 公司) 小牛血清( h y c l o n e 公司) 无血清培养基o p t i m e m ( g i b c ob r l 公司) 限制性内切酶h i n d m 和x h oi ( g i b c o b r l 公司) 酵母抽提物，胰蛋白胨( o x o i d 公司) g - 4 1 8 ( p r o m e g a 公司) v e g fe l i s a k i t ( r & d 公司) t r i z o l r e a g e n t ( g i b c o b r l 公司) 逆转录酶m - m l v r t , o l i gd t , r n a s ei n h i b i t o r ( g i b i c o 公司) p f u t a q ( 3 r - 海生工公司) d n t p ( p r o m e a g 公司) 引物由上海基康公司合成。 其它试剂均为国产分析纯。 质粒：重组质粒p c d n a 3 一g f p ( c l o n e t e c h ) 重组质粒p c d n a 3 一v e g f ( 本室孙欲晓博士构建) 菌株：大肠杆菌d h 5 0 c ( 本室冻存) 细胞：n i h 3 t 3 ( 本室冻存) 仪器：台式冷冻离心机( e p p e n d o r f 公司) t海第二医 科大学碗士 论文 高速冷冻离心机s c r 2 0 b a ( h i t a c h i 公司) 超净工作台，c 0 2 培养箱黜姬u s 公司) 倒置显微镜( o l y m p u s 公司) 全波长酶标仪( m a x 2 5 0 ，m o l e c u l a rd e v i c e s 公司) 细胞计数仪( c o u l t e r 公司) p c r 仪( p r o g e n e 公司) 微型电泳槽、紫外分光光度计( b e c k m a n 公司) 可调式移液器( e p p e n d o r f 公) 1 1 2 方法 1 1 2 1 质粒护j 毫 ( 1 ) 质粒转化大肠杆茵( m g c l 2 一步法) ： a ) 感受态茵制备：取冻存于一7 0 。c 大肠杆茵d h 5o c 一支，溶解后加 至5 m ll b 培养基中，3 7 2 2 0 r p m 震荡5 - 6 小时。取5 0 斗l 震 荡过的茵液，加至新的5 m l l b 培养基中，同上震荡培养2 小时，当 o d 6 0 0 值为o 2 - 0 4 时，细菌进入对数生长期或对数生长前期， 此时准备进行转化。 b ) m g c l 2 法转化大肠杆菌：取l m l 感受态d h 5 0 【，4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃去上清，加入1 0 0 l 预冷的t s s 缓冲液( 1 0 聚乙二醇、 5 d m s o 、5 0 n m o l lm g c l 2 溶于l b 中，p h 调至6 5 ，一2 0 保存 备用) 重悬。冰上静置5 分钟后，加入1 “g 重组质粒p c d n a 3 一g f p 或p c d n a 3 一h v e g f ，混匀。在冰上静置3 0 分钟后，加9 0 0 “1 含2 0 m m o l l 葡萄糖的l b ，3 7 、2 2 0r p m 培养1 小时。取2 0 0 上海第二医科 大学硕士 论文 p1 转化产物，涂布于含氨卞青霉素1 0 0 pg m l 的l b 琼脂平板 上。3 7 培养1 6 1 8 小时后，挑取白色的阳性克隆，加到5 m l 含1 0 0 肛g m l 氨卞青霉素的l b 培养液中，3 7 、2 2 0r p m 震荡培养6 小时。 ( 2 ) 质粒d n a 的小量制备：取l m l 茵液，用碱裂解法进行质粒d n a 的小量制备。 a ) l m l 的茵液4 0 0 0r p m 离心5 分钟，沉淀用预冷的s t e ( 0 1 m o l l n a c ip h 8 0 的1 0 m m o l lt r i s c 1 、1 m m o l le d t a ) 重悬洗涤， 4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃去上清。 b ) 用1 0 0 斗1 溶液i ( 5 0 m m o l l 葡萄糖、2 5 m m o l lt r i s c i 、 1 0 m m o l le d t a ) 悬浮细菌。再加入1 5 0 “1 的溶液( 0 2 n n a o h 、l s d s ) ，轻轻混匀后，静置冰上2 分钟，再加入1 5 0 “l 的溶液( 5 m o l lk a c6 0 m l 、1 1 5 m l 冰醋酸、2 8 5 m l 水) 轻轻 混匀，冰上放置5 分钟后，1 2 0 0 0r p m 、4 离心5 分钟。 c ) 移取上清，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，轻轻 混匀后，1 2 0 0 0r p m 4 离心5 分钟。 d ) 吸取上层水相，加入2 倍体积无水乙醇，振荡混匀，室温静置 1 0 分钟，1 2 0 0 0r p m 、4 离心5 分钟，弃去上清，用7 0 的乙 醇漂洗沉淀，7 5 0 0r p m 、4 离心5 分钟后弃去上清。 e ) 室温下静置3 0 分钟挥发乙醇待干，加入2 0 “1t e ( p h 8 0 含 2 0 “g lr n a s e ) 溶解沉淀。 ( 3 ) 酶切鉴定：取5 1 小量制备重组质粒，加h i n d 和x h oi 各1 - n 兰壁墨三墨盟 力学厕士 趁卫 b tl ( 1 u p 1 ) 、1 0 h b u f f e r2 pl 、加蒸馏水补充至2 0 “l ，3 7 孵育2 小时后，0 8 琼脂糖电泳进行酶切鉴定。鉴定结果正 确后，进行重组质粒大量制备。 ( 4 ) 重组质粒的大量制备：取已转重组质粒的茵液l m l ，加至1 5 0 m l 含1 0 0 b tg m l 氨卞青霉素的l b 中，3 7 。c ，2 2 0 r p m 震荡过夜，收 集茵液进行质粒的a t - & 提。方法按照g b i c ob r l 公司的中 量质粒提取试剂盒说明书进行操作。 a ) 用h i t a c h 冷冻离心机6 0 0 0 r p m 离心菌液1 5 分钟后弃去上清 b ) 加入4 m l 的e 1 溶液置于涡旋震荡器上混匀后，转移至5 0 m l 离心 管中。加4 m le 2 于f 2 - ：- 溶液中，轻轻混匀，室温下静置5 分钟 后，再加入4 m l e 31 5 0 0 0 r p m 室温下离心1 0 分钟。 c ) 将上清加至已用溶液e 4 洗涤过的柱子中，弃去滤出液。用e 5 洗涤柱子两次，每次1 0 m l ，弃去滤出液。 d ) 加入5 m l 溶液e 6 过柱，收集滤出液至5 0 m l 离心管中。在滤出 液中加入3 5 m l 异丙醇，混匀后于4 。c ，1 5 0 0 0 r p m 离心3 0 分钟 后弃去上清。 e ) 沉淀用5 m l7 0 乙醇进行洗涤，4 。c ， 7 5 0 0r p m 离心5 分钟， 弃去上清。 f ) 沉淀在室温下静置3 0 分钟，挥发残留的乙醇后，加入2 0 0 p 1 t e ( p h 为8 0 ) ，溶解沉淀，紫外分光光度计测定d n a 的含量。 1 1 2 2 转染 ( 1 ) 细胞准备：将n 1 h 3 t 3 细胞胰酶消化后，用含1 0 小牛血清的高 上 海第 二 医科大学碗士论文 糖d m e m 培养基终止胰酶作用并进行细胞精确计数( 细胞计 数仪，c o u l t e r 公司) ，按照每孔l 1 0 5 的量种于6 孔板中， 加入d m e m 培养基3 5 毫升，培养2 0 小时左右。待其细胞融 合度为6 0 7 0 时，准备转染。 ( 2 ) 转染复合物的配制：取4 “g 质粒( p c d n a 3 一v e g f 或 p c d n a 3 一g f p ) 和1 2 “l 的l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 分别用无血清 培养基稀释至2 5 0 “l ，轻轻混匀并于室温下静置5 分钟。然 后二者混合，颠倒混匀后室温下静置2 0 分钟后，稀释至l m l 即可用于转染。 ( 3 ) 转染：将细胞用无血清的培养基洗涤两遍后，用移液器在每孔 中均匀加入脂质体d n a 复合物l m l ，置于3 7 。c 、5 c 0 2 的培 养箱培养5 小时后，吸去培养基，加入含2 0 小牛血清，不合 抗生素的d m e m3 m l 。p c d n a 3 一v e g f 转染细胞继续培养4 8 小时后准备筛选，p c d n a 3 一g f p 转染细胞则作为参照评估转染 效果。 1 1 2 3 筛选 ( 1 ) g - 4 1 8 配制：在超净台中将g 4 1 8 千粉用无茵p b s 缓冲液溶 解，使终浓度为5 0 1 tg pl ，然后使用一次性0 2 2 肛m 滤头过 滤。将无茵的g 一4 1 8 溶液储存于一2 0 备用。 ( 2 ) g - 4 1 8 加压筛选混合阳性细胞克隆：将上述培养4 8 小时的 p c d n a 3 一v e g f 转染细胞用p b s 洗涤两遍，胰酶消化至一次 性细胞培养瓶，加入含2 0 小牛血清的d m e m 和g - 4 1 8 ，使 上 海_ 第 二 医科大学 硕 士 论文 g 一4 1 8 浓度为8 0 0 pg m l 。每隔5 天换一次液，g 4 1 8 浓度维 持不变。加压筛选维持三周。 ( 3 ) 极限稀释法筛选单克隆h v e g f 工程细胞：准备好9 6 孔板， 每孔加入含2 0 小牛血清和8 0 0 pg m l g 一4 1 8 的d m e m 培养 基2 0 0 pl 。将加压筛选的混合阳性细胞用胰酶消化，然后用 d m e m 培养基终止消化并精确计数。稀释细胞悬液至1 个 pl ，用微量移液器在9 6 孔板每孔加1 肛l 。镜下观察，将只有 含一个细胞的孔挑出并标记，标记孔中长出的细胞将成为单克 隆细胞。将细胞置于3 7 。c 、5 c 0 2 的培养箱培养，每隔一周 左右换液，每次换液降低( 3 - 4 1 8 浓度2 0 0 pg i l l l ，直至浓度为 2 0 0 hg m l 时维持。当9 6 孔板中某孔细胞长满时消化转移至 2 4 孔板，此后随着细胞数增加，依次转移至6 孔板和细胞培 养瓶。当细胞数达到一定量时，进行h v e g f 表达测定，挑 选高表达克隆。 1 3 2 4 挑选高表迭细胞克隆：使用h v e g f e l i s a 法和半定量 r t ，p c r 进行挑选 ( 1 ) 细胞上清的收集： 取筛出的备株单克隆细胞消化后，按照每孔1 1 0 6 的量分别 种植于6 孔板各孔中，每孔加入含1 0 小牛血清无抗生素的 d m e m s m l 。细胞长满后( 约4 8 小时) 收集细胞上清，1 0 0 0 r p m ，5 分钟离心后2 0 冻存备用，作e l i s a 检测。六孔板的细胞用 作r t p c r 。 上 海第 二医 科大学硕士论文 ( 2 ) e l i s a 检测 a ) 先将板条和各种试剂平衡至室温。然后按照说明书，用对倍稀 释法配制各相应浓度的标准品。 b ) 取所需数量的板条，每孔中加入5 0 “l 的溶液r d l w 后，再加 入2 0 0 pl 细胞上清或标准品，用封板胶纸封住反应孔，室温 下置于避光处孵育1 2 0 分钟。 c ) 洗涤：甩干孔内液体，每孔中加入1x w a s h i n g b u f f e r 2 0 0 “l ， 静置3 0 秒后弃去孔内液体，在厚叠吸水纸上拍干。重复3 次。 d ) 洗涤后，每孔加入2 0 0 pl 的v e g fc o n j u g a t e ( a n t i v e g f ) ， 室温下置于避光处1 2 0 分钟。 e ) 同c ) 洗涤3 次。同时配制s u b s t r a t es o l u t i o n ( s o l u t i o na 和b 等 体积混合) ，1 5 分钟内使用。 d 每孔加入2 0 0 斗l 的s u b s t r a t es o l u t i o n ，室温下避光处静置2 0 分 钟。待显色完全后，每孔加入终止液5 0 肛l 。 曲震荡板条，充分混匀后，在酶标仪上读取4 5 0 n m 和5 7 0 n m 处 的o d 值求出校正o d 值( o d 4 5 0 - o d 5 7 0 ) 。 h ) 根据标准品的o d 校正值绘制标准曲线，然后由待测样品的 0 1 3 校正值求出其h v e g f 的浓度。找出h v e g f 表达水平最 高的细胞株。 ( 3 ) 半定量r t - p c r ： a ) 细胞r n a 的抽提( t r i z o l 一步法) ： 按g i b i c ot r i z o l 说明书操作：先用p b s 洗涤细胞一遍。6 i海第二医科大学硕士论文 孔板中，按照1 m i 孔的量加入t r i z o l ，室温下静置3 - 5 分钟。 用移液器吹打数下后将液体移至1 5 m l 的e f f e n d o f 管中，加入 2 0 0 pl 的氯仿，剧烈振荡1 5 秒钟后室温下静置1 0 分钟。将 混合液置于高速冷冻离心机，4 ，1 2 0 0 0 9 离心1 5 分钟。小 心吸取最上层水相转移至新的1 5 m le f f e n d o f 管中，加入5 0 0 p1 的异丙醇，轻轻混匀后室温下静置1 0 分钟。4 c ，1 2 0 0 0 9 离心1 0 分钟后，弃去上清加入用d e p c 水配制的7 5 乙醇 l m l ，轻轻振荡后，4 ，7 5 0 0g 离心5 分钟。弃去上清，室 温下静置3 0 分钟，待乙醇挥发完毕，加入1 0 肛1d e p c 处理 过的水溶解沉淀。紫外分光光度计测定r n a 浓度。 调整其溶度为l “g , 1 ，一7 0 。c 保存待用。 b ) 逆转录反应：取1 “1 所提取的r n a ，用无r n a s e 的d n a s e 分解残留的d n a 污染。然后置于0 5 m l e f f e n d o f 管中，加入 0 5 “lr n a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u l u1 ) ，2 p lo l i g d t ( 1 0 0 p m 0 1 ) 后，6 5 。c 水浴5 分钟。取出后立即置于冰上，依次加入o 5 pl r n a s e i n h i b i t o r ，4 “l5 b u f f e r ，4 斗ld n t p ( 2 5 m m o l l ) ，7 pl d e p c 水、逆转录酶m m l v r t1 肛l ( 2 0 0 u p1 ) 后，置于3 7 。c 水浴中9 0 分钟，9 5 。c3 分钟后将r t 产物置于一7 0 。c 备用。 c ) p c r ：取o 5 m l e f f e n d o f 管，依次加入d d h 2 06 7 5 pl ，l o “1 1 0 b u f f e r ，8 p ld n t p ( 2 5 m m o l l ) ，v e g f 上下游引物各1 “ l ( 5 0 p m o l p1 ) ，鼠源pa c t i n 上下游引物各1 v1 0 2 5 p m o l “1 ) ， 以及l o b tlr t 产物。将其置于p c r 仪9 5 。c 3 分钟后，加入 - j 矗 上海第二医科大 学硕 士 论文 p f u t a q0 5 pl ( 5 u p1 ) 。于p c r 仪上按照以下条件进行扩增 9 4 。c 3 分钟完全变性后，9 4 。c3 0 秒，6 4 。c3 0 秒，7 2 。c 9 0 秒3 5 个循环，7 2 。c1 0 分钟后4 。c 保存，1 5 琼脂糖凝胶， 6 0 v 电泳。进行凝胶灰度扫描分析，找出h v e g f m r n a 水 平最高的细胞株。 引物序列：鼠b a c t i n 上游引物5 c t c t i 叮g a t g t c a c g c a c g a t t t c 3 下游引物5 g t g g g c c c g c t c t a g g c a c c a a 3 扩增片段大小为5 4 0 b p 人v e g f 特异性引物 上游引物5 g a g g g c a g a a t c a t c a c g a a g t 3 下游引物5 t c c t a t g t g c t g g c c t t g g t g a 3 扩增片段大小为2 5 7 b p - j 7 - 上 海第 二医 辩大学碗 士 论文 1 2 结果 1 2 1 质粒酶切鉴定结果 将p c d n a 3 一g f p 和p c d n a 3 - v e g f 用h i n d i l i 和x h oi 酶切。结果如 图( f i g1 ) 与预期结果一致，证实了质粒正确。 8 嘶叫 - 6 9 1 b p 1 2 2g f p 表达间接显示转染效率 f i 9 1p c d n a 3 g f p 和 p c d n a 3 v e g f 经 h i d 和x b a i 酶切 鉴定结果 ( 1 ) p c d n a 3 g f p ( 2 ) 1 0 0 b pl a d d e rm a r k e r ( 3 ) p c d n a 3 - v e g f 按照阳离子脂质体l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 的说明书进行转染n i h 3 t 3 细 胞后7 2 小时，以绿色荧光蛋白为标记，倒置显微镜观察其转染效率 ( f i g2 ) 。可以看到在细胞融合度为6 0 7 0 ，d n a ：脂质体为1 ：3 ，转 染时间为5 小时的条件下，获得了较高的转染效率。 _ 亡 蓐劳 _ 二 层群力 学劈 士 糖卫 f i g2g f p 表达间接显示转染效率 1 2 3e l i s a 检测细胞分泌h v e g f 用1 1 2 3 所得的各株单克隆细胞于6 孔板培养4 8 小时收集细胞上清， 用辣根过氧化物酶标记的e l i s ak i t 检测细胞上清中的h v e g f ，反应 后于4 5 0 r i m 处测得o d 值，用5 7 0 r i m 处o d 值进行校正，以校正值 ( o d 4 5 0 - o d 5 7 0 ) 作为样品最终的o d 值。 反应时h v e g f 标准品的o d 值用s l i d e 统计软件绘出的h v e g f e l i s a 的标准曲线( f i g3 ) 得到公式h v e g f ( p g ) = 1 1 6 6 2 9 6 1 o d - - 2 8 5 9 6 1 相关系数r = 0 9 9 4 9 墨塑童 = 晷科大学 硬 士 论文 刍 ： g h v e g f8 t a e d a r dc u r v e o p u m id _ d ， f i 9 3h v e g f e l i s a 标准曲线 x 轴标准品的暖光度( o d 4 s o o d 5 7 0 ) y 轴标准品浓度 相关度r - - 0 9 9 4 9 由此计算出单位细胞数( 1 1 0 6 ) 的备株细胞在4 8 小时分泌的h v e g f 量如图( f i 9 4 ) f i g4e l i s a 检测各棒 细胞的h v e g f 分泌量 x 轴n i h 3 1 3 细胞和 各棒单克隆细 胞( 1 为n 3 t 3 细胞，2 - 8 为单 克隆细胞) y 袖l 1 0 6 细胞在4 3 小时内分泌 h v e g f 的量 _ 亡薄筹二 压群力 学砑 士 跨卫 从图中可以看到细胞7 表达的h v e g f 最高，而细胞2 ，5 几乎不表达 h v e g f ，说明存在仅仅整合n e o 基因，而丢失目的基因的情况。此时 细胞虽然能抗拒很高的g 一4 1 8 ，但并不表达h v e g f 。 1 2 4 半定量r b p c r 用1 1 。2 4 ( 1 ) o f 收集过上清的细胞抽取r n a ，用同样量的r n a 进行 r t p c r 得结果如图( f i 9 5 ) b 一蕊d 耻一一 h g f - ( 8 ) ( 7 )( 6 )( 5 )( 4 )( 3 )( 2 )( 1 )m a r k e r f 1 9 5 ：半定量r t - p c r 电泳圈 ( i )n i h 3 t 3 细胞 ( 2 ) 一( 8 ) 单克隆细胞株 m a r k e r 为1 0 0 b pm a r k t t r , p - a c t i n 为5 4 0 b p ，h v e g f 为 2 5 7 b p ：蓬 箍_ = 医 型j ： 堂短趁t ： 可见细胞4 、7 的h v e g f m r n a 的量最高，而n i h 3 t 3 细胞和细胞2 无h v e g fm r n a 的转录。 + 凝胶灰度扫描分析数据如下：( 表中数据为条带面积x 条带亮度) 汰 123 45678 n i h 3 t 3 h v e g f2 3 5 5 22 9 5 6 88 7 9 7 91 8 5 2 8 39 0 0 6 36 5 1 9 01 5 1 5 3 33 1 1 2 0 b a c t i n1 9 8 8 0 3 2 7 1 1 8 0 3 8 8 4 0 02 7 9 2 8 0 3 5 5 1 9 0 1 5 5 2 0 02 “2 8 08 2 1 9 2 据此数据绘制各细胞h v e g fm r n a 的量如l 图( f i g6 ) 半定量r t p c r 凝胶分析图 n i h 3 t 3 ( 1 ) 与单克隆细胞株( 2 - 8 ) 6 半定量 r t - p c r 挑选高表 达克隆 x 抽：n i h 3 t 3 细胞( 1 ) 与 单克隆细胞 株( 2 - 8 ) y 轴：h v e g f 与 b a c t i n 的 比值 从这个图可以看出细胞7 的h v e g fm r n a 的量较高，细胞2 则反之， 这与e l i s a 的结果是一致的。 由以上结果可知，细胞7 可能为高表达的h v e g f 单克隆细胞株， 可进行进一步的鉴定分析。 上海第 二 医科大学硬 士 论文 1 3 讨论 外源d n a 导入哺乳动物细胞主要有两类方法：转染和病毒载体 介导的基因导入1 2 ) 。在给定的试验中，病毒载体几乎可将d n a 导入 所有的细胞中，但它们也有一些不足之处。常用的腺病毒载体不能整 合到靶细胞的基因组中1 ，随着宿主细胞的不断复制和分裂，将很快 被稀释和丢失。逆转录病毒载体虽然可以将一个基因以稳定形式导入 细胞，获得能够稳定表达某一基因的细胞系。但构建一个重组逆转录 病毒和病毒包装系统是一件很复杂的工作，而且应用时还必须考虑生 物安全性的问题，只有当靶细胞不易被转染时，才考虑使用。本实验 所使用的n i h 3 t 3 细胞是比较容易被转染的，所以优先考虑使用转柒 的方法。 转染是指在某种物理或化学条件的辅助下，直接将外源d n a 导 入靶细胞。常用的方法有四种，即：磷酸钙转染法，d e a e 葡聚糖转 染法，电穿孔法和脂质体转染法( 1 舢。磷酸钙转染法和d e a e 一葡聚糖 转染法是造成一种使d n a 附着在细胞表面的化学环境，然后d n a 被细胞内吞，进入细胞。电穿孔法则是用电场在细胞上穿孔，d n a 通过所穿的孔进入细胞中。脂质体转染法是将d n a 与脂质体混匀，由 脂质体包裹d n a ，再与细胞膜结合，然后脂质体d n a 复合物被细胞 内吞，使外源基因进入细胞。从外源基因在细胞中的表达情况来言， 转染又可分为短暂( 瞬时) 转染和稳定( 永久) 转染1 2 ) 。短暂转染时， 外源基因只能短暂表达数天至数周。此时外源基因的表达效率取决于 上海锖二医 科大学硕士论文 细胞摄入外源d n a 的数量，基因的拷贝数和基因的表达水平。短暂 转染的缺陷在于表达产物产生量的不稳定性。由于只有一部分细胞获 得了外源基因，而且这些细胞在整个细胞群体中所占的比例并不确 定，所以不能通过增加细胞数来按比例放大蛋白质的生产。同时高拷 贝的外源基因最终可导致细胞的死亡，这种致死作用更加加大了表达 效果的不确定性。稳定转染则可以避免短暂转染的这些缺点。所谓稳 定转染，就是在转染之后进行细胞筛选，分离出将外源基因稳定整合 于基因组中的细胞。不同的细胞具有不同的稳定整合频率，而且整合 外源基因的能力也不同。此时，获得稳定整合体的取决因素是整合的 频率，而不是d n a 的摄取频率。获得的稳定整合体能够持续表达目 的基因，而且表达量也是相对衡定的，所以可用于基因功能分析和生 产基因工程产物。在常用的四种转染方法中，d e a e - 葡聚糖转柒法由 于不易形成稳定转化细胞系，故仅用于短暂转染；其余的三种方法则 可通用于短暂和永久两种转染方式。但是对于不同的细胞还是要选择 最适合其特点的转染方式。电穿孔法主要用于悬浮培养的细胞，因为 细胞必须被移入一个电击池中，同时电击对细胞的损伤也比较大；而 贴壁细胞的转染多使用磷酸钙转染法和脂质体转染法。本实验所采用 的n i h 3 t 3 细胞为贴壁细胞，所以后两种方法比较适用。 一般来说，转染中大约只有1 1 0 4 细胞将稳定整合外源基因1 舢， 所以为了得到稳定的整合体，需要选择可高效转柒的细胞系，效率高 的转染方法以及适当的显性( 正向) 选择标记进行分离。 n i h 3 t 3 细胞为小鼠源性胚胎成纤维细胞。成纤维细胞因为容易 上蓐第 二 层剥才学砑越卫+ 在体外转化和容易移植等特点早已被广泛应用于许多疾病的基因治 疗实验。很早就有将因子基因和糖原储积病基因成功转染小鼠的报 道”，国内也曾有人将白介素6 基因导入鼠成纤维细胞，用于骨髓移 植小鼠的造血重建( 1 4 ) 。n i h 3 t 3